Elektroforeza serumskih proteina. Jasna Pavela

Transcript

1 Elektroforeza serumskih proteina Jasna Pavela

2 Elektroforeza Elektroforeza Koristi se za separaciju makromolekula (proteini,nukleinske kiseline,lipoproteini itd.) Putovanje nabijenih čestica u elekričnom polju U vodenoj otopini proteini imaju nabijene skupine npr, karboksilna COO- ( Asp, Glu ), amino NH3+ (Lys, Arg) stoga mogu putovati u električnom polju. Amino skupine disociraju u alkalnom ph, a karboksilne kod kiselog ph. ph kod kojeg je molekula neutralna ( Zwitter ion ) zove se izoelektrična točka pi proteina

3 Elektroforeza Migracija molekula ovisi o naboju molekule ( kationi ili anioni )- mrežni naboj ( -ve, +ve) veličini i obliku molekule ( veće molekule sporije putuju) jačini el.polja ( gustoća ionskog polja utječe na brzinu putovanja-gušće polje usporava migraciju) svojstvima nosača na kojem se odvija ( veličina pora, interakcija sa uzorkom) temperaturi efektu endoosmoze

4 Elektroforeza Vrste elektroforeze 1.) slobodna eletroforeza izvodi se u tekućem mediju razdvajanje se vrši na osnovu različite gustoće proteina 2.) zonska elektroforeza odvija se u solidnom mediju ( škrob, papir, celuloza acetat, agaroza, poliakrilamid gel ) Prva elektroforeza izvedena je 1930 god. Tiselius

5 Kapilarna elektroforeza- CZE Kombinira principe razdvajanja konvencinalnih oblika elektroforeze sa HPLC i kapilarnom tehnologijom Odvija se u tekućem sistemu u kapilarma od stopljenog silikata koje imaju negativan naboj na površini Mehanizam zaslužan za radvajanje elektroosmotski protok( EOF) Elektroendosomoza negativno nabijeni proteini putuju prema negativno nabijenom polu- katodi zbog vezivanja iona pufera na negativno nabijene silanolne skupine u zidu kapilare Posljedica - putovanje iona vode i nabijenih proteinskih molekula prema katodi

6 Sastav proteinskih frakcija u serumu Ƴ globulini: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE β1 globulini: transferin, LDL β2 globulini: C3 komplement α2 globulini: α2 makroglobulin i haptoglobin α1 globulini: α1 antitripsin i AAG Albumin Prealbumin v

7 Klinička stanja Oboljenja bubrega Oboljenja jetre Reakcija akutne faze Hipogamaglobulinemije Hipergamaglobulinemije Monoklonske gamapatije

8 Nefrotski sindrom Izrazito povišena α2 frakcija te smanjena albuminska i Ƴ globulinska frakcija ukazuju na renalni gubitak proteina. Povišenje α2 frakcije posljedica je rasta α2 makroglobulina zato jer zbog veličine α2 makroglobulin ne prolazi glomerularnu bazalnu membranu a osim toga kompenzatorno se sintetizira radi održavanja koloidnoosmotskog tlaka plazme. α1 frakcija nije promijenjena što ukazuje da nije prisutan neki upalni proces uz postojeći glomerularni poremećaj. Primjetno je da je β1 frakcija snižena zbog gubitka transferina kao i Ƴ globulinska frakcija zbog gubitka imunoglobulina.

9 Ciroza jetre Snižena frakcija albumina uz povišenu frakciju gama globulina i pojavu beta gama mosta karakterištična je slika ciroze jetre. Beta gama most se javlja i kod imunoloških bolesti npr. RA ili npr. Chronove bolesti.

10 Primarna bilijarna ciroza. Hipergamaglobulinemija uz visoku koncentraciju IgM. Gama frakcija je pravilna i na anodnom i na katodnom dijelu bez pojave pikova. Iako je IgM visok riječ je o poliklonskoj sintezi. Visoke vrijednosti poliklonskog IgM karakteristične su za PBC.

11 Manjak α1 antitripsina Ref.vrijednost AAT= 0.93 g/l ( ) U relativnom udjelu α1 frakcija je na donjoj granici referentnog intervala dok je u apsolutna koncentracija α1 frakcije snižena. Imunonefelometrijsko mjerenje dokazalo je sniženu vrijednost AAT-a koji je glavni protein α1 frakcije.

12 Reakcija akutne faze Snižena koncentracija albumina i povišene koncentracija α1 i α2 frakcije ukazuju na akutnu upalnu reakciju. Na albuminu je primjetan nagib na anodnom dijelu koji potječe od visoke koncentracije bilirubina. α2 frakcija podijeljena je na α2 makroglobulin te na haptoglobin dok se katodno najvjerojatnije nalazi kompleks hemoglobin- haptoglobin zbog prisutne intravaskularne hemolize. Iako je prisutna izrazita anemija transferin je snižen jer je negativni reaktant akutne faze. U Ƴ frakciji su vidljive nepravilnosti koje nisu monoklonski proteini što je dokazano sa IFE, ali mogu potjecati i od visoke koncentracije CRP-a.

13 Hipogamaglobulinemija IgG 1.92 g/l IgA < 0.58 g/l IgM <0.046 g/l Slobodni laki lanci kapa 8.21 mg/l Slobdni laki lanci lambda 0.33 mg/l Izrazita hipogamaglobulinemija uz povišenje relativnog udjela albumina. Sa IFE nije dokazano prisustvo monoklonskog proteina iako hipogamaglobulinemije često prati pojava Bence-Jones proteina.

14 Hipergamaglobulinemija IFE Visoke vrijednosti ukupnih proteina kao i Ƴ globulina uz sniženje svih ostalih globulinskih frakcija upućuje na moguće prisustvo M- proteina. Ipak unatoč visokom piku u Ƴ globulinskoj frakciji ta frakcija je simetrična. Sa IFE nije dokazano prisustvo M- proteina. Izrazito visoka poliklonska sinteza imunoglobulina može se javiti kod sarkoidoze, Gaucherove bolesti.

15 Monoklonski proteini Produkcija imunoglobulina koji imaju iste antigene i fizikalne karakteristike od strane plazma stanica Elektroforetski se vide kao zaseban pik obično u gama frakciji ali se mogu javiti i ostalim globulinskim frakcijama Mogu se pojaviti u malignim kao i u nemalignim stanjima Najčešća stanja: - Multipli mjielom - Waldenstrom- makroglobulinemija - kronična limfatična leukemija - MGUS- monoklonska gamapatija neodređenog značaja

16 Laboratorijska detekcija monoklonskih proteina Elektroforeza zone restrikcije u području gamaglobulina, najčešće u Ƴ globulinima Imunotipizacija monoklonskog proteina metodom imunofiksacije (IFE) ili imunosuptrakcije (ISUB) Imunokemijsko određivanje koncentracije imunoglobulina Ostale pretrage: ESR, KKS, Ca, β2 mikroglobulin u serumu Biopsija koštane srži Određivanje BJP proteina

17 Monoklonska gamapatija IgG 94.6 g/l IgA 0.10 g/l IgM 0.05 g/l Slobodni laki lanci kapa 6.17 mg/l Slobodni laki lanci lambda mg/l Kapilarna elektroforeza IFE Slika 10. Izrazito visoka koncentracija ukupnih proteina i visoka oštra frakcija gamaglobulina te snižena albuminska i ostale globulinske frakcije ukazuju na prisutan monoklonski protein. Sa IFE je dokazano prisustvo dva klona IgG tip lambda te BJP protein tip lambda.

18 Bolest lakih lanaca IgG 5.64 g/l IgA 0.13 g/l IgM 0.06 g/l Slobodni laki lanci kapa >33700 mg/l Slobodni laki lanci lambda mg/l IFE Kapilarna elektroforeza Slika 9. Sniženi albuminini i povišene sve globulinske frakcije osim gama globulina. U području β1 frakcije nalazi se izrazit pik koji pripada monoklonskom proteinu. Sa IFE je dokazano prisustvo BJP proteina.

19 Monoklonska gamapatija Kapilarna elektroforeza IFE Kapilarna elektroforeza Slika 11. Elektroforeza i IFE istog pacijenta u vremenskom razmaku od tri mjeseca. I u jednom i drugom slučaju dokazano je prisustvo monoklonskog proteina i BJP proteina s tom razlikom da se u prvom slučaju na krivulji uočava samo jedan pik,dok se u dru slučaju uočavaju dva pika. Oba pripadaju BJP proteinu ali je u prvom slučaju koncentracija iznosi 1760 mg/l, a u drugom 5360 mg/l.

20 CZE vs agaroza gel elektroforeza Agaroza gel elektroforeza IFE Kapilarna elektroforeza Slika 12. Usporedba kapilarne elektroforeze i gel elektroforeze Sa obje tehnike moguće je uočiti više pikova u Ƴ području pikova koji pripadaju monoklonskim proteinima što je i dokazano imunofiksacijskom elektroforezom..

21 CZE vs agaroza gel elektroforeza prednosti Visoka rezolucija frakcija Mala količina uzorka Nema procedure bojanjadirektno mjerenje peptidne veze u UV području mane Interferencija komponenata koje apsorbiraju u UV području Povećan broj imunotipizacija Ponekad teško detektirati male monoklonske proteine Nema grešaka pri aplikaciji uzorka Jasno vidljiva α1 frakcija Jasno razdvajanje β1 i β2 frakcije

22 Interferncije u CZE Hemoliza- slobodan hemoglobin migrira u β području Bilirubin se ne opaža do koncentracije 250 μmol/l iskrivljuje albuminsku frakciju u anodnom dijelu Visok CRP se može zamijeniti za monoklonski protein u Ƴ području Lipoproteinske frakcije se mogu pojaviti npr. VLDL između albumina i α1 frakcije

23 Zaključak Elektroforeza serumskih proteina je tehnika probiranja za razdvajanje i kvantifikaciju pojedinih skupina proteina a ne poejdinih proteina Najznačajnija klinička značajnost je detekcija M-proteina CZE osjetljiva, brza i reproducibilna tehnika koja daje visoku rezoluciju proteinskih frakcija