Tkii Toksini u vodi dr Siniša Markov WW2014 Kvalitet voda 02-05.09. Novi Sad
toksične i opasne materije abiotičkog porekla - (ne)svesna ljudska aktivnost Biotoksini??? Da li je prisustvo CIJANOBAKTERIJA I CIJANOTOKSINA iznenađujuća informacija ili...?
Poređenje toksičnosti raznih biotoksina (Falconer i sar. 1999) Toksin Vrsta- producent Letalna doza (LD50)* BOTULINUM Clostridium botulinum (bakterija) 0,00003 TETANUS Clostridium tetani (bakterija) 0,0001 RICIN Ricinus communis (biljka) 0,02 DIPHTHERIA Corynebacterium diphtheriae (bakterija) 03 0,3 TOXIN KOKI TOXIN Phyllobates bicolor (žaba) 2,7 TETRODOTOXIN Sphaeroides rubripes (riba) 8 SAXITOXIN Aphanizomenon flos-aquae (cijanobakterija) 9 COBRA TOXIN Naja naja (kobra) 20 NODULARIN Nodularia spumigena (cijanobakterija) 30-50 MICROCYSTIN-LR Microcystis aeruginosa (cijanobakterija) 50 ANATOXIN-a Anabaena flos-aquae (cijanobakterija) 200 MICROCYSTIN-RR Microcystis aeruginosa (cijanobakterija) 300-600 CURARE Chrondodendron tomentosum (brazilska biljka) 500 STRYCHNINE Strychnos nux-vomica (biljka) 500 AMATOXIN Amanita phalloides (gljiva) 600 MUSCARIN Amanita muscaria (gljiva) 1100 PHALLATOXIN Amanita phalloides (gljiva) 1800 GLENODIN TOXIN Peridinium polonicum (dinoflagelatna alga) 2500 SODIUM CYANIDE 10000
Cijanobakterije i cijanotoksini, dr Jelica Simeunović, docent
Da li je organizatorima WW ovaj problem nov? U odrastanju do punoletstva pažnja posvećena ovom pitanju? 2. DEO: MIKROBIOLOŠKI PARAMETRI KVALITETA VODE ZA PIĆE Prof. dr Olgica Petrović ALGE I CIJANOBAKTERIJE KAO POKAZATELJI KVALITETA VODE ZA PIĆE 2 DEO SMERNICE ZA ZDRAVSTVENO BEZBEDNU VODU ZA PIĆE PRIRODNE ORGANSKE MATERIJE U VODI 2.2. BIOLOŠKI PROCESI I PRIRODNE ORGANSKE MATERIJE
Pravi fosilni ostaci najnaprednih bakterija i danas su živi organizmi na nekoliko lokacija na planeti i koje su nazvane CYANOBACTERIE, a njihovi fosilni ostaci su STROMATOLITI.
Ovi organizmi (CYANOBACTERIE) su dominirajući oblik života U NAREDNIH SKORO preko 2000 miliona godina, I ONE SU U TOM PERIODU SAMO PROKARIOTSKOG TIPA Oni su strpljivi tvorci kiseonika i njegovo pojavljivanje u ogromnim količinama u tadašnjoj zemljinoj atmosferi, jednom od najbitnijih preduslova za početak opšteg bujanje života.
Život je nastao u vodi i u današnje vreme većina najznačajnijih pojava se odigrava (brže ili sporije) u ovoj sredini originalno su to mora i okeani, ali ne manje bitne su promene u rekama i potocima, prirodnim jezerima, rezervoarima, barama (registruju se promene i u podzemnim vodama, ledu, hidrotermalnim izvorima i dr.) pojave tj. promene (ako nema nikakve druge ono bar kruženje elemenata u prirodi) u vodenim sistemima se mogu registrovati na osnovu fizičko-hemijskih i bioloških mikrobioloških parametara (kvalitativni i kvantitativni pokazatelji
Šta su cijanobakterije? Cijanobakterije su nazivane, a i danas je taj termin u upotrebi - modro-zelene alge usled sličnosti sa zelenim algama po morfologiji, staništu i fotosintetskim mogućnostima (Cyanobacteriophyta) u današnjem vremenu poznato nam je oko 2000 vrsta i većina su ubikvitarni it i organizmi; i neke su i ekstremofili (od -190 do +70 C) BIOLOŠKA KLASIFIKACIJA Kriterijumi podele - velika raznovrsnost oblika i veličine, kao i načina razmnožavanja razvrstane u 150 rodova, tj. 5 redova MIKROBIOLOŠKA KLASIFIKACIJA Po Bergey-u: Phylum BX: Cyanobacteria; Eubacteria, gramnegativne
red Karakteristike predstavnici (rodovi) Chroo- Kokoidne ćelije koje se Aphanocapsa, Aphanothece, Gloeococcales razmnožavaju binarnom fisijom ili pupljenjem capsa, Merismopedia, Microcystis, Synechococcus, Synechocystis Pleuro- Kokoidne ćelije, agregati ili Chroococcidiopsis, i Pleurocapsa capsales pseudofilamenti koji se razmnožavaju beocitama (endospore) Oscillatoriales Pravi filamenti bez heterocisti ili Lyngbya, Leptolyngbya, Microcoleus, akineta Oscillatoria, Phormidium, Planktothrix Nostocales Filamentozne, koje se dele u jednoj ravni, sa heterocistama; lažno grananje kod nekih Anabaena, Aphanizomenon, Calothrix, Cylindrospermopsis, Nostoc, Scytonema, Tolypothrix rodova kao što je Scytonema Stigonema Deljenje u više ravni; pravo Mastigocladus (Fischerella), tales grananje i raznovrsni filamenti; heterociste Stigonema
Ekološka podela cijanobakterija 3 glavne grupe u vodenim sredinama: -stvaraju prevlake (navlake), u vidu perifitnog biofilma na kamenju, sedimentima i submerznim biljkama - izazivaju i cvetanje javlja se niz problema za kvalitet t vode; uglavnom prisutne u eutrofičnim (nutrijentima bogatim) jezerima - pikocijanobakterije izuzetno sitne (<3 mm prečnik), često prisutne u bistrim jezerima - kolonijske koje ne izazivaju cvetanje u različitim vodenim sredinama mezotrofna jezera,... - metafitne vrste - stvaraju agregate koje su slabim vezama povezane sa makrofitama
građa ćelije cijanobakterija hromatoplazma ćelijski zid centroplazma (nukleoplazma)
ĆELIJSKI ZID uglavnom višeslojna struktura - L1 unutrašnji mekani sloj - L2 je rigidni sloj sastavljen od mureina - L3 i L4 spoljašnji elastični slojevi načinjeni od lipopolisaharida - po strukturi je veoma sličan građi ćelijskog zida Gr (-) bakterija u ćelijskom zidu se nalaze pore (70 nm) kroz koje prolaze plazmodezme i kroz koje se luče sluzni ili galertni omotači - Sluzavi omotači zaštita od isušivanja, puzeće kretanje
HROMATOPLAZMA hroma (grč. boja) periferni deo citoplazme sa fotosintetičkim pigmentima koji su povezani sa tilakoidima (grč. tilakoides - meškolik) invaginacija plazmaleme fotosintetički aparat sadrži oko 30 pigmenata; osnovni pigment - hlorofil a; tzv. pomoćni pigmenti - karotenoidni pigmenti u tilakoidu (β-karoten i zeaksantin), zatim fikobilini (C-fikocijanin, alofikocijanin i C-fikoeritrin) fikobilizomi koji su pričvršćeni na površini tilakoida
Boja cijanobakterija - Boja u masi zavisi od zastupljenosti fikobilinskih pigmenata - fikocijanin + hlorofil modrozelena boja - različiti odnosi fikocijanina i fikoeritrina od purpurne p do crvene boje - crna boja usled absorpcije skoro celog vidljivog spektra od strane pigmenata - Boja zavisi od uslova spoljašnje sredine hromatska adaptacija
CITOPLAZMATSKE INKLUZIJE CIJANOBAKTERIJA Rezervne supstance -zrnca cijanoficinskog skroba - α-1-4 glukan ne daje bojenu reakciju sa jodom -cijanoficinska zrnca velike granule u blizini ćelijskog zida kod končastih oblika; složeni polimer amino kiselina arginina i asparagina rezerve azota, rast u vodama bez azota Polifosfatne granule (volutin) - visokopolimerizovan fosfat; rezerve fosfora, rastu u vodama bez fosfora -Poli-β-hidroksibutirat β rezerve ugljenika i energije kod nekih
Gasne vakuole - šuplji proteinski cilidri sa koničnim krajevima ispunjeni gasom reguliše gustinu ćelija što omogućava promenu položaja u vodenom ekosistemu - malo svetla više gasnih vakuola talus bliže ili na samoj površini - u svetlom sloju više fotosinteze šećeri -negativan osmotski pritisak - voda ulazi u ćeliju, povećanje hidrostatičkog pritiska - Visok hidrostatički pritisak kolaps gasnih vakuola alge tonu
NUKLEOPLAZMA (centroplazma)- hijaloplazma i fibrile DNK, nema jedrove membrane, nema jedarca, hromozoma ni jedrovog vretena - multiple, tzv back-up kopije bakterijskog hromozama (6 ili više)
Vodena staništa cijanobakterija prirodni BIOREAKTORI Za rast i razmnožavanje mikroorganizama i u njemu potrebno je sagledati: - karakteristike mikroorganizama - uslove sredine Cijanobakterije su fotoautotrofni mikroorganizmi fotoliza vode (retko koriste H 2 S) i oslobađaju kiseonik; neke mogu biti miksotrofi; - Mada su aerobi, neke su tolerantne na niske koncentracije O 2 i više koncentracije H 2 S koje bi bile toksične za alge; ova tolerancija im omogućava preživljavanje u anoksičnom i eutrofičnom sedimentu jezera - jedini fotoautotrofni organizmi koji mogu da fiksiraju azot
Cijanobakterije su visoko tolerantne na UV zračenje razvile su različite strategije, t a od opštih treba podsetiti da sadrže karotenoide, tj. hvatače reaktivnih kiseoničnih radikalskih vrsta, enzime (kao što su superoksid dismutaze) i proteine za reparaciju nakon UV oštećenja -odnos prema temperaturi naginju višim temperaturama, kako po minimalnoj tako i po optimalnoj (grupa koja izaziva cvetanje preferira temperature iznad 15 C) - odnos prema ph: u principu pogodnije su im alkalnije sredine; tokom cvetanja ph se može povećati iznad 9 (u takvoj sredini većina neorganskog ugljenika je u obliku karbonata i nije dostupan brojnim algama) - osmofilnost je prisutna kod nekih vrsta
- neke cijanobakterijske vrste imaju sposobnost azotofiksacije što ima daje kompetitivnu prednost u sredinama sa niskom koncentracijom nitrata i amonijaka, pa na taj način obogaćuju takve vodene sredine sa azotom -ako su u bioreaktoru ispunjeni abiotiči i biotički uslovi nema razloga da ne dođe do rasta i razmnožavanja može se posmatrati kao obična prirodna pojava međutim ubrzan stepen reprodukcije rezultuje sa drastičnim povećanjem ukupne biomase poznate pod nazivom cvetanje vode (uslovni kriterijum koncentracija ćelija veća od 10.000 u mililitru vode)
izraženo cijanobakterijsko cvetanje se definiše kao opasno algalno l cvetanje (eng. harmful algal l blooms -HABs) ukoliko je povezano sa negativnim posledicama po okolinu, kao što su mortalitet živog sveta, smanjenje submerzne akvatične vegetacije, poremećaj stabilnosti ekosistema, negativan uticaj na lance ishrane, produkciju veoma aktivnih toksičnih supstanci i dr. -cijanobakterije ne mogu dugo da održe ekstremno visok nivo razvoja populacije već ono traje određeno vreme (1-2 nedelje) pa počinju ubrzano da odumiru - međutim, pojava novog cvetanja u istoj vodenoj sredini se može ubrzo opet desiti ukoliko su prisutni uslovi koji to omogućavaju (sukcesivna cvetanja su vrlo česta pojava )
ne postoji jedan, ključni faktor koji doprinosi ovoj pojavi prvi uslov je da izvora bitnih elemenata za ćeliju j mora biti u dovoljnoj j količini to se pre svega odnosi na P: koncentracije fosfora veće od 0,1 mgl -1 (30-100 μg L -1 ) dovoljne da izazovu pojavu cvetanja; sledeći je N - na proliferaciju cijanobakterija presudan uticaj ima odnos azota prema fosforu, odnosno nizak nivo N:P (<29:1) - visok ph and niska koncentracija CO 2 smatraju se važnim faktorima -u nekim slučajevima raspoloživost Fe se smatra ograničavajućim faktorom za cijanobakterijski razvoj - pored odgovarajućeg, visokog sadržaja nutrijenata u vodi, uticaj ima i spor protok vode i niska turbulencija koja omogućava održavanje ćelija na površini.
ovu prirodnu pojavu, koja je u direktnoj vezi sa eutrofikacijom (proces obogaćivanja vode nutrijentima) ti može značajno č da ubrza i doprinese većoj učestalosti, razvoj poljoprivrede i urbanizacija, kao i niz drugih pojava antropogenog porekla Šta su posledice ove pojave? (zadržaćemo se samo na vodosnabdevanju) - uticaj na neuspešnost procesa obrade sirove vode -rast ti razviće doprinose obogaćivanju vodene sredine sa produktima primarnog i sekundarnog metabolizma; nije ključno da li su produkti ekstracelularni, jer nakon odumiranja i intracelularni su u istoj sredini
nećemo se zadržavati na mogućnosti prisustva geosmina i 2-metil- izoborneola (miris zemlje i plesni), kao i na nekim fenolnim supstan- cama koje stvaraju miris hlorofenola nakon reakcije sa hlorom CIJANOTOKSINI - sve cijanobakterijske vrste koje učestvuju u pojavi cvetanja NISU producenti toksina (u 15.-tak rodova); čak k svi sojevi unutar vrste ne moraju biti toksikogeni, a među toksikogenim velike razlike u nivou produkcije ali i mogućnost produikcije više različitih formi i vrsta toksina
Osnovne grupe cijanobakterijskih toksina i njihovi izvori (Codd i sar., 2005) Broj Toksin strukturnih varijanti Struktura i aktivnost HEPATOTOKSINI Mikrocistini 71 ciklični heptapeptidi; hepatotoksični, inhibitori protein- fosfataza, promoteri tumora, narušavaju celovitost membrane i provodljivost Nodularini Cilindro spermo psini i 9 ciklični pentapeptidi; hepatotoksini, inhibitori proteinfosfataza, narušavaju celovitost membrane i provodljivost, promoteri tumora, karcinogeni 3 guanidni alkaloidi; izazivaju nekrotične povrede jetre (takođe đ bubrega, b slezine, pluća, ć creva), inhibitori sinteze proteina, genotoksični Toksični rodovi Microcystis, Anabaena, Nostoc, Aphanizomenon, Anabaenopsis, Planktothrix, Oscillatoria, Hapalosiphon Nodularia, Theonella (sunđer koji sadrži cijanobakterijske simbionte) Cylindrospermopsis, Aphanizomenon, Umezakia, Anabaena, Raphidiopsis
Toksin Broj strukturnih varijanti Struktura i aktivnost 5 alkaloidi; postsinaptički, depolarizirajući neuromuskulatorni blokatori Toksični rodovi Anabaena, Oscillatoria, Phormidium, Aphanizomenon, Rhaphidiopsis ksin-a) Anatoksin-a 1 estar guanidin metil fosfata; Anabaena (s) inhibitor acetilholinesteraze Saksitoksini 20 karbamat alkaloidi; Aphanizomenon, blokatori natrijumovih kanala Anabaena, Lyngbya, Planktothrix, Cylindrospermopsis 1 alkaloidi; inflamatorni agensi, aktivatori protein kinaze C Lyngbya, Schizothrix, Oscillatoria NEUROTOKSINI Anatoksin-a (uključujući homoanato- DERMATOTOKSINI I CITOTOKSINI Lingbiatoksin-a Aplazia- 2 alkaloidi; Lyngbya, Schizothrix, toksini inflamatorni agensi, aktivatori protein Oscillatoria kinaze C ENDOTOKSINI Lipopoli- nekoliko lipopolisaharidi; svi saharidi inflamatorni agensi, gastrointestinalni iritanti
Cijanotoksini i njihova akutna toksičnost (WHO, 1998) Cijanotoksin LD 50 čistog toksina Hepatotoksini 45-1000 μg/kg Mikrocistin-LR 60 (25-125) μg/kg Mikrocistin-YR 70 μg/kg Mikrocistin-RR 300-600 μg/kg Nodularin 30-50 μg/kg Neurotoksini i Anatoksin-a (alkaloid) 250 μg/kg Anatoksin-a (organofosfat) 40 μg/kg Saksitoksini 10-30 μg/kg Citotoksini Cilindrospermopsin 200 μg/kg/ posle 5-6d Internacionalna agencija za istraživanje kancera (IARC) toksin MCYST-LR klasifikuje u 2B grupu supstanci (moguće karcinogene supstance za čoveka)
Procentualna zastupljenost toksičnih cijanobakterija u uzorcima vode Zemlja Broj analiziranih % uzoraka sa toksičnim uzoraka cijanobakterijama Engleska 78 70 Finska 188 44 Holandija 29 79 Mađarska 35 82 Nemačka 80 90 Danska 96 72
Najveće detektovane (HPLC metoda) koncentracije cijanotoksina u vodenim sredinama sa cvetanjem Toksin Koncentracija (μgg-1 suve mase) Lokalitet mikrocistin 7.300 Kina i Portugalija nodularin 18.000 Baltičko more cilindrospermopsin 5.500 Australija anatoksin-a 4.400 Finska saksitoksin 3.300300 Australija anatoksin a (s) 3.300 SAD
Analitičke metode za detekciju cijanotoksina (Boyer i Dyble, 2007) Opšte (lumpers) metode MIKROCISTINI bioeseji (npr. miševi, A. salina) PPIA ELISA CILINDROSPERMOPSIN bioeseji ELISA ANATOKSIN-A bioeseji ELISA PST toksini bioeseji ELISA Posebne (splitters) metode HPLC-PDA LC-MS (/MS) HPLC-PDA LCMS HPLC-FD LC-MS HPLC-FD LC-MS
komercijalni standardi cilindrospermopsina, nekih mikrocistina, nodularina, anatoxin-a, i saksitoksina
HRA-Procena zdravstvenog rizika (Health Risk Assessment) razvijen je od strane Američke Nacionalne naučne akademije, a prihvaćen je i primenjen i u Australiji 1. Identifikacija opasnosti podrazumeva procenu za cijanobakte- rije da izazivaju po zdravlje negativne efekte i određivanje nivoa ćelija i toksina prisutnih u vodi; 2. Izlaganje riziku podrazumeva određivanje mogućnosti i načina izlaganja ljudi kontaminiranoj vodi; 3. Rizične doze kada su vode za rekreaciju i pijaće vode u pitanju ne postoje standardi za većinu cijanobakterijskih vrsta i njihovih toksina, što predstavlja otežavajuću okolnost u proceni zdravstvenog rizika. Procena rizičnih doza je posebno korisna u određivanju najvišeg nivoa izlaganja pri kojem se ne javljaju po zdravlje negativni efekti (kao što to čini npr. direktiva No Observable Effect Level- NOEL); 4. Karakterizacija rizika ukoliko rezultati monitoringa prevazilaze vrednosti date direktivom onda postoji povećan rizik za pojavu po zdravlje negativnih efekata.
Šema procena zdravstvenog rizika po HRA (preuzeto iz Australian Drinking Water Guidelineswww.nhmrc.health. gov.au/pdfcover/wat er.htm)
Rezime WHO direktive za cijanobakterije u vodama namenjenim za vodosnabdevanje (modifikovano Chorus i Bartram,1999) Nivo upozorenja Stanje gustina algalnih ćelija Aktivnosti opreznost 200 ćelija *necvetajući uslovi, cijanobakterije se detektuju u malom broju, (opasnost niskog stepena) 1 (opasnost srednjeg stepena) cijanobakte-rija ml -1 2.000 cijanobakterijskih ćelija j ml -1 ili 1 μgl -1 hlorofila a sa dominacijom cijanobakterija nedeljni monitoring *trend kretanja ka povećanom broju ili održavanju srednjeg broja cijanobakterija *voda može biti neupotrebljiva za piće bez predhodne obrade *u izvorima za vodosnabdevanje uvodi se testiranje toksina, naročito ukoliko su u uzorku najdominantnije poznate toksične vrste - ponavljati nedeljno analize *nizak rizik za iritaciju kože i gastrointestinalne probleme kroz kontakt tokom aktivnosti u vodi (plivanje idr.) *kontinuirano nedeljno određivanje brojnosti cijanobakterija i davanje izveštaja javnosti
nastavak Nivo upozorenja 2 (opasnost visokog stepena) Stanje gustina algalnih ćelija 100.000 cijanobakterijskih ćelija ml -1 ili 50 μgl -1 hlorofila a sa dominacijom cijanobakterija Aktivnosti *stalno visok broj potencijalno toksičnih cijanobakterija u vodi i/ili vidljivo lokalizovane formirane nakupine *voda može biti neupotrebljiva za piće bez predhodnog odgovarajućeg tretmana *uvodi se testiranje toksina i/ili vrši se nedeljno *ukoliko je mogućeć zameniti izvor snabdevanja vodom *nedeljno uzimanje uzoraka i određivanje broja cijanobakterija *povećan rizik od negativnih po zdravlje efekata kroz kontakt tokom aktivnosti u vodi *šire medijsko izveštavanje javnosti
UMESTO ZAKLJUČKA:
Hvala na pažnji!!