SEMINAR Mehanika citoskeleta Avtor: Samo Štajner Mentor: doc. dr. Primož Ziherl 11. 11. 2010 Povzetek V seminarski nalogi predstavimo nekaj fizikalnih modelov, ki opisujejo mehaniko celice. Poudarimo teorijo entropične elastičnosti filamentov. Uvedemo persistenčno dolžino. Pogledamo zamrežitev citoskeleta v dveh in treh dimenzijah. Na koncu omenimo še ostale fizikalne modele, ki so v razvoju in pojasnjujejo mehanske lastnosti celice. Raziskovalno dejavnost na področju mehanike celice postavimo v širši kontekst mehanotransdukcije in pogledamo smernice bodočega raziskovanja.
Kazalo 1 Uvod 1 2 Filamenti v celici 1 3 Mrežne strukture citoskeleta 5 4 Sklep 11
2 FILAMENTI V CELICI 1 Uvod Motivacij za raziskovanje mehanskih lastnosti citoskeleta je zagotovo dovolj. Že samo razumevanje obnašanja osnovnih gradnikov, iz katerih smo kot živa bitja zgrajeni, je zadostni razlog za naše raziskovanje. Seveda pa obstaja poleg te najbolj osnovne motivacije, ki izhaja iz radovednosti, še praktična. V kolikor bi želeli namreč posegati v naša telesa in medicinsko pristopati k nepravilnostim in bolezenskim stanjem ter jih odpravljati, moramo poznati lastnosti in naravo obravnavanih celic. Elastične lastnosti rdečih krvničk nam lahko povedo, kako hitro se bodo premikale po kapilarah, kakšen bo njihov odziv na skrčitve, ko preidejo v kapilare, in podobno. Po drugi strani lahko tudi odkrijemo, kako delujejo mišična tkiva in kaj daje mišicam trdnost in elastičnost, da lahko opravljajo svoje naloge. Če lahko razumemo delovanje mišic, lahko morda identificiramo tudi napake v njihovem delovanju in jih odpravljamo. Celica ni samo s celično membrano omejena citoplazma, ampak vsebuje organele, ki so na membrano in drug na drugega pritrjeni s citoskeletom, kot prikazuje slika 1 [1]. Zaradi notranje strukture lahko celice kontrolirajo in spreminjajo svojo velikost in obliko, se zoperstavljajo zunanjim napetostim in vodijo lastno celično dinamiko. Vse to jim omogoča citoskelet, katerega mehaniko bomo obravnavali v tej seminarski nalogi. Citoskelet sestavljajo proteinski filamenti različnih trdnosti in dolžin, ki delujejo podobno kot palice ali ohlapne vrvi [1]. Te se lahko preko posebnih sidrišč pripnejo na celično membrano in druge organele v celicah ter jih tako povezujejo in Slika 1: Primer citoskeleta v evkariontski celici [2]. Zeleno je ohranjajo njihovo relativno razdaljo [1]. obarvan polimer aktina, rdeče pa Mnoge vidike mehanike celice lahko pripišemo njegovi monomeri. citoskeletu in poiščemo fizikalne modele, s katerimi se želimo čim bolj približati izmerjenim lastnostim celic. Takšen pristop je v svoji osnovi fenomenološki in deluje dobro, dokler je obravnavana celica razmeroma preprosta. Lahko pa model sestavimo iz enostavnih gradnikov citoskeleta, katerih lastnosti smo že raziskali. S tem pristopom smo sposobni napovedati in predvideti širši spekter pojavov v celici, zato mu bomo v začetku tudi podrobneje sledili. 2 Filamenti v celici Za začetek klasificirajmo monomere, ki se bodo povezovali v citoskeletne filamente. Vsi glavni deli citoskeleta to so aktin, intermedialni filamenti in mikrotubuli so sestavljeni iz proteinskih podenot. Vsaka proteinska podenota je lahko tudi sama dolga veriga iz več deset ali sto aminokislin [1]. V podrobnejšo strukturo citoskeletnih filamentov se na tem mestu ne bomo spuščali, temveč bomo samo pogledali dimenzije nekaterih pomembnejših predstavnikov. 1
2 FILAMENTI V CELICI V človeških eritrocitih sta dve sklenjeni verigi, vsaka sestavljena iz prepletenih in med seboj različnih molekul spektrina (imenovani α in β). Ti dve verigi sestavljata 200 nm dolg citoskeletni filament [1]. Molekulski masi verig α in β sta 230000 oziroma 220000 Da. Iz teh podatkov ugotovimo, da je skupna dolžinska masa tetramera 4500 Da/nm [1]. Nekoliko debelejši filament kot spektrin tvori protein aktin (slika 2). Elementarni gradnik aktina je protein G- aktin, ki je veriga 375 amino-kislin in ima molekulsko maso 42000 Da. Proteini G-aktina se združijo v protofilament F-aktin, dva protofilamenta pa se prepleteta v aktin. Povejmo še, da sta verigi sami zase neobstojni. Na stabilnost proteinov lahko vpliva ionska struktura celične raztopine, vendar pa je tu Slika 2: Mikrotubul, aktin in intermedialni filament. Filamenti so sestavljeni iz protofilamentov, ki so polimerne verige [3]. nestabilnost povezana predvsem s samo strukturo F-aktina. Aktin ima premer okoli 8 nm in maso na dolžinsko enoto 16000 Da/nm [1]. Intermedialni filamenti so še širši od F-aktina, hkrati pa imajo tudi bolj kompleksno strukturo. Večinoma jih sestavlja 8 protofilamentov, ki ležijo drug zraven drugega v krogu in tako ustvarjajo intermedialni filament s premerom približno 10 nm. Mnogi monomeri, ki sestavljajo intermedialne filamente imajo mase v rangu 40000 700000 Da in povprečno dolžino okoli 50 nm. Hitro preračunamo, da je masa na dolžinsko enoto teh protofilamentov 4500 Da/nm. Intermedialni filament je sestavljen iz 32 takih niti, tako da je njegova masa na dolžinsko enoto 35000 Da/nm. Najdebelejši individualni citoskeletni filamenti so mikrotubuli, ki jih sestavljata proteina tubulin α in β. Vsak izmed njiju ima maso okoli 50000 Da. Para obeh različic proteina sestavljata 8 nm dolg monomer. Monomeri tvorijo protofilament, 13 takih protofilamentov pa se uredi v vijačnico in tvori votel mikrotubul, velikost navoja pa je pogojena s položajem aminokislin, ki lahko tvorijo intermolekulske vezi vzdolž posameznih mikrofilamentov. Masa na dolžinsko enoto mikrotubula je posledično največja izmed vseh obravnavanih, 160000 Da/nm. Ta vrednost je desetkrat večja kot pri aktinu. Dolžinske mase so pomembne, ker posredujejo informacijo o širini filamentov, pričakujemo pa lahko, da bodo širši filamenti manj gibki [1]. Filamenti lahko obstajajo izven celic in jih najdemo v raznih vezivnih tkivih. Najbolj osnoven primer so proteinske komponente celulozne stene pri rastlinskih celicah. Podrobneje posameznih protofilamentov ne bomo obravnavali. Pomembno se je zavedati, da se zaradi razlike v debelini in organizaciji protofilamentov aktin, mikrotubuli in drugi filamenti močno razlikujejo v svojih mehanskih lastnostih na celični skali. Tako se mikrotubuli s persistenčno dolžino nekaj milimetrov na 2
2 FILAMENTI V CELICI mikrometrski skali celic obnašajo kot trde paličice, medtem ko sta aktin in spektrin bolj podobna gibkim nitim [1]. Elastičnost citoskeletnih filamentov Pri absolutni ničli bi bili vsi citoskeletni filamenti ravni. Pri končnih temperaturah pa njihova oblika fluktuira. Sposobnost ukrivljanja je zelo pomembna za elastične lastnosti struktur, ki jih filamenti gradijo. Zato je pomembno, da ugotovimo, kakšne so elastične lastnosti posameznih citoskeletnih filamentov. Iz elastomehanike poznamo modele, ki napovedujejo potrebno energijo za ukrivljanje kontinuumskih palic. Preko te teorije lahko pridemo do modela Kratkyja in Poroda, ki napoveduje celotno elastično energijo filamenta [1,4]: E bend = κ f 2 Lc 0 ( ) 2 t ds. (1) s Tu predstavlja κ f upogibni modul palice, t tangencialni vektor in s vzdolžno koordinato filamenta. Ker je upogibni modul sorazmeren z Youngovim modu-lom Y in vztrajnostnim momentom preseka J citoskeletnega filamenta, se vrednost κ f za različne mikrofilamente razteza čez 6 velikostnih redov [1,4]. Očitno so lastnosti citoskeletnih filamentov odvisne od Youngovega modu-la protofilamentov in predvsem od načina, kako se več takih protofilamentov uredi v večjo tvorbo, saj bo od tega odvisen njihov vztrajnostni moment preseka. Vpeljemo lahko persistenčno dolžino citoskeletnega filamenta, ki je direktno merilo za njihovo togost in je definirana kot [1] ξ p = κ f k B T = Y J k B T. (2) Vidimo, da je persistenčna dolžina odvisna od temperature. Z naraščajočo temperaturo ima namreč citoskeletni filament na razpolago več termične energije, s katero lahko doseže bolj ukrivljena stanja. Večja ξ p pomeni manjše ukrivljanje filamenta, bolj točno zvezo med ukrivljenostjo in persistenčno dolžino pa lahko najdemo s statistično obravnavo. Korelacijska funkcija tangente vzdolž filamenta je eksponentna [1,5] t(0) t(s) = exp ( s/ξ p ). (3) Ta rezultat pove, da filamenti z zelo kratko persistenčno dolžino postanejo zelo hitro poljubno ukrivljeni. Na celični skali je tako aktin skoraj prosto gibka nit. Njegova persistenčna dolžina znaša približno 50 nm, medtem ko se mikrotubul s persistenčno dolžino nekaj mm na mikrometrski skali skoraj ne ukrivi [1]. Energije ukrivljanja se med različnimi konfiguracijami citoskeletnih filamentov razlikujejo. V splošnem se citoskeletni filamenti interno ne vežejo strukturno in obravnavamo vse njihove možne konformacije. Vprašamo se lahko, kakšna je pri dani temperaturi njihova povprečna ukrivljenost, ki jo prikladno opiše razdalja med krajiščema filamenta r ee = r(l c ) r(0). Če je filament težko upogniti, bo r ee zelo blizu njegovi dolžini, če pa bo zelo gibek, je lahko razdalja med krajiščema dosti manjša od njegove dolžine. 3
2 FILAMENTI V CELICI Citoskeletne filamente z določeno persistenčno dolžino lahko obravnavamo kot palico. Dostikrat pa je prikladneje razmišljati o filamentih kot o gibkih verigah, kjer je dolžina segmenta primerljiva s persistenčno dolžino, tako da je naslednji segment lahko usmerjen poljubno. V diskretni reprezentaciji je statistična obravnava preprostejša, rezultat pa mora biti enak, kot če bi vzeli za filament palico. Rezultat povprečne vrednosti vektorja odmika pri dolžini citoskeletnega filamenta L c je [1,5] r 2 ee = 2ξ p L c. (4) Veriga se večino časa nahaja v kofiguraciji, katere vektor razmika krajišč je v okolici svoje povprečne vrednosti. Razlog za to je veliko število realizacij stanj s to vrednostjo r ee. Če bi polimer želeli raztegniti ali skrčiti, bi se temu zoperstavil in bi deloval kot vzmet. Elastičnost citoskeletnih filamentov je potem entropijske narave. V primerjavi s Hookovo vzmetjo lahko takšni polimerni vzmeti pripišemo konstanto vzmeti [1] k sp = 3k BT Nb 2 = 3k BT 2ξ p L c. (5) Ta rezultat lahko uporabimo samo za majhne raztezke od povprečne dolžine. Citoskeletni filamenti imajo namreč končno dolžino in se zaradi tega v režimu velikega raztezka ne obnašajo več linearno. Za polimere poznamo rešitev v obliki Langevinove funkcije [5], za naš primer pa je še bolj pomemben rezultat Kratkyja in Poroda [1], kjer je sila f takole odvisna od raztezka x pri dolžini filamenta L c ξ p f k b T = 1 4 ( 1 x L c ) 2 1 4 + x L c (6) Ta formula dobro opisuje eksperimentalno dobljene rezultate tudi za večje raztezke, čeprav se lahko na nekaterih intervalih od izmerjenih vrednosti razlikuje tudi do 15% [1]. V naslednjem podpoglavju si bomo ogledali nekaj meritev persistenčnih dolžin. Meritve persistenčne dolžine v celicah Metode za meritve persistenčnih dolžin so zelo raznolike. Z aspiracijsko metodo so na primer določili persistenčno dolžino mikrotubula [6]. Na sliki 3 vidimo, da so mikropipeto prislonili na vezikel z mikrotubulom in izčrpavali okolno raztopino. V režimu majhnih odmikov so tako izmerili persistenčno dolžino mikrotubula. Pri določeni vrednosti aspiracijskega tlaka se je mikrotubul sesedel in vidimo lahko popolnoma sferično obliko vesikla. Rezultat meritve, ki znaša 6.3 mm [6], pada v interval rezultatov, ki jih ponujajo druge metode [1]. Z metodo fluorescentne mikroskopije so izmerili gibanje aktina ob zunanjem vzbujanju njegovega krajišča [7]. Vzbujanje je potekalo preko optične pincete, s katero so premikali na krajišče aktina pripet delec. Na ta način so opazovali vzbujene transverzalne valove in primerjali rezultate s teorijo. Rezultati so se skladali s polimerno teorijo citoskeletnih filamentov [1], izmerjena vrednost (9 µm) pa je še vedno v intervalu pričakovanih vrednosti. Druge metode dajo nekoliko višje vrednosti, tako da lahko predpostavimo, da je mehanično vzbujanje filamenta oslabilo njegovo strukturo in s tem zmanjšalo persistenčno dolžino [7]. 4
3 MREŽNE STRUKTURE CITOSKELETA Eksperimentalni podatki so zbrani v tabeli 1. Opazimo lahko, da se rezultati nahajajo znotraj predvidenih vrednosti, ki jih napoveduje teorija. Teoretični minimum persistenčne dolžine spektrina je denimo 2.5 nm. Do tega rezultata pridemo z upoštevanjem dolžine monomera spektrina, ki je okoli 5 nm. Vemo, da je persistenčna dolžina za idealno gibko verigo kar Slika 3: Aspiracijski poizkus, v katerem so obremenjevali vezikel, ki vsebuje mikrotubul in je zaradi tega podolgovat. Pri aspiracijskem tlaku 80 Pa se mikrotubul sesede. [6] ξ p = b/2 = 2.5 nm [1]. Monomeri seveda niso idealno gibki, zato je rezultat meritev večji in sicer v območju 10 20 nm. Do podatkov o persistenčni dolžini pogosto pridejo tudi posredno z aspiracijskim eksperimentom membranskega citoskeleta, kjer nato rekonstruirajo vrednost persistenčne dolžine preko elastičnih konstant citoskeleta, ki ga sestavljajo posamezni citoskeletni filamenti [8-10]. V nadaljevanju si bomo ogledali, kako se filamenti povezujejo v citoskelet. Najprej si bomo pogledali membranski citoskelet in dokaze zanj, nato pa se bomo lotili še celičnega citoskeleta. polimer λ p (Da/nm) ξ p (nm) dolgi alkani 110 0.5 spektrin 4500 10-20 DNA 1900 53 ± 2 F-aktin 16 000 10 20 10 3 intermedialni filament 35 000 mikrotubul 160 000 1 6 10 6 Tabela 1: Masa na dolžinsko enoto nekaterih citoskeletnih filamentov in njihova persistenčna dolžina [1]. Za primerjavo sta navedeni še vrednosti dobro znanih makromolekul (DNA, alkani). Opazimo, da je togost sorazmerna z naraščajočo maso na enoto dolžine. 3 Mrežne strukture citoskeleta Spoznali smo filamente, ki so sestavni del citoskeleta, nič pa še nismo povedali o samem citoskeletu. Zamislimo si lahko zelo veliko načinov vezave filamentov v večje organizirane strukture. Pogledali si bomo tvorbo mrežnih struktur na celični membrani. Za obravnavo celičnih membran se izkaže, da nekaterih njihovih lastnosti ne moremo razložiti brez vpeljave mrežnega citoskeleta [10]. Tako nam te meritve ponujajo direktno potrditev, da bo model dvodimenzionalnega mrežnega citoskeleta na membrani upravičen. Najprej poglejmo, kako se aktin, spektrin in drugi filamenti povezujejo v kompleksnejše strukture. Dvodimenzionalne mreže so sestavljene iz filamentov, ki so preko sidrišč v celični membrani pripeti nanjo. Sidrišča v eritrocitu na primer predstavlja protein ankirin, ki se za vezavo na citoskeletne filamente poveže z integralnim 5
3 MREŽNE STRUKTURE CITOSKELETA proteinom band 3. Vezi med sidriščem in filamentom so navadno kovalentne (esterske) in orientirane. Povejmo še, da navadno v sidriščih sodeluje tudi aktin (slika 4) [1]. Filamenti se lahko na membrano sidrajo po celi svoji dolžini, tako da se lahko en sam filament razteza preko mnogo sidrišč. Takrat si lahko predstavljamo, da je vsak segment med sidriščema ločena vzmet. Takšen citoskelet sestavlja v primeru eritrocita spektrin, ki se na celično membrano veže preko okoli 75 nm oddaljenih sidrišč. Ker je tipična velikost spektrina okoli 200 nm, se spektrin med vozlišči že lahko obnaša kot entropijska vzmet. Dejansko lahko površino eritrocita raztegnemo kar za faktor 7, če jo obremenimo z zadosti veliko raztezno silo. Tako je tudi zato, ker eritrocit nima notranje strukture, recimo jedra in drugih organelov. Posledično ne vsebuje mikrotubulov, ki bi tvorili volumski citoskelet. Elastične lastnosti dvodimenzionalnih struktur so odvisne od povezanosti in simetrije mreže. Mreže navadno nimajo samo izključno štirištevne, petštevne ali šestštevne povezanosti, ampak lahko zavzamejo različne Slika 4: 2D citoskelet na povečanem delu membrane [11]. Vidimo lahko heksagonalno mrežo preko sidrišč na celično membrano pripetega spektrina. konfiguracije po prostoru, kjer se razpredajo. Vendar postajajo stanja z višjim številom povezav na vozlišče čedalje težje dosegljiva, saj se mora na manjšem prostoru urediti večje število filamentov. Hkrati se moramo zavedati, da vezi niso trajne in čim večje je število povezav na sidrišče, tem večja je verjetnost, da se bo kakšna vez razgradila ali preuredila. Tako lahko pogledamo, kakšne so lastnosti pravilnih kvadratnih in heksagonalnih mrež, nato pa primerjamo napovedane rezultate z izmerjenimi in ugotovimo, kolikšno je odstopanje od idealne mreže. Rezultati računa za šestštevne mreže nam dajo naslednje elastične konstante [1] K A = µ = 3ksp 2 3ksp 4 ( 1 τ ), (7) 3ksp ( ) 3τ 1 +. (8) K A je kompresijski modul, µ je strižni modul in k sp je konstanta vzmeti iz enačbe (5). Učinek predobremenitve z izotropno dvodimenzionalno napetostjo τ opisujeta izraza v oklepajih v enačbah (7) in (8) [1]. Pri izračunu entalpije heksagonalne mreže ugotovimo, da se pri kompresijskem tlaku, večjem od τ coll = 3k sp /8, mreža sesede in postane njena površina enaka 0. Do kolapsa pride, ker je energijsko ugodneje utrpeti malo večjo deformacijo vzmeti, kot pa izpostavljati površino veliki površinski napetosti [1]. Kvadratna mreža ima 3 elastične konstante: K A je znova kompresijski modul, µ s in µ p pa sta strižna modula obeh možnih načinov striga za kvadratno mrežo. Rezultati, ki vključujejo tudi predobremenjeno strukturo, so: K A = k sp τ 2 6 k sp,
3 MREŽNE STRUKTURE CITOSKELETA µ p = k sp + τ, (9) 2 µ s = τ. Pri kvadratnih mrežah je zanimivo, da pride do kolapsa mreže takoj, ko mrežo predobremenimo s kompresijsko silo τ coll < 0. Do tega pride zato, ker se lahko kvadratna mreža poklopi v kolinearno obliko brez spremembe dolžine katere koli izmed vzmeti. V resnici seveda nimamo pravilnih mrežnih struktur. Tudi razmiki med sidrišči in dolžine veznih filamentov niso fiksni. Lahko pa izmerimo razmerja med elastičnimi konstantami in jih primerjamo z izračunanimi. Tako hitro vidimo, ali se vrednosti nahajajo v območjih, ki jih taka obravnava napove. Meritve membranske elastičnosti Osnovno vprašanje je, ali lahko z eksperimentom dokažemo prisotnost membranskega citoskeleta. Elastične lastnosti membran bi lahko pripisali zgolj lipidnemu dvosloju, ki sestavlja celično membrano. Izračuni [8] so reproducirali večino oblik, ki jih v normalnih pogojih zavzame eritrocit. Takšna preprosta teorija pa vendarle ne more pojasniti pojava izrastkov (spikul) na membrani, kar je tudi neposredni dokaz dvodimenzionalnega citoskeleta [10]. V eksperimentu so eritrocit, ki je velik okoli 8 µm, deformirali s spreminjanjem medija, v katerem se nahaja. Tako so s spreminjanjem ph, slanosti, koncentracije holesterola in podobnega dosegli, da se je celica najprej raztezala, nato pa krčila. Teoretične napovedi oblik eritrocita, zasnovane na modelu, ki vključuje tako upogibno elastičnost dvosloja kot elastomehaniko membranskega skeleta, se popolnoma ujemajo z eksperimentalno opaženimi oblikami (slika 5) [10]. Citoskelet v tem primeru nudi dodatno togost in strižno elastičnost ter prepreči, da bi se membrana razletela [10]. Dve skupini sta računalniško modelirali velike in majhne deformacije membranskega citoskeleta človeškega eritrocita [8,9]. Prva skupina je izhajala iz teorije, ki smo jo povzeli v prejšnjem poglavju, in dobro reproducirala meritve, dokler niso prišli v režime zelo velikih raztezkov. Takrat niso opazili ne kolapsa ne pričakovanega razmerja med elastičnima moduloma kompresije in striga [8]. Slika 5: Levo so prikazane dejansko opažene ehinocitne oblike eritrocita, desno pa simulirane oblike z modelom, ki poleg upogibnosti lipidnega dvosloja vključuje še membranski citoskelet [10]. Zelo značilni so izrastki na izbočenem eritrocitu (ehinocitu), ki jih lahko reproduciramo samo z upoštevanjem citoskeleta. Brez citoskeleta bi se bilo izrastkom energijsko ugodneje odcepiti in tvoriti vesikel. 7
3 MREŽNE STRUKTURE CITOSKELETA Druga skupina je spektrinske filamente modelirana z bolj realističnim modelom. Njihove numerične simulacije so pokazale dobro ujemanje s podatki (slika 6), kjer so modelirali tri različne začetne pogoje [9]. Napovedali so rahlo anizotropijo, ki izvira iz predpisanih pritrdišč na membrani [9]. Vendar pa njihove napovedi za velike raztezke izpodbijajo direktne fluorescentne mikroskopske meritve. Razliko pripisujejo dejstvu, da večina eksperimentov poteka in vitro, ne in vivo. Upoštevati je potrebno, da se živa celica na zunanje obremenitve odzove [8,9]. Elastične lastnosti membranskega citoskeleta so opazovali tudi preko termičnih fluktuacij celične membrane [1]. Mikroskopske metode dajo rezultate, ki so za velikostni red manjši kot pri mikromanipulativnih eksperimentih. Ni popolnoma jasno, zakaj pride do tako velike razlike pri teh dveh tehnikah. Možno pa je tudi, da se lastnosti citoskeleta znatno spremenijo v interakciji z mikropipeto ali lasersko pinceto [1]. Za predstavo navedimo, da je pri mikromanipulativnih metodah vrednost strižnega modula okoli 5 10 6 J/m 2, kompresijski modul pa je približno dvakrat večji. Izveden je bil še en zelo zanimiv eksperiment, kjer so s kemijskimi spojinami poizkušali uničiti aktinski citoskelet v fibroblastih [12]. Ugotovili so, da se citoskeletna struktura razgradi v prisotnosti citohalasina D. Z meritvami so nato opazovali mehanske lastnosti fibroblastov z uničenim citoskeletom [12]. Še ena dodatna anomalija, ki potrebuje razjasnitev, je temperaturni odziv spektrinskega citoskeleta. Tudi to področje še raziskujejo, saj bi se moral modul pri spektrinu, če je res entropijska vzmet, povečati za 13% na temperaturnem porastu iz 5-45 C. Zgodi pa se, da prožnostni Slika 6: Na ordinati je razmerje med dolžino vsesane membrane L in polmerom mikropipete R p. Na abscisi odberemo aspiracijski tlak. Točke označene s križci, kvadratki in krogci, so modelirane vrednosti za tri različne modele membranskega citoskeleta. Pri malih deformacijah te vrednosti dobro sovpadajo z meritvami, ki jih prikazujejo sivi trikotniki [9]. modul pade za 30%. Možno je, da se pri tem pojavu zaradi neznanega razloga razklene število povezanih sidrišč, kar bi ustrezalo znižanju strižnega modula brez kršitve entropijske narave prožnosti [1]. Omenimo še, da lahko v lasnih celicah opazimo anizotropijo, ker ima celica aktinske filamente, ki jo ovijajo v eni smeri, prečno pa za povezanost aktinov skrbijo spektrini, ki imajo drugačne elastične lastnosti. Razliko v elastičnosti glede na smer deformacije so tudi v resnici izmerili [1]. Prostorski citoskelet Ko preidemo na obravnavo trirazsežnih mrež, se matematični formalizem bistveno ne spremeni. V splošnem lahko rečemo, da imamo po celotnem volumnu celice sidrišča in citoskeletne filamente, ki se nanje pripnejo. Potem lahko znova izračunamo 8
3 MREŽNE STRUKTURE CITOSKELETA elastične konstante, ki jih bo v treh dimenzijah še več kot prej, in jih primerjamo z izmerjenimi rezultati. V resnici celica v svoji notranjosti ni tako homogena kot celična membrana. Zato je takšna obravnava sicer mogoča, vendar ne nujno najbolj realna [1]. Primerov, kjer bi bila celica volumsko tako homogena in izotropna, da bi lahko shajali samo s kompresijskim in strižnim modulom, praktično ni. Vedno imamo večje število elastičnih konstant, ki nakazujejo na notranjo strukturiranost celice, ki presega preprosto mrežno interpretacijo [1]. Predstavljamo si lahko, da imamo po citoplazmi prosto plavajoče filamente. Poleg mikrotubulov, ki so praviloma zelo veliki citoskeletni filamenti, imamo lahko tudi manjše trdne paličice, ki lahko dajo citoplazmi nematski tekočekristalni značaj. To se zgodi, ko se dva aktina povežeta preko prečnih proteinov s kovalentnimi vezmi, ki dajejo takemu paru prečno trdnost. Takšni proteini so recimo fimbrin, aktinin in filaminski dimer. Količina, ki pove, kdaj moramo obravnavati citoskelet v celici kot mrežo in kdaj kot raztopino ali drugačno mikrostrukturno tvorbo, je perkolacijski prag (slika 7). Načeloma potrebujemo za tvorbo 3D mreže v celici zadostno število citoskeletnih filamentov, da se bodo lahko povezali v mrežo, ki bo prepredala celotno celico. Z manjšanjem gostote filamentov v nekem trenutku preidemo v režim, ko se citoskelet ni več Slika 7: Prag perkolacije nam pove, koliko črnih kvadratkov potrebujemo, da bomo pri naključnem razporejanju neizbežno povezali stranice območja z neprekinjeno gručo [13]. sposoben povezati v trdno strukturo. Tej točki pravimo prag perkolacije [1]. Razjasnimo, kaj je perkolacija. Predstavljajmo si kvadratno mrežo s 5 5 vozlišči. Če imamo na voljo samo 8 vezi, ni samoumevno, da se bodo povezale v gručo, ki se bo razprostirala med koncema kvadrata. Lahko imamo nekaj ločenih povezanih območij, vendar takšna struktura ni trdna. Pri šestnajstih vezeh neizogibno dobimo neprekinjeno mrežo, ki se bo razprostirala med robovi območja. Pravimo, da smo dosegli prag perkulacije [13]. Delež izmed vseh možnih povezav, ki ga potrebujemo za trdno povezano strukturo, je odvisen od simetrije mreže. Rezultati so povzeti v tabeli 2. Perkolacijo v celici lahko ocenimo, če izmerimo maso vseh filamentov, ki se nahajajo v celici. Te meritve so bile opravljene in postavljajo večino celic v območje polkoncentrirane raztopine filamentov [1]. V tem režimu je prag perkolacije sicer lahko dosežen, je pa težko ugoditi strožji zahtevi za perkolacijo trdnosti. Perkolacija trdnosti nam pove, kdaj bo mreža toliko povezana, da bo tvorila trdno strukturo. Tako lahko celice obravnavamo kot skupek prepletenih filamentov, ki izkazuje viskoelastične lastnosti [1,14]. Do viskoelastičnega obnašanja pride, če imamo prepletene, vendar ne vezane polimere. Pri velikih frekvencah se polimeri med sebojno odrivajo in ustvarjajo silo kot odgovor na deformacijo. Če pa je obremenitev dolgotrajna, se že uspejo raz- 9
3 MREŽNE STRUKTURE CITOSKELETA mreža z p c (vezi) p c (mest) P (vezi) dve dimenziji satovje 3 0.653 0.696 1 kvadratna 4 0.500 0.593 1 trikotna 6 0.347 0.500 2/3 tri dimenzije SC 6 0.249 0.312 1 BCC 8 0.180 0.246 3/4 FCC 12 0.119 0.198 1/2 Tabela 2: Potreben delež zasedenih vezi ali sidrišč v posameznih simetrijah, da dosežemo perkolacijski prag [1]. P je perkolacijski prag trdnosti in je dosti strožja zahteva od enostavne povezanosti. plesti in počasi zrelaksirajo v novo ravnovesno stanje in sila izgine. Matematični opis viskoelastičnosti poteka preko konstitutivne zveze σ xy = G (ω)u xy (t) + G (ω) du xy 1 dt ω, (10) kjer sta G in G realna oziroma imaginarna komponenta strižnega modula. Oglejmo si dve limiti. Recimo, da sistem nima nobenih izgub (G = 0). Tedaj je napetost direktno sorazmerna z odmikom in imamo elastični odziv snovi. V kolikor pa se v sistemu energija le disipira (G = 0), prepoznamo v preostanku enačbe Newtonov zakon za viskozno tekočino σ xy = η(du xy /dt), kjer η predstavlja ravno viskoznost. Torej predstavlja G /ω od frekvence odvisno dinamično viskoznost [1,14]. V resnici so izmerili, da večina celic leži v polrazredčenem režimu, kjer je že mogoče opaziti nekatere viskoelastične značilnosti. V primeru redkih in koncentriranih raztopin G narašča s frekvenco, kot bi to pričakovali. Pri polrazredčenih polimerih pa v režimu srednjih frekvenc lahko opazimo plato, kjer se strižni modul s frekvenco ne spreminja [1]. Ugibamo lahko, da se v tem režimu polimeri uspejo preplesti do mere, da se obnašajo, kot bi bili sklenjeni in tvorili mrežo. V primerjavi z eksperimentalnimi podatki lahko nato sklepamo na stopnjo razredčenosti filamentov v celicah, ki jo lahko preverimo z meritvami gostote citoskeletnih filamentov. Meritve kažejo, da se določene celice dejansko obnašajo, kot bi vsebovale raztopino polimerov. Spet druge dominirajo s svojo mrežno strukturo ali se obnašajo tako kompleksno, da jih s tem modelom ne moremo zajeti [1,14]. Z razvojem mikromanipulativnih tehnologij smo dobili veliko načinov pridobivanja informacij mehanskih lastnostih celice [14]. Mehanski model celice, ki smo ga predstavili v prejšnjih poglavjih, se je pretežno naslanjal na aspiracijsko metodo, lahko pa ga uspešno uporabimo tudi za razlago nekaterih drugih eksperimentalnih metod. Slika 8 prikazuje še dve možni eksperimentalni postavitvi, katerih rezultate prav tako lahko opišemo z elastično teorijo citoskeletnih filamentov, vendar pa ne manjka merskih metod, pri katerih se celice obnašajo tudi drugače [14]. Celice se na zunanje dražljaje odzivajo zelo različno. Veliko število uporabljenih modelov [14] nakazuje, da je razumevanje mehanike celice še vedno na fenome- 10
4 SKLEP (a) (b) (c) Slika 8: Aspiracijska metoda uporablja sesalni tlak za pridobivanje podatkov (a). Mehanske lastnosti celice lahko opazujemo tudi pri obtekanju celice z viskozno tekočino (b). Če na aktivna mesta celične membrane pripnemo dva delca, ju lahko manipuliramo z optičnima pincetama (c) [14]. nološkem nivoju. Obstajajo poizkusi opisa celičnega citoskeleta z modelom prednapete strukture. V tem modelu predpostavimo, da mikrotubuli prenašajo kompresijske sile, aktin in drugi bolj gibki citoskeletni filamenti pa natezne sile [15,16]. Slika 9: Mikrotubuli prenašajo kompresijske sile celičnega citoskeleta, bolj gibki filamenti pa natezne sile [16]. Pri razgradnji mikrotubula se zaradi prednapete strukture posledice vidijo tudi na ekstracelularnem matriksu. Model s prednapeto strukturo je diskreten in zahteva malo težjo matematiko. Vseeno lahko o njegovi veljavnosti odločamo na podlagi treh preprostih kriterijev. Celica se mora obnašati kot diskretna mehanska struktura in ne kot preprost kontinuum. Poleg tega mora biti prednapetost pomembna za deformabilnost celice. Naposled morajo mikrotubuli delovati proti zunajceličnemu matriksu, ki poskrbi za mehanično obremenitev celice [16]. To hkrati tudi pomeni, da se morajo celice na lokalno razgradnjo citoskeletnih filamentov odzvati na skali, ki presega takojšnjo okolico razkroja. Takšno obnašanje v celicah resnično opazimo (slika 9) [15,16]. Večina eksperimentov se izvaja in vitro, zato ne moremo vedeti, kako bi se odzivala živa celica. Z mikropipetno aspiracijo so izvedli tudi in vivo poizkuse in dobili zanimive rezultate [17]. Nevtrofilne celice so se obnašale po modelu membranskega citoskeleta s prenapetostjo τ = 30 pn/m 2 in viskoelastično notranjostjo z viskoznostjo η = 100 Pas. Po drugi strani pa so se endotelijske celice obnašale popolnoma elastično s kompresijskim modulom K A = 500 pn/µm 2 [17]. 4 Sklep Trenutno se na področju mehanike celic nadaljuje živahno raziskovanje lastnosti citoskeletnih filamentov [15,16]. Konkretno so raziskovali sidranje in zamreževanje aktina, od koder poizkušajo napovedati tudi in vivo elastične lastnosti citoskeletnih 11
4 SKLEP filamentov in njihovih struktur [18]. Še bolj aktualni temi pa sta motilnost ali gibljivost celic in mehanotransdukcija [14,19]. Na področju gibanja celic poizkušajo odkriti mehanizme premikanja. Aktinski citoskelet je zanimiv, ker pri določeni gostoti prečnih povezav pri gibanju aktivno sodelujejo miozinski II motorji, ki jih najdemo v mišičnih tkivih (slika 10). Ti pretvarjajo energijo, ki jo dobijo z razgradnjo ATP molekul, in povlečejo skupaj dva aktinska citoskeletna filamenta, katerih se držijo, posredno pa lahko vplivajo tudi na vozlišča [19]. Da gibanje dejansko povzročajo miozinski motorji, so potrdili z njihovo inhibicijo. Če so v citoplazmo dodali molekule, ki onemogočijo delovanje miozinskih motorjev, dejansko ni prišlo do krčenja. V kolikor pa so njihovo koncentracijo povečali, so opazili hitrejše krčenje. Za predstavo povejmo, da govorimo o silah reda 100 pn na posamezen filament aktina [19]. Slika 10: Bele puščice prikazujejo gibanje markiranih mest na membrani po aktivaciji miozinskih II motorjev [19]. Rdeča puščica nakazuje točko, proti kateri poteka krčenje. Raziskuje se tudi gibanje celic zaradi polimerizacije in razkroja aktina. Celice se premikajo s spreminjanjem svojega citoskeleta. To poteka preko polimerizacije, torej podaljševanjem obstoječih in ustvarjanjem novih citoske-letnih filamentov, oziroma razkroja odsluženih [20,21]. Še eno področje raziskav je stabilnost citoskeletnih struktur. Ko postavimo celice v širši okvir s svojo okolico, moramo obravnavati vlogo zunajceličnega matriksa, ki prilagaja svojo strukturo in obliko delovanju celice. Celica deluje na zunajcelični matriks preko aktina. Zanima nas, kako vpliva na stabilnost citoskeleta razkroj posameznih aktinskih filamentov v strukturi. Posledice takšnega trganja citoskeletnih filamentov so študirali z lasersko pinceto [22], kjer so z zelo ostro fokusiranim snopom v pulznem delovanju hitro segreli material v gorišču. Posledice so opazovali z mikroskopom, še prej pa so preko aktivnih mest na citoskelet nanesli barvila [22]. Opazili so, da se kažejo posledice razkroja posameznega citoskeletnega filamenta zelo daleč od njegove dejanske lege [15,16,22]. Če celotno prizadevanje raziskovalcev povzamemo z eno besedo, lahko rečemo, da vsi skupaj raziskujejo mehanotransdukcijo [14]. Potrebno je umestiti celico v kontekst tkiva in ugotoviti, kako globalni pojavi vplivajo na njeno sintezo spojin in premikanje. Citoskelet tako lahko razumemo tudi kot sredstvo sporazumevanja med celicami, saj si lahko preko mehanske napetosti pošiljajo signale. Cilj je razumeti, kako se celice obnašajo v svojem delovnem okolju. Ker večine podatkov ne moremo pridobiti na živih celicah, je ta naloga kar precejšen izziv. Pri študiju citoskeleta zato ne smemo pozabiti, da ta ni zgolj neživa komponenta celic, temveč igra svojo vlogo v celičnem življenju. Zato ga ne moremo obravnavati 12
LITERATURA LITERATURA kot vnaprej določeno strukturo, ampak moramo njegove mehanske lastnosti vedno povezovati z okolico ter funkcijo celice. Literatura [1] D. Boal, Mechanics of the Cell (Cambridge Univarsity Press, Cambridge, 2002). [2] http://imcurious.wikispaces.com/midterm+exam+2010+review+p2 [3] http://tutorvista.com/content/biology/biology-iii/cellorganization/nonmembranous-cell-organelles.php [4] L. D. Landau in E. M. Lifshitz, Theory of Elasticity (Pergamon Press, Oxford, 1986). [5] L. D. Landau in E. M. Lifshitz, Statistical Physics (Pergamon Press, Oxford, 1980). [6] M. Elbaum, D. K. Fygenson in A. Libchaber, Phys. Rev. Lett. 76, 4078 (1996). [7] D. Riveline, C. H. Wiggins, R. E. Goldstein in A. Ott, Phys. Rev. E 56, R1330 (1997). [8] S. K. Boey, D. H. Boal in D. E. Discher, Biophys. J. 75, 1573 (1998). [9] D. E. Discher, D. H. Boal in S. K. Boey, Biophys. J. 75, 1584 (1998). [10] G. H. W. Lim, M. Wortis in R. Mukhopadhyay, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 16766 (2002). [11] http://www.coe.drexel.edu/ret/personalities/2005/ziegler/researchfocus.html [12] C.Rotsch in M. Radmacher, Biophys. J. 78, 520 (2000). [13] D. Stauffer, Introduction to percolation theory (Taylor & Francis, London, 1985). [14] C. T. Lim, E. H. Zhoua in S. T. Quekb, J. Biomech. 39, 573 (2006). [15] N. Wang, K. Naruse, D. Stamenovic, J. J. Fredberg, S. M. Mijailovich, I. M. Tolic- Norrelykke, T. Polte, R. Mannix in D. E. Ingber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 7769 (2001). [16] D. E. Ingber, J. Cell. Sci. 116, 1158 (2003). [17] R. M. Hochmuth, J. Biomech 33, 15 (2000). [18] M. Bathe, C. Heussinger, M. M. A. E. Claessens, A. R. Bausch in E. Frey, Biophys. J. 94, 2955 (2008). [19] P. M. Bendix, G. H. Koenderink, D. Cuvelier, Z. Dogic, B. N. Koeleman, W. M. Brieher, C. M. Field, L. Mahadevan in D. A. Weitz, Biophys. J. 94, 3126 (2008). [20] A. Mogilner in L. Edelstein-Keshet, Biophys. J. 83, 1237 (2002). [21] T. D. Pollard in G. G. Borisy, Cell 112, 453 (2003). [22] S. Kumar, I. Z. Maxwell, A. Heisterkamp, T. R. Polte, T. P. Lele, M. Salanga, E. Mazur in D. E. Ingber, Biophys. J. 90, 3762 (2006). 13