ДЕОКСИНИВАЛЕНОЛ У ХРАНИВИМА НАМЕЊЕНИM ИСХРАНИ ДОМАЋИХ ЖИВОТИЊА

Transcript

1 УНИВЕРЗИТЕТ У НОВОМ САДУ ПОЉОПРИВРЕДНИ ФАКУЛТЕТ Департман за ветеринарску медицину Саша Крстовић ДЕОКСИНИВАЛЕНОЛ У ХРАНИВИМА НАМЕЊЕНИM ИСХРАНИ ДОМАЋИХ ЖИВОТИЊА Mастер рад Нови Сад, 2014.

2 УНИВЕРЗИТЕТ У НОВОМ САДУ ПОЉОПРИВРЕДНИ ФАКУЛТЕТ Департман за ветеринарску медицину Кандидат Саша Крстовић Ментор Проф. др Милош Беуковић ДЕОКСИНИВАЛЕНОЛ У ХРАНИВИМА НАМЕЊЕНИM ИСХРАНИ ДОМАЋИХ ЖИВОТИЊА Mастер рад Нови Сад, 2014.

3 Mастер рад Чланови комисије КОМИСИЈА ЗА ОЦЕНУ И ОДБРАНУ МАСТЕР РАДА Др Милош Беуковић, ванредни професор, ментор Ужа научна област: Исхрана животиња Пољопривредни факултет, Нови Сад Др Бранислава Белић, ванредни професор, члан Ужа научна област: Патологија Пољопривредни факултет, Нови Сад Др Нада Плавша, ванредни професор, члан Ужа научна област: Болести животиња и хигијена анималних производа Пољопривредни факултет, Нови Сад

4 Садржај Резиме... 1 Summary Увод Особине трихотецена Продукција и присуство у природи Физичке и хемијске особине Особине деоксиниваленола Продукција и присуство у природи Физичке и хемијске особине Утицај на здравље животиња Токсикокинетика и симптоми тровања деоксиниваленолом Резидуе деоксиниваленола и елиминација из организма Дијагностика микотоксикоза Превенција Правна регулатива Циљ рада Материјал и метод рада Узорци, хемикалије и раствори Апаратура Аналитички поступак Принцип Припрема узорка Ток испитивања Валидација методе Резултати и дискусија Садржај деоксиниваленола у узорцима хранива Присуство деоксиниваленола у функцији климатских услова Присуство у Србији и региону Закључак Литература... 33

5 Mастер рад Резиме РЕЗИМЕ Микотоксини као секундарни метаболити плесни представљају велики изазов данашњице у погледу безбедности хране и хране за животиње. Најчешће заступљени микотоксини су из групе афлатоксина, охратоксина, трихотецена и зеараленона. Деоксиниваленол припада групи трихотецена и, иако припада групи најмање токсичних трихотецених микотоксина, потенцијални је индикатор могућег присуства других, знатно токсичнијих трихотецена, па је отуда веома значајно утврђивање његовог садржаја у храни за животиње. У овом раду је примењена ELISA техника за одређивање садржаја деоксиниваленола у 75 узорака различитих хранива, чему је претходила валидације методе. Од укупног броја анализираних узорака хранива, деоксиниваленол је био присутан у 49 (65,3%) узорака, односно у 100% узорака сточног брашна и сојине сачме. У узорцима кукуруза, присуство овог микотоксина је износило 43,2%, док је у узорцима пшенице и сунцокретове сачме нешто више и уједначено (76,9% односно 77,8%). Просечни садржај деоксиниваленола у узорцима хранива се кретао од 345 µg/kg у случају кукуруза до 607 µg/kg у случају сточног брашна. Садржај овог микотоксина је упоређен са законским регулативама у Европској унији и у нашој земљи. Утврђено је да садржај деоксиниваленола превазилази максимално дозвољене концентрације прописане нашим и ЕУ прописима само у случају узорака сточног брашна и то у једном узорку са концентрацијом од 1930 µg/kg. Изненађујуће је да је у узорцима сојине сачме деоксиниваленол детектован у 100% узорака са средњом вредношћу од 512 µg/kg, јер соја, по правилу, није осетљива на Fusarium graminearum. Добијени резултати су потом анализирани у функцији климатских услова који су владали на подручју наше земље у производној години, при чему је установљено да су услови били релативно неповољни за развој фузаријумских плесни, што је и потврђено добијеним резултатима. Кључне речи: деоксиниваленол, хранива, ELISA, климатски фактори. 1

6 Mастер рад Summary SUMMARY Mycotoxins as secondary metabolites of fungi represent a great challenge in the safety of food and feed, nowadays. The most frequent mycotoxins are aflatoxin, ochratoxin, trichothecenes and zearalenone. Deoxynivalenol belongs to the group of trichothecene mycotoxins and although it is one of the least toxic trichothecene mycotoxins, it is also a potential indicator of the possible presence of other, more toxic trichothecenes, therefore, it is very important to determine its content in feed. In this work, ELISA method was used for the determination of deoxynivalenol in 75 various feed samples, after method validation. Out of total number of analyzed feed samples, deoxynivalenol was present in 49 (65.3%), respectively, in 100% of wheat meal and soybean meal. The presence of this mycotoxin in corn samples was 43.2%, while in samples of wheat and sunflower meal was higher (76.9% and 77.8%). The average content of deoxynivalenol in feed samples was ranged from 345 µg/kg in the case of maize to 607 µg/kg in the case of wheat meal. The content of this mycotoxin was compared with the regulations of the European Union and our country. It was found that the content of deoxynivalenol exceeds the maximum permitted level legislated by our and EU regulations only in case of one sample of corn meal with a concentration of 1930 µg/kg. Surprisingly, in samples of soybean meal deoxynivalenol was detected in 100% with a mean value of 512 µg/kg, considering that soybean is not susceptible to Fusarium graminearum. The results were then analyzed as a function of climatic conditions that prevailed in our country during the 2012 production year, and it can be concluded that the climatic conditions were relatively unfavorable for development of Fusarium mold, which was confirmed by the obtained results. Keywords: deoxynivalenol, feedstuff, ELISA, climatic factors. 2

7 1. УВОД Микотоксини представљају велики изазов данашњице у погледу безбедности хране. Ова једињења представљају секундарне метаболите плесни, који имају токсично дејство како на људе, тако и на животиње. Микотоксини су органске супстанце које не изазивају стварање антитела, те су људи и животиње трајно незаштићени од њиховог деловања (Pier, 1990). Неке плесни су у стању да продукују више врста микотоксина, а такође се и поједини микотоксини јављају као продукти неколико врста плесни (Eskola, 2002). Најчешће заступљени микотоксини су из групе афлатоксина, охратоксина, трихотецена и зеараленона. Штетно деловање микотоксина се најчешће огледа у изазивању хепатотоксичног, нефротоксичног и дерматотоксичног ефекта код већине животиња. Имајући у виду токсично деловање ове групе једињења, као и економске губитке настале као последица контаминације плеснима, микотоксини данас представљају један од водећих проблема у области исхране људи и животиња. Својом бројношћу и распрострањености, међу микотоксинима се истиче група структурно сличних једињења која се назива трихотецени. Деоксиниваленол (DON) припада групи трихотецена. Без обзира на чињеницу да DON припада групи најмање токсичних трихотецена, због његове изузетно велике распрострањености у усевима широм света, као и због чињенице да је он нека врста индикатора за могуће присуство других, знатно токсичнијих трихотецена, познавање садржаја овог токсина је од велике важности за безбедност хране. У нашој земљи је од године законски регулисана и усаглашена са регулативом Европске Уније максимална дозвољена количина овог микотоксина у намирницама, док је у сточној храни још увек регулисана само у потпуним смешама за исхрану свиња. Такође, не постоји довољно података о његовом присуству у усевима нашег поднебља који се користе за исхрану животиња, иако, обзиром на честу миколошку контаминираност и еколошке услове нашег климатског подручја, постоји реална могућност за његово присуство. Наиме, DON, као и неке друге микотоксине, продукују гљивице рода Fusarium које су често изоловане из узорака хране за животиње на нашем подручју. У овом раду је примењена имунохемијска техника (ELISA) за детекцију и одређивање DON-а у кукурузу. Овим испитивањима је претходила валидација 3

8 експерименталне методе, након чега је примењена за испитивање узорака кукуруза, пшенице, пшеничног сточног брашна, сунцокретове и сојине сачме прикупљених са различитих локалитета у Републици Србији Особине трихотецена Продукција и присуство у природи Као веома важан фактор у појави микотоксина у хранивима су климатски услови. Дуготрајне или ране кише, поплаве, прерана зима, висока влажност, као и дуготрајна суша су предуслови који слабе отпорност биљке, а самим тим омогућавају лакши продор и развој плесни (Ожеговић, 1995). Инсекти и штеточине које механички оштећују биљку, корови, као и употреба заштитних хемијских средстава, такође, могу да омогуће развој плесни, самим тим и микотоксина већ на пољу. Остаци прошлогодишњих усева су одлична подлога за развој плесни и, наравно, извор са кога плесни лако прелазе на биљку која расте. Ако се повећана влажност усева и висока температура задрже и након скидања усева, наставља се раст плесни и продукција микотоксина. Даља контаминација усева се обично наставља складиштењем, када се одређеним пропустима и коришћењем хемијски и механички неодговарајућих складишта, може контаминирати усев, који на пољу није био загађен. Трихотецене продукују различити родови плесни као што су Trichoderma, Myrothecium, Stachybotrys, Fusarium и Trichothecium. Име самих трихотецена је изведено из имена рода Trichothecium (WHO, 1990). Већина плесни које их продукују припадају роду Fusarium, од којих се најчешће сусрећу, F. acuminatum, F. avenaceum, F. chlamydosporium, F. crookwellense, F. culmorum, F. equesti, F. graminearum, F. moniliforme, F. nivale, F. oxysporium, F. poae, F. proliferatum, F. sambunium, F. scirpi, F. semetectum, F. solani, F. sporotrichioides, и F. tricinctum (Eskola, 2002). Број трихотецена изолованих из природних извора износи више од 200 (Nielsen и Thrane, 2001) и њихов број непрестано расте. Међутим, само неколико микотоксина из групе трихотецена контаминирају храну, као што су деоксиниваленол, ниваленол (NIV), диацетоксисцирпенол (DAS), 3-ацетилдеоксиниваленол (3-AcDON), 15- ацетилдеоксиниваленол (15-AcDON), 4-ацетилниваленол (fusarenon-x, Fus-X), HТ-2 токсин и Т-2 токсин, од којих се најчешће јавља DON (WHO, 1990). 4

9 Физичке и хемијске особине Трихотецени припадају групи тетрацикличних сесквитерпеноида. Већина садржи двоструку везу између атома C9 и C10, као и епоксидни прстен у положају C12,13 те су названи 12,13-епокситрихотецени (Langseth и Rundberget, 1998). По својој хемијској структури, трихотецени се могу поделити на макроцикличне и немакроцикличне, зависно од тога да ли је присутан макроциклични прстен између C4 и C15, или није (Leeson и сар, 1995). Осим ове структурне разлике, макроциклични трихотецени се од немакроцикличних разликују и по томе што осветљени ултраљубичастом (UV) светлошћу интензивно флуоресцирају. Њихова основна подела је извршена према њиховим карактеристичним функционалним групама, на трихотецене А, Б, Ц и Д групе. Трихотецени групе А, могу да садрже хидроксилну или ацилокси-групу у положају C8. Најпознатији представник ове групе је веома токсични Т-2 токсин. Као део ове велике групе трихотецена, DON је веома значајан, пре свега због његове велике распрострањености у житарицама, као и због чињенице да је он нека врста индикатора за могуће присуство других, знатно токсичнијих трихотецена те се стога нарочита пажња поклања његовом одређивању Особине деоксиниваленола Продукција и присуство у природи Деоксиниваленол је микотоксин који продукују плесни рода Fusarium, најчешће Fusarium graminearum и Fusarium culmorum (JECFA, 2001). Присуство ових плесни је изражено код житарица, с тим да нарочиту осетљивост показују пшеница и кукуруз узрокујући њихово труљење. Поред на овим културама, наведенe плесни се јављају на јечму, зоби и ражи, као и на производима од житарица - сладу, пиву и хлебу (Scientific Committe on Food, 1999). У страној литератури болест пшенице и јечма изазвана овом плесни је позната под именом Fusarium head blight, а болест кукуруза под именом Gibberella ear rot (JECFA, 2001). Инфекцији пшенице овим плеснима која се одиграва у току фазе цветања, погодује топло и влажно време. Оптимална температура за раст Fusarium graminearum је 25 C и влажност изнад 88%, док за раст Fusarium culmorum она износи 21 C и 87% (JECFA, 2001). Најпогоднији услови за продукцију DON-а од стране Fusarium graminearum 5

10 према Martins и Martins (2002) су 22 C (6,0 mg/kg) и 28 C (5,5 mg/kg), након 35 дана инкубације. Међутим, наведени аутори су нашли да при температури од 37 C не долази до продукције DON-а. Као последица инфекције долази до смањења величине зрна, смањења количине протеина у зрну, као и штетног утицаја на клијавост. Крајњи резултат свега овога је смањење приноса и квалитета хранива (Prom и сар., 1999). Током инфективног процеса, ове плесни продукују секундарни метаболит, предмет нашег интересовања, назван деоксиниваленол или вомитоксин. Овај токсин се најчешће истовремено јавља са осталим Fusarium микотоксинима у пшеници, јечму, кукурузу, као и у дурум пшеници, данас веома интересантној због производње тестенине (Krska и сар., 2001). Будући да је DON термички стабилан, он у изворној форми опстаје током складиштења и целокупног ланца хране, тако да је присутан и у производима од житарица, хлебу, храни за децу, сладу, пиву и др. Осим у житарицама, присуство DON-а је детектовано у бананама (Jiménez и сар., 1997), кикирикију и путеру од кикирикија, кинеској шећерној трсци (Al-Julaifi и Al-Falih, 2001), пиринчу (Al-Julaifi и Al-Falih, 2001; Mateo и сар., 2001), као и др. Овај микотоксин, као последица неповољних климатских услова, може бити присутан у чак 100% укупног броја зрна и то у опсегу од µg/kg (Langseth и Rundberget, 1998) Физичке и хемијске особине године Morooka и сар. су изоловали деоксиниваленол и назвали га Rd токсин. Годину дана касније Yoshizawa и Morooka (1973) су одредили структуру овог једињења и назвали га 4-деоксиниваленол. Исте године, Vesonder ет ал. (1973) су изоловали из зараженог кукуруза, једињење, које је изазивало одбијање хране и повраћање (лат. vomitus) код животиња, те га називају вомитоксин. По својој хемијској структури, деоксиниваленол припада трихотеценима Б групе и садржи, као што се на слици 1 може видети, у положају C12,13 епоксидну групу, 3 OH-групе и једну α,βнезасићену кето-групу, тако да је његово име 12,13-епокси-3α,7α,15- трихидрокситрихотец-9-ен-8-он. 6

11 Слика 1. Структура деоксиниваленола ( Деоксиниваленол је безбојна кристална супстанца, са тачком топљења у интервалу од 151 до 153 C. Присутна незасићена α,β кето група је одговорна за апсорпцију у UV области, с тим да UV спектар деоксиниваленола није изразито карактеристичан. Ово једињење је растворљиво у води, као и у поларним растварачима, као што су ацетон, ацетонитрил и етилацетат. DON је стабилан и на температурама до 120 C, као и у умерено киселим срединама. Релативно је стабилан и у растворима пуфера у опсегу ph од 1 до 10. Међутим, при високим вредностима ph (преко 11), високој концентрацији соли, вишој температури (80 C), као и при дуготрајној изложености оваквим условима долази до деградације овог токсина (Lauren и Smith, 2001). Такође налазе да долази до значајне редукције садржаја DON-а у узорцима кукуруза (у опсегу од %) уколико се третира раствором натријум-карбоната. Наиме, наведени аутори налазе да излагањем анализираног раствора DON-а (5 µg/cm 3 ) при ph 12 у 1 mol/dm 3 раствору На2CО3 током 24 сата на собној температури долази до деградације 50% овог токсина. Слични резултати су добијени и у 1,19 mol/dm 3 раствору натријум-хидрогенкарбоната при ph 8 након 10 дана на собној температури. Међутим, повећањем температуре ефикасност деградације се повећава, тако да на 80 C, при ph 8, током 24 сата чак и у разблаженијим растворима натријум-хидрогенкарбоната (0,1 mol/dm 3 ) долази до већег степена деградације (60%). Young и сар. (1987) су утврдили да долази до значајне редукције нивоа DON-а (до 95%) уколико се контаминирани кукуруз третира у аутоклаву један час на 121 C у присуству 8,33% воденог раствора натријум-хидрогенсулфита. Међутим, само термичко третирање узорака кукуруза, обогаћених DON-ом, у аутоклаву при условима 7

12 истим као у индустријском процесу, је резултирало несигнификантним смањењем (p < 0,05) количине DON-а (Wolf-Hall и сар., 1999) Утицај на здравље животиња Токсикокинетика и симптоми тровања деоксиниваленолом Акутна токсичност DON-а на животињама се манифестује одбијањем хране, повраћањем, диареом и коначно, губитком тежине. Нарочито су осетљиве свиње, које храну одбијају већ при концентрацијама DON-а од 1-2 mg/kg хране, док је минимална еметичка доза код ових животиња 0,05-0,2 mg/kg телесне тежине, уколико се уноси орално (Scientific Committe on Food, 1999). Сличан ефекат је запажен код паса и мачака. Узимање хране код паса је знатно редуковано уколико је садржај DON-а већи од 4,5 mg/kg, док је код мачака ниво DON-а виши и износи 7,7 mg/kg (Hughes и сар., 1999). Претпоставља се да је одбијање хране код животиња последица утицаја DON-а на серотонински систем који посредује у процесу узимања хране и нагона за повраћање (Rotter и сар., 1996). Последица акутног тровања овим токсином може да доведе до некрозе ткива гастроинтестиналног тракта, коштане сржи, као и лимфног ткива (Scientific Committe on Food, 1999). DON је познат као инхибитор синтезе DNA и RNA, као и синтезе протеина на нивоу рибозома. Овај токсин, такође, поседује хемолитички ефекат на еритроците (Scientific Committe on Food, 2002). Постоје докази да DON поседује имуносупресивна и имуностимулаторна својства у зависности од дозе, као и времена експозиције (Rotter и сар., 1996). Не постоје докази о карциногеном, мутагеном и тератогеном ефекту DON-а, као и о значајнијој акумулацији резидуа овог токсина у ткиву и телесним течностима (Prelusky и Trenholm, 1991). У прилог овој тврдњи говоре и експерименти са пацовима који су показали да се овај токсин након 96 сати од оралног уношења у организам животиње, излучује путем фецеса (64%) и путем урина (25%) (Lake и сар., 1987), као и експерименти Prelusky и сар. (1986a) који су утврдили да након оралног уношења DON-а у организам пилића, долази до излучивања 79, 92, односно 98% унесеног токсина у току 24, 48 и 72 сата. Све ово наводи на закључак да се DON не депонује у значајнијим количинама у организму животиња. Његова метаболичка трансформација у организму се заснива на де-епоксидацији и 8

13 глукуронидацији што доводи до губитка токсичних особина и настајања његовог редукованог облика, у којем се излучује из организма (WHO, 1990). Што се тиче дејства на људе, симптоми тровања DON-ом могу бити развијени унутар 30 минута од времена уноса токсина у организам, и описују се као бол или осећај надувености абдомена, вртоглавица, главобоља, мучнина, повраћање и пролив. Овакве симптоме није једноставно разликовати у односу на уобичајене гастроинтестиналне проблеме изазване микроорганизмима (JECFA, 2001). Нека епидемиолошка истраживања у Индији године су забележила тровања храном, којом је доминирала контаминирана пшеница. Међутим, подаци су сакупљани четири месеца после почетка инфекције и излагање људи није било ограничено искључиво на DON, већ је укључивало и друге токсине, што води извесној несигурности у процени нивоа штетног дејства DON-а (Scientific Committe on Food, 1999). Многи аутори су посветили велику пажњу проучавању судбине DON-а након његовог уношења у организам животиња. Бројним истраживањима је утврђена различита биодоступност DON-а код различитих врста животиња. Оралним уношењем 5 mg/kg телесне масе деоксиниваленола у организам овце, унутар 30 минута је у крви откривено 7,5% од укупно унете количине деоксиниваленола. Узимање узорака крви је поновљено унутар 30 часовног периода и деоксиниваленол, као и његов де-епокси метаболит нису пронађени. Одређивање је вршено помоћу GC ECD (Prelusky и сар., 1985). Оралним уношењем исте количине деоксиниваленола, такође у организам овце, након 36 часова, Prelusky и сар. (1986b) утврђују присуство 6,9% унетог микотоксина у урину и 0,11% у жучи. Анализа је такође вршена помоћу GC ECD. Појава и присутност деоксиниваленола је посматрана и у крви крава музара којима је орално дозирано 920 mg деоксиниваленола (што одговара 1,84 mg/kg телесне масе). Истраживања су вршена унутар 24 сата, а серумске концентрације DON-а су биле испод нивоа детекције методе која је коришћена (GC-MS) (Prelusky и сар., 1984). Насупрот овим врстама животиња, висока присутност DON-а је уочена код свиња, 24 сата након уношења интрагастричне дозе од 0,6 mg/kg телесне масе. C-14 деоксиниваленола или интравенске дозе од 0,3 mg/kg телесне масе. Применом GC-MS методе је потврђено присуство 55% од укупно унете количине означеног деоксиниваленола (Prelusky и сар., 1988). Даљим експериментима са другим врстама животиња, Lake и сар.(1987) су мушким јединкама пацова оралним путем давали 10 9

14 mg/kg радио-означеног C-14 деоксиниваленола. Након 96 сати, 25% унесеног DON-а је откривено у урину, 64% у фецесу, а свега 0,11% у издахнутом ваздуху. Prelusky и сар. (1986а) након уношења 2,2 mg (што одговара 1,3-1,7 mg/kg телесне масе) радиоозначеног C-14 деоксиниваленола у организам пилића, након 24, 48 и 72 сата, уочавају излучивање путем екскрета 79, 92 и 98% од укупно унесене количине радио-означеног деоксиниваленола Резидуе деоксиниваленола и елиминација из организма Резидуе деоксиниваленола су веома значајне, нарочито у млеку и јајима, пре свега, због значаја ових намирница за људску исхрану. Пренос деоксиниваленола у млеко је посматран након храњења крава музара (Prelusky и сар., 1984). Једнострука орална доза је износила 920 mg деоксиниваленола који је потицао из Fusarium контаминираног кукуруза. Млеко је сакупљано 2 пута дневно и највећа концентрација, која је одређивана помоћу течне хроматографије (LC), је износила 4 ng/ml. Charmley и сар. (1993) су поделили 18 крава холштајн расе у 6 група и хранили храном која је садржавала 0, 5 и 12 mg/kg суве материје, односно дневни унос деоксиниваленола је износио 0,0; 0,085 и 0,21 mg/kg телесне масе. Користећи методу LC MS са границом детекције од 5 ng/ml, ови аутори нису утврдили присуство деоксиниваленола или његовог де-епокси метаболита у млеку. Такође, није уочено смањење дневног уноса хране и производње млека, али је уочено смањење количине млечне масти код две групе крава које су храњење храном која је садржавала деоксиниваленол. Пренос деоксиниваленола у јаја је посматран код кока носиља, тако што је свакој коки давана једнострука орална доза радио-означеног C-14 деоксиниваленола у количини од 2,2 mg/kg (што одговара 1,3-1,7 mg/kg телесне масе) (Prelusky и сар.,1987). У јајима која су снешена унутар 24 сата је утврђена присутност 0,087% DON-а од укупно унешене количине (што одговара 1,9 µg деоксниваленола или метаболита по јајету). Након поновљеног дозирања за 6 дана максималан износ DON-а је био 0,19% унешене дневне дозе деоксиниваленола (у овом случају је то одговарало количини од 4,2 µg деоксиниваленола или метаболита по јајету). Исти аутори две године касније (Prelusky и сар.,1989), током 65 дана хране коке носиље храном која је садржавала 5,5 mg/kg радио-означеног C-14 деоксиниваленола. Током првих 8 дана уношења контаминиране хране, ниво резидуа DON-а у јајима, расте. Максимална количина у јајима је откривена након 8 дана администрирања у износу од 1,7 µg по јајету, што представља 0,31% 10

15 унесене дневне дозе. Од тог тренутка до периода око 30. дана ниво резидуа, супротно очекивањима, полако опада и задржава се на константном нивоу све до престанка уноса хране која садржи радиоактиван DON. Након престанка уноса контаминиране хране резидуе DON-а нису детектоване. Такође, ови аутори закључују да је DON знатно више заступљен у жуманцу него у беланцу, а најмање га има у љусци јајета. На основу свега, Prelusky и сар. (1989) закључују да су након дугог периода (65 дана) конзумирања контаминиране хране DON-ом, нађене концентрације резидуа овог микотоксина у јајима биле минималне. Хранећи одрасле коке носиље храном која је садржавала 18,0 mg DON-а/kg хране, Kubena и сар. (1987) налазе да нема значајних ефеката на телесну тежину самих носиља, дневну производњу јаја, тежину јаја, као и конзумацију хране. Чак уочавају мало, али ипак значајно повећање висине беланца, али и смањење масе и укупног процента љуске јаја код групе носиља храњених храном која је била контаминирана DON-ом. Sypecka и сар. (2004) за експеримент користе 19- то недељне коке носиље (врста Bovan Goldline). 32 јединке су подељене у 4 експерименталне групе, једну контролну и оне које су храњене са 5,0; 7,5 и 10,0 mg DON-а/kg хране. Животиње су током 3 недеље аклиматизације храњене оброцима (200 g/дан) заснованим на пшеници, соји и сунцокрету. Затим су носиље храњене 3 недеље храном која је била природно контаминирана DON-ом и пре чина жртвовања су поново храњене недељу дана неконтаминираном храном. Сва снесена јаја су сакупљена и измерена. Пре хомогенизације и чувања јаја на -20 C, измерена је маса љуске и заједнички садржај беланца и жуманца. Након тронедељног храњења храном која је садржавала 5,0; 7,5 и 10,0 mg DON-а/kg хране, Sypecka и сар. (2004) су у свакој од наведених група јаја утврдили просечно 0,33; 0,41 и 0,35 mg/kg DON-а. На основу ових резултата, аутори су закључили да, након храњења кока носиља контаминираном храном, нема значајнијег преноса DON-а у јаја. Чак ни врло висок садржај DON-а у храни (10,0 mg/kg) није имао значајнији утицај на принос јаја, њихову масу или дебљину љуске Дијагностика микотоксикоза У савременој сточарској производњи дијагностика микотоксикоза представља велики проблем из висе разлога. Schiefer (1990) је набројао факторе који отежавају постављање дијагнозе микотоксикоза. Аутор пре свега наводи постојање неспецифичних лезија као што је некроза јетре, која може бити изазвана од стране 11

16 различитих нокси. Затим, ефекти микотоксина могу бити маскирани секундарним ефектима који се појављују као примарни, као што је појава имуносупресије. Такође, код постојања неоплазија, које су откривене у касној фази, није могуће открити етиолошку основу. Велики проблем у дијагностици представља и интеракција више микотоксина, који у комбинацији са другим токсичним материјама, доводе до појаве необичних ефеката који се не могу повезати са микотоксикозама или се повезују са другим (погрешним) стањима. На крају, аутор наводи да је некада немогуће поставити етиолошку дијагнозу јер микотоксини или њихови метаболити нису присутни у храни за животиње. Дијагностици микотоксикоза треба приступити систематски. Потребно је пажљиво испитати већину органских система при чему је неопходно укључити принципе дијагностике тровања. Schiefer (1990) је дао смернице приликом дијагностике микотоксикоза. У даљем тексту ће бити описани само оне које се односе на трихотецене микотоксикозе. Када је у питању кожа, примарни ефекти се јављају само код тровања трихотеценима и то у виду иритације. Повраћања централног порекла такође могу бити изазвана тровањем токсинима из ове групе. Трихотецени доводе и до различитих промена у дигестивном тракту као што су перорални дерматитис, упала једњака и гастритис. Такође, могу изазвати и озбиљне дегенеративне промене у хематопоетском систему као што је тешка атрофија коштане сржи, затим поремећаје у кардиоваскуларном систему, крварења, дисеминоване интраваскуларне коагулације као и репродуктивне поремећаје (отежана спермиогенеза, ембриотоксични и тератогени ефекти). За дијагностику значајнијих ефеката нема када су у питању респираторним, ендокрини, уринарни и хепатобилијарни систем Превенција Пошто контаминација хране за животиње микотоксинима представља озбиљан проблем, последњих година се поклања посебна пажња заштити животиња коришћењем смеше адсобената и сточне хране за које се претпоставља да ефикасно везују микотоксине у гастро-интестиналном тракту. У ту сврху се користе различите врсте адсорбената од којих су најчешћи алумосиликати, активни угаљ и разне врсте полимера. Само везање микотоксина за адсорбент зависи како од хемијске структуре 12

17 микотоксина, тако и од адсорбента (Huwig и сар., 2001). Посебно место у уклањању деоксиниваленола има активни угаљ. Испитујући 19 различитих типова активног угља, који се међусобно разликују по одређеним физичко-хемијским особинама (површина, јодни број и индекс метиленског плавог), Galvano и сар. (1998) су установили да се адсорпција DON-а креће у опсегу од 1,83 до 98,93% зависно од типа активног угља. Испитујући хидрирани натријум-калцијум-алумосиликат и сепиолит исти аутори су установили да не показују ефикасно везивање DON-а. Поред адсорбената за детоксикацију DON-а, али и осталих микотоксина често се користи и микробиолошка деградација. Познато је да је 12,13-епоксидни прстен DON-а, али и осталих трихотецена, одговоран за њихову токсичну активност. Бактерија Eubacterium тип BBSH 797 врши деградацију овог прстена и коначну биотрансформацију трихотецена у не токсични метаболит (Heidler, 2003). Заштита од микотоксина може се спроводити превенцијом контаминације или поступцима елиминације (Синовец и сар., 2006). Поступци превенције контаминације обухватају превенцију у пољу (укључују култивацију земљишта у смислу побољшања чврстоће биљака, правилно коришћење инсектицида и фунгицида у циљу смањења инфекције плеснима и инфестације инсектима и наводњавање у циљу превенирања штетног деловања суше) односно превенцију у складишту кроз употребу физичких (одговарајућа температура, влажност) и хемијских (конзервирање) метода. Поступци елиминације микотоксина се примењују када је храна већ контаминирана микотоксинима и они обухватају поступке сепарације микотоксина који могу бити физички (уклањање зрневља који су, на основу промена органолептичких својстава, сумњива на присуство микотоксина), хемијски (екстракција микотоксина хемијским средствима при чему се губе и хранљиве материје) односно поступци деградације, детоксификација (конверзије токсичних материја у нетоксичне деривате) и детоксикације (уклањање токсичних супстанци из хране селективним растварачима или поступцима). Уклањање микотоксина је изузетно значајна тема којој се у нашој земљи још не поклања довољно пажње, тако да даља истраживања треба усмерити у овом правцу. 13

18 1.4. Правна регулатива Што се тиче правне регулативе о максимално дозвољеним количинама деоксиниваленола, у Европској Унији директивом EC/1881/2006 односно регулативом EC/32/2002 је усаглашен ниво максимално дозвољених количина DON-а у намирницама и храни за животиње (Табела 1а и 1б). Табела 1a. Максимално дозвољене количине деоксиниваленола (EC/1881/2006) Храна и храна за животиње Максимално дозвољене количине (µg/kg) Непрерађене житарице, осим дурум пшенице, зоби и кукуруза Непрерађена дурум пшеница и зоб Непрерађени кукуруз Житарице, брашно, мекиње и клице намењени за непосредну исхрану људи осим хране наведене у 750 тач Тестенина (сува) Хлеб (укључујући мале пекарске производе), пециво, кекс, снек производи и жита за доручак Прерађена храна на бази житарица 200 Табела 2b. Максимално дозвољене количине деоксиниваленола (EC/32/2002) Производи намењени за храну за животиње Максимално дозвољене количине (µg/kg) 8000 Житарице и производи од житарица осим производа од кукуруза Производи од кукуруза, Допунске и потпуне смеше осим за: 5000 свиње 900 телад ( 4 месеца), јагњад и јарад, 2000 Максимално дозвољена количина деоксиниваленола за САД у пшеничним производима, као што су брашно и мекиње, износи 1000 µg/kg (Lombaert, 2002). У 14

19 Канади за непречишћену пшеницу износи 2000 µg/kg. Максимално дозвољена количина DON-а у пшеници, брашну и мекињама у Русији износи 1000 µg/kg. Иста количина DON-а у житарицама је дозвољена у Кини (Li и сар., 2002). Правилником о квалитету хране за животиње (Сл. гласник РС, 4/2010) је у нашој земљи прописана максимално дозвољена количина која се односи на укупне трихотецене и она за крмне смеше за исхрану пилића, прасади и телади износи 0,3 mg/kg, а за крмне смеше за исхрану крмача, говеда и перади износи 0,6 mg/kg, док се је ова количина за деоксиниваленол регулисана само у потпуним и допунским смешама за свиње и износи 0,5 mg/kg. Правилником о максимално дозвољеним количинама остатака средстава за заштиту биља у храни и храни за животиње и о храни за животиње за коју се утврђују максимално дозвољене количине остатака средстава за заштиту биља (Сл. гласник РС, 20/2013) се предвиђају исте вредности као и у Европској регулативи. 15

20 2. ЦИЉ РАДА У овом раду се планира примена ELISA технике за одређивање деоксиниваленола у хранивима. Овим истраживањима ће претходити валидација методе као потврда ваљаности технике за одређивање овог микотоксина у храни за животиње. Под претпоставком да се метода покаже као ваљана, биће примењена за испитивање прикупљених узорака хранива у циљу добијања потпунијег увида у погледу садржаја деоксиниваленола. Биће анализирано више врста хранива како би се испитала појединачна осетљивост на Fusarium spp. Највећи број прикупљених узорака чини кукуруз због његове високе процентуалне (50-70%) заступљености у смешама за исхрану животиња, али и пшенице због значаја и у људској исхрани као и у исхрани животиња. Добијени резултати ће потом бити упоређени са резултатима из наше земље и региона. Такође ће ови резултати бити анализирани у функцији климатских услова који су владали у одговарајућој производној години. 16

21 3. МАТЕРИЈАЛ И МЕТОД РАДА 3.1. Узорци, хемикалије и раствори Узорци хранива који су анализирани прикупљени су током календарске године. Порекло узорака је различито, са више локација у Републици Србији, с обзиром да су то узорци који су донети у Лабораторију. Приликом пријема узорака у Лабораторију део материјала се користио за редовне анализе, а део се паковао у пластичне вреће и чувао у замрзивачу на -18 ºC до анализе. Непосредно пред анализу узорци су темперирани до собне температуре и потом припремани за анализу. За екстракцију је коришћена дејонизована вода добијeна реверзном осмозом на RO system (Amtast, САД), електропроводљивости <3,5 µs/cm, као и хемикалије које су саставни део тест-кита за одређивање деоксиниваненола (Neogen, САД): готови раствори стандарда деоксиниваленола различитих концентрација (0,25; 0,5; 1; 2 и 5 mg/kg), супстрата, коњугата и стоп реагенса). За потребе валидације аналитичког поступка је коришћен сертификовани референтни материјал - пшеница природно контаминирана деоксиниваленолом, ознаке TR-D100 (Trilogy, USA) Апаратура Одређивање деоксиниваленола ELISA техником је вршено на читачу микротитарски плоча ELx800 (Bio-Tek Instruments, САД) који поседује филтере за таласне дужине од 405 nm, 450 nm и 630 nm. Приликом екстракције DON-а из узорка кукуруза, коришћен је хомогенизатор T-18 Basic (IKA, Немачка), а за филтрацију је коришћена 5B Advantec филтер-хартија (0,13 mg/круг, пречника 125 mm, Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Јапан). Наношење узорака, стандардних раствора DON-а и реагенаса на микротитарске плоче је вршено микропипетом варијабилне запремине Labopette µl (Hircshmann, Немачка). Остала лабораторијаска опрема: лабораторијска чаша од 150 cm 3 ; левак стаклени; одмерна мензура од 100 cm 3 ; епрувете стаклене; градуисане пипете од 1 и 5 cm 3, aналитичка вага EL204-IC (Metller Toledo, Швајцарска). 17

22 3.3. Аналитички поступак Принцип Деоксиниваленол је екстрахован из узорака дејонизованом водом. Након филтрације сирови екстракт је разблажен пет пута у дејонизованој води. Потом се разблажени сирови екстракт наноси на ELISA микротитар плочу. Након испирања, додаје се супстрат који реагује са везаним коњугатом при чему долази до појаве боје чији интензитет је обрнуто пропорционалан концентрацији микотоксина. Реакција се прекида додатком стоп реагенса, а интензитет оптичке густине се очитава на читачу микротитарских плоча, на таласној дужини од 630 nm Припрема узорка Анализирани узроци хранива су рода године. Узроци прикупљени насумично, након приспећа у лабораторију. Одабрани су узроци хранива које се најчешће користе за припремање готових смеша за исхрану животиња и то: кукуруз, пшеница, сточно брашно, сунцокретова сачма и сојина сачма. Одмах по пријему узорака у лабораторију, 1000 g сваког узорка је припремљено млевењем у лабораторијском млину, до величине честица од 1 mm, а затим је узорак хомогенизован мешањем. Тако припремљени узроци су паковани у пластичне кесе и складиштени у замрзивачу на -18 C до анализе. Пре сваке анализе, узроци су темперирани до собне температуре. Након одмрзавања узорка, за анализу је у лабораторијску чашу од 150 cm 3 одмеравано 20,0 g узорка Ток испитивања Директно на плочу са антителима наноси се 100 µl коњугата, а затим 100 µl стандарда односно профилтрираног и разблаженог раствора узорка у посудицу за мешање. Потом се 100 µl ове мешавине преноси у посудицу с антителима. Инкубира се на собној температури 5 минута. Раствор се уклања и врши се испирање 5 пута дејонизованом водом. Након тога додаје се 100 µl супстрата, инкубира 5 минута и реакција прекида додатком 100 µl стоп реагенса. За идентификацију и одређивање садржаја деоксиниваленола се користе стандарди овог микотоксина, на начин да се врши читање вредности оптичке густине (OD) на 18

23 основу које се конструише калибрациона крива у односу c (mg/kg) - оптичка густина (OD) те се на основу ње израчунава садржај деоксиниваленола у узорку. Користи се читач микротитарских плоча са филтером од 630 nm. Резултати се приказују аутоматски преко рачунарског софтвера Gen Валидација методе Како би се обезбедило поверење у резултате испитивања, неопходно је пре анализирања узорака извршити валидацију методе. Овај поступак је извршен у складу са регулативом Европске Уније (EC/657/2002). Одређивање тачности Тачност методе је мера усаглашености експериментално добијених резултата са правим (стварним) вредностима. Тачност методе се проверава коришћењем сертификованих референтних материјала (CRM) и изражава се као проценат приноса (recovery) одређивања за познату количину испитиваног аналита: R = Cdobijena / CCRM За оцену прихватљивости процента приноса узимају се критеријуми приказани у Табели 2. Табела 2. Критеријуми прихватљивости процента приноса Концентрација Проценат аналита приноса (%) 1% ,1% mg/kg mg/kg mg/kg ppb Испитивање тачности методе је вршено испитиванјем садржаја деоксиниваленола у сертификованом референтном материјалу, у осам понављања. Добијена средња вредност је износила 0,965 mg/kg деоксиниваленола. Ако се узме у обзир да је 19

24 сертификована вредност CRM-a 0,9 mg/kg, онда проценат приноса износи 107,88% што одговара критеријуму прихватљивости од %. Одређивање прецизности Прецизност представља меру расипања резултата серије мерења узорка добијеног вишеструким узорковањем проба од исте масе узорка под прописаним условима. Прецизност се одређује праћењем поновљивости и репродуктивности. Поновљивост методе представља показатељ на основу којег се процењује колико је изабрани метод добар да се његовом применом добија исти резултат на истом узорку у кратком временском интервалу. За квантитативно изражавање поновљивости користе се стандардна девијација (SDr) и релативна стандардна девијација (RSDr) резултата мерења добијених у условима поновљивости. За n 8 граница поновљивости r се са 95 % вероватноће израчунава на основу формуле: r = 2,8 x SDr, где 2,8 = 2 2 потиче од нормалне (Гаусове) расподеле У случају малог опсега варирања добијених аналитичких резултата, вредност стандардне девијације зависи од вредности добијених резултата, тако да уколико су добијене бројчане вредности веће, већа је и стандардна девијација. Стога је за поређење постојећих одступања унутар одговарајућег сета аналитичких резултата, погодније користити релативну стандардну девијацију. Приликом испитивања поновљивости, како би се могла извршити потребна статистичка израчунавања, потребно је извршити најмање 5 испитивања, три различита матрикса узорка, два или три различита нивоа концентрација. За методе којима се испитују животне намирнице, поновљивост у великој мери зависи од матрикса узорка, концентрације појединих састојака и примењене методе испитивања. За оцену прихватљивости резултата испитивања поновљивости могуће је користити модификовану Horwitz-ову једначину: RSDr,H = 2 (1-0,5logC) x 0,67 Где је: RSDr,H могућа релативна стандардна девијација при испитивању поновљивости C концентрација испитиваног састојка у узорку изражена као децимални удео 20

25 Као критеријум прихватљивости добијених резултата испитивања поновљивости узима се: RSDr < RSDr,H односно RSDr < 2 (1-0,5logC) x 0,67 Где је: RSDr стварна релативна стандардна девијација при испитивању поновљивости. Репродуктивност методе представља меру слагања резултата мерења истог показатеља квалитета изведених у условима репродуктивности који подразумевају промену аналитичара, мерног инструмента, локације, услова употребе, времена. Репродуктивност методе представља показатељ који указује на то колико је метода добра за добијање истог резултата мерења испитивањем истог узорка у условима репродуктивности. За квантитативно изражавање репродуктивности се користе вредности стандардне девијације резултата добијених у условима репродуктивности (SDR) и релативне стандардне девијације (RSDR), а за n 8 граница репродуктивности R се са 95 % вероватноће израчунава по формули: R = 2,8 x SDR где 2,8 = 2 2 потиче од нормалне (Гаусове) расподеле. Приликом квантитативног изражавања репродуктивности могућа је употреба Horwitz -ове једначине, која се користи као критеријум прихватљивости за израчунату репродуктивност. Употреба Horwitz-ове једначине омогућава једноставан начин процене прихватљивости прецизности било које аналитичке методе и има облик: RSDR,H = 2(1-0,5logC) Где је: RSDr,H могућа релативна стандардна девијација при испитивању поновљивости C концентрација испитиваног састојка у узорку изражена као децимални удео Поређење стварне репродуктивности са могућом репродуктивношћу методе, израчунатом коришћењем Horwitz-ове једначине, омогућава HORRAT вредност: HORRATR = RSDR /RSDR,H Gde je: HORRATR HORRAT вредност за репродуктивност 21

26 RSDR релативна стандардна девијација при испитивању репродуктивности добијена на основу резултата мерења RSDR,H могућа релативна стандардна девијација при испитивању репродуктивности израчуната на основу Horwitz-ове једначине. Ниво репродуктивности аналитичке методе је прихватљив уколико је израчуната HORRATR вредност мања од 2. Испитивањем поновљивости, критеријум прихватљивости добијених резултата RSDr < RSDr,H применом модификоване Horwitz-ове једначине се сматра испуњеним јер је вредност стварне релативне стандардне девијације (8,24) мања од вредности могуће релативне стандардне девијације (10,755). У случају испитивања репродуктивности, квантитативно изражена репродуктивност (Р) износи 0,231. Критеријум прихватљивости добијених резултата испитивања поновљивости RSDr < RSDr,H применом модификоване Horwitz -ове једначине се сматра испуњеним јер је вредност стварне релативне стандардне девијације (8,43) мања од вредности могуће релативне стандардне девијације (16,053). Добијена HORRAT вредност (0,525) се сматра прихватљивом за критеријум HORRATR < 2. Одређивање границе детекције и границе одређивања Граница детекције (LOD) представља најмању количину аналита у узорку која се може детектовати, али не и квантификовати. Овај параметар примјењује се само код валидација метода одређивања онечишћења било квантитативном методом или лимит тестом. Граница детекције се израчунава из формуле: LOD = 3 x SDsp Где је: SDsp - стандардна девијација 8 поновљених мерења слепе пробе. Граница одређивања (LOQ) представља најмању количина аналита у узорку која се може квантификовати уз одговарајућу прецизност и тачност. Граница квантификације је параметар који се одређује код квантитативних анализа код којих је ниво концентрације аналита који се одређује низак. 22

27 Граница одређивања се израчунава из формуле: LOQ = 10 x SDsp Где је: SDsp - стандардна девијација 8 поновљених мерења слепе пробе. Мерењем оптичких густина слепе пробе у осам понављања добијена је стандардна девијација од 0,02 mg/kg што, након примене горе наведених формула даје вредност за границу детекције од 0,07 mg/kg, односно за границу одређивања од 0,22 mg/kg. Вредности деоксиниваленола које су ниже од вредности границе одређивање биће посматране као негативне, тј. да узорци са таквим вредностима не садрже овај микотоксин. Одређивање мерне несигурности Одређивање мерне несигурности је извршено према NORDTEST-у (Magnusson и сар., 2012). Утврђена проширена мерна несигурност износи 47,79%. 23

28 4. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 4.1. Садржај деоксиниваленола у узорцима хранива Након извршене валидације одређивања DON-а у хранивима ELISA техником, приступило се одређивању овог микотоксина у прикупљеним узорцима хранива након екстракције. Испитивани узорци хранива су подељени, према врсти, у следеће групе: кукуруз, пшеница, сточно брашно, сунцокретова сачма и сојина сачма. Табела 3. Присуство деоксиниваленола у хранивима Број Позитивних Узорака преко Храниво % % узорака узорака регулативе Кукуруз ,2 - - Пшеница ,9 - - Сточно брашно ,0 1 14,3 Сунцокретова сачма ,8 - - Сојина сачма ,0 - - Укупно ,3 1 2,0 Као што се може видети из табеле 3, од 75 анализираних узорака хранива, деоксиниваленол је присутан у 49 (65,3%) узорака. Када посматрамо хранива појединачно, деоксиниваленол је био присутан у 100% узорака у случају сточног брашна и сојине сачме. У узорцима кукуруза, присуство овог микотоксина је износило 43,2%, док је у узорцима пшенице и сунцокретове сачме нешто више и уједначено (76,9% односно 77,8%). Применом метода дескриптивне статистике може се установити да се садржај деоксиниваленола у узорцима кукуруза кретао у концентрационом опсегу од 221 до 684 µg/kg, затим у узорцима пшенице од 219 до 913 µg/kg. Када су у питању узорци пшеничног сточног брашна садржај деоксиниваленола се кретао од 293 па чак до 1930 µg/kg, док је у узорцима сунцокретове сачме овај опсег износио од 231 до 915 µg/kg. На крају, узорци сојине сачме су са просечном вредношћу садржаја деоксиниваленола од 512 µg/kg биле у опсегу од 282 до 712 µg/kg. 24

29 Садржај деоксиниваленола (µg/kg) Кукуруз Пшеница Сточно брашно Сунцокретова сачма Сојина сачма Графикон 1. Садржај деоксиниваленола у узорцима хранива Анализом варијансе (ANOVA) су статистички обрађени сви добијени резултати (Графикон 1), а потом и само позитивни резултати (Графикон 2) са циљем испитивања значајности између испитиваних група хранива. Утврђене су вредности средине најмањих квадрата (LSM), стандардна грешка средине најмањих квадрата (SELSM), минималне и максималне вредности са вероватноћом од 95%. За испитивање значајности између испитиваних група хранива урађен је Tucky HSD тест, помоћу софтверског пакета Statistica 12. Табела 4. Просечан садржај деоксиниваленола (µg/kg) у узорцима хранива Храниво LSM SELSM Минимум Максимум (-95%) (+95%) N Кукуруз Пшеница 320 ns Сточно брашно 607 ** Сунцокретова сачма 381 ns Сојина сачма 512 ** ** - високо статистички значајно (p < 0,01) ns - није статистички значајно (p > 0,05) 25

30 Табела 5. Просечан садржај деоксиниваленола (µg/kg) у позитивним узорцима Храниво LSM SELSM Минимум Максимум (-95%) (+95%) N Кукуруз Пшеница 416 ns Сточно брашно 607 ns Сунцокретова сачма 489 ns Сојина сачма 512 ns ** - високо статистички значајно (p < 0,01) ns - није статистички значајно (p > 0,05) Као што се може видети из табеле 4, посматрајући резултате свих узорака хранива, може се утврдити високо статистички значајна разлика између узорака кукуруза и узорака пшеничног сточног брашна. Такође постоји високо статистички значајна разлика између узорака кукуруза и узорака сојине сачме. Поређењем осталих хранива није утврђена статистички значајна разлика Садржај деоксиниваленола (µg/kg) Кукуруз Пшеница Сточно брашно Сунцокретова сачма Сојина сачма Графикон 2. Садржај деоксиниваленола у позитивним узорцима хранива 26

31 С друге стране, поређењем само позитивних резултата сваке групе хранива (Табела 5), није утврђена статистички значајна разлика између хранива. Садржај овог микотоксина превазилази максимално дозвољене концентрације прописане Правилником (Сл. гласник РС, 20/2013) само у случају узорака сточног брашна и то у једном узорку са концентрацијом од 1930 µg/kg. Просечни садржај деоксиниваленола у узорцима хранива (Табела 4) се кретао од 345 µg/kg у случају кукуруза до 607 µg/kg у случају сточног брашна. Уопштено речено, садржај деоксиниваленола у хранивима он је углавном уједначен и знатно испод вредности прописаних регулативама Србије и ЕУ. Изузетак представљају поједини узорци пшенице и пшеничног сточног брашна са садржајем деоксиниваленола блиским или нешто вишим вредностима од максимално дозвољених које су наведене у поменутим регулаторним документима. Када се узме у обзир да је пшеница веома осетљива на инфекцију фузаријумским плеснима, овакви резултати не представљају нарочито изненађење. Изненађујуће је да је у узорцима сојине сачме деоксиниваленол детектован у 100% узорака са средњом вредношћу од 512 µg/kg, јер соја, по правилу, није осетљива на Fusarium graminearum (Neshein и Wood, 1995) Присуство деоксиниваленола у функцији климатских услова Према извештају JECFA (2001), оптимална температура за раст Fusarium graminearum је 25 C и активност воде изнад 0,88. Martins и Martins (2002) наводе да на температури од 37 C Fusarium graminearum не продукују деоксиниваленол. Инфекција фузаријумским плеснима је уско повезана са влажним временом у периоду цветања биљака, а познато је и да је период влажног времена значајнији од количина падавина (JECFA, 2001). За пшеницу у климатском региону Србије је то крај месеца маја и почетак јуна. Код кукуруза инфекција клипа најчешће почиње на његовом врху, када плесни продиру преко свиле, у фази цветања кукуруза (Sutton, 1982). Клип је на контаминацију најосетљивији на почетку свилања, а затим како процес свилања одмиче, смањује се и осетљивост клипа (Reid и сар., 1992; Reid и Hamilton, 1996). Изузетно влажно време у овом периоду свилања кукуруза па све до његовог зрења доприноси контаминацији клипа (Vigier и сар., 1997). Период свилања у нашем региону се одиграва око 60 дана од момента ницања биљака (током месеца јула и прве половине августа). 27

32 Према извештају Републичког хидрометеоролошког завода Србије (2012), лето године (јун-август) карактерисало је неуобичајено топло време са веома малом количином падавина које су најчешће захватале мали део територије Србије (Слика 2). Дуготрајне високе температуре ваздуха и мала количина падавина проузроковале су јаку до екстремну сушу на скоро читавој територији земље (Слика 3). Најнеповољнији период за већину пољопривредних култура трајао је од средине јуна до 25. јула када је услед захлађења са падавинама био на кратко прекинут. Слика 2. Просечне максималне и минималне температуре ваздуха, њихова одступања од просека ( ) и просечне падавине (mm) у лето (1. јун 31. август) године у пољопривредном подручју Србије (РХМЗ, 2012). Међутим, веома слаб прилив падавина, високе температуре ваздуха и тла и повећана потрошња воде у августу условили су даље погоршање стања влажности земљишта тако да су крајем лета залихе влаге у тлу биле минималне. Последњи месец периода вегетације, септембар, карактерисало је знатно топлије време од уобичајеног са израженим дефицитом падавина тако да се летњи сушни период продужио и на почетак јесени. Овакви услови су релативно неповољни за развој фузаријумских плесни, што се и може видети из приказаних резултата. С друге стране, климатски услови су одговарали развоју неких других плесни нпр. Aspergillus spp. што се и показало високим присуством афлатоксина у кукурузу током године. 28

33 Слика 3. Услови влажности у Србији, процењени на основу Стандардизованог падавинског индекса (SPI) одређеног за временски период од 90 дана (3. јун 31. август 2012) (РХМЗ, 2012) Присуство у Србији и региону Подаци о присуству деоксиниваленола из земаља које нас окружују или припадају нашем региону су нам посебно интересантни имајући у виду да се наша земља налази у умереном климатском појасу и региону југоисточне Европе. Примарни разлог упоређивања података из земаља нашег региона лежи у чињеници да се у региону југоисточне Европе гаје сличне културе, као и да је примена агротехничких мера у производњи хране земаља овог региона слична. На територији Мађарске, Rafai и сар. (2000) су, у периоду између и 1998., анализирали кукуруз (760), пшеницу (367), соју (119), јечам (222), мекиње (85), овас (60), раж (14) и сунцокрет (22) на присуство DON-а и одредили његову концентрацију 29