Tom Turk Teze predavanj iz mikrobne biokemije* Ljubljana, november 1996, oktober 2003 *slike so na CD v ppt formatu, besedilo v drobnem tisku je priporočljivo ni pa obvezno, Študentom mikrobiologije 1. bolonjske stopnje je namenjen tisk, ki je označen z rumeno barvo!
Prokarionti in evkarionti Organizme razdelimo na živali, rastline in protiste. Razdelitev temelji na očitnih razlikah v njihovi obliki in zgradbi. Če zanemarimo morfološke razlike, lahko zemeljske organizme razdelimo tudi po načelih različnih virov hrane in energije, ki jih lahko izkoriščajo za svojo rast in razvoj. Živali so heterotrofni organizmi (vir energije je organski ogljik), ki se hranijo s kompleksnimi organskimi spojinami, le-te pa potem razgradijo pri čemer se sprošča energija. Razgradne produkte pa vgrajujejo v procese nastanka novih snovi. Rastline so autotrofni organizmi (vir energije je anorganski ogljik in sončna svetloba), ki s pomočjo svetlobe iz anorganskih molekul (CO 2 ) sintetizirajo kompleksne organske molekule. Razdelitev med živalmi in rastlinami je relativno preprosta, kar pa ne velja za mikroorganizme. Tretja skupina organizmov torej nosi skupno ime Protista. Mednje uvrščamo bakterije, cianobakterije in druge enocelične organizme obeh zgoraj omenjenih kraljestev. Protisti nimajo morfoloških specializacij, lahko pa jih razdelimo na dve osnovni skupini. Višji protisti so po zgradbi svoje celice podobni bodisi živalim ali rastlinam zato jih uvrščamo med evkarionte. Med višje protiste uvrščamo alge, glive in praživali. Med nižje protiste pa uvrščamo bakterije in cianobakterije (modrozelene alge), ki so prokarionti, saj se njihova celična zgradba razlikuje od celic drugih živih bitij. Od vseh navedenih skupin pa se popolnoma razlikujejo virusi, ki nimajo prave celice in se lahko razmnožujejo le v gostiteljski celici. Osnovna enota vsakega živega organizma (razen virusov) je celica. Celice pa se po svoji zgradbi in sestavi medsebojno močno razlikujejo, te razlike pa so največje med celicami bakterij in modrozelenih alg na eni in vsemi drugimi organizmi na drugi strani. Na osnovi teh razlik torej organizme na Zemlji delimo na prokarionte in evkarionte. Prokarionti naj bi bili prvotni organizmi, pojav evkariontov pa v zemeljski zgodovini predstavlja največji preskok v evoluciji živih bitij. Evkariontske celice imajo jedro, ki na kromosomih vsebuje glavni dedni zapis organizma v obliki DNA. Evkariontska celica ima poleg tega v citoplazmi tudi mitohondrije in pri rastlinah kloroplaste, ki prav tako nosijo del dedne informacije v obliki krožne DNA. Evkariontski ribosomi so sorazmerno veliki. Prokarionti nimajo z membrano obdanega jedra, zato je njihova DNA v citoplazmi v obliki enega samega "bakterijskega kromosoma". Dodatna genetska informacija lahko obstaja tudi v obliki plazmidov. Prokariontska celica ne vsebuje z membranami omejenih organelov, pa tudi notranjost citoplazme ne kaže take razdelitve kot pri evkariontski celici. Prokariontski ribosomi (70S) so manjši od evkariontskih (80S), proteinska sinteza pa pri prokariontih poteka nekoliko drugače. Vse prokariontske celice imajo celično steno. Morfološke posebnosti so pri prokariontih le slabo izražene, tako da ločimo le nekaj osnovnih oblik. Uniformnost njihove oblike pa je v ostrem nasprotju z neverjetno raznovrstnostjo in prilagodljivostjo njihovih metabolnih procesov. Medtem ko vse rastline in živali za življenje potrebujejo kisik, pa lahko nekateri organizmi žive v anaerobnih razmerah v odsotnosti kisika, potrebno energijo za rast pa lahko dobivajo s fermentacijo ali anaerobno respiracijo. Mnogi prokarionti so avtotrofi in pri tem izkoriščajo 2
svetlobno energijo, kemolitotrofni prokarionti pa dobivajo energijo z oksidacijo anorganskih substratov in elementov. Nekatere bakterije so sposobne direktno vezati atmosferski dušik. Evolucija bakterij je potekala glede na razpoložljive vire energije in hrane od skupnega prednika vseh bakterij (progenot) in se je že zgodaj v zemeljski zgodovini razdelila na arhebakterije in evbakterije. Šele pojav prokariontov in s tem povezanega nastanka kisika v atmosferi je ustvaril pogoje za razvoj evkariontov. Razdelitev mikroorganizmov glede na vire energije, protonske donorje in vire ogljika Mikroorganizme lahko glede virov energije, ki so jih sposobni izkoriščati, uvrstimo v različne metabolne skupine. Poleg vira energije razdelimo mikroorganizme tudi glede na vir ogljika, ki ga vgrajujejo v nove organske spojine, ter vire vodikovih protonov, ki ustvarjajo protonski tok in s tem povezano redukcijsko moč. 1. Fototrofi Fototrofi so vsi tisti organizmi, ki kot vir energije izkoriščajo sončno svetlobo. S pomočjo sončne svetlobe pridobivajo energijo, ki jo porabijo za sintezo organskih molekul iz anorganskih molekul. Med fototrofe uvrščamo skupino anaerobnih bakterij, ki ne sproščajo kisika, kot je to slučaj pri cianobakterijah, algah in višjih rastlinah. 2. Kemotrofi Kemotrofi so vsi tisti organizmi, ki kot vir energije izkoriščajo anorganske ali organske spojine. Delimo jih na litotrofe in organotrofe. a) Litotrofi Litotrofi so vsi tisti organizmi, ki kot vir energije pretvarjajo anorganske spojine (npr. NH 3, H 2 S, S, CO 2, Fe 2+, itd.), le-te pa jim služijo tudi kot vir vodikovih protonov. b) Heterotrofi ali organotrofi Heterotrofi ali organotrofi so vsi tisti organizmi, ki zadostijo svojim energetskim potrebam z razgradnjo organskih molekul od koder dobivajo tudi potrebne vodikove protone. Fototrofne in litotrofne organizme imenujemo tudi avtotrofi, ker so neodvisni od drugih organizmov in lahko svojim energetskim potrebam zadoste sami, kot edini vir razpoložljivega ogljika pa jim služi CO 2. Izraz avtotrof se ne nanaša na vir energije pač pa na vir ogljika, ki ga dobijo iz anorganskih spojin, zlasti ogljikovega dioksida. Z drugimi besedami, ti organizmi lahko rastejo v odsotnosti organskih spojin. Majhna skupina mikroorganizmov izkorišča za pridobivanje 3
ATP sončno svetlobo, vendar pa ne more pretvarjati ogljikovega dioksida v organske spojine. Take organizme imenujemo fotoheterotrofi. Na osnovi prikazane razdelitve lahko zaključimo, da so zelene rastline, cianobakterije in škrlatne žveplove bakterije fotolitotrofi (fotoavtotrofi), nitrifikacijske bakterije kemolitotrofi (kemoautotrofi), živali in večina mikroorganizmov pa kemoorganotrofi (kemoheterotrofi). 4
Mikrobni metabolizem Tako kot pri živalih in rastlinah se metabolizem mikroorganizmov deli na procese, pri katerih nastaja energija in se snovi razgrajujejo, kar imenujemo katabolizem ter procese pri katerih se energija porablja nastajajo pa nove spojine, kar imenujemo anabolizem. V teh procesih celice porabljajo hranilne snovi, jih spreminjajo in vgrajujejo v svoje strukture, odpadne produkte pa izločajo v okolico. Pri metabolizmu mikroorganizmov se srečujemo z nekaterimi posebnostmi, ki jih pri živalih in višjih rastlinah ni. Ne glede na to, pa tako v procesih katabolizma kot anabolizma nastopajo številni encimi ter razni koencimi in kofaktorji, ki so skupni vsem živim bitjem. Kratek pregled redoks reakcij Uporaba kemične energije je v živih organizmih vezana na redoks reakcije. Kadar se neka snov oksidira odda elektrone, ob redukciji pa elektrone sprejme. V biokemičnih redoks reakcijah snovi pogosto oddajajo ali sprejemajo cele vodikove atome in ne samo elektrone. Vodikov atom, ki se ponavadi prenaša v biokemičnih redoks reakcijah, je sestavljen iz enega elektrona in enega protona. Kadar odda elektron nastane vodikov ion ali proton H +. V biokemičnih procesih je pomembno tudi to, da v mnogih redoks reakcijah ni vpleten molekularni kisik. Elektroni v vodnih razstopinah ne morejo obstajati samostojno, zato je vsako oddajanje elektronov nujno povezano s sprejetjem elektronov v drugi reakciji. Vsaka redoks reakcija je torej sestavljena iz dveh sklopljenih polovičnih reakcij: H 2 2e - + 2H + 1/2 O 2 + 2e - + 2H + H 2 O V prvi reakciji se vodikov atom oksidira, v drugi reakciji pa se kisikov atom reducira, kar privede do ravnotežja: H 2 + 1/2 O 2 H 2 O V tem primeru je torej vodikov atom elektronski donor (reducent) in se torej oksidira, kisik pa je elektronski akceptor (oksidant), ki se reducira. Redukcijski (redoks) potencial Snovi se razlikujejo po tem koliko so nagnjene k sprejemanju elektronov oz. kako lahko jih reduciramo, kar označujemo z redukcijskim potencialom (E o ). Potencial merimo z elektrokemijskimi metodami glede na standardno snov, kar je elementarni vodik H 2. Po dogovoru so redukcijski potenciali izraženi kot polovične reakcije, se pravi kot redukcije, kjer sta na levi strani napisana oksidant + e - na desni strani pa reduciran produkt. Če so v reakcijo vpleteni vodikovi ioni (kar je pogosto), potem je redukcijski potencial do neke mere odvisen od ph vrednosti zato se vrednost redukcijskih potencialov vedno podaja v nevtralnem ph, to je pri ph 7.0. Oksidacijsko redukcijski pari in sklopljene reakcije 5
Večina molekul lahko služi kot donor ali akceptor elektronov, kar je odvisno od druge snovi s katero vstopajo v sklopljeno reakcijo. Oksidirane in reducirane oblike snovi lahko zapišemo v obliki oksidacijsko redukcijskih parov, pri čemer je oksidirana oblika vedno napisana na levi strani. 2H + /H 2 ali 1/2 O 2 /H 2 O Močnejši reducent je tista reducirana molekula O-R para, katerega redukcijski potencial je bolj negativen in lažje odda elektrone oksidirani molekuli O-R para, katerega redukcijski potencial je bolj pozitiven. Večja ko je ta razlika, lažje bo reducirana molekula enega para oddala elektrone oksidirani molekuli drugega para. O-R pare lahko razvrstimo v vertikalni stolpec, kjer so na vrhu pari z najbolj negativnim redukcijskim potencialom, na dnu pa pari z najbolj pozitivnim redukcijskim potencialom. Reducirana molekula na vrhu stolpa bo najlaže oddajala elektrone in bo zato močan reducent, oksidirana molekula pa bo najtežje sprejemala elektrone in bo zato najšibkejši oksidant. Oksidirana molekula na dnu stolpa bo najraje sprejemala elektrone in bo zato najmočnejši oksidant, njen par pa bo najslabši reducent, saj bo najtežje oddal svoje elektone. Iz stolpca je razvidno, da je najmočnejši reducent vodik, najmočnejši oksidant pa kisik. V prenosu elektronov po stolpcu navzdol se sproščeni elektroni lahko ujamejo na druge elektonske akceptorje, ki jih nato oddajo naprej, ob tem pa se sprošča energija Molekule O-R parov, ki so nekje v sredini stolpca, lahko delujejo kot reducenti ali oksidanti, zato so to molekule, ki jih najpogosteje zasledimo v različnih dihalnih verigah. V katabolnih reakcijah je elektronski donor ponavadi naveden kot snov, ki predstavlja vir energije, čeprav se energija dejansko sprošča v sklopljenih redoks reakcijah. Prenašalci elektronov V celici so v redoks reakcijah pri prenosu elektronov od donorja do akceptorja elektronov vključene vmesne molekule, ki jih imenujemo elektronski prenašalci. Kadar imamo opravka s prenašalci imenujemo začetnega donorja elektronov primarni elektronski donor, končnega akceptorja elektronov pa terminalni elektronski akceptor. Neto vrednost sproščene energije, ki se sprosti v seriji reakcij od primarnega donorja do terminalnega akceptorja, je odvisna le od razlike med njunima redukcijskima potencialima, neodvisno od števila vmesnih redoks reakcij. Prenašalce elektronov lahko razdelimo na tiste, ki so prosto gibljivi in tiste, ki so tesno vezani na membranske encime. Slednji imajo velik pomen pri prenosu elektronov v dihalnih verigah, prosto gibljivi (difuzija) elektronska prenašalca pa sta npr. NAD + in NADP +. Ti dve molekuli v bistvu prenašata vodikove atome,in vedno preneseta dva vodikova atoma na naslednji elektronski akceptor v verigi. Tak transfer vodikovih atomov imenujemo dehidrogenacija, encime, ki opravljajo tak transfer pa dehidrogenaze. V bistvu NAD+ in NADP+ prenašata dva elektrona in en proton, drugi proton pa pride iz razstopine (od vode, ki je ionizirana na H+ in OH-). To lahko ponazorimo z naslednjim zapisom: NAD + + 2e - + 2H + NADH + H + kar pa zaradi poenostavitve pišemo navadno kot NADH (oz. NADPH) Redoks potencial NAD + /NADH para oz. NADP + /NADPH para je -0.32 V, kar ju uvršča med dobre elektronske donorje. Kljub enakim redukcijskim potencialom obeh parov, pa imata v celici ponavadi različno vlogo. NAD + je vpleten v katabolne reakcije, kjer energija nastaja, NADP + pa sodeluje v glavnem v biosintetskih, anabolnih reakcijah. 6
Koencimi pripomorejo k različnosti posameznih redoks reakcij, ker omogočijo sklopitev kemično različnih molekul od donorjev elektronov do njihovih terminalnih akceptorjev. Večino bioloških reakcij katalizirajo specifični encimi, ki pa ponavadi pretvarjajo le določene substrate. Oksidacijsko redukcijske reakcije potekajo v treh stopnjah: 1. odstranitev elektronov z elektronskega donorja, 2. prenos elektronov prek vrste elektronskih nosilcev, 3. sprejem elektronov na elektronski akceptor. Vsako reakcijo katalizira drug encim, ki se veže na specifičen substrat in specifičen koencim. Poleg omenjenih koencimov poznamo še številne druge koencime in prostetične skupine, ki služijo bodisi za prenos elektronov ali drugih skupin. Najpogostejši prenašalci so flavoproteini, kinoni, železožveplovi (FeS) proteini in citokromi. Energetsko bogate molekule in ATP Energija, ki se sprosti ob redoks reakcijah se mora na nek način zajeti in shraniti, da bi koristila celici takrat, ko jo ta potrebuje. V življenski procesih se ta energija najpogosteje nakopiči v energetsko bogatih fosfatnih vezeh. Spojine s takimi vezmi so posrednik pri pretvarjanju energije v koristno delo. Pri fosforiliranih snoveh so fosfatne skupine z estersko ali anhidridno vezjo vezane na kisikove atome, vendar vse niso energetsko bogate vezi. Pri hidrolizi glukoze-6-fosfata se tako sprosti le -13.8 kj/mol, kar je približno 4.5 x manj kot se sprosti energije pri hidrolizi fosfoenolpiruvata. ATP Med vsemi energetsko bogatimi snovmi je v živih organizmih najpomembnejša molekula adenozin trifosfat ali ATP. ATP je glavni prenašalec energije in nastaja med eksorgenimi (eksotermnimi) reakcijami v živih organizmih, porablja pa se v endorgenih (endotermnih) reakcijah. Prosta energija, ki nastaja ob hidrolizi energetsko bogatih vezi, se mora porabiti v sklopljenih reakcijah, ker bi se drugače porazgubila kot toplota. Sproščanje energije v bioloških sistemih Za sintezo spojin z energetsko bogatimi vezmi (ATP in nekatere druge spojine) izkoriščajo organizmi tako svetlobno kot kemično energijo. Kot donorji elektronov jim služijo tako anorganske kot organske spojine. Tudi elektronski akceptorji so lahko različni, bodisi organske ali anorganske spojine. V naslednjih urah si bomo ogledali mehanizme, ki vodijo k sintezi ATP, kot posledice sklopljenih redoks reakcij, v katere so vključene organske molekule. Metabolizem organskih molekul predstavlja vir energije za vse živali ter veliko večino mikroorganizmov. Sosledje kemičnih reakcij, pri katerih pride do oksidacije določene snovi imenujemo biokemijska pot. Biokemijske poti pri katerih pride do oksidacije organskih molekul in nastanka ATP lahko delimo v dve skupini: -fermentacije -dihanje 7
Pri fermentacijah potekajo redoks reakcije brez zunanjega elektronskega akceptorja, pri dihanju pa kot terminalni elektronski akceptor služi kisik ali nek drug oksidant. Fermentacija (vrenje) Kadar ni zunanjega elektronskega akceptorja, lahko v mnogih organizmih potekajo notranje uravnotežene redoks reakcije različnih organskih snovi, pri katerih pride do nastanka energije. Take reakcije imenujemo fermentacije ali vrenja Znanih je veliko vrst fermentacij, pri katerih pa pride le do delne oksidacije ogljikov v organskih molekulah, zato je izkoristek pri fermentaciji mnogo manjši kot pri dihanju, ker se sprosti le del potencialne energije. Oksidacija je pri fermentacijah vedno vezana na redukcijo neke organske molekule, ki nastaja kot produkt v katabolnih procesih iz izhodnega fermentacijskega substrata. Tako odpade potreba po zunanjem akceptorju elektronov. Kot primer fermentacije si oglejmo shemo oksidacije glukoze v laktat. Če seštejemo vodikove in kisikove atome v substratu (glukozi) in produktu (mlečni kislini) vidimo, da se njihovo število ne spremeni. Podobno poteka tudi alkoholno vrenje pri kvasovkah, le da so tam nekateri C atomi produktov reakcije (CO 2 ) bolj oksidirani, drugi pa bolj reducirani (etanol) kot v izhodnem substratu (glukozi). Energija, ki se sprosti pri alkoholnem in mlečnem vrenju zadostuje za sintezo dveh ATP molekul oziroma dveh energetsko bogatih vezi. K različnim tipom fermentacije, ki jih srečujemo pri mikroorganizmih se bomo še vrnili, zdaj pa si poglejmo fermentacijo glukoze oz. glikolizo, ki je osnovna metabolna pot razgradnje sladkorjev tako pri evkariontih kot pri prokariontih. Glikoliza Čeprav je glikoliza na prvi pogled zapleten proces, je biokemična pot razgradnje glukoze pravzaprav sorazmerno preprosta in jo lahko razdelimo na tri osnovne dele. V prvem delu pride do začetnega preoblikovanja molekule glukoze, kjer redoks reakcije niso vključene. Tu ne prihaja do sproščanja energije pač pa nastane ključni intermediat gliceraldehid-3-fosfat. V drugi fazi glikolize pride do redoks reakcij, nastane ATP in dve molekuli piruvata, ki vstopa v procese oksidativne fosforilacije (dihanje) ali pa se razgradi z alkoholno ali mlečno fermentacijo v anaerobnih pogojih do etanola in ogljikovega dioksida ali do laktata. Pri večini organizmov poteka glikoliza na način, ki sta ga opisala Embden in Mayerhof in se zato imenuje Embden-Mayerhof-Parnasova pot. Pri številnih bakterijah pa poteka glikoliza nekoliko drugače, tak potek se imenuje Entner-Doudoroffova pot razgradnje glukoze, pri kateri pa nastane manj ATP kot pri klasični glikolizi. Tretji način razgradnje je pot pentoze fosfata, ki vodi k sintezi 12 molekul NADPH. Pot pentoze fosfata se pojavlja v večih oblikah, kar je verjetno odvisno od potreb organizma po NADPH, ATP in majhnih prekurzorskih molekulah, ki se vgrajujejo v makromolekule.glukoza ni edini sladkor, ki se lahko pretvori prek glikolize v piruvat. Mikroorganizmi lahko poleg monosaharidov porabljajo za rast tudi disaharide in polisaharide. Pogosti sladkorji, ki jih mikroorganizmi s svojimi encimi razgrade do glukoze so maltoza, saharoza in laktoza. Tako nastali monosaharidi vstopajo v EMP pot ali v pot pentoze fosfata. Pri razgradnji disaharidov ali polisaharidov do glukoza-6-fosfata ni potreben ATP zato se neto isplen ATP tako poveča.emp pot razgradnje glukoze.najpogostejši način razgradnje glukoze je EMP pot. Najbolj zaslužni raziskovalci za odkritje celotnega poteka glikolize so bili Embden, Mayerhof in Parnas, ki so leta 1940 dokazali vse intermediate, ki se pojavljajo pri razgradnji glukoze v piruvat. Glikoliza pri prokariontih in evkariontih poteka na enak način, razlika je le v prvi stopnji, kjer pride do aktivacije glukoze. 8
Prva stopnja glikolize je aktivacija glukoze v glukozo-6-fosfat, pri čemer se porabi 1 molekula ATP. S fosforilacijo glukoze je ta pripravljena za nadaljni razkroj. Ta reakcija poteka pri evkariontih ob prisotnosti Mg 2+ in encima heksokinaze, pri nekaterih prokariontih pa ATP nadomesti fosfoenol piruvat, ki ob prisotnosti skupine transportnih encimov fosforilira glukozo ob njenem transportu preko membrane. Sledi izomerizacija glukoze-6-fosfata z encimom fosfoglukoza izomerazo v fruktozo-6-fosfat nato pa v fruktozo-1,6-bifosfat s pomočjo encima fosfofrukto kinaze, ene molekule ATP, ki se pretvori v ADP in ob prisotnosti Mg 2+ ionov. Na tem mestu encim aldolaza razcepi fruktozo-1,6-bifosfat v molekulo gliceraldehid-3-fosfata in njegovega izomera dihidroksi aceton fosfata, torej molekul s po tremi C atomi, ki prehajata drugo v drugo brez pomoči posebnega encima. Naprej se vedno metabolizira le gliceraldehid-3-fosfat. Do te stopnje niso bile vpletene redoks reakcije, prišlo je le do porabe ATP, ne da bi se ob tem prenašali elektroni. Edina redoks reakcija v vsej glikolizi je pretvorba gliceraldehid-3-fosfata v 1,3 difosfoglicerat. Molekula gliceraldehid-3-fosfata se fosforilizira z dodatno molekulo anorganskega fosfata z encimom gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazo (GAPDH) in s pomočjo koencima NAD +, ki sprejme dva e - ter se tako reducira v NADH. Energetsko je ta reakcija ugodna saj spremeni anorganski fosfat v organskega in tako omogoči nadaljne reakcije, kjer pride do sproščanja ATP. Vsak od fosfatov je vezan v molekulo 1,3 difosfoglicerata z visokoenergetsko vezjo. V naslednji stopnji pride s pomočjo fosfoglicerat kinaze do nastanka 3-fosfoglicerata in dveh molekul ATP. Encim fosfoglicerat mutaza pretvori 3-fosfoglicerat v 2-fosfoglicerat, ta pa se ob prisotnosti Mg 2+ in encima enolaze, ki odcepi vodo, pretvori v fosfoenolpiruvat. Le-ta se s piruvat kinazo, ki za svoje delovanje potrebuje Mg 2+ in K + ione, pretvori v končni produkt glikolize, piruvat. V zadnji reakciji se sprostita tudi dve molekuli ATP. Večina reakcij v EM poti je reverzibilnih, izjema je le fosforilacija glukoze z encimom heksokinazo, reakcija, ki jo katalizira 6-fosfofrukto kinaza in pretvorba fosfoenol piruvata z encimom piruvat kinazo v piruvat. Za anaerobne organizme sta dve reakciji, pri katerih se sprošča ATP neprecenljivega pomena, saj predstavljajo glavni vir energije za njihovo rast. Za vse mikroorganizme, z le nekaj izjemami, ki pretvarjajo ogljikove hidrate velja, da so popolnoma odvisni od energije, ki jo pridobe z oksidacijo gliceraldehid-3-fosfata. Celoten energetski isplen glikolize za vsako oksidirano molekulo glukoze znaša torej dve molekuli ATP in dve molekuli NADH. Fermentacija glukoze, reduktivna stopnja Pri nastanku dveh molekul 1,3-difosfoglicerata se reducirata dve molekuli NAD +. Ker je v celici število molekul NAD + omejeno, bi se oksidacija glukoze prej ali slej ustavila zato se morajo nastale molekule NADH reoksidirati v drugih metabolnih poteh. NADH se porablja in reoksidira v različnih fermentativnih poteh, kjer pride do razgradnje piruvata v različne fermentativne produkte. Kvasovke tako reducirajo piruvat v etanol, mlečne bakterije (ali fermentacija piruvata v mišicah v anaerobnih pogojih) pa reducirajo piruvat v mlečno kislino (laktat). Bakterije lahko reducirajo piruvat še na mnoge druge fermentativne produkte. Te poti si bomo ogledali v nadaljevanju. Ne glede na fermentativno pot je rezultat vedno oksidacija NADH nazaj v NAD +, pri tem pa se sprošča določena energija. NADH in NAD + prosto difundirata na mesta, kjer pride do njune redukcije ali oksidacije. Pri vsakem procesu, kjer pride do sproščanja energije mora za vsak oddan elektron obstajati spojina, ki ta elektron sprejme. V primeru fermentacije je redukcija NAD + v glikolizi uravnotežena z njegovo oksidacijo v fermentativnih procesih. Poleg tega mora biti tudi izhodna snov v redoks ravnotežju s končnim produktom (npr. etanol + CO 2 morata biti v redoks ravnotežju z glukozo). Glikoliza in fermentacija-energetski isplen 9
Pri razgradnji glukoze nastaneta dve molekuli ATP ter dve molekuli NADH, ki se reoksidirata v fermentativni razgradnji končnega produkta glikolize na fermentativne produkte. Za večino organizmov so fermentativni produkti le stranski produkti, ki zanje niso pomembni. Za človeka pa imajo številni fermentativni produkti nižjih organizmov velik pomen. Druge poti razgradnje glukoze Poleg najbolj znane EM poti razgradnje glukoze, obstajajo pri številnih mikroorganizmih tudi alternativne poti razgradnje glukoze, kot sta Entner-Doudoroffova pot in pot pentoze fosfata. ED pot razgradnje glukoze ED pot predstavlja alternativno pot razgradnje glukoze pri nekaterih mikroorganizmih, ki pa je energetsko manj učinkovita, saj na eno oksidirano molekulo glukoze dobimo le eno molekula ATP in eno molekulo NADPH. Ena sama molekula ATP nastane zato, ker se glukoza-6-fosfat oksidira (ob hkratni redukciji NADP + v NADPH) preden aldolaza razcepi substrat na dva 3C intermediata in tako ne pride do fosforilacije z anorganskim fosfatom, ki ponavadi spremlja oksidacijo. To pot uporabljajo zlasti bakterije iz rodu Pseudomonas in nekatere druge bakterije. Po tej poti razgradnje se glukoza-6-fosfat najprej oksidira ob hratni redukciji NADP + v NADPH v 6- fosfoglukonolakton, ki ga laktonaza pretvori v 6-fosfoglukonat. Encim fosfoglukonat dehidraza odcepi molekulo vode, kar vodi k nastanku osrednjega metabolita poti, 2-keto-3-deoksifosfoglukonata. Le-tega posebna aldolaza razcepi na piruvat in gliceraldehid-3-fosfat, slednji pa se naprej pretvori tako kot v EMP poti. Pot pentoze fosfata PPF je pomembna predvsem zato ker v njej nastajajo reducirani koencimi (NADPH), ki se kot reducenti vključujejo v različne biosintetske poti. Poznamo nekaj različic PPF, ki so verjetno posledica različnih potreb po NADPH, ATP in majhnih prekurzorskih molekulah, iz katerih nastajajo makromolekule. PPF srečamo tako pri evkariontih kot prokariontih. Pri eni različici PPF se glukoza-6-fosfat najprej pretvori v 6-fosfoglukonolakton, pri čemer se reducira NADP + v NADPH. 6-fosfo glukonolakton spontano ali encimatsko (laktonaza) hidrolizira v 6-fosfoglukonat. Ta se oksidira ob hratni redukciji nove molekule NADP + v NADPH v 3-keto-6-fosfoglukonat z odcepom CO 2 pa nastane ribuloza-5-fosfat, ki predstavlja končni produkt oksidacije glukoze. Kadar celica potrebuje veliko količino NADPH lahko PPF vodi k nastanku 12 molekul NADPH, pri čemer se molekula glukoze pretvori vse do CO 2. Kadar pa celica potrebuje tako ATP kot NADPH, pride do nadaljne razgradnje ribuloze 5-fosfata, pri čemer najprej porabi ena molekula ATP, da nastane fruktoza 1,6 bifosfat. Ta razpade v dihidroksiaceton fosfat in gliceraldehid-3- fosfat, le-ta pa se pretvori v piruvat ob hkratnem nastanku ene molekule ATP in ene molekule NADH na vsako molekulo gliceraldehid-3-fosfata. Ribuloza-5-fosfat predstavlja zadnjo stopnjo v oksidaciji glukoze vse nadaljne reakcije imamo lahko le za pretvorbe pentoza fosfatov v heksoza fosfate in obratno. Ribuloza-5-fosfat je v ravnotežju z ribozo-5-fosfatom in ksilulozo-5-fosfatom. Riboza-fosfat je pomemben gradnik, ki se vgrajuje v nukleotide in nukleinske kisline. Pentoza fosfati se lahko pretvorijo v dve molekuli fruktoze-6-fosfata, toda le eno molekulo gliceraldehid-3-fosfata. Te konverzije potekajo encimatsko s pomočjo encimov transketolaze in transaldolaze. Izomerizacija fruktoze-6-fosfata v glukozo-6-fosfat ter kondenzacija dveh trioz-fosfata v heksoza fosfat pa poteka pod nadzorom izomeraz in epimeraz. S 10
temi reakcijami se zapre cikel pentoze fosfata v katerem se pretvorijo tri molekule glukoze-6- fosfata v dve molekuli fruktoze-6-fosfata in eno molekulo gliceraldehid-3-fosfata. Ob tem se sprostijo tri molekule CO 2 in 3 x 2 molekule NADPH. Dehidrogenaze, ki sodelujejo v poti pentoze fosfata, lahko prenašajo iz substrata vodikove protone tako na NADH kot na NADPH. Pot metilglioksala To pot srečamo le pri nekaterih enterobakterijah (npr. E. coli), nekaterih klostridijih in pseudomonasih, a še to le takrat, kadar bakterijam primanjkuje anorganski fosfat. Ta pot porablja ATP, ker po nastanku dihidroksiacetona, le tega bakterije spremene v metilglioksal, tega pa prek D- laktata v piruvat, ki lahko kasneje vseeno vstopi v CCK. Pomen različnih poti razgradnje (oksidacije) glukoze za mikroorganizme Mikroorganizmi se precej razlikujejo po obsegu uporabe različnih poti razgradnje glukoze. Encimi, ki sodelujejo v EMP poti so večinoma prisotni v vseh organizmih, čeprav jih nekatere bakterije izkoriščajo le v obratni smeri in tako povezujejo ireverzibilne reakcije s pomočjo drugih encimov. PPF pot ima prav tako univerzalni pomen, medtem ko je ED pot široko razširjena med bakterijami, njen glavni pomen pa je v pretvorbi glukonata in nastanku NADPH. Drugi sladkorji kot vir energije v glikolizi Glukoza ni edini sladkor, ki ga mikroorganizmi lahko razgrade do piruvata, saj lahko vanj pretvorijo tudi disaharide in polisaharide. Maltoza je pogost disaharid, ki ga maltaza razgradi v glukozo. Iz saharoze nastaneta s posredovanjem encima saharaze glukoza in fruktoza, laktoza pa se razradi z encimom β-galaktozidazo v glukozo in galaktozo. Vsi tako nastali monosaharidi lahko vstopijo v EMP ali PPF, kjer se naprej metabolizirajo na utečen način. Galaktoza, ki nastane iz laktoze se npr. konvertira v glukozo-1-fosfat, ta pa v glukozo-6-fosfat, ki je intermediat v glikolizi. Glukoza, ki nastane iz laktoze se lahko direktno pretvori v glukozo-6-fosfat. Kadar kot vir glukoze služita saharoza ali glikogen, nastala glukoza reagira direktno z anorganskim fosfatom, tako da nastane glukoza-1-fosfat. Le-to encim fosfoglukomutaza pretvori v glukozo-6- fosfat, ki vstopi v EMP pot glikolize. Na ta način ni potrebna začetna aktivacija (fosforilacija) glukoze s hidrolizo ATP in je tako neto izkoristek glikolize večji. Regulacija glikolize Pretvorbo substratov v glikolizi in posledično število nastalih ATP molekul celica strogo nadzoruje. Za regulacijo celotne glikolize je ključna stopnja pretvorbe fruktoze-6-fosfata v fruktoza-1,6-bifosfat, ki jo katalizira encim fosfofruktokinaza. Čeprav je za pretvorbo fruktoze-6- fosfata v fruktozo-1,6-fosfat potreben ATP, pa višek ATP inhibira encim. ATP je alosterični inhibitor fosfofruktokinaze. Kadar je količina ATP, ki ga celica potrebuje zadostna, višek nastalega ATP inhibira encim in glikoliza se ustavi že razmeroma zgodaj in tako prepreči nadaljno sintezo ATP. Ko se ATP porabi, v celici naraste koncentracija AMP, ki nastaja s hidrolizo ADP. AMP je alosterični aktivator fosfofruktokinaze, ki ponovno začne pretvarjati fruktozo-6-fosfat, kar glikolizo ponovno požene in vodi k nastanku ATP. Alosterična kontrola fosfofruktokinaze vodi do zanimivega opažanja, da v prisotnosti kisika številni mikroorganizmi za svojo rast porabijo manj sladkorja, kot v anaerobnih razmerah. V aerobnih razmerah namreč nastaja bistveno več ATP (dihanje), ki tako inhibira glikolizo. V anaerobnih razmerah (fermentacija) nastaja manj ATP 11
molekul, zato je poraba sladkorjev večja. Nesorazmerje med pretvorbo sladkorja v aerobnih in anaerobnih pogojih imenujemo Pasteurjev efekt. Alosterična kontrola fosfofruktokinaze predstavlja ključno regulatorno stopnjo v metabolizmu ogljikovih spojin, kar celični metabolizem usmerja k tistim potem, ki vodijo k nastanku ali k porabi ATP. Oksidacija piruvata Piruvat, ki je končni metabolit glikolize ne more vstopiti v ciklus citronske kisline direktno, pač pa se mora predhodno oksidirati v acetil-coa. Vir acetil-coa ni le piruvat, ki nastaja pri razgradnji sladkorjev, pač pa tudi maščobe in aminokisline. Pri oksidaciji piruvata se najprej z dekarboksilacijo sprosti CO 2, tako da nastane acetil (spojina z 2C atomoma), ki se poveže z koencimom A v acetil-coa. Ta spojina vstopi v ciklus citronske kisline. Vez med acetilom in CoA je energetsko bogata vez. Ob oksidaciji piruvata se reducira tudi ena molekula NAD + v NADH. Pri bakterijah se piruvat lahko oksidira na tri različne načine: 1. piruvat + CoA + NAD + acetil-coa + NADH + CO 2 2. piruvat + CoA + 2ferodoksin(ox) acetil-coa + 2 ferodoksin(red) + CO 2 3. piruvat + CoA acetil-coa + format Prvo reakcijo katalizira multiencimski kompleks piruvat dehidrogenaza, ki ga premorejo vsi aerobni organizmi. Njegova naloga je, da sintetizira acetil-coa, ki nato vstopa v ciklus citronske kisline. Drugo reakcijo katalizira encim ferodoksin oksidoreduktaza. Ta encim ima pomembno vlogo pri številnih anaerobnih bakterijah, kot so npr. bakterije iz rodu Clostridia. Tretjo reakcijo katalizira encim piruvat format liaza. Ta encim imajo številne anaerobne bakterije, ki izločajo mravljično kislino (format), zlasti enterobakterije ter tudi fototrofni organizmi. Kvasovke in nekatere bakterije premorejo še četrti encim za oksidacijo piruvata, pri čemer pa ne nastaja acetil- CoA pač pa sta produkta acetaldehid in CO 2. Koencim A (CoASH ali CoA) je sestavljen iz β-merkaptoetanolaminske skupine, ki je vezana z amidno vezjo na vitamin pantotensko kislino, ta pa prek pirofosfatnega mostička na 3- fosfoadenozin. Acetil se pripne prek tioesterske vezi na sulfhidrilni del molekule CoA. CoA je v bioloških sistemih torej nosilec acetilne in drugih acilnih skupin. Acetil-CoA je visokoenergetska spojina. Prosta energija, ki se sprosti ob hidrolizi tioesterske vezi je -31.5 kj/mol, kar je celo malenkost več kot se sprosti energije pri hidrolizi ATP. Tioesterska vez v acetil-coa torej uskladišči del proste energije, ki nastane pri oksidaciji različnih substratov. Ciklus citronske kisline (Krebsov cikel ali cikel trikarboksilnih kislin) Ciklus citronske kisline (CCK) je običajna pot oksidativne razgradnje substrata tako pri evkariontih kot pri prokariontih. Ta cikel predstavlja osrednji del metabolnih poti, saj se tu oksidira večina intermediatov, ki v cikel vstopajo kot delno oksidirani produkti razgradnje sladkorjev, maščobnih kislin in aminokislin, poleg tega pa v njem nastajajo številni biosintetski prekurzorji. Ciklus citronske kisline je torej amfibolen, saj deluje tako v smeri katabolizma kot anabolizma. Bistvo ciklusa citronske kisline je oksidacija acetil-coa do dveh molekul CO 2, pri čemer nastajajo reducirani koencimi (NADH, FADH 2 ) in nekaj energije v obliki GTP. V samem delovanju CCK 12
pri prokariontih in evkariontih ni bistvene razlike, razlika je le v mestu, kjer vse skupaj poteka. Pri prokariontih v citosolu in v plazmatski membrani, pri evkariontih pa v mitohondrijih znotraj celice. Preden si celoten proces podrobneje ogledamo se sprehodimo skozi njegove glavne stopnje in poglejmo kaj se dogaja z acetilno molekulo. Zgodovinski pregled odkritja ciklusa citronske kisline Stopnje v ciklusu citronske kisline je leta 1937 predpostavil Hans Krebs, ki je za svoje delo prejel tudi Nobelovo nagrado. Do leta 1937 je bilo že veliko znanega o glikolizi, manjkal pa je velik vmesni del med oksidacijo glukoze in dihalno verigo, čeprav je bilo nekaj vmesnih produktov in njihova vloga že poznana. Leta 1935 je Albert Szent-Gyorgyi pokazal da se celično dihanje neverjetno pospeši z majhnimi količinami sukcinata, fumarata, malata ali oksalacetata, ki jih je dodal k zmletemu mišičnimu tkivu. Dodatek omenjenih snovi poveča porabo kisika in produkcijo CO 2 veliko bolj kot je potrebno za preprosto oksidacijo dikarboksilnih kislin. Dokazal je tudi, da te substance prehajajo druga v drugo v naslednjem zaporedju: sukcinat fumarat malat oksalacetat. Kmalu za tem sta Carl Martins in Franz Knoop dokazala, da se citrat pretvori prek cis-akonitata v izocitrat, nato pa v ketoglutarat. Za ketoglutarat pa se je že vedelo, da z oksidativno dekarboksilacijo prehaja v sukcinat in CO 2. Tako je bil poznan niz reakcij od citrata do oksalacetata, manjkala je le še sklenitev cikla, torej pretvorba oksalacetata v citrat. Leta 1936 sta Martins in Knoop predpostavila, da lahko pride do nastanka citrata iz piruvata in oksalacetata po neencimski poti s pomočjo vodikovega peroksida v bazičnih razmerah. Krebs je uporabil njun predlog kot kemično osnovo, na kateri je osnoval biokemične poskuse, ki so kasneje utemeljili njegovo hipotezo o citratnem ciklu. S svojimi raziskavami je začel leta 1936. Kot testni sistem so mu služile zmlete prsne mišice golobov, ki so znane po zelo hitrem dihanju. Njegova najbolj pomembna opažanja, ki so podpirala obstoj CCK so bila: 1. sukcinat nastaja iz fumarata, malata ali oksalacetata v prisotnosti metabolnega inhibitorja malonata. Ker malonat inhibira direktno redukcijo fumarata v sukcinat, mora sukcinat nastajati z oksidativnim ciklom. 2. Piruvat in oksalacetat lahko tvorita citrat po encimski poti. Krebs je predlagal naslednjo reakcijo: Piruvat + oksalacetat citrat + CO 2 3. Pretvorbene hitrosti med posameznimi stopnjami cikla so dovolj hitre, da odgovarjajo opažanim hitrostim dihanja, zaradi česar mora cikel predstavljati glavno pot oksidacije piruvata v mišicah. Čeprav je Krebs predpostavil obstoj CCK, pa je kljub temu ostalo nerazjasnjenih nekaj pomembnih stvari. Mehanizem nastanka citrata tako ni bil pojasnjen vse do odkritja acetil-coa leta 1945. Severo Ochoa in Feodor Lynen sta leta 1951 dokazala da je acetil-coa tisti intermediat, ki se kondenzira z oksalacetatom v citrat. V CCK je udeleženo osem encimov, ki katalizirajo niz dobro znanih organskih reakcij oksidacije acetilne skupine v dve molekuli CO 2 ob hkratnem nastanku treh molekul NADH, ene molekule FADH 2 in ena molekule GTP. 1. Citrat sintaza katalizira kondenzacijo acetil-coa in oksalacetata v citrat (od tu ime za celoten cikel). 13
2. Sam citrat se težko oksidira, zato so naslednje stopnje namenjene strukturni spremebi citrata v intermediat, ki se lažje oksidira. Encim akonitaza pretvori citrat v sekundarni alkohol izocitrat. V tej reakciji pride najprej do dehidracije, pri kateri nastali cis-akonitat ostane vezan na encim, nato pa pride do ponovne hidracije, tako da se OH skupina citrata v bistvu prestavi na sosednji C atom. 3. V naslednj stopnji encim izocitrat dehidrogenaza oksidira izocitrat v β-keto kislino oksalosukcinat. Ob tem pride do redukcije koencima NAD + v NADH, sledi dekarboksilacija, ki vodi k nastanku α-ketoglutarata. V tej reakcije se torej prvič sprosti CO 2 in prvič nastane NADH. 4. Multiencimski kompleks α-ketoglutarat dehidrogenaza oksidativno dekarboksilira α- ketoglutarat v sukcinil-coa. V tej stopnji pride do nastanka druge molekule NADH ter druge molekule CO 2. Tu je neto oksidacija acetilne molekule končana, ne pa tudi oksidacija preostalih C atomov, ki so vstopili v citratni CCK v obliki acetill-coa. 5. Sukcinil-CoA sintetaza konvertira sukcinil-coa v sukcinat. Prosta energija tioesterske vezi se porabi za nastanek visokoenergetske molekule GTP (iz GDP + anorganskega fosfata). 6. Preostale reakcije služijo za oksidacijo sukcinata nazaj v oksalacetat, ki vstopa v naslednji krog. Encim sukcinat dehidrogenaza katalizira oksidacijo osrednje enojne vezi v molekuli sukcinata v trans dvojno vez, tako da nastane fumarat ob hkratni redukciji koencima FAD v FADH 2. 7. Encim fumaraza katalizira hidracijo fumaratne dvojne vezi, kar vodi k nastanku malata. 8. V zadnji stopnji malat dehidrogenaza oksidira malat (sekundarni alkohol v keton) v oksalacetat, ob tem pa nastane tretja molekula NADH. Acetilna skupina se torej popolnoma oksidira do CO 2 z naslednjo stehiometrijo: 3NAD + + FAD + GDP + acetil-coa + Pi 3NADH + FADH 2 + GTP + CoA + 2CO 2 CCK deluje torej tako, da se s pomočjo ene same molekule oksalacetata, ki se stalno regenerira, oksidira neskončno število acetilnih molekul. Reducirani koencimi se reoksidirajo v dihalnih verigah, kjer pride do nastanka molekul ATP. Encimi, ki nastopajo v CCK Piruvat dehidrogenaza - multiencimski kompleks, ki katalizira nastanek acetil-coa Acetil-CoA nastane iz piruvata z oksidativno dekarboksilacijo, ki jo katalizirajo piruvat dehidrogenaza (E1), dihidrolipoil transacetilaza (E2) in dihidrolipoil dehidrogenaza (E3). Ta encimski kompleks je pri prokariontih nekoliko drugačen kot mitohondrijski encimski kompleks evkariontov, čeprav oba sistema katalizirata isto reakcijo s podobnim mehanizmom. Nastanek acetil-coa poteka v petih stopnjah, kjer so vključeni tudi naslednji koencimi in prostetične skupine: tiamin pirofosfat (TPP), flavinadenin dinukleotid (FAD), nikotinamid dinukleotid (NAD + ) in lipoamid. 14
Multiencimski kompleks inhibira arzen, ki je bil znan strup že v antičnih časih. Arzenit in organski arzeniki so toksični, ker se kovalentno vežejo na sulfhidrilne spojine, zlasti na spojine kot je lipoamid, kjer se arzen veže med dva žveplova atoma. Arzen tako inhibira encime, ki imajo za prostetično skupino lipoamid (npr. piruvat dehidrogenaza in ketoglutarat dehidrogenaza), posledica je ustavitev dihanja. Organske arzenove spojine so zaradi nekaterih strukturnih posebnosti bakterijskih encimov bolj toksične za mikroorganizme kot za živali, zato so jih pred odkritjem antibiotikov uporabljali za zdravljenje nekaterih bolezni, zlasti sifilisa in protozojske tripanosomijaze. Kontrola delovanja piruvat dehidrogenaze Multiencimski kompleks nadzoruje vstopanja acetilnih enot, ki so nastale z oksidacijo sladkorjev v CCK. Ker je dekarboksilacija piruvata z E1 ireverzibilen proces, ki je vsaj pri sesalcih edini način sinteze acetil-coa, je torej ključna stopnja za kontrolo celotnega cikla. Obstajata dva regulatorna mehanizma: 1. Inhibicija z nastalimi produkti (NADH in acetil-coa) 2. Kovalentna modifikacija fosforilacije/defosforilacije piruvat dehidrogenaze (E1) Pri prvem načinu pride do kompeticije med NADH ter acetil-coa na eni strani ter NAD + in CoA na drugi strani za vezavna mesta ustreznih encimov. NADH in acetil-coa tudi poganjata transacetilazo (E2) in dihidrolipoil dehidrogenazo (E3), da katalizirata reakciji v nasprotno smer. Veliko razmerje med koncentracijami NADH/NAD+ in acetil-coa/coa ohranja E2 v acetilirani obliki, zaradi česar ne more sprejeti hidroksietilne skupine iz TPP, ki je vezan na E1. Posledica je da ostane TTP vezan na E1, kar zmanjša hitrost dekarboksilacije piruvata. Drug način kontrole se pojavlja le pri evkariontskih organizmih, ki vsebujejo dva dodatna encima, ki s pomočjo ATP bodisi fosforilirata (kinaza) ali defosforilirata (fosfataza) aktivno mesto (serin) piruvat dehidrogenaze (E1). Tudi prebitek NADH in acetil-coa aktivira kinazo, ki fosforilira aktivno mesto dehidrogenaze. Pri teh procesih ni vpleten camp. Citrat sintaza Citrat sintaza katalizira kondenzacijo acetil-coa in oksalacetata v citrat. To je prva prava reakcija CCK. Citrat sintaza je eden redkih encimov CCK z znano kristalno zgradbo. Encim je sestavljen iz dveh podenot, med katerima je reža kamor se veže oksalacetat. Manjša podenota se nato zasuka, tako da se reža zapre, to pa izpostavi vezavno mesto za acetil-coa. Tak mehanizem je klasičen primer "induciranega prileganja" (induced fit) substrata encimskemu aktivnemu mestu. Reakcija, ki jo katalizira citrat sintaza poteka v treh stopnjah, po katerih nastane citrat ob hkratnem odcepu CoA. Akonitaza Akonitaza katalizira reverzibilno izomerizacijo citrata v izocitrat prek intermediata cis-akonitata. Akonitaza je encim, ki vsebuje kovalentno vezano prostetično skupino sestavljeno iz 4Fe in 4S atomov, ki so potrebni za njeno katalitično aktivnost. Eden od Fe(II) atomov naj bi koordinativno vezal OH skupino citrata in tako olajšal njeno eliminacijo. Za Fe-S komplekse je značilno, da skoraj vedno nastopajo v redoks procesih, akonitaza pa je očitna izjema. Akonitaza iz citrata najprej odcepi vodo, da nastane cis-akonitat, ta pa se v naslednji stopnji zopet rehidrira in tako nastane izocitrat. Zanimivo je, da se iz citrata v bistvu odstrani le OH skupina, proton pa ostane vezan na encim. Akonitazo inhibira fluorocitrat. Fluoroacetat je ena od najbolj toksičnih majhnih molekul, ki jo najdemo v listih nekaterih tropskih rastlin (LD 50 za podgane je 0.2 mg/kg). Presenetljivo je, da sam fluoroacetat ni kaj dosti toksičen za celice. Le-te ga najprej pretvorijo v fluoroacetil-coa potem pa v fluorocitrat, ki specifično inhibira akonitazo. Fluorocitrat tudi inhibira transport citrata prek mitohondrijske membrane. 15
Izocitrat dehidrogenaza Izocitrat dehidrogenaza katalizira oksidativno dekarboksilacijo izocitrata v α-ketoglutarat. To je prva reakcija v CCK, kjer se sprosti CO 2 in nastane NADH. Tkiva sesalcev vsebujejo dve različni obliki tega encima. Prvi, ki mu kot koencim služi NAD + je vključen le v CCK in ga najdemo le v mitohondriju. Druga oblika se nahaja tako v mitohondriju kot v citosolu, za kofaktor pa ima NADP +. NAD+ odvisna izocitrat dehidrogenaza potrebuje za svoje delovanje kofaktorje bodisi Mn 2+ bodisi Mg 2+ ione. Katalizira pretvorbo izocitrata (sekundarni alkohol) prek intermediata oksalosukcinata (keton), ki se najprej dekarboksilira v β keton, nato pa pretvori v α-ketoglutarat. V prvi stopnji reakcije pride do redukcije koencima in nastane NADH. Intermediat oksalosukcinat med pretvorbo verjetno ostane vezan na encim. α-ketoglutarat dehidrogenaza α-ketoglutarat dehidrogenaza katalizira oksidativno dekarboksilacijo α-keto kisline (ketoglutarat). Pri tej pretvorbi se sprosti druga molekula CO 2 in druga molekula NADH. Celotna reakcija je podobna reakciji, ki jo katalizira piruvat dehidrogenaza oz. multiencimski kompleks. Oksidacijo ketoglutarata torej katalizira multiencimski kompleks, ki je sestavljen iz α-ketoglutarat dehidrogenaze (E1), dihidrolipoil trans sukcinilaze (E2) in dihidrolipoil dehidrogenaze (E3) Slednji encim je enak kot pri piruvat dehidrogenaznemu kompleksu. Tudi sama reakcija poteka na enak način kot pri oksidaciji piruvata, končni produkt pa je tioester z energetsko bogato vezjo. V reakcijo vstopa CoA, končni produkt pa je sukcinil-coa. Sukcinil-CoA sintetaza (sukcinat tiokinaza) Sukcinil-CoA sintetaza hidrolizira visokoenergetsko spojino sukcinil-coa v sukcinat ob hratnem nastanku GTP. Ta se kasneje pretvori v ATP z reakcijo, ki jo katalizira nukleozid difosfat kinaza: GTP + ADP GDP + ATP pri čemer je ΔG o' = 0 Energija tioesterske vezi se ohrani tako da nastane niz "visokoenergetskih" fosfatov. Sukcinil-CoA sintetaza mora torej spojiti eksotermno hidrolizo sukcinil-coa (ΔG o' = -32.6 kj/mol) z endotermno reakcijo, ki vodi k nastanku nukleozid trifosfata (GTP) (ΔG o' = 30.5 kj/mol). Poskusi z izotopi so pokazali da: 1. Sukcinil-CoA reagira s anorganskim fosfatom v sukcinil fosfat in CoA. 2. Fosforilna skupina sukcinil fosfata se prenese na His ostanek encima (3-fosfo-histidin), sukcinat pa se sprosti. 3. Fosforilna skupina se z encima prenese na GDP in nastane GTP. Na tem mestu pride do popolne oksidacije acetila v CO 2. Ob tem sta nastali dve molekuli NADH in ena molekula GTP (ATP). Da bi se CCK zaključil mora v naslednjih stopnjah priti do pretvorbe sukcinata v oksalacetat. Sukcinat dehidrogenaza Sukcinat dehidrogenaza katalizira stereospecifično dehidrogenacijo sukcinata v fumarat. Encim močno inhibira malonat, ki je strukturni analog sukcinata in je klasičen primer kompetitivnega inhibitorja. Koencim sukcinat dehidrogenaze je FAD, ki sprejema elektrone. V splošnem je FAD spojina, ki oksidira alkane v alkene, medtem ko NAD + oksidira alkohole v ketone ali aldehide. Oksidacija alkana (sukcinat) v alken (fumarat) je dovolj eksotermna, da se ob tem lahko reducira FAD v FADH 2, ne pa tudi NAD + v NADH. Pri sukcinat dehidrogenazi je koencim FAD kovalentno vezan na histidinski ostanek encima. Taka kovalentna vez med FAD in encimom je nenavadna, saj je v večini primerov FAD nekovaletno, čeprav tesno vezan na encim. Zanimivo je, kako pride do reoksidacije FADH 2, saj ta koencim ni prosto gibljiv tako kot NADH. Sukcinat dehidrogenaza se reoksidira z elektronsko transportno verigo, kjer FADH 2 odda elektrone ubikinonu in citokromu b. To tudi pojasnuje zakaj je ta encim vsajen v notranjo mitohondrijsko membrano oz. plazmatsko membrano (prokarionti) in je edini membranski encim CCK, vsi ostali pa so raztopljeni v mitohondrijskem matriksu, pri prokariontih pa v citosolu. Fumaraza 16
Fumaraza (fumarat hidrataza) katalizira hidracijo dvojne vezi v molekuli fumarata, da nastane L-malat. Mehanizem adicije H + in OH - ionov na dvojno vez ni popolnoma pojasnen in je kontradiktoren, saj ni znano ali encim najprej pripne OH - skupino ali vodikov proton, čeprav zadnje raziskave dajejo prednost prvi možnosti. Malat dehidrogenaza Malat dehidrogenaza katalizira končno reakcijo CCK, regeneracijo malata v oksalacetat, pri čemer pride do oksidacije -OH skupine L-malata v keton ob asistenci NAD +, ki sprejme vodikov proton. Vezavno mesto za NAD + na malat dehidrogenazi je podobno vezavnim mestom za isti koencim na laktat in alkohol dehidrogenazi, kar nakazuje, da so se vezavna mesta za NAD + razvila iz istega proteina. Prosta energija (ΔG o') za reakcijo, ki jo katalizira malat dehidrogenaza je + 29.7 kj/mol. Ta stopnja CCK je zelo endotermna, kar je tudi vzrok za zelo majhno koncentracijo oksalacetata v ravnotežnem stanju. Ker vemo, da je po drugi strani reakcija, ki jo katalizira citrat sintaza močno eksotermna (ΔG o' = -31.5 kj/mol), saj pride do hidrolize citril-coa tioesterske vezi, je razumljivo, zakaj je reakcija, ki jo katalizira malat dehidrogenaza, na videz energetsko tako potratna. Omogoča, da je reakcija, ki jo katalizira citrat sintaza močno eksotermna, pa čeprav je koncentracija oksalacetata zelo majhna. To pa omogoča, da oksalacetat vstopi v nov krog CCK. Neto energetski isplen CCK Ob oksidaciji ene acetilne molekule v dve molekuli CO 2 (čeprav se ob tem oksidirajo ogljiki oksalacetata in šele kasneje acetila) nastanejo: - 3 molekule NADH - ena molekula FADH 2 - ena molekula GTP ali ATP Vsega skupaj acetilna skupina odda osem elektronov, ki vstopajo v dihalno verigo. Tu reducirajo dve molekuli kisika v vodo. Trije elektronski pari molekul NADH dajo oksidativno fosforilacijo vsak po 3 molekule ATP, medtem ko da elektronski par FADH 2 dve molekuli ATP. V vsakem obratu CCK torej nastane skupaj 12 molekul ATP. Kontola in regulacija CCK Hitrost CCK kontrolirajo citrat sintaza, izocitrat dehidrogenaza in α-ketoglutarat dehidrogenaza. Kontrola in regulacija delovanja CCK je v veliki meri odvisna od razpoložljivega substrata, inhibicije s produkti ter inhibicije z drugimi intermediati v ciklu. Delovanje encimov v CCK je v veliki meri odvisno od celične porabe kisika. Ker je poraba kisika v tesni povezavi z reoksidacijo NADH in nastankom ATP, je razumljivo, da regulacija CCK v glavnem poteka prek mehanizma povratne zveze, ki uravnava nastajanje NADH glede na potrošeno energijo. Zdi se, da je hitrost delovanja ključnih encimov v CCK uravnavana s tremi preprostimi mehanizmi: - razpoložljivost substrata - inhibicija s produkti - inhibicija z intermediati CCK prek kompetitivne povratne zveze Najpomembnejši regulatorji CCK so substrati, kot sta acetil-coa in oksalacetat ter produkt NADH. Tako acetil CoA kot oksalacetat sta v mitohondrijih prisotna v tako nizki koncentraciji, da ne pride do nasičenja citrat sintaze. Nastajanje acetil-coa iz piruvata je odvisno od aktivnosti piruvat dehidrogenaze. Oksalacetat je v ravnotežju z malatom, njegova koncentracija pa je odvisna od razmerja koncentracij med NADH/NAD +. Kadar pride do povečanja dela celice in povečanega dihanja upade konc. NADH, posledično pa naraste konc. oksalacetata, kar stimulira delovanje citrat sintaze. Na ta način se nadzoruje nastajanje citrata. Kljub temu pride ob povečanju dihanja do padca 17