STRUKTURE BIOLOŠKIH MOLEKUL

Transcript

1 STRUKTURE BILŠKIH MLEKUL Študijsko gradivo pri predmetu: Strukture bioloških molekul Univerza na Primorskem, Fakulteta za matematiko, naravoslovje in informacijske tehnologije Andrej Perdih

2 Študijsko gradivo za uporabo pri predmetu: Strukture bioloških molekul Namenjeno študentom 3. letnika 1. stopnje univerzitetnega programa Bioinformatika Fakulteta za matematiko, naravoslovje in informacijske tehnologije, Univerza na Primorskem Avtor: doc. dr. Andrej Perdih Ljubljana,

3 Kazalo 1. snove vizualizacije bioloških makromolekul 4 2. Uvod v proteinsko kristalografijo Uvod v proteinsko NMR spektroskopijo Teoretične metode za določenje strukture makromolekul Uvod v metode molekulskega modeliranja Metode virtualnega rešetanja in načrtovanja biološko aktivnih spojin Uporaba metod molekulskega modeliranja pri razumevanju bioloških makromolekul Uporaba metod molekulskega modeliranja pri načrtovanju novih biološko aktivnih molekul Vprašanja za ponovitev in utrjevanje snovi Priporočena literatura za nadaljnji študij 127 3

4 1. poglavje snove vizualizacije bioloških makromolekul 4

5 SNVE VIZUALIZACIJE BILŠKIH MAKRMLEKUL Molekulska grafika je področje molekulskega modeliranja, ki se ukvarja z grafično predstavitvijo molekulskih modelov. mogoča prikaz (vizualizacijo) modelov atomov in molekul, uporabljamo pa jo tudi za predstavitev drugih rezultatov računanja (npr. molekulske dinamike, kvantnokemijskih računov itd.). Večina grafičnih programov uporablja standardno označevanje (barvanje) atomov (Preglednica 1), čeprav med njimi obstajajo tudi manjše variacije. Preglednica 1. Standardna barvne oznake atomov (obstajajo tudi razlike med programi). Atom Barva vodik bela ogljik črna/siva kisik rdeča dušik modra žveplo rumena fosfor oranžna fluor zelena klor zelena brom rjava jod vijolična Pri grafični predstavitvi strukture molekule atome najpogosteje predstavimo s kroglicami, kemijske vezi pa s paličicami, ki jih povezujejo. Take modele imenujemo modeli kroglic in paličic (ball-andstick models). Zaradi preglednosti lahko atome predstavimo tudi kot točke, povezane s kemijskimi vezmi. Dobimo enostavne žičnate (wire) ali paličaste (stick) modele. menjene predstavitve molekul ne povedo veliko o prostoru (volumnu), ki ga zavzema molekula. V ta namen uporabljamo CPK (kalotne) modele, poimenovane po začetnicah imen njihovih avtorjev: Corey, Pauling in Koltun. V CPK modelu so atomi predstavljeni kot sfere, ki se med seboj prekrivajo in tvorijo molekulo. Velikost sfere je določena z van der Waalsovim radijem posameznega atoma, ki predstavlja približek prostora, ki ga zavzema atom (npr. van der Waalsov radij atoma vodika je 1,2 Å, ogljika 1,7 Å, dušika 1,55 Å in kisika 1,52 Å), in ga imenujemo tudi atomski ali molekulski volumen, celotno površino, ki jo očrta, pa van der Waalsova površina. Na sliki 1 je z različnimi modeli predstavljena molekula aspirina. Molekulske modele lahko predstavimo tudi brez prikazanih vodikovih atomov. To storimo predvsem takrat, ko bi celotna mreža vodikov ovirala vizualizacijo preučevanih strukturnih elementov. 5

6 Slika 1. Predstavitev molekule adrenalina (v nenabitem stanju) z različnimi modeli. Podatke o molekulah (tridimenzionalna struktura, delni naboji, povezanost atomov, topološki podatki in tudi nekatere druge lastnosti molekule) zapišemo v različnih standardnih formatih (molecular file formats), ki jih programi za vizualizacijo lahko berejo in prikažejo. Uveljavljenih je več različnih formatov in večina programov omogoča branje in zapisovanje molekul v več zapisih. Pri bioloških makromolekulah je to največkrat pdb format, v katerem so zapisane strukture v proteinski bazi PDB. Molekule organskih spojin pogosto zapisujemo v drugih standardnih zapisih. Nekateri izmed uporabljenih formatov za zapis molekul so: cdx (ChemDraw exchange file), mol (MDL molfile), mol2 (SYBYL format), sdf (structure data file) ter še mnogi drugi. Molekule lahko prikažemo tudi s površinami (Slika 2). Večina algoritmov za konstrukcijo molekulskih površin uporabi kroglico, ki ji lahko izberemo polmer. Če je topilo voda, potem je polmer enak 1.4 Å. Kroglica nato potuje po van der Waalsovi površini molekule. črt, ki ga med kotalenjem opiše središče kroglice, predstavlja površino, ki je dostopna topilu (solvent-accessible surface area - SASA). Poznamo tudi od topila izključeno površino (solvent-excluded surface), imenovano molekulska ali Connollyjeva površina, ki je inverzna površini dostopni topilu. Površine, poleg predstavitve geometrijskih parametrov, lahko uporabimo tudi za nazornejšo predstavo izračunanih lastnosti molekule. Prikažemo izopovršine ali konture (to so tridimenzionalni obrisi, kjer ima preiskovana količina konstantno vrednost) molekulskih orbital (npr. HM: Highest ccupied Molecular rbital in LUM: Lowest Unoccupied Molecular rbital), elektronske gostote in elektrostatskega potenciala. 6

7 Slika 2. Površina dostopna topilu za molekulo aspirina. Prikazan je tudi CPK model. Pri prikazu strukture bioloških makromolekul (predvsem proteinov) lahko uporabljamo shematsko predstavitev njihove celotne strukture; prikažemo potek glavne proteinske verige, na kateri lahko še dodatno poudarimo elemente sekundarne strukture (alfa vijačnice, beta strukture). V uporabi so tudi kombinacije opisanih vizualizacijskih tehnik. Slika 3. Vizualizacija makromolekul: Prikaz poteka glavne verige proteina (levo zgoraj), dodatni prikaz elementov sekundarne strukture (alfa vijačnice, beta strukture in proteinskih zank), (desno zgoraj). Tako lahko npr. del makromolekule (aktivno mesto) predstavimo s površino dostopno topilu, ki jo pobarvamo po hidrofobnosti spodaj ležečih aminokislin (svetleje so obarvana hidrofobnejša področja). S tem prikažemo ključne topološke lastnosti aktivnega mesta in naravo aminokislin, ki ga tvorijo. Lahko prikažemo tudi interakcije liganda le s specifičnimi aminokislinami. Vse to nam omogoča, da 7

8 podrobno spoznamo ključne lastnosti biološke makromolekule ter preučimo interakcije, ki so odgovorne za medmolekulsko prepoznavanje ligandov (Slika 4). Slika 4. Vizualizacija makromolekul: Prikaz poteka glavne verige proteina (levo zgoraj), dodatni prikaz elementov sekundarne strukture (alfa vijačnice, beta strukture in proteinskih zank), (desno zgoraj). Kombinaciji vizualizacijskih tehnik biomakromolekul in ligandov. Deloma prijeno iz poglavja UVD V MLEKULSK MDELIRANJE v ANDERLUH, Marko MRAVLJAK, Janez, SVA, Matej, PERDIH, Andrej, PEČAR, Slavko: Farmacevtska kemija III : vaje in seminarji. Ljubljana: Fakulteta za farmacijo,

9 NIVJI UREJENSTI STRUKTURE PRTEINV VIZUALIZACIJA TRIDIMENZINALNE PRTEINSKE STRUKTURE (1) Vizualizacija vseh atomov strukture biološke makromolekule je nepregledna. Vidimo vse atome, venadar dobimo le omejeno predstavo o celotni strukturi. 9

10 VIZUALIZACIJA TRIDIMENZINALNE PRTEINSKE STRUKTURE (2) Poenostavitev: Boljejeshematskopredstaviti ključne elemente proteinske strukture Prikažemo potek glavne proteinske verige VIZUALIZACIJA PRTEINSKE STRUKTURE (3) Še bolje je shematsko izpostaviti še dodatne strukturne elemente: a) Prikažemo potek glavne proteinske verige (backbone) b) dodatno poudarimo elemente sekundarne strukture (alfa vijačnice, beta strukture) 10

11 VIZUALIZACIJA PRTEINSKE STRUKTURE (4) Drug aspekt vizualizacije: Molekula predstavljena z Van der Waalsovimi kroglami (sferami) Unija vseh atomskih sfer = Volumen molekule VIZUALIZACIJA Z MLEKULSKIMI PVRŠINAMI Molekula l predstavljena z Van der Če zakotalimo kroglico, ki ima radij topila Waalsovimi kroglami (sferami) čez Van der Waalsove sfere, očrtamo molekulsko površino, ki je na voljo za Unija vseh atomskih sfer = interakcijo z topilom = Volumen molekule Solvent accessible surface area (SASA) 11

12 VIZUALIZACIJA TERCIARNE STRUKTURE (5) Molekulska površina, ki je na voljo za interakcijo s topilom: Solvent accessible surface area (SASA) Površino lahko nato še specificno pobarvamo po: 1. hidrofobnih lastnostih spodaj ležečih aminokislin 2. elektrostatskih lastnostih spodaj ležečih aminokislin NATANČNEJŠA VIZUALIZACIJA BIMAKRMLEKUL 1. Del makromolekule (aktivno mesto) predstavimo s površino dostopno topilu, ki jo pobarvamo po hidrofobnosti spodaj ležečih aminokislin. 2. Lahko prikažemo tudi interakcije liganda le s specifičnimi aminokislinami. Namen: - podrobno spoznamo ključne lastnosti biološke makromolekule -preučimo interakcije, ki so odgovorne za medmolekulsko prepoznavanje ligandov 12

13 2. Poglavje Uvod v proteinsko kristalografijo 13

14 UVD V PRTEINSK KRISTALGRAFIJ MDEDE DLČANJA STRUKTURE PRTEINV EKSPERIMENTALNE METDE: 1. PRTEINSKA KRISTALGRAFIJA 2. PRTEINSKA NMR SPEKTRSKPIJA ( 3. ELEKTRNSKA MIKRSKPIJA ) HIV Proteaza PQITLWKRPLVTIRI GGQLKEALLDTGAD DTVLEEMNLPGKW KPKMIGGIGGFIKV RQYDQIPIEICGHKA IGTVLVGPT PVNIIGRNLLTQIGC TLNF Eksperiment HIV Proteaza z inhibitorjem 14

15 DEFINICIJA Rentgenska kristalografija omogoča določitev razporeditve atomov znotraj kristala, ki ga obsevamo z x-žarki, ki se ob interakciji s kristalom razpršijo v specifične smeri, odvisne od funkcije kristala. S poznavanjem kotov in intenzitet sipanih žarkov, lahko kristalograf določi tridimenzionalno sliko elektronske gostote proteina v kristalu. S pomočjo elektronske gostote nato kristalograf izračuna atomistični model proteina, ki ustreza elektronski gostoti. ZGDVINA PRTEINSKE KRISTALGRAFIJE 1934: J. D. Bernal in Dorothy Crawfoot prva izmerila difrakcijo kristalov pepsina v raztopini (motherliquor). 1958: Določena prva kristalna struktura proteina Mioglobina Max Perutz in sir John Cowdery Kendrew 1962: Nobelova nagrada za kemijo podeljena raziskovalcema za to odkritje 15

16 SPLŠNI PREGLED METDE PRTEINSKE KRISTALGRAFIJE PRIPRAVA IN KRISTALIZACIJA PRTEINA PRTEINSKI KRISTALI DIFRAKCIJSKI EKSPERIMENT REVERZNA FURIERJEVA TRANSFRMACIJA MAKRMLEKULARNI DIFRAKCIJSKA SLIKA MDEL PRTEINA 16

17 PRIPRAVA TARČNEGA PRTEINA Protein lahko pridobimo na dva načina: 1.Izolacija iz izvornega vira 2.Kloniranje gena in ustavitev le-tega v primerni ekpresijski sistem (npr. bakterije) Dobljeni vzorec proteina ocenimo s sledečimi kriteriji: -čistost in homogenost IZLACIJA PRTEINA -topnost proteina -monodisperznost proteina -funkcionalna aktivnost -stabilnost proteina ZAKAJ PTREBUJEM KRISTALE? 1. Intenziteta dobljene difrakcije le ene molekule je premajhna za dobro detekcijo. 2. Urejena kristalna rešteka molekul v bolj ali manj isti konformaciji ojača signal. 3. Že majhen proteinski kristal vsebuje miljarde proteinskih molekul. Če proteinnebouniformen,bodifrakcijskaslikaslabainiznjenebomo dobili uporabnih podatkov za določitev strukture. 4. V primeru visoke urejenosti iki kristala je difrakcijska ij k slika uporabna in iz nje lahko določimo strukturo proteina. 17

18 KRISTALIZACIJA PRTEINA 1. Pogosto more art than science 2. Pričnemo s čistim proteinom, ki ga predhodno skoncentriramo Ideja: Vzorec v kristalizacijskih pogojih najprej privesti do supernasičenja, ki vodi do nastanka kristalizacijskih jeder in nadalje spontane nukeacije. Ti dosežemo z variiranjem: temperature, ph, koncentracije precipitanotov in organskih topil. ISKANJE PTIMALNIH KRISTALIZACIJSKIH PGJEV ph gradient Precipita ant Concentration Precipitate 10 % 15 % 20 % 30 % Crystalline precipitate Fiber like Microcrystals Small crystals Ideal crystal 18

19 METDA VISEČE E KAPLJICE HANGING DRP METHD 1. Pufer za kristalizacijo predstavlja matično raztopino(0.5-1 ml) 2. Kapljica navadno vsebuje 1/2 raztopine proteina, 1/2 pufra za kristalizacijo (6-10 L). Koncentracija precipitanta v kapljici je ½ koncentracije v matični raztopini pufra. 3. Kaplico obrnemo v raztopino in sistem neprodušno zapremo. 4. Koncentracija precipitanta v kapljici se bo tako počasi ekvilibrirala s koncetracijo v matični raztopini s pomočjo difuzije vodne pare. IZGLED PRTEINSKIH KRISTALV 19

20 KRISTALE TVRI VELIK ŠTEVIL SNVNIH CELIC snovna celica je najmanjša enota kristala, ki če jo ponavljamo v v vse smeri, tvori celoten kristal. Dimenzije kristala definiramo s 6 številkami: Dolžinami treh osi: a, b, in c, Kristalna mreža je mrežni sistem točk v treh dimenzijah, v katerih ima vsaka točka ali vozljišče tako okolje, ki je enako katerikoli drugi točki ali vozljišču. Interaksialnimi koti:, in. SIMETRIJSKE PERACIJE S KRISTALI Ponavljanje elementov je definirano s 4 osnovnimi simetrijskimi operacijami, ki jih definirajo 4 simetrijski operatorji: peracija pis perator 1. Translacija Vzporeden premik Translacijski vektor 2. Rotacija Zasuk Rotacijska os 3. Refleksija Zrcaljenje skozi ravnino Zrcalna ravnina 4. Inverzija Zrcaljenje skozi točko Center inverzije Simetrijska operacija je postopek kako iz ene lege atoma generiramo drugo lego v prostoru upoštevaje simetrijski operator. Analognu premikom analitskih funkcij v prostoru Pomembno: aplikacija simetrijskih operacij ne spremeni položaja kristalov. 20

21 1. Rotacija Rotacija vseh točk v asimetrični enoti okoli osi, ki je center rotacije. 2. Translacija Premik vseh točk za enak vektor premika KRISTALNI SISTEMI Kristali so urejeni v 7 kristalnih razredov glede na karakteristične simetrije njihovih osnovnih celic. Karakteristčna simetrija kristala je navadno sestavljena iz kombinacje več osnovnih simetrijskih operacij. kubična ortorombska monoklinka tetragonna heksagonalna triklinska trigonalna Kristalni sistem Simetrijske operacije Značilnosti enotne celice Triclinic None a, b, c, Monoclinic ne 2-fold axis, to b (b unique) a, b, c, 90,, 90 rthorhombic Three perpendicular 2-folds a, b, c, 90, 90, 90 Tetragonal ne 4-fold axis, parallel c a, a, c, 90, 90, 90 Trigonal ne 3-fold axis a, a, c, 90, 90, 120 Hexagonal ne 6-fold axis a, a, c, 90, 90, 120 Cubic Four 3-folds along space diagonal a, a,,a, 90, 90, 90 21

22 BRAVAISVE MREŽE 1848 je Auguste Bravais pokazal, da je v 3-dimensionalnem prostoru možnih 14 mrež Bravaisova mreža je neskončna mreža diskretnih točk v enakem okolju 7 kristalnih sistemov + 4 načini centriranja mreže 14 Bravaisovih mrež TČKVNE SKUPINE Kristalografska točkovna skupina je niz simetrijskih operacij, (npr. rotacij in zrcaljenj), v katerih ostane pri premiku vsakega atoma kristala na položaj drugega istovrstnega atoma točka, okoli katere potečeoperacija,fiksna. 22

23 PRSTRSKE SKUPINE Prostorske skupine so kombinacije 32 kristalografskih točkovnih skupin in 14 Bravaisovih mrež, ki spadajo v enega od sedmih kristalnih razredov. Prostorska skupina je kombinacija translacijske simetrije osnovne celice, vključno s centriranjem mreže, simetrijskih operacij točkovne skupine - rotacije (zasuk okrog rotacijske osi), refleksije (zrcaljenje na zrcalni ravnini) in inverzije (zrcaljenje skozi točko center inverzije) ter simetrijskih operacij vijačnih osi in drsnih ravnin. Kombinacije vseh naštetih operacij dajejo skupno 230 edinstvenih prostorskih skupin, ki opisujejo vse možne kristalne simetrije. D ASIMETRIČNE ENTE D KRISTALNE MREŽE Enota, ki se ponavlja skozi celoten kristal je asimetrična enota. Če obstajajo ponavljajoče proteinske molekule l v osnovni celici, jih lahko generiramo z simetričnimi operacijami asimetrične enote. Gradnik kristala z najmanjšim volumnom se imenuje osnovna celica. Ko zgradimo kristal s premiki osnovnecelicevvsesmeri,dobimo kristalno mrežo. 23

24 ZAKAJ UPRABLJAM RENTGENSKE ŽARKE Vvsehvrstahmikroskopijejekoličina informacij, ki jih lahko dobimo omejena z valovno dolžino uporabnega elektromagnetnega valovanja. Pri običajni mikroskopiji je najkrajša valovna dolžina okoli 300 nm. To omogoča npr. opazovanje organelov v celici. Da lahko določimo strukturo proteina z atomistično natančnostjo potrebujemo elektromagnetno valovanje z valovno dolžino na nivoju velikosti atomov to je okoli 0.1 nm. V to območje elektromagnetnega valovanja padejo x-žarki. PRIPRAVA PRTEINSKIH KRISTALV NA DIFRAKCIJSKI EKSPERIMENT 1. Dobljeni proteinski kristal prenesemo na posebno zanko, ki ta kristal ujame. Sistem kriogensko zamrznemo na temperaturo 100K. 2. Zanko z ujetim zamrznjenim kristalom damo na goniometersko glavo, ki omogoča pravilno postavitev vzorca v apliciran tok x-žarkov. 3. Pri kriogenskem zbiranju podatkov tok tekočega dušika hladi kristal pri približno 100k ves čas potekanja difrakcijskega eksperimenta. Crystal 24

25 GNIMETER DIFRAKCIJSKI EKSPERIMENT X-ray izvor: anoda, rotirajoča anoda, sinhrotron Gonoimeter: pozicioniranje vzorca glede na rengentske žarke Detektorji: X-ray filmi, CCD kamere itd 25

26 IZVR X-ŽARKV (1) -ANDA IZVR X-ŽARKV (2)- SINHRTRN 26

27 KAJ SE ZGDI MED DIFRAKCIJSKIM EKSPERIMENTM X-žarki se odbijejo od elektronov in rezultat difrakcijskega ekeperimenta je tridimenzionalna mapa, ki pokaže distribucijo elektronov v preiskovani molekuli. KAJ SE ZGDI Z ELEKTRNM, K GA ZADANJEJ RENTGENSKI ZARKI? 1. Elektron začne vibrirati z isto frekvenco kot jo ima vhodni rentgenski žarek 2. Elektron sipa sekundarne x-žarke, ki se širijo v vse smeri. 3. Za rentgensko difrakcijo je pomembno predvsem elastično sipanje rentgenskih zarkov na elektronih (valovna dolžina in faza se ohranita, žarek pa spremeni smer). 27

28 SIPANJE RENTGENSKIH ŽARKV NA MLEKULI Molekula ima veliko elektronov in vsak sipa sekundarne rentgenske žarke potem, ko molekulo zadane primarni rentgenski žarek. Sipani rentgenski žarki med seboj interferirajo (znan valovni pojav). Kakšen bo končni vzorec sipanih žarkov je odvisno od števila in položaja elektronov v molekuli torej od strukture molekule. Če poznamo intenzitete odbojev in faze le-teh lahko izračunamo strukturo preiskovane molekule. BRAGGV PGJ: ZA KNSTRUKTIVN DIFRAKCIJ Z družine kristalnih ravnin (h, k, l) dobimo sekundarni žarek takrat, ko je vpadni kot primarnega žarka na to družino ravnin enak. n = 2d sin 28

29 DIFRAKCIJSKI VZREC PRTEINA DBLJEN P DIFRAKCIJSKEM EKSPERIMENTU FURIERJEVA TRANSFRMACIJA IN INVERZNA FURIERJEVA TRANSFRMACIJA Sine Curve Amplitude=100, Period=5 mins Fourier Transform of a Sine Curve Amplitude=100, Period = 5 mins 100 FT 7e+05 6e+05 Sine Cuve (un unitless) rft Fourier Transform (unitless) 5e+05 4e+05 3e+05 2e+05 1e Time (mins) Period (mins) FT rft ELEKTRNSKA GSTTA (direktni prostor) DIFRAKCIJSKA SLIKA (recipročni prostor) 29

30 FURIERJEVA TRANSFRMACIJA (FT) V kristalografiji Fourierjeva transformacija povezuje direktni in reciproči prostor - atomsko strukturo in uklonsko sliko. Zuporaboreverzne Fourierjeve transformacije lahko iz strukturih amplitud in faznih kotov izračunamo elektronsko gostoto v osnovni celici. ENAČBA ELEKTRNSKE GSTTE (xyz) 1 V h k l F(hkl) exp[ 2 i(hx ky lz) i hkl ] h,k,l koordinate indeksov odbojev v reciprocnem prostoru xyz koordinate atomov v realnem prostoru F amplitude odbojev faze (fazni kot) odbojev V- volumen osnovne celice FAZNI PRBLEM VKRISTALGRAFIJI Strukturni faktor F v točki (h,k,l): N F(h,k,l)= f n exp [2 i(hx+ky+lz)] n=1 n1 f atomski sipni faktor N število atomov F je kompleksno število: faza F(h,k,l)= F(h,k,l) exp( i ) amplituda Izmerjene intenzite odbojev: I(h,k,l)= F(h,k,l) 2 30

31 FAZNI PRBLEM V KRISTALGRAFIJI (xyz) 1 V h k l F(hkl) exp[ 2 i(hx ky lz) i hkl ] Strukturni faktor Fazni kot ( Faza ) Detektor meri intenzitete odbojev difrakcijske slike. Difrakcijski podatki ne dajo podatkov o faznem kotu, ki je potreben za popolno določitev strukture Faze (fazne kote) moramo zato določiti s pomočjo drugih metod. METDA 1: IZMRFNA RFNA ZAMENJAVA Pristop: Z upeljavo težkih atomov (npr. Pt, Pb, Hg) vproteinski kristal spremenimo difrakcijsko sliko. S primerjavo obeh slik je mogoče določiti položaj teh atomov in iz pozicij določiti tudi njihove faze. Te pa nato uporabimo za določitev strukture proteina. Ponavadi pri tem pristopu uporabljamo vsaj dva različna težka atoma. Možne težave: 1) Spremeba dimenzij enotne celice 2) Proteinski kristal se v prisotnosti težkih atomov ne tvori 3) Težki atomi nimajo definiranega mesta vezave na proteinu 31

32 METDA 2: MLEKULSKA ZAMENJAVA Najpogosteje uporabljena tehnika proteinske kristalografije. Pristop: Faze privzamemo iz prejšnjih ekperimentov in jih kombiniramo z dobljenimi intenzitetami odbojev za nov protein. Uporabna le, če imamo protein, ki je po primarni sekvenci vsaj 25% podoben proteinu za katerega struktura ze obstaja. Priprava referenčnega proteina na molekulsko zamenjavo: Preden pričnemo moramo z računalniskimi pristopi prenesti znani proteinski model v umetno zgrajeno enotno celico, ki ima enako orientacijo, kot struktura za katero želimo dobiti model (uporaba razlicnih rotacijskih in translacijskih funkcij). GRAJENJA MLEKULSKEGA MDELA Včasih uporaba STATIČNIH MEHANSKIH MDELV Danes uporaba RAČUNALNIŠKE TEHNLGIJE 32

33 GRAJENJA MLEKULSKEGA MDELA 1. Primarno sekvenco proteina poskušamo umestiti v dobljeno mapo elektronske gostote 2. Če imamo soroden protein in uporabljamo molekulsko zamenjavo, je to relativno enostavno, če nizačetnega modela je postopek bolj zahteven (npr. izomorfna zamenjava) Resolucija boljša od 3.0 Å: vveliko primerih omogoča identifikacijo dokaj dobrega modela. Resolucija boljša od 2.0 Å: gradnjo modela lahko popolnoma avtomatiziramo s pomočjo različnih računalniških programov. RESLUCIJA MLEKULSKEGA MDELA Resolucija: pomembno merilo kako dober bo molekulski model. Resolucija da vrednost najmanjše razdalje, ki jo še lahko ločimo. dvsina je od količine in kvalitete dobljenih ekprerimentalnih odbojev in določenih faz. Dobra resolucija omogoča gradnjo dobrega molekulskega modela. 33

34 IZBLJŠAVA MDELA MDEL REFINEMENT Avtomatska računalnisko podprta izboljšava začetnega molekulskega modela, da se bolje razložijo dobljeni eksperimentalni podatki t.j. ekperimentalno dobljena elektronska gostota. Dobljene faze se ibljšj izboljšajo in vedno natančneje č opišejo dobljeno mapo elektronske gostote. VALIDACIJA DBLJENEGA MLEKULSKEGA MDELA 1. cena končne kvalitete modela modela 2. cena ustreznosti konformacij posameznih amino kislin (Ramachandranov diagram) 3. Ali so nekovalentno vezani atomi dovolj stran eden od drugega? 4. Ali imajo aminokisline ustrezno okolico? (navadno hidrofobno sredico in polarno površino) 5. Ali se tvorijo ustrezni pari vodikovih vezi? 34

35 DEFINICIJA: TRZIJSKI KT Kot, ki ga oklepata ravnini, ki potekata skozi atome ijk in jkl. TRZIJSKI KTI V PEPTIDNIH VEZEH Kot Phi ( definirajo i ga atomi: ic(i 1) >N(i) C (i) C(i) Kot Psi definirajo ga atomi: N(i) C (i) C(i) > N(i+1) 35

36 RAMACHANDRANV DIAGRAM IN PSAMEZNE SEKUNDARNE STRUKTURE R-FAKTR Primerjamo eksperimentalno elektronsko gostoto in elektronsko gostoto, ki jo izračunamo na osnovi molekulskega modela. R faktor je merilo za konvergenco med strukturnimi faktorji, ki jih dobimo na osnovi modela dl ineksperimentalno i določenimi. č i F obs - F calc R= F obs R: 0.6-Zelo slabo 0.5 -Slabo 0.4-Spodnja meja sprejemljivosti 0.2-Dobro za proteinske molekule 0.05-Dobro za majhne organske molekule 0-Popolno ujemanje 36

37 F 0 -F c MAPE F 0 -F c = diferenčna mapa med ekperimentalno mapo elektronske gostote F 0 in mapo F c ki jo izračunamo iz dobljenih atomskih koordinat v modelu. Prikaze nam vse atome, ki so napačno locirani oz. nove specificne dele proteina. 2F 0 -F c = to je eksperimentalna mapa F 0 + diferenčna mapa F 0 -F c mapa izgleda kot popravljeni model. -ta DEPNIRANJE STRUKTURE Strukturo tako naredimo dostopno vsem z deponiranjem v proteinsko banko (PDB). 37

38 PDB BANKA IN KLIČINA STRUKTUR Proteinske strukture določene z metodo proteinske krostalografije PNVIM: KRAKI PRTEINSKE KRISTALGRAFIJE 1. Kristalizacija proteina 2. Krio-zamrznenje proteina 3. Rentgenska difrakcija (4. Ce je potrebno derivati s težkimi atomi) (5. Rentgenska difrakcija novih kristalov) 6. Reverzna Fourierjeva transformacija 7. Izdelava in izboljšava dobljenih modelov 8. Validacija modelov 38

39 3. poglavje Uvod v proteinsko NMR spektroskopijo 39

40 UVD V PRTEINSK NMR SPEKTSKPIJ ZGDVINA PRTEINSKE NMR SPEKTRSKPIJE 1957 Prvi NMR spekter proteina 1980 Kurt Wüthrich opiše metodo določanja strukture proteina z NMR spektroskopijo 40

41 1986:Določena je struktura proteina tako z NMR spektroskopijo, kot tudi proteinsko kristalografijo 2002 Kurt Wüthrich prejme Nobelovo nagrado za kemijo Jedrska ali nuklearna magnetna resonanca (NMR) je najbolj uporabljana spektroskopska tehnika v organski kemiji. 1 H 13 C 15 N JEDRA UPRABNA ZA 19 F NMR EKSPERIMENTE 31 P Atomska jedra imajo pozitiven naboj, nekatera med njimi pa tudi spin. Spin si v klasični fiziki predstavljamo kot vrtenje nabitega delca (vrtavke), pri čemer zaradi vrtenja nastane majhno magnetno polje. 41

42 Ko taka jedra postavimo v zunanje magnetno polje, se spini jeder obnašajo kot magneti in se orientirajo bodisi z bodisi proti magnetnemu polju. Energijska razlika: E = h = h B 0 2 Giromagnetno razmerje,, je za vsako jedro konstantno (26,753 s -1 gauss -1 for H). NMR EKSPERIMENT 1. Vzorec, ki vsebuje magnetno aktivna atomska jedra, damo v močno magnetno polje in ga obsevamo z elektromagnetnim valovanjem primerne frekvence. FID free Z močnim kratkim pulzom radiofrekvenčnega induction valovanja vzbudimo vsa jedra (enega nuklida) v decay vzorcu. 2. Vzbujena jedra se počasi iznihavajo (relaksirajo), sprejemna tuljava pa sprejema signale, ki jih jedra oddajajo. Ti signali vsebujejo vse frekvence, ki jih oddajajo jedra v molekuli preiskovane snovi. NMR spekter FT 3. Signale iznihavanja jeder zapišemo obdelamo s Fourierovo transformacijo. 4. Zapis nihanja iz časovne domene v frekvenčno; iz zapisa nihanja po času dobimo zapis nihanja po frekvenci spekter. 42

43 SHEMA NMR SPEKTRMETRA NMR SPEKTRMETER 43

44 SDBEN NMR SPEKTRFTMETER TIPI NMR SIGNALV Število signalov = število protonov (oz. obravnavanih jeder) Položaj signala = kako močno je senčen posamezni proton Intenziteta signala = število protonov posameznega tipa Sklopitve signala = število protonov na sosednjih atomih 44

45 MAGNETN SENČENJE ENJE JEDER Vsa atomska jedra obdajajo različno gosti oblaki elektronov. Elektroni so delci s svojim lastnim spinom in se odzivajo na zunanje magnetno polje. V tem polju se orientirajo, podobno kot atomska jedra, večinoma nasproti zunanjemu polju in ga tako zmanjšajo. Pravimo tudi, da elektronski oblak senči jedra pred zunanjim magnetnim poljem. Čim večja je elektronska gostota okrog atomskega jedra, tem močnejše je senčenje. Različna č a okolica o pomeni različno senčenje ZEL UPRABN ZA ASIGNACIJ SIGNALV SENČENJE ENJE IN PRTNI V MLEKULI Glede na kemijsko okolico (položaj drugih jeder in elektromov) je vsak atom senčen nekoliko drugače, zato potrebujemo tudi nekoliko različno frekvenco, da pride do obrata spina. 45

46 KEMIJSKI PREMIK Kemijski premik je resonančna frekvenca jedra relativno normirana glede na standard. (TMS tetrametilsilan). ENSTAVEN NMR SPEKTER 46

47 CEPITVE SIGNALV Poleg kemijskega premika in integrala najdemo v večini NMR spektrov še dodatno informacijo, ki je posledica medsebojnega delovanja magnetno aktivnih jeder. Ta vpliv se izkazuje v cepitvi spektralnih vrhov na več črt. PRIMERI 1 H NMR SPIN-SPIN SKLPITVE 47

48 IZVR H NMR SPIN-SPIN SKLPITVE J 17 IZVR H NMR SPIN-SPIN SKLPITVE Razdalja (sklopitvena konstanta J) med vrhovoma v sklopljenem NMR spektru je enaka za sklopljena protona

49 PMEMBNI PDATEK SKLPITVENE KNSTANTE IN TRZIJSKI KTI KRAKI PRTEINSKE NMR SPEKTRSKPIJE 49

50 1D 1 H-NMR SPEKTRI PRTEINV Prevelika količina informacij prekrivanje signalov. Ni možna asignacija posameznih signalov. Posamezne signale protonov moramo ločiti, da jih lahko prepoznamo. Rešitev je upeljava večdimenzionalnih NMR spektrov, ki omogočajo, č da podatke bolj ločimo in jih tako tudi lažje identificiramo in asigniramo. VEČDIMENZINALNI NMR PULZ FT VEČ ČASVN LČENIH RAZLIČNIH ALI ENAKIH PULZV =PULZNA FT SEKVENCA 1D NMR 2D NMR FT 3D NMR 50

51 TIPI PULZNIH SEKVENC Pulzne sekvence so lahko zelo različne tako dobimo komplementarne informacije o preiskovanem proteinu VECČDIMENZINALNI NMR SPEKTRI IZBLJŠAJ RESLUCIJ SIGNALV Ločeni signali Veliko signalov 51

52 VEČDIMENZINALN DIMENZINALNENMR NMR TEHNIKE TIP EKSPERIMENTA DEFINIRA PULZNA SEKVENCA! SNVNA IDEJA PRTEINSKEGA NMR 1. KRAK: S pomočjo različnih večdimenzionalnih NMR spektov asignirati (določiti) položaje vseh protonov v v preiskovani biološki molekuli in definirati geometrijske omejitve med njimi. 2. KRAK: S pomočjo računalniskih programov izračunati strukturo, ki ustreza tem omejitvam. 52

53 2D NMR CSY SPEKTER Dvodimezionalna 2D NMR CSY (Correlation SpectroscopY) spektoskopija je skupina NMR eksperimentov, ki da NMR spekter, ki je funkcija dveh apliciranih frekvenc in ne le ene. mogoča identifikacijo sosednjih protonov, kisiskopljeniprekokemijskihvezi. Proton, ki je sklopljen z drugim Protonom preko kemijskih vezi LAŽJA ASIGNACIJA SIGNALA DEGENERIRANST 2D CSY SPECTRV Niz signalov za posamezno stransko verigo predstavlja: spinski sistem Problem: Spinski sistemi so degenerirani (več aminokislin ima isti spinski sistem) Na osnovi CSY spektra ne moremo vedno ugotoviti, kateri amino kislini posamezne vrste pripada posamezni spinski sistem. 53

54 2D NMR TCSY (TTAL CRRELATIN SPECTRSCPY) SPEKTER TCSY (Ttal Correlation SpectroscopY) je metoda, kjer koreliramo veliko (v teoriji vse) spine v nizu sklopljenih spinov. TCSY tako lahko dobimo natančnejso asignacijo za vsako amino kislino. TCSY je neke vrste generaliziran CSY spekter. Dobimo ga z aplikacijo specificne pulzne sekvence. NUKLEARNI VERHAUSERJEV EFEKT (NE) Nuklearni verhauserjev efekt (NE) je prenos polarizacije jedernega spina iz ene spinske populacije jeder na drugo skozi proces cross-relaxation. NE je posledica interakcije jeder preko PRSTRA in ne preko KEMIJSKIH VEZI. NESY spekter dobimo z uporabo specifične pulzne sekvence 54

55 2D NESY SPEKTER 2D NESY spekter omogoca identifikacijo dveh vodikov skozi prostor ne preko vezi, če je razdalja med njima manjša od 6Å. Proton, ki je sklopljen z drugim protonom preko prostora LAŽJA ASIGNACIJA SIGNALA HETERNUKLEARNI NMR EKSPERIMENTI Pri večjih proteinih samo kombinacija 1H 2D NESY in 2D CSY spektrov ne zadošla za določitev strukture. Takrat protein obogatimo z 13C 15N (2H) atomi 15N- 1H NMR SPEKTER FINGER PRINT PRTEINA Zelo drag in časovno zahteven postopek vendar včasih nujen. Zmanjša se tudi degeneracija spektrov izboljsa locljivost. 55

56 SEKVENČNA ASIGNACIJA PSAMEZNIH SIGNALV Z UPRAB NMR SPEKTRSKPIJE 1. Proteini do velikosti 10kD - uporaba le 1H NMR spektrov a) Mapiranje posameznih aminokislin z uporabo 2D CSY spektrov Preko niza 2D NMR signalov za posamezno stransko verigo ( spin system ) b) Lociranje posameznih aminokislin znotraj sekvence z uporabo 2D NESY spektrov (sekvenčna asignacija) Preko identifikacije povezav med HA (i) do HN (i+1) c) Zbiranje niza razdalj (geometrijskih omejitev) med vodiki, ki nastanejo preko prostora z 2D NESY spektri 2. Proteini velikosti do 30kD uporaba drugih jeder ( 15 N, 13 C, 2 H) a) Ker so 1 H spektri preveč polni, obogatimo protein z jedri, ki dajejo signale v NMR eksperimentu. b) S pomočjo različnih dodatnih 2D in 3D NMR eskperimentov lahko nato asigniramo vse posamezne signale v razliznih spektrih. VEČDIMENZINALNI HETERNUKLEARNI EKSPERIMENTI -LAŽJA ASIGNACIJA VSEH DBLJENIH SIGNALV Triple resonance experiments so nizi več multidimenzionalnih NMR eksperimentov, ki povezujejo največkrat tri jedra, ki dajo signal v NMR spektru to so: 1 H, 15 Nand 13 C. Zaradi več prisotnih dimenzij in sklapljanj prek različnih jeder je asignacija signalov lažja. 56

57 SPLŠEN PREGLED REZULTATV RAZLIČNIH NMR EKSPERIMENTV RAČUNANJE STRUKTURE NA SNVI DBLJENIH NMR PDATKV 57

58 RAČUN PRTEINSKEGA MDELA 1. Na koncu asignacije signalov vemo kateremu atomu pripada posamezen signal z uporabo različnih spektrov (2D NESY, CSY, 3D spektri) 2. Za vsako aminoskislino dobimo iz različnih 2D NESY in CSY spektrov tudi do omejitev na amino kislino: 1. Razdelje (podatki iz NE spektov) 2. Torzijski koti (J sklopitvene konstante) 3. S pomočjo računalnika izračunamo strukturo proteina, ki najbolje zadosti strukturnim omejitvam. Uporabljamo različne teoretčne metode: 1. Distančna geometrija 2. Molekuska dinamika 3. Simulated annealing Pomembno: Vedno dobimo več rešitev (molekulskih modelov), ki ustrezajo danim začetnim pogojem. METDA DISTANČNE GEMETRIJE Distančna geometrija je matematična metoda karakterizacije niza točk, ki temelji le na razdaljah med točkami. Začetni robni pogoji Struktura, ki zadovolji eksperimentalne geometrijske omejitve 58

59 MLEKULSKI MDEL DBLJEN Z NMR JE VEDN ANSAMBEL PRTEINSKIH STRUKTUR Dobljene možne strukture omogočajo vpogled v dinamiko proteina v raztopini: 1. Če strukture naložimo in so različne - večja dinamika proteina 2. Zelo uniformna superpozicija- manjša dinamika proteina DEPNIRANJE STRUKTURE V PDB BANK 59

60 PDB BANKA IMA VSAK LET VEČ NMR STRUKTUR Proteinske strukture določene z metodo proteinske NMR spektoskopije PNVIM: KRAKI PRTEINSKE NMR SPEKTRSKPIJE 60

61 PRIMERJAVA BEH METD BISTVENE RAZLIKE NMR vidi le vodikove atome. Kristalografija vidi vse atome le vodikov ne. NMR eksplicitno določi razdalje med vodikovimi atomi. Kristalografija implicitno določi razdalje med vsemi atomi razen vodikov. NMR strukure so predstavljene kot družine konformacij. Kristalna struktura je predstavljena kot povprečje p vseh struktur. X-ray KRISTALGRAFIJA Prednosti: Ni omejitve velikosti Zelo natančno določen položaj atomov (koordinata določena tudi do 0.1 Å natančno, če je resolucija visoka) Včasih zelo hitra metoda Slabosti: Vsi proteini ne kristalizirajo Elektronska gostota je le povprečje vseh možnih konformacij proteina Na strukturo lahko zelo vpliva tudi kristalna mreža (res fiziološka konformacija?) NMR SPEKTRSKPIJA Prednosti: Meritev opravljamo v raztopini Možnost vpogleda v dinamiko Fiziološki ooš pogoji meritve. mogoča razlikovanje med konformacijami. Slabosti: mejena z velikostjo nekje do 35 kda. Manj natančna določitev položaja posameznih atomov (koordinata določena nekje na 0.5-1Å natančno). 61

62 4. poglavje Teoretični pristopi pri napovedovanju strukture makromolekul 62

63 TERETČNI PRISTPI PRI NAPVEDVANJU STRUKTURE PRTEINV RAZDELITEV TERETČNIH PRISTPVV 63

64 1. HMLGN MDELIRANJE Homologno modeliranje je teoretični pristop, kjer uporabimo predhodne eksperimentalne podatke o tridimenzonalni strukturi proteinov, kot osnovo za gradnjo atomistične slike nove proteinske molekule Metoda temelji na predpostavki, da imajo sorodni proteini tudi zelo sorodne strukture (kar v splošnem večinoma drži). TIPIČNI KRAKI: 1. Najdemo template 2. Tarčno sekvenco poravnamo s template strukturo tu 3. Zgradimo model: - dodamo zanke - dodamo stranske verige 4. Model izboljšamo USPEH HMLGNEGAGNEGA MDELIRANJA JE ZEL DVISEN D PDBNSTI S PRTEINI Z ZNAN STRUKTUR, KI JIH UPRABLJAM KT TEMPLATE 64

65 PRGRAMI ZA HMLGN MDELIRANJE DSTPNI NA SPLETU SWISS Model : WHAT IF : The CPHModels Server : 3D Jigsaw : SDSC1 : EsyPred3D : 2. FLD RECGNITIN METHDS Protein threading, alimetodafold recognition, jemetoda, ki jo uporabimo pri tistih proteinih, ki imajo isto zvitje fold podobno kot proteini z znano strukturo, ni pa na voljo ustreznega homolognega proteina, ki bi služil kot template. Uporabljamo jo kot metodo izbere za proteine z zelo nizko podobnostjo s proteini za katere je struktura že znana. 65

66 MTIV/FLD (ZVITJE) motif = majhna specifična kombinacija elementov sekundarne strukture fold = splošna oblika in orientacija elementov sekundarne strukture, pri čemer ne upoštevamo povezanosti med posameznimi strukturami PREGLED: FLD RECGNITIN METDA 66

67 3. AB-INITI METDE PRTEINSKI FLDING Ab-initio (lat. iz prvih principov ) = iz zaporedja aminokislin (primarne strukture) izračunamo strukturo proteina brez predhodnih omejitev in eksperimentalnih podatkov. Izhodišče: Metoda: 1. bsežno preiskovanje možnih konformacij proteina: - tako osnovne verige -stranskih verig 2. Identifikacija tistih konformacij, ki so energijsko ugodne: - upoštevanje efektov topila (voda) AB-INITI FLDING METDA Zahteve: Potrebujemo zelo natančno energijsko funkcijo, ki dobro opiše interakcijo med atomi (dobri parametri). Učinkovito metodo za preiskovanje konformacijskega prostora. Prednosti: Deluje tudi v primeru novih zvitj ( fold ) Daje možnost vpogleda v mehanizem nastanka proteina Slabosti: Zelo uporabno le za kratke sekvence Nezvit protein Intermediati Zvit protein 67

68 VALIDACIJA IN EVALVACIJA TERETIČNIH MDELV Konformacija molekule je definirana s prostorsko razporeditvijo atomov, ki sestavljajo molekulo. Kvantitativno oceno ujemanja največkrat uporabimo parameter RMSD (root-mean square distance). RSMD N i, j 1 d N 2 i, j Primarjava teoretičnega in eksprimentalnega modela, če je možna 68

69 5. poglavje Uvod v metode molekulskega modeliranja 69

70 UVD V METDE MLEKULSKEGA MDELIRANJA 1. MLEKULSKA MEHANIKA Molekulska mehanika opisuje molekule kot med seboj povezane atome (za razliko od kvantnomehanskih modelov, kjer dobimo večelektrosko valovno fukcijo za celotno molekulo) in molekulsko geometrijo kot odstopanja od»idealnih«veznih razdalj, veznih kotov in dihedralnih kotov, pri čemer upošteva še prispevka van der Waalsove in Coulombske interakcije, ki ju skupaj imenujemo nevezne interakcije. Glavna premisa, ki stoji za molekulsko mehaniko, je visoka stopnja prenosljivosti geometričnih parametrov iz ene molekule na drugo, prav tako pa je predvidljiva odvisnost parametrov od hibridizacije različnih atomov. Slika 1: Parametri, ki jih spreminjamo pri molekulski mehaniki Tu energijo opisujemo kot vsoto prispevkov, ki so posledica odstopanj od idealnih veznih razdalj, valenčnih kotov in dihedralnih (torzijskih) kotov ter neveznih (van der Waalsovih in Colombskih interakcij) interakcij. Naslednja enačba predstavlja modelno enačbo. V tota ln i vezi i V deformacij evezi i valencni koti deformacij e valencnih kotov Vi i torzijski koti torzije Vi i nevezni atomi i j V nevezniato mi ij Prve tri vsote predstavljajo vsoto čez vse vezi, čez vse valenčne kote in čez vse dihedralne kote, zadnja vsota pa čez vse pare atomov, ki med seboj ne tvorijo vezi. Vez med dvema atomoma ter valenčni kot si v molekulski mehaniki lahko predstavljamo z obnašanjem vzmeti, za katero v najenostavnejšem primeru velja Hookov zakon: V deformacije vezi (l) = ½ k i (l- l eq ) 2 V deformacije valenčnega kota ( ) = ½ k j ( - eq ) 2 70

71 Tu l in predstavljata vezno razdaljo in valenčni kot ter l eq in eq idealno (eq= equilibrium) vezno razdalja in vezni kot. Ti dve vrednosti privzamemo iz predhodnih kvantnokemijskih računov ali eksperimentalnih podatkov. Prav tako dobimo vrednosti za obe konstanti. Vrednosti predhodno vstavimo v program. Če želimo večjo natačnost, se ponavadi poslužimo razvoja v Taylerjovo vrsto in upoštevamo še kubni ali višji polinomski člen. Enačba, ki opisuje torzijski kot, mora odražati periodične lastnosti. Na primer: pri enojni vezi C-C upoštevaje sp 3 hibridizacijo dobimo po treh premikih dihedralnega kota začetno stanje. Torej lahko napišemo: V torzije = k torzije 3 [1-cos 3( eq )] Celotni prispevek mora zaradi deformacije dihedralnega kota upoštevati tudi enkratno in.dvokratno periodičnost. V torzije = k torzije 1 [1-cos( eq )] + k torzije 2 [1-cos( eq )] + k torzije 3 [1-cos 3( eq )] Tudi v tem primeru predstavljajo vse konstante v zgornji programu znane podatke, ki jih predhodno pridobimo eksperimentalno ali pa s kvantnokemijskimi računi. Nevezne interakcije navadno vključujejo Van der Waalsove interakcije in Coulombske (elektrostatke) interakcije. V nevezne interakcije (r) = V VDW (r) + V coulombske int. (r) Van der Waalsove interakcije predstavimo kot vsoto odbojnih in privlačnih členov (Lennard-Jonesov potencial): min 12 mni 6 r ij r VDV ij V ij ij 2 rij rij Člen, ki predstavlja Coulobske interakcije, pa opišemo s Coulombovim zakonom: V Coulombske ij q 4 i m q j o r ij Računalniški program med računanjem spreminja parametre (r, vseh vezi valenčnih in dihedralnih kotov ter poišče tako konformacijo, kjer je skupna energija minimalna. Tu pa je tudi 71

72 glavna slabost: čim večje je število spremenjivih parametrov, tem težje je obravnavati vse možnosti, saj mora program sistematično pregledati vse korake, kar pa predvsem podaljša čas izračuna najugodnejše konformacije. 2. GEMETRIJSKA PTIMIZACIJA Mutidimenzionalno površino, ki ponazarja energijo molekule kot funkcijo vseh možnih razporeditev (koordinat) njenih atomov, imenujemo površina potencialne energije (potential energy surface - PES). Pri velikih molekulah je zaradi ogromnega števila možnih stanj sploh ne moremo konstruirati. Na PES so zanimive predvsem stacionarne točke, tako minimumi (lokalni in globalni), kjer ima molekula ugodno energijo, kot tudi sedla (za lokacijo geometrij prehodnih stanj). Geometrijska optimizacija pomaga najti minimume (in tudi sedla) na PES. Če na PES iščemo minimume, postopek pogosto imenujejo tudi energetska minimizacija. Navadno geometrijsko optimizacijo poženemo iz začetne konformacije x k, ki je kemijsko smiselna; le-tej optimizacijski algoritem nato toliko časa spreminja geometrijske parametre, da na koncu najde stacionarno točko. Potencialno funkcijo V(x) lahko razvijemo v Taylorjevo vrsto okrog trenutne konfiguracije x k. Prvi odvod potencialne funkcije V`(x k ) imenujemo tudi gradient glede na odvajano koordinato. 3N x 3N matrika drugih odvodov V``(x k ) imenujemo tudi Hesse-jeva matrika. V ( x) V ( x k ) ( x x k ) V `( x k ) ( x x k 2 ) V ``( x k )... ptimizacijske algoritme razvrstimo v dve veliki skupini. Tiste, ki temeljijo na prvem odvodu potencialne funkcije, in tiste, ki pri optimizaciji uporabljajo še drugi odvod. V prvo skupino uvrščamo metode najhitrejšega spusta (steepest descent) in konjugiranih gradientov (conjugative gradients) v drugi skupini pa so najpomembnejše Newton-Raphsonove metode. Metode najhitrejšega spusta uporabljamo pri začetnih grobih minimizacijah struktur daleč od minimuma, saj tu izračunamo spremembo energije, ko enega izmed atomov premaknemo iz začetne geometrije in nato v večih iteracijah, s spreminjanjem geometrijskih parametrov, molekulo pripeljemo v energijsko optimizirano strukturo. Metoda ni najbolj učinkovita, ko se struktura približa minimumu. Nato metode konjugiranih gradientov so veliko bolj usmerjene in za izračun geometrijskega vektorja premika v naslednjem koraku optimizacije uporabijo gradient, izračunan v prejšnjem koraku. So računsko bolj zahtevne, toda veliko bolje konvergirajo. Pri Newton-Raphsonovih optimizacijskih algoritmih dodatno izračunamo še drugi odvod, ki poleg gradienta poda informacije o ukrivljenosti funkcije, kar pripomore k uspešni konvergenci. Izbor optimizacijske metode je pogojen z začetnim stanjem sistema, velikostjo in računalniškimi kapacitetami, ki so na voljo. 72

73 3. MLEKULSKE SIMULACIJE MLEKULSKA DINAMIKA Molekulske simulacije omogočajo natančnejše preiskovanje PSE in s tem generiranje konfiguracijskega ansambla, ki ga uporabljamo za računanje makroskopskih lastnosti sistema, kamor spadajo tudi termodinamske količine, ki jih lahko izmerimo z različnimi eksperimentalnimi tehnikami. Najpogosteje uporabljana metoda molekulske simulacije je molekulska dinamika (MD), pogosto pa se poslužujemo tudi metode Monte Carlo. Pri MD konfiguracije molekulskega ansambla generiramo z integriranjem Newtonovih enačb gibanja. 2 d ri ( t) Fi ( t) 1 V ( r( t)) dt m m r ( t) i Pri tem velja, da je sila Fi na i-ti delec enaka negativnemu gradientu potencialno energijske funkcije, ki je enaka produku mase i-tega delca in njegovega pospeška. Rezultat simulacije molekularega sistema z molekulsko dinamiko je trajektorija, ki opiše, kako se pozicije in hitrosti delcev, ki tvorijo molekularni sistem, spreminjajo s časom. Na žalost za večje sisteme ne poznamo analitičnih rešitev teh enačb gibanja in se moramo zateči k numeričnemu reševanju. Najpogosteje uporabljene numerične tehnike so metode končnih razlik (finite difference methods), kjer izvedemo integracijo v seriji majhnih časovnih korakov z dolžino Δt. Ta premisa je osnova za množico integracijskih algoritmov, med drugimi tudi za Verletov algortitem, ki predpostavlja, da se položaj r delca i v časovnih intervalih t+δt in t-δt da zapisati v obliki Taylorjeve vrste. i i 2 dri d ri ri ( t t) ri ( t) t 2 dt dt 2 3 t d ri 3 2! dt 3 t... 3! 2 dri d ri ri ( t t) ri ( t) t 2 dt dt 2 3 t d ri 3 2! dt Kombinacija zgornjih enačb da končno obliko Verletovega algoritma 3 t... 3! 2 d ri ri ( t h) 2ri ( t) ri ( t h) 2 dt 2 t 4 ( t ) 2! Ker se v Veletovem integracijskem algoritmu hitrosti ne pojavijo eksplicitno, jih lahko izračunamo na več različnih načinov, med drugim tudi iz pozicij v času t+δt in t-δt dri ri ( t t) ri ( t t) 3 ( t ) dt 2 t V literaturi najdemo še druge integracijske algoritme (npr. Leap-frog algoritem velocity Verlet algoritem itd.). Z vsemi opisanimi algoritmi lahko ohranimo celotno energijo sistema. V primeru, da želimo izvajati simulacijo molekulske dinamike pri konstantni temperaturi, uporabimo ustrezen termostat oz. barostat v primeru konstantnega tlaka. 73

74 UVD V METDE MLEKULSKEGA MDELIRANJA 1. RAČUNALNIŠKA (RAČUNSKA) KEMIJA MLEKULSK (MLEKULARN) MDELIRANJE Molekulsko (molekularno) modeliranje je krovni pojem za uporabo teoretičnih pristopov, ki omogočajo posnemanje obnašanja atomov in molekul s pomočjo računalnika (in silico). 74

75 NEKATERE ZNAČILNSTI MDELIRANJA 1. Uporaba fizikalnih teorij in/ali empirično ugotovljenih povezav prevedenih v matematični jezik 2. Uporabna tako v naravoslovnih (npr. fizika, matematika) kot v tehničnih znanostih (npr. strojništvo, elektrotehnika, gradbeništvo) 3. Pričetek eksperimentalnega/projektnega dela, ko se sistemi in procesi dobro preučijo (modelirajo/simulirajo) z računalniškimi tehnikami Primeri modeliranja iz drugih področji: gradnja hidroelektrarne, načrtovanje avtomobila, preučevanje gibanja tokov v oceanih, gibanja delcev v polprevodnikih itd. 4. Dostopni eksperimentalni podatki usmerjajo potek postavljanja modela pomembna zanesljivost eksperimenta in kritično ovrednotenje 5. Uporaba modeliranja za razumevanje sveta na atomskem nivoju je manj eksaktno RAČUNALNIŠKA KEMIJA IN NBELVE NAGRADE 75

76 RAČUNSKA KEMIJA IN NBELVE NAGRADE The 2013 Nobel Prize in Chemistry was awarded to Martin Karplus, Michael Levitt and Arieh Warshel for the development of multiscale models for complex chemical systems. NIVJI MLEKULSKEGA MDELIRANJA Molekulske ( atomistične ) simulacije Monte Carlo simulacije Simulacije na mezo skali 10-6 S 10-8 S S Kvantna kemija Molekulska dinamika F = ma exp(- E/kT) m 10-8 m 10-6 m 10-4 m Velikost obravnavanih sistemov 76

77 2. MLEKULSKA GRAFIKA Molekulska grafika je področje molekulskega modeliranja, kiseukvarja zgrafično predstavitvijo molekulskih modelov. mogoča prikaz(vizualizacijo) modelov atomov in molekul, uporabljamo pa jo tudi za predstavitev rezultatov računanja. Večina grafičnih programov uporablja standardno označevanje atomov. Atom vodik ogljik kisik dušik žveplo fosfor fluor klor brom jod Barva bela črna/siva rdeča modra rumena oranžna zelena zelena rjava vijolična TEKSTVNI ZAPIS MLEKULE Podatke o molekulah zapišemo v različnih standardnih formatih, ki jih programi za vizualizacijo lahko prepoznajo in prikažejo. Primeri standardnih formatov: 1. pdb format 2. cdx (ChemDraw exchange file), 3. mol (MDL molfile), 4. mol2 (SYBYL format), 5. sdf (structure data file) 77

78 GRAJENJE MDELA MLEKULE S PMČJ GRAFIČNEGA VMESNIKA gradnike s standardnimi geometrijami (znane medatomske razdalje, valenčni koti in tipi hibridizacije) povezujemo med seboj moramo definirati vse parametre strukture (povezanost atomov, stereokemijo) VIZUALIZACIJA Z MLEKULSKIMI PVRŠINAMI Molekula l predstavljena z Van der Če zakotalimo kroglico, ki ima radij topila Waalsovimi kroglami (sferami) čez Van der Waalsove sfere, očrtamo Unija vseh atomskih sfer = molekulsko površino, ki je na voljo za interakcijo z topilom = Volumen molekule Solvent accessible surface area (SASA). 78

79 Molekulske površine (primer: adrenalin) Površina dostopna topilu Conollyjeva površina VIZUALIZACIJA BIMAKRMLEKUL (1) Vizualizacija vseh atomov strukture bioloških makromolekul (predvsem proteinov) ni pregledna in informativna. Bolje je shematsko predstaviti ključne elemente strukture: a) Prikažemo potek glavne proteinske verige (backbone) b) dodatno poudarimo elemente sekundarne strukture (alfa vijačnice, beta strukture) c) Narišemo površino molekule zavoj beta struktura alfa vijačnica 79

80 3. PRILEGANJE KNFRMACIJ MLEKUL Konformacija molekule je definirana s prostorsko razporeditvijo atomov, ki sestavljajo molekulo. Lahko primerjamo med seboj različne konformacije molekul (tudi makromolekul) ali pa konformacije delov dveh različnih molekul, ki imajo podobno ali enako funkcijo. Kvantitativno oceno ujemanja največkrat uporabimo parameter RMSD (rootmean square distance). d i, j ( xi x j ) ( yi y j ) ( zi z j ) d i,j razdalja med atomoma i in j, ki sta: 1. identična (pri primerjavi konformacij iste molekule) 2. primerljivi funkciji v dveh različnih molekulah RSMD N d 2 i, j i, j 1 N PRIMER PRILEGANJA MLEKUL d1 d2 RSMD RMSD vrednost je odvisna od relativnega položaja obeh molekul Iskanje optimalnega RMSD pred Prileganje PRILEGANJE MLEKULE NA DRUG KT TG TEL N i, j 1 RSMD d i d N 2 i, j 0 RSMD prileg. N i, j 1 d N 2 i, j 80

81 UPRABA RSMD PARAMETRA 1. Primerjava konformacij različnih molekul 2. Primerjava vezavnih mest sorodnih encimov 3. Primerjava različnih konformacij preiskovane molekule 4. PIS ATMSKE STRUKTURE: MLEKULSKA MEHANIKA (MM) Molekulska mehanika je aplikacija klasične Newtonove mehanike za modeliranje geometrije in dinamike atomov in molekul KAJ VSE VPLIVA NA ENERGIJ MLEKULE? 81

82 ENERGIJSKI ČLEN 1: DEFRMACIJA KVALENTNE VEZI Deformacijo kovalentne vezi med dvema atomoma opišemo z obnašanjem prožne vzmeti, za katero velja Hookov zakon. Energija je sorazmerna kvadratu odmika od ravnotežne razdalje med atomoma. V( r N kvezi ) ( li li 2 vezi 2, 0 ) l i predstavljata vezno razdaljo l i,0 pa idealno ravnotežno razdaljo Primeri vrednosti parametrov: karbonilni kisik - karbonilni ogljik k vezi = kcal/molå 2 l i,0 = Å karbonilni ogljik - alfa ogljik k vezi = kcal/molå 2 l i,0 = Å alfa ogljik - amidni dušik k vezi = kcal/molå 2 l i,0 = Å ENERGIJSKI ČLEN 2: DEFRMACIJA VALENČNEGA KTA Deformacijo valenčnega kota opišemo z obnašanjem prožne vzmeti, za katero velja Hookov zakon. Energija je sorazmerna kvadratu odmika deformacije valenčnega kota. N k V( r ) kota ( i i 2 koti 2 2, 0 ) i predstavljata valenčni kot i,o pa ravnotežni vezni kot. Primeri vrednosti (aminokislinsko ogrodje) karbonilni kisik - karbonilni ogljik - alfa ogljik k kota = 80.0 kcal/mol, i,o = karbonilni ogljik - alfa ogljik - amidni dušik k kota = 63.0 kcal/mol, i,o =

83 ENERGIJSKI ČLEN 3: TRZIJSKI PTENCIAL Torzijski potencial prikazuje odvisnost energije od vrednosti torzijskega kota. Torzijski kot med zaporednimi atomi ijkl N k definira kot, ki ga oklepata ravnini, ki potekata torzije V ( r ) (1 cos( n 0 )) skozi atome ijk in jkl. 2 torzije ktorzije predstavlja torzijsko bariero, n pa periodičnost, ki pove, kolikokrat se posamezen minimum oz. maksimum ponovi med rotacijo za 360 o je referenčni torzijski kot Torzijski potencial = vsota več enostavnih trigonometričnih funkcij ENERGIJSKI ČLEN 4: CULMBV PTENCIAL Coulombov potencial za opis elektrostatskih interakcij med atomi. q i in q j - delna (parcialna) naboja atomov r ij - razdalja med atomoma. V qiq j 4 0 r ij Poseben opis vodikove vezi med molekulami lahko računsko obravnavamo z energijskim členom podobnim Lennard-Jonesovem potencialu. C V ( H vez) ( r ij ij ) 12 D ( r pari atomov na razdalji r ij, ki vstopajo v tvorbo vodikove vezi. C ij in D ij sta empirični konstanti. ij ij ) 10 A D 83

84 ENERGIJSKI ČLEN 5: LENNARD- JNESV PTENCIAL Vsota odbojnega in privlačnega člena odboj: ~r Člen r 12 opisuje kratkosežne (Paulijeve) odbojne sile, ki nastanejo zaradi odboja pri kontaktu elektronskih orbital, 2. r 6 člen pa opisuje privlačne daljnosežne interakcije (van der Waalsove sile in disperzijske sile). ij V 4 ij ( ) rij 12 ij 6 ( ) rij A ij in B ij sta parametra, ki jih določimo s pomočjo znanih vrednosti za posamezne atome. EMPIRIČNA ENERGIJSKA PTENCIALNA FUNKCIJA Potencialna energija molekule = energija kovalentnih (veznih) interakcij + energija nekovalentnih interakcij V ( r N N N i 1 j i 1 kvezi 2 k k kota 2 ) ( li li,0) ( i i,0) vezi koti torzije ij (4 ij ( ) rij 12 ij q 6 iq j ( ) ) rij 4 0rij torzije (1 cos( n )) 0 INTERAKCIJSKA ENERGIJA (energija neveznih interakcij) 84

85 5. PREISKVANJA PVRŠINE PTENCIALNE ENEGIJE MLEKULE Večdimenzionalno površino, ki ponazarja energijo molekule kot funkcijo vseh možnih razporeditev (koordinat njenih atomov), imenujemo PVRŠINA PTENCIALNE ENERGIJE (PTENTIAL ENERGY SURFACE - PES). Na PES želimo poznati predvsem stacionarne točke: 1. Minimume - energijsko ugodne lege 2. Sedla - za lokacijo geometrij prehodnih stanj METDI PREISKVANJA: 1. GEMETRIJSKA PTIMIZACIJA 2. MLEKULSKA DINAMIKA METDA PREISKVANJA PES: ENERGIJSKA MINIMIZACIJA GEMETRIJSKA PTIMIZACIJA Geometrijska optimizacija je računski postopek iskanja konformacij molekul v energijskih minimumih (ali sedlih) na PES. Potrebna informacija: Začetna konformacija sistema (initial guess) ptimizacijski algoritem v več korakih (iteracijah) poišče konformacijo molekule, ki ima v lokalni okolici najnižjo vrednost potencialne energije (lokalni minimum) = ENERGIJSKA MINIMIZACIJA. Kriterij iskanja: prvi odvod (gradient) energije po koordinatah, ki se mu lahko pridruži tudi drugi odvod. 85

86 GEMETRIJSKA PTIMIZACIJA -VREDNTENJE Kompleksnost večdimenzionalne površine potencialne energije je vzrok, da začetno stanje sistema močno vpliva na končni rezultat geometrijske optimizacije. ptimizacijski algoritmi uspejo najti le stacionarno točko, ki je blizu začetni strukturi. Pomembni eksperimentalni podatki! 6. MLEKULSKE SIMULACIJE Molekulske simulacije omogočajo preiskovanje površine potencialne energije in generiranje mnogih konformacij molekul (molekulski ansambel), ki so pri danih pogojih simulacije, dostopne posameznemu sistemu. Tako lahko izračunamo makroskopske merljive količine in primerjamo rezultate simulacij z eksperimentalnimi podatki. Teoretično osnovo za to povezavo med strukturo molekul in njihovimi makroskopskimi lastnostmi omogoča statistična mehanika. Atomistična obravnava sistema STATISTIČNA MEHANIKA Makroskopska obravnava sistema STRUKTURNI PDATKI MERITVE 86

87 METDA: MLEKULSKA DINAMIKA (MD) Molekuska dinamika (MD) je računalniška simulacija, kjer opazujemo dinamične lastnosti in obnašanje atomov ali molekul, ki interagirajo med seboj v skladu Newtonovimi enačbami gibanja (II. Newtonov zakon). N krat ponovimo snovni algoritem MD: Atomom določimo začetne koordinate r, in izberemo časovni interval Δt (ta korak je zelo kratek = 1 fs = s) Izračunamo rezultanto sil na vsak atom in posledični pospešek: E F ( X ) E( X ) X M X F(X ) Premaknemo atom v smeri pospeška z uporabo poljubnega integracijskega algoritma r i 1 r premaknemo čas naprej za Δt i i v t 1/ 2a t SIMULACIJSKI ČAS = N x Δt Npr. če opravimo 1000 korakov po 1fs je izvedena MD simulacija dolga 1ps 2... {r(t), v(t)} {r(t+ t), v(t+ t)} MLEKULSKA DINAMIKA VS. ENERGIJSKA MINIMIZACIJA Energija LKALNI MINIMUM 87

88 6. poglavje Metode virtualnega rešetanja in načrtovanja biološko aktivnih spojin 88

89 UVD V METDE VIRTUALNEGA REŠETANJA 1. VIRTUALN REŠETANJE ISKANJE NVIH BILŠK AKTIVNIH MLEKUL Tehnike računalniške kemije, ki jih uporabljamo kot pomoč pri načrtovanju in iskanju novih biološko aktivnih molekul, imenujemo s krovnim izrazom virtualno rešetanje (virtual screening - VS). VS je definirano kot avtomatizirano preiskovanje (»rešetanje«) velikih knjižnic virtualnih molekul z uporabo računalniške tehnologije, z namenom preiskati in zožiti obstoječi kemijski prostor na nekaj razredov spojin, ki so z veliko verjetnostjo aktivne na preiskovani tarči. Metoda virtualnega rešetanja je sorodna svoji eksperimentalni različici rešetanju visokih zmogljivosti (high-troughput screening - HTS), le da pri VS različici»rešetamo«z računalnikom (in silico). Na sliki 1 je shematsko predstavljen splošen postopek virtualnega rešetanja. Priprava knjižnice virtualnih spojin 3D konformacije, stereokemija, protonacija, tavtomerija Validacija programa za VS Virtualno rešetanje (LBDD ali SBDD) Izbor spojin In biološko testiranje Slika 1. Splošna shema celotnega postopka virtualnega rešetanja. Pred izvedbo virtualnega rešetanja je zelo pomembna priprava knjižnice virtualnih molekul, kjer vsako molekulo opišemo z ustrezno konformacijo (včasih celo s nizom več konformacij). Uporabimo generatorje tridimenzionalnih struktur, ki zgradijo tridimenzionalne modele molekul. Previdno moramo ovrednotiti kemijsko smiselnost dobljenih konformacij, pravilnost protonacijskih vzorcev, aromatičnost, stereokemijo in upoštevati potencialne tavtomerne oblike molekule. V primeru neprimerno pripravljenih virtualnih knjižnic je tudi uspeh virtualnega rešetanja manjši. Naj omenimo, da obstajajo tudi metode virtualnega rešetanja, kjer pri preiskovanju ne uporabljamo tridimenzionalnih struktur, ampak npr. topološko dvodimenzionalno predstavitev molekule in tudi druge enostavnejše predstavitve molekul. 89

90 V drugem koraku virtualnega rešetanja opredelimo robne pogoje, ki jim mora virtualna molekula zadostiti, da bo v procesu rešetanja identificirana kot potencialni zadetek. Poznamo dve osnovni skupini metod virtualnega rešetanja. Pri načrtovanju in iskanju novih biološko aktivnih spojin lahko robne pogoje postavimo na osnovi strukture in lastnosti poznanih aktivnih ligandov - načrtovanje na osnovi strukture liganda - ligand-based drug design (LBDD) ali pa za načrtovanje uporabimo dosegljive podatke o tridimenzionalni strukturi tarče ali kompleksa tarče z ligandom - načrtovanje na osnovi strukture tarče - structure-based drug design (SBDD). ba pristopa se med seboj lahko dopolnjujeta. Kateri pristop izberemo, je vedno odvisno od konkretnega obravnavanega primera in eksperimentalnih podatkov, ki jih imamo na voljo. Glavna metoda pri SBDD je molekulsko sidranje, pri LBDD pa se najpogosteje uporabljajo tridimenzionalni farmakoforni modeli. Uporabljeno metodo virtualnega rešetanja moramo tudi validirati. Med validacijo preučujemo, kako se pod postavljenimi robnimi pogoji obnašajo molekule, za katere imamo tudi eksperimentalne podatke, npr. kristalno strukturo kompleksa s proteinom ali izmerjeno aktivnost. Tako lahko direktno primerjamo eksperimentalne in izračunane vrednosti in s tem pridobimo nove informacije, ki omogočajo nadaljnjo optimizacijo robnih pogojev pri rešetanju knjižnic virtualnih molekul. Na koncu postopka virtualnega rešetanja analiziramo dobljene rezultate in izberemo spojine, ki jih ovrednotimo v testih biološke aktivnosti na izbrano tarčo. Postopek virtualnega rešetanja je iterativen, saj novi eksperimentalni podatki, ki jih dobimo po testiranju izbranih spojin, vodijo v postavitev novih pogojev rešetanja, dokler ne dobimo spojin z optimalno aktivnostjo in želenimi lastnostmi. 90

91 2. VIRTUALN REŠETANJE NA SNVI STRUKTURE TARČE - MLEKULSK SIDRANJE Pri molekulskem (dockingu) sidranju poizkušamo predvideti strukturo intermolekularnega kompleksa, ki se tvori med dvema ali več molekulami, kot bi ga lahko ugotovili s pomočjo kristalografskih ali pa NMR študij. Molekulsko sidranje se v veliko primerih uporablja kot metoda za oceno vezave proteinskih inhibitorjev. Večina računalniških algoritmov, ki izvaja molekulsko sidranje, je sposobna generirati zelo veliko količino možnih struktur, zato mora biti program tudi sposoben oceniti te strukture in izmed njih izbrati tiste, ki se najboljše vežejo (t. i. docking problem). Potencialni ligandi Molekulsko sidranje Tarčni protein Ligand postavljen v aktivno mesto Slika 2. Splošna shema molekulskega sidranja snovna zveza, ki omogoča ocenitev afinitete kompleksov ligand-receptor, izhaja iz termodinamike in predstavlja povezavo med količinama ΔG (sprememba Gibssove proste energije) in Kd (disociacijska vezavna konstanta). ΔG = R T In Kd 91

92 Pri čemer je ΔG razlika med G v G n,torej prosto energijo v veznem in v neveznem stanju, Kd pa predstavlja konstanto kemijskega ravnotežja za reakcijo razpada kompleksa ligand-receptor. K d R L RL Zgoraj omenjene enačbe predstavljajo teoretično osnovo za izdelavo scoring (cenilnih) funkcij, ki omogočajo napovedovanje vezavne konstante molekul, ki so kandidatke za sintezo na osnovi poznavanja kompleksa protein-ligand. Cenilne funkcije so lahko uspešne le pod pogojem, da le-ta zelo dobro opredeli fizikalne sile, udeležene v interakciji, in da je tridimenzionalna struktura receptorja znana. Večina do sedaj razvitih algorotmov za molekulsko sidranje (docking) temelji na predpostavki, da je receptor rigidna struktura. Algoritem nato poizkuša umestiti ligand v naprej definirano rigidno strukturo. Žal se ta predpostavka lahko izkaže za napačno, kar omejuje napovedno sposobnost teh modelov. Strukturo receptorja določijo ponavadi z uporabo rentgenske strukturne analize ali pa NMR spektroskopijo. Ker je receptor rigiden, se spreminja le geometrija liganda. V času procesa sidranja algoritem spreminja rotacijske translacijske in interne dihedralne stopnje prostosti molekule, ko poskuša kar najbolje umestiti molekulo v vezavno mesto. Splošno sprejeta predpostavka, ki jo večina algoritmov tudi vsebuje, je tudi, da se dolžina vezi ne spreminja. Izkazalo se je, da je pri ligandih, ki vsebujejo do 40 atomov, ta predpostavka upravičena. Molekulsko sidranje na rigidni receptor predstavlja torej optimizacijo preko 6+n dimenzionalnega prostora, kjer n predstavlja število vezi liganda, ki lahko rotirajo. SCRING (CENILNA) FUNKCIJA Cenilna funkcija omogoča relativno razvrščanje ligandov enega nasproti drugemu glede na energijo interakcije. Tako lahko razvrstimo molekule, ki smo jih sidrali v vezavno mesto med seboj, in tako dobimo podatke, ki so analogi z»in vitro«določeno biloško aktivnostjo (Ki, IC50). Najprej so razvili metode, ki so težile k čim boljši simulaciji fizikalno-kemijskega procesa vezave liganda na protein, kar pa je bilo predvsem časavno neracionalno. Te metode so omogočile izgradnjo najboljših cenilnih funkcij. Zaradi zahteve po virtualnem rešetanju velikega števila molekul, so kasneje razvili metode, ki se poslužujejo mnogih približkov in zanemarjajo določene aspekte vezave. Kljub relativni preprostosti te funkcije omogočajo napovedi s standardno deviacijo 1-1,5 logk. Vsaka od do sedaj znanih cenilnih funkcij ima svoje prednosti in slabosti in trenutno nobena ne izpolnuje 92

93 vseh pogojev idealne funkcije, ki naj bi bila zanesljiva, natančna, robustna, splošno uporabna in fizikalno osnovana. Cenilne funkcije predstavljajo zelo obetajoče področje nadaljnjega razvoja predvem na področju preiskovanja velikih kombinatornih knjižnic, kjer predstavljajo filter, ki omogoča predizbor molelul, ki bi lahko predstavljale potencialne zdravilne učinkovine. Cenilne funkcije v splošnem delimo na tri kategorije:»explicit force field«cenilne funkcije Te cenilne (scoring) funkcije temeljijo na modificinarinih različicah znanih polj sil (force field), kot sta npr. AMBER in CHARMM. To sta znani polji sil, ki omogočata računanje molekulske mehanike (princip MM je opisan že predhodno v uvodu). Izgradnja funkcije poteka navadno po dveh metodologijah. Prva poizkuša dosledno opisati termodinamski cikel, ki opisuje nastanek kompleksa med proteinom in ligandom (zelo dolgotrajno). Drug pristop pa predpostavlja, da struktura proteinligand, pridobljena z rentgensko difrakcijo, ustreza strukturi kompleksa v ravnotežju. Receptor so obravnavali kot izključno statičen objekt. Interakcijska enerjija se nato izračuna na osnovi 3D kordinat kompleksa protein-ligand. Algoritem izračuna posamezne prispevke interakcijske energije, ki se zaradi aditivnosti termodinamskih funkcij dajo sešteti in dajo oceno celotne energije interakcije. Dobljeno enačbo so poimenovali temeljna (master) enačba.. ΔG vezave = ΔG interakcije + ΔG raztapljanja + ΔG konformacije + ΔG gibanja ΔG interakcije predstavlja spremembo proste energije zaradi specifičnih elektrostatskih in van der Waalsovih sil. ΔG raztapljanja je solvatacijska prosta energija, ΔG konformacije je vsota ΔG l in ΔG, r kar predstavlja spremembo proste energije proteina (r) in liganda pri nastanku kompleksa. ΔG gibanja je vsota členov ΔG rotacija ΔG traslacija/rotacija in ΔG vibracije, Empirične cenilne funkcije Tudi empirične cenilne funkcije slonijo na uporabi temeljne enačbe in aplikaciji modificiranega polja sil. Glavna razlika od prej opisanih načinov izračuna konstante molekule je, da je tu vsak prispevek (člen) energije, ki nastopa v enačbah, utežen s utežnim koeficientom. ΔG vezave = (ΔG i f i (l, r)) 93

94 Utežne koeficiente ΔG i pridobijo tako, da eksperimentalno strukturo korelirajo z eksperimentalnimi vrednostmi konstant (Ki) z eno od statističnih metod (npr. multivariantno analizo). Njihova glavna prednost je hitrost, saj potrebujejo za izačun le delček sekunde. Preciznost napovedi, ki jo te funkcije dosežejo, je 1-1,5 velikostnega razreda eksperimentalne Ki. Glavna slabost empiričnih cenilnih funkcij pa je predvsem v tem, da ni povsem jasno, do katere mere se jih lahko uporablja za napovedi vezavnih konstant inhibitorjev, ki se strukturno signifikantno razlikujejo od tistih, s pomočjo katerih so izračunali utežne koeficiente. Vsaka empirična cenilna funkcija namreč opiše energijske prispevke na nekoliko drugačen način. Programski paket FlexX, ki smo ga uporabili tudi v tem delu, vsebuje kar nekaj teh cenilnih funkcij. Med njimi so tudi sledeče F-score, D-score, G-score in Chem score. Podrobno predstavljamo algoritme treh pomembnejših: 1. F-score Böhn je s sodelavci opisal funkcijo F-score, ki vezavno konstanto izračuna iz prispevkov ionskih in vodikovih vezi, aromatskih in ostalih kontaktov ter oceno izgube entropije zaradi zmanjšanja notranjih stopenj prostosti vrtljivih vezi. Funkcija je podana s sledečim formalzmom: G G G aromatske int erakcije o G rot aromatske int erakcije N rot G H vezi f ( R, ) G lipofi ln e int erakcije f ( R, ) G ionske nev. H vezi int erakcije f lipofi ln e int erakcije * ( R ) f ( R ) ionske int erakcije f ( R, ) Člen ΔG 0 opredeljuje redukcijo rotacijske in translacijske proste energije ΔG rote izgubo entropije zaradi zmanjšanja notranjih stopenj prostosti. N rot je število prosto rotabilnih vezi, ki so v kompleksu imobilizirane. ΔG H-vezi je prosta energija asociacije zaradi vodikovih vezi, ΔG ion, interakcije pa prispevek energije elektrostskih interakcij, Člen f( ΔR,Δ ) predstavlja kazensko funkcijo za izločanje konformacij s strukturo, ki odstopa od idealne geometrije. ΔG aromatske interakcije, in ΔG lipofilne interakcije predstavljata prosto energijo interakcij aromatskih skupin ter lipofilno kontaktno interakcijo. ΔR = R R 0 pa je razdalja med centroma atoma in R 0 idealna vrednost, ki je za 0,3 Å večja od van dre Wallsovega radija. Koeficiente ΔG i so dobili s pomočjo multiple linearne regresije na nizu molekularnih kompleksov z eksperimentalno podano afiniteto liganda. 94

95 2. Chem-score Eldrige in sodelavci so 1997 razvili funkcijo Chem-score. Ta funkcija ocenjuje vodikove vezi, lipofilnost in interakcijo liganda s kovinskimi ioni. Tudi zanjo lahko napišemo splošno enačbo: G vezave G 0 GH vezi g1( ri ) g 2 ( j i, j ) G metal am f ( r am ) G lipo IL f ( r IL ) G rot H rot I, a, i označujejo atome liganda, j in M kovinski atom L pa proteinske atome. Razlikovanja med nevtralnimi in ionskimi vodikovimi vezmi ni, člen g ( r i ) g ( ) pa opredeli jakost vezi glede na odstopanje od idealne geometrije. Funkcija ima tudi poseben kovinski člen ΔG metal, pri čemer je r am razdalja med kovinskim atomom in atomom liganda. G f ( ) predstavlja lipofilni prispevek i, j 1 2 lipo r IL IL k prosti energiji vezave, kot funkcijo razdalje med dvema atomoma. j G rot H opredeljuje prosto energijo zaradi izgube rotacije prostih vezi. Funkciji g in g omogočata natančnejšo razdelitev vodikovih vezi glede na dolžino in velikost kota D H A. Tudi v tem primeru so koeficiente ΔG i so dobili s pomočjo multiple linearne regresije na nizu molekularnih kompleksov z eksperimentalno podano afiniteto liganda. 3. D-score To nekoliko strarejšo cenilno funkcijo so razvili Kuntz in njegovi sodelavci. Upoštevali so le naboje in van der Waalsove interakcije med proteinom in ligandom. Skupno energijo interakcije izračunamo s sledečim formalizmom: Ker qi je naboj vsakega posameznega atoma i in D je dielektrična konstanta. A in B sta parametra, ki jih dobimo s Tripos poljem sil za vsak tip atomov. Naboje izračunamo s Gasteiger-Marsili metodo. Knowledge-based«scoring funkcije Zadnja skupina funkcij temelji na statistični mehaniki. Te funkcije so sposobne statistične analize eksperimentalno določenih kompleksov protein-ligand, za katere predpostavljajo, da so v termodinamskem ravnotežju in predstavljajo globalni minimum proste energije kompleksa. Tako 95

96 določijo začilnosti molekule, preferenčne za vezavo. Te značilnosti se nato pretvotijo v psevdo potenciale, ki se nato služijo za ocenitev nove molekule. Prednost teh funkcij naj bi bila predvsem v tem, da s statističnim pristopom vključimo v obravnavo tudi fizikalne zakonitosti vezave, ki je še ne razumemo (recimo solvatacija in polarizacija). Izmed bolj znanih cenilnih funkcij lahko na tem mestu omenimo funkciji PMF (potential mean force), ki je del cenilnih funkcij v programu Flexx in DrugScore. 3. VIRTUALN REŠETANJE NA SNVI STRUKTURE LIGANDV - FARMAKFRNI MDELI Farmakofor je zbirka steričnih in elektronskih lastnosti, ki so potrebne za zagotovitev optimalnih medmolekulskih interakcij s specifično biološko tarčo, in vodijo do indukcije ali inhibicije biološkega odziva. Tehnologija virtualnega rešetanja lahko postavljene farmakoforne modele uporabi kot robne pogoje pri iskanju novih biološko aktivnih vodnic. Pomembno je vedeti, da farmakofor ni realna molekula ali zbirka funkcionalnih skupin. V preglednici 3 so zbrani najpomembnejši farmakoforni elementi in njihove shematske oznake, ki jih uporabljamo za postavitev farmakofornega modela. Predstavljajo točke v prostoru, obdane z določenim tolerančnim radijem, v katerem mora ležati fragment preiskovane molekule, ki izkazuje enake lastnosti kot posamezni farmakoforni element (npr. ionski center, hidrofobna interakcija, sterična omejitev, aromatski obroč itd.). Pri donorjih in akceptorjih vodikove vezi moramo poleg tolerančnega radija upoštevati še usmerjenost H-vezi v prostoru, zato moramo dodati še geometrijsko omejitev, ki omogoča tvorbo H-vezi le pri določenih vrednostih interakcijskega kota. Primer farmakofora z dvema ionskima centroma, hidrofobno interakcijo, akceptorjem vodikove vezi in več steričnimi omejitvami prikazuje desna stran preglednice 1. bstajata dva temeljna pristopa gradnje farmakofornega modela. Farmakofor lahko zgradimo s pomočjo znane tridimenzionalne strukture kompleksa protein/ligand, dobljenega s kristalografskimi ali NMR eksperimenti. To so na strukturi temelječi farmakofori (structure-based pharmacophore). Druga možnost je, da ga izpeljemo iz niza ligandov z znano biološko aktivnostjo, za katere predpostavljamo, da se vežejo v isto aktivno mesto z identičnim vzorcem medmolekulskega prepoznavanja. To so na ligandih temelječi farmakofori (ligand-based pharmacophore). 96

97 Preglednica 1. Pregled najpogosteje uporabljenih farmakofornih elementov (levo) in primer farmakofora z dvema ionskima centroma, hidrofobno interakcijo, akceptorjem vodikove vezi in več steričnimi omejitvami (desno). Farmakoforni element Definicija Farmakoforni element Definicija Donor ali akceptor vodikove vezi Hidrofobna interakcija Kationski ali anionski center Interakcijas kovino Primer farmakofornega modela Aromatski obroč Sterična omejitev Pri virtualnem rešetanju zgrajeni farmakoforni model predstavlja robne pogoje, ki jih mora virtualna molekula izpolniti, da bo upoštevana kot potencialni zadetek. Največkrat ocenjujemo ujemanje molekul z metodami prileganja. Prileganje spojine na postavljeni farmakofor je lahko točkovno, v tem primeru je kriterij kakovosti prileganja lahko kar RMSD parameter, lahko pa temelji na osnovi prileganja lastnosti, kot so npr. elektrostatski potencial, elektronska gostota itd. Drugi ključni parameter med prileganjem predstavlja tudi pravilno obravnavanje fleksibilnosti molekul. Farmakoforne modele validiramo z nizi spojin z znanimi podatki o biološki aktivnosti. Rezultate virtualnega rešetanja na koncu še ovrednotimo z različnimi farmakofornimi cenilnimi funkcijami, od RMSD kriterija do različnih kompleksnejših geometrijskih kriterijev. Grafični prikaz in kritična analiza rezultatov pomagata izbrati najbolj obetavne spojine, ki jim tudi eksperimentalno ovrednotimo biološko aktivnost. Deloma prijeno iz poglavja: UVD V MLEKULSK MDELIRANJE iz ANDERLUH, Marko MRAVLJAK, Janez, SVA, Matej, PERDIH, Andrej, PEČAR, Slavko: Farmacevtska kemija III : vaje in seminarji. Ljubljana: Fakulteta za farmacijo,

98 UVD V METDE VIRTUALNEGA REŠETANJA UVD V METDE VIRTUALNEGA REŠETANJA V sodobnem pristopu racionalnega načrtovanja učinkovin se sočasno uporabljajo eksperimentalne in metode računalniške kemije (in silico metode). Kemijski prostor organskih spojin je izredno velik (ocena: spojin) Del kemijskega prostora kjer so spojine za specifično indikacijo CADD=Computer assisted drug design Primeri uspešne uporabe CADD: -zaviralci HIV proteaze (nelfinavir, amprenavir in lopinavir), -zaviralci virusne nevraminidaze (zanamivir in oseltamivir), -učinkovino za zdravljenje kronične mieloidne levkemije (imatinib) Računalniške metode ga pomagajo zožiti in najti področja, kjer se lahko nahajajo nove biološko aktivne spojine. 98

99 VIRTUALN REŠETANJE Virtualno rešetanje je preiskovanje velikih knjižnic virtualnih molekul z uporabo računalniške tehnologije, z namenom preiskati in reducirati obstoječi kemijski prostor na nekaj razredov spojin, ki so z veliko verjetnostjo aktivne na preiskovani tarči. Priprava knjižnice virtualnih spojin Validacija programa za VS Virtualno rešetanje (LBDD ali SBDD) Izbor spojin in biološko testiranje Metoda virtualnega rešetanja je konceptualno sorodna svoji eksperimentalni različici rešetanju visokih zmogljivosti (high-troughput screening - HTS), le da pri VS različici»rešetamo«z računalnikom (in silico). SNVNA PRISTPA VIRTUALNEGA REŠETANJA 1. Uporabimo strukture in lastnosti poznanih aktivnih ligandov Načrtovanje na osnovi strukture liganda - ligand-based drug design (LBDD) 2. Uporabimo dosegljive podatke o tridimenzionalni strukturi tarče ali kompleksa tarče z ligandom Načrtovanje na osnovi strukture tarče - structure-based drug design (SBDD) 99

100 5.1 VIRTUALN REŠETANJE NA SNVI STRUKTURE TARČE MLEKULSK SIDRANJE Molekulsko sidranje (molecular docking) je metoda, ki izračuna preferenčno konformacijo izbrane molekule (navadno majhne molekule liganda, lahko pa tudi makromolekule) v izbranem aktivnem mestu biološke makromolekule (tarče), ob predpostavki, da le-ti tvorita stabilen kompleks. Sestavni komponenti vsakega programskega paketa za sidranje sta: ISKALNI ALGRITEM služi generiranju novih konformacij CENILNA FUNKCIJA - ocenjevanje moči vezavnih interakcij Vezava + = ISKALNI ALGRITEM SEARCH ALGRITEM Iskalni algoritem omogoča generiranje novih vezavnih konformacij (binding mode). Konformacijski prostor kompleks tvorijo vse možne orientacije proteina z vezanim ligandom = veliko konformacij (neobvladljive številke). KNFRMACIJSKA EKSPLZIJA Imamo dve molekuli, katerih konformaciji se spremenita, ko pride do medsebojne interakcije (medsebojna odvisnost). Večina računalniških programov ligand obravnava fleksibilno, medtem ko je receptor statičen. Vrste iskalnih algoritmov: - inkrementna konstrukcija - genetski algoritem 100

101 PRIMER ISKALNEGA ALGRITMA INKREMENTNA IZGRADNJA KMPLEKSA Postopek: 1.V aktivno mesto najprej sidramo večji fragment molekule. 2.Uporaba različnih omejitvenih kriterijev (energijskih ali geometrijskih) da do konca zgradimo konformacijo molekule v aktivnem mestu. SCRING FUNCTIN CENILNA FUNKCIJA Cenilna funkcija generirani konformaciji liganda v aktivnem mestu izračuna energijo interakcije, ki predstavlja oceno afinitete te molekule do preiskovane tarče. Prvi zelo grobi približek proste energije vezave. mogočajo hitro oceno vezavne energije Napovedi s standardno deviacijo logki 1. Cenilne funkcije osnovane na empirični potencialni funkciji E interakcije lig prot Aij Bij qiq j c 12 6 i j r ij rij r ij 2. Empirične cenilne funkcije 3. Cenilne funkcije, dobljene s pomočjo statistične mehanike 101

102 VIRTUALN REŠETANJE Z UPRAB SBDD Definirano aktivno mesto VALIDACIJA METDE MLEKULSKEGA SIDRANJA REŠETANJE BAZE SPJIN NAČRTVANJE NA SNVI STRUKTURE LIGANDA FARMAKFRNI MDELI Farmakofor je zbirka steričnih in elektronskih lastnosti, ki so potrebne za zagotovitev optimalnih supramolekularnih interakcij s specifično biološko tarčo, ki vodi do indukcije ali inhibicije biološkega odziva. Farmakofor ni realna molekula ali zbirka funkcionalnih skupin! DVA TIPA FARMAKFRNIH ELEMENTV: 1. Točke v prostoru, obdane z določenim tolerančnim radijem, v katerem mora ležati fragment preiskovane molekule, ki izkazuje enake lastnosti kot posamezni farmakoforni element. Anionski (kationski) center Hidrofobna interakcija Aromatični obroč 2. Pri donorjih in akceptorjih vodikove še usmerjenost H-vezi v prostoru, geometrijska omejitev, ki omogoča tvorbo H-vezi le pri določenih vrednostih interakcijskega kota. Donor vodikove vezi Akceptor vodikove vezi 102

103 D LIGANDA D FARMAKFRNEGA MDELA Ligand Farmakoforni model VIRTUALN REŠETANJE Z UPRAB LBDD Farmakoforna hipoteza VALIDACIJA FARMAKFRNE HIPTEZE REŠETANJE BAZE SPJIN 103

104 7. poglavje Uporaba metod molekulskega modeliranja pri razumevanju bioloških makromolekul 104

105 UPRABA METD MLEKULSKEGA MDELIRANJA PRI RAZUMEVANJU BILŠKIH MAKRMLEKUL 1. PRIMER PREUČEVANJE STABILNSTI ALFA HELIKSA IN EKSPERIMENTALNA ŠTUDIJA 105

106 MEMBRANSKI RECEPTR BILITRANSLKAZA Receptor,ki skrbi za transport organskih kislin TM3 Transport bilirubina edenga od pomembnih razpadnih produktov hemoglobina Neznana struktura (nobenih strukturnih sorodnikov) Iz primarne strukture NAPVEM TRANSMEMBRANSKE DELE Navadno v: alfa heliks konformaciji NAČRT DELA 106

107 ZAČETNI SISTEMI MLEKULSKA DINAMIKA BEH HELIKSV NAPVED TM3 Razlika V obeh sistemih je le v eni dodatni amino kislini v drugem primeru NAPVED TM3A 107

108 ANALIZA PDATKV STABILNST HELIKSV RMSD PARAMETER RSMD N i, j 1 d N 2 i, j ANALIZA PDATKV BLIKA SEKUNDARNE STRUKTURA 1. RAMACHANDRANV DIAGRAM 2. DINAMIČNA NAPVED SEKUNDARNE STRUKTURE 108

109 EKSPERIMENTALNA PTRDITEV 2. PRIMER SIMULACIJE VEZAVE IN PREMIKANJA DMEN ENCIMA, KI IZKAZUJE VELIK KNFRMACIJSK MBILNST 109

110 BAKTERIJSKI ENCIM MurD Tarča za razvoj novih protibakterijskih zdravilnih učinkovin KNFRMACIJSKA MBILNST ENCIMA MurD Gibanje v ravnini N-terminalne in centralne domene Premik iz ravnine N-terminalne in centralne domene 2UAG zaprta struktura 110

111 RBNE TMD STRUKTURE 1. VEZAVA IN DINAMIKA ZAPIRANJA MurD KNFRMACIJSKA PT 1 ZAKLJUČKI 1. Reproducirano eksperimentalno zaporedje vezave substratov ATP in UMA 2. C-terminalna domena se zavrti v zaprto strukturo kot togo telo (RMSD analiza) 3. Pri obratu sodeluje več aminokislin zanke, ki povezujejo C-terminalno in centralno domeno (Gly298, Leu299, Pro300, Arg302) 111

112 VEZAVA ATP MLEKULE Vezava ATP VEZAVA UMA MLEKULE 112

113 2. VEZAVA IN DINAMIKA ZAPIRANJA ENCIMA MurD KNFRMACIJSKA PT 2 ZAKLJUČKI 1. Reproducirano eksperimentalno zaporedje vezave substratov ATP in UMA 2. C-terminalna domena se zavrti v zaprto strukturo kot togo telo (RMSD analiza) 3. Pri obratu sodeluje več aminokislin zanke, ki povezujejo C-terminalno in centralno domeno (Pro300, Arg302, Glu304). 3. PRIMER MLEKULSKE SIMULACIJE KMPLEKSV ENCIM-INHIBITR INHIBITR ZA VEČJE RAZUMEVANJE MEDMLEKULSKEGA PREPZNAVANJA 113

114 INHIBITRJI ENCIMA MurD KRISTALNA STRUKTURA S SULFNAMIDNIM INHIBITRJEM LIE termodinamski cikel binding Prosto stanje - Free state G ) vdw P vdw W el P el ( Vl s ) solvated ( Vl s ) solvated ( Vl s ) solvated ( Vl s w solvated Vezano stanje - Bound state 114

115 MLEKULSKA DINAMIKA N-SULFNILNIH DERIVATV GLUTAMINSKE KISLINE Interakcijska energija Razčlemba IE po členih IZRAČUNANE PRSTE ENERGIJE VEZAVE PTIMIZIRANI LIE KEFICIENTI α=0.175 β=0.06 Compound X Substitution K i R1 R2 [μm] exp. G binding kcal/mol calc. G binding kcal/mol 1 * H C,C 2, ± H C,C 2, ± H C,C 2, ± H C,C 2, ± H H C,C 2, ± H C,C 2, ± H C,C 2, ± H C,C 2, ± *** H C,C 2,6 >2000 > ± H C,C 1,5 >1000 > ± **** CH3 N,N 2,6 / / -5.2 ± **** H C,C 2,6 / / -5.8 ±

116 3 PRSTE ENERGIJE PSAMEZNIH KMPNENT IN ANALIZA STABILNSTI VEZANE KNFRMACIJE D-Glu izomer (NRMALN PRI ENCIMU) 6 5 RMS [Å] D Glu G Naphthalene Sulphonamide binding G G Tail Compound binding binding G binding kcal/mol kcal/mol kcal/mol kcal/mol 1* -2.7 ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0.1 / ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0.4 9** -1.5 ± ± ± ± ± ± ± ± *** -2.5 ± ± ± ± ± ± ± ± Simulation time [ps] STABILNA KNFRMACIJA L-Glu izomer (ENCIM GA NE VGRAJUJE) 5 4 RMS 3 [Å] Simulation time [ps] 116

117 8. poglavje Uporaba metod molekulskega modeliranja pri načrtovanju novih biološko aktivnih molekul 117

118 UPRABA BILŠKIH MAKRMLEKUL PRI NAČRTVANJU BILŠK AKTIVNIH SPJIN RACINALN NAČRTVANJE ZDRAVILNIH UČINKVIN VPETST MLEKULSKEGA MDELIRANJA Drug design cycle poenostavljena shema Eksperiment STRUKTURA TARČE (ENCIMI, RECEPTRJI) PTENCIALNE UČINKVINE In silico metode MLEKULSK MDELIRANJE 118

119 VIRTUALN REŠETANJE Z UPRAB SBDD Definirano aktivno mesto VALIDACIJA METDE MLEKULSKEGA SIDRANJA REŠETANJE BAZE SPJIN VIRTUALN REŠETANJE Z UPRAB LBDD Farmakoforna hipoteza VALIDACIJA FARMAKFRNE HIPTEZE REŠETANJE BAZE SPJIN 119

120 Primer virtualnega rešetanja etanja: Načrtovanje novih inhibitorjev bakterijskih Mur ligaz BAKTERIJSKI ENCIM MurD Tarča za razvoj novih protibakterijskih zdravilnih učinkovin 120

121 NAČRTVANJE NVIH DUALNIH INHIBITRJEV ENCIMV MurD in MurE Analog MurD tetraedričnega intermediata -potencialni DUALNI inhibitor MurD in MurE PRTKL VIRTUALNEGA REŠETANJA (1) Znani sulfonamidni inhibitorji MurD so dobro izhodišče za iskanje novih inhibitorjev ligaz. 121

122 2N CN (E) S N H HN (R) (S) - HN P (S) S S S (R) S S S C - P S (S) (R) C - C - C - C - C - (R) C - C - C - C - C - HN F 3 C N N (E) S (S) S HN S HN HN S HN (R) (S) (S ) (S) (S) (S) S S (S) HN (S) (S) P P P P (S) S S (R) (R) S (R) P S (R) (R) (R) (R) (R) (R) (R) (R) FARMAKFRN MDELIRANJE Poravnava 3D farmakoforov N-sulfonil derivati glutaminske kisline (PDB: 2JFH, 2JFF, 2UU, 2UUP) Farmakoforni model, namenjen virtualnemu rešetanju s pomočjo farmakoforov Primer zadetka VALIDACIJA FARMAKFRNEGA MDELA Comp. Structure IC 50[μM] T1* T2* Niz aktivnih molekul N H N H C - C - T3* N C - H C - C - Catalyst HIT Comp. Structure IC 50[μM] T10* T11* T12* T13* Niz neaktivnih molekul N H N H N H N H C - C - N H N H C - C - C - C - C - C - ND ND Catalyst HIT - - ND - ND - T4* N H T14* N H N H C - C - ND + T5* N H T15* N H N H C - C - ND + T6* N H C T C - ND - T7* N H T17 N H - C - C - ND + T C T C - ND - T9 C - - C T19 - C - C - ND - 8/9 molekul T20 - C - C - 6/21 molekul ND - 122

123 VALIDACIJA RDJA ZA MLEKULSK SIDRANJE Scoring function evaluation 2JFF active site Reproduction of the experimental binding modes IZBR IN TESTIRANJE vhts SPJIN GLD vezavne geometrije Chemical structure H N H S S H N H S S H H S 7* N 2 N2 M e IC50[μM] or RA (%) MurD IC50[μM] or RA (%) MurE 74 % 61 μm 87% 70% H Chemical structure H H 14* 8* 15** N S Me 98% 89% H H H N N GLUTAMATNI DERIVAT S S N NH NH N S H N NH S S IC50[μM] or RA (%) MurD IC50[μM] or RA (%) MurE 82 % 81 % 99 % 76 % 690 μm 89 μm H H N H 9* S N H N 89 % 95 % H H 16 N NH N S 92 % 55% DERIVATI BENZEN-1,3- DIKARBKSILNIH KISLIN H H H H H H N H 10* N H S N S 97 % 94 % H H 17** 11* Cl 18** S 12* 13 S N S S N 66 % 69 % 270 μm 32 μm H H H H N N Cl 19** N Cl Cl 20** N N N NH NH S S NH S 69 % 97 μm 90 % 104 μm 83 % 79 μm 123

124 9. VPRAŠANJA ZA PNVITEV IN UTRJEVANJE SNVI 1. TEMA: Določevanje strukture bioloških makromolekul (PGLAVJE 2, 3, 4) pišite metodo proteinske kristalografije. Zakaj pri tej metodi uporabljamo rentgenske žarke? pišite metodo viseče kapljice. Definirajte asimetrično enoto, enotno celico, kristalno mrežo in prostorsko skupino. Narišite shematsko difrakcijski eksperiment in aparaturo. Kaj je to Fouriejeva transformacija in zakaj jo uporabljamo v proteinski kristalografiji? Kako v kristalografiji rešujemo fazni problem? Kako iz elektronske gostote dobimo molekulski model proteina? pišite nekatere kriterije s katerimi opredelimo kvaliteto strukture določene z metodo proteinske kristalografije. pišite NMR eksperiment. Katera jedra lahko uporabljamo pri NMR eksperimentih? Kako Fouriejevo transformacijo uporabljamo v NMR spektroskopiji? Kaj je kemijski premik in zakaj do njega pride? pišite razlog za 1H-1H sklopitev jeder (primer dubleta in tripleta). Zakaj pri določevanju struktur proteinov potrebujemo večdimenzionalne NMR spektre? Katere podatke dobimo iz 2D NESY in 2D CSY NMR spektrov? Kaj je nuklearni verhauserjev efekt in zakaj je pomemben v NMR spektroskopiji? pišite splošno shemo določanja proteinskih struktur z NMR spektroskopijo Primerjajte obe metodi (X-ray in NMR) in izpostavite prednosti in slabosti obeh. Naštejte in opište teoretične metode določanja strukture proteinov. 124

125 2. TEMA: Uvod v metode molekulskega modeliranja (PGLAVJE 5, 6) Definicija molekulskega modeliranja. Kaj je molekulska grafika in kako vizualiziramo biološke makromolekule? Kako dobimo površino dostopno molekuli (Solvent available surface area). snovne fizikalne enote, ki jih uporabljamo v molekulskem modeliranju (za merjenje razdalj, energije, naboja). Molekulska mehanika (Definicija in uporaba) Definirajte delni naboj atoma. Kvantna mehanika in njena uporaba v molekulskem modeliranju Kaj je konformacija molekule in kaj torzijski kot? Kaj je površina potencialne energije molekule in kako jo lahko preiskujemo? Kaj je geometrijska optimizacija molekulske strukture? pišite metodo molekulske dinamike (MD) Razložite razliko med molekulsko dinamiko in geometrijsko optimizacijo. pišite kaj razumemo pod pojmom konformacijska analiza in navedite primer. Kaj so molekulske simulacije? Virtualno rešetanje (definicija, uporaba) snovi pristopi pri virtualnem rešetanju (strukturno podprto načrtovanje in načrtovanje na osnovi strukture ligandov). 125

126 3. TEMA: Molekulsko modeliranje in biološke makromolekule (PGLAVJE 7, 8) Problemska naloga: Z vašim pridobljenim znanjem o uporabi metod molekulskega modeliranja in eksperimentalnih metod določanja struktur proteinov predlagajte strategijo teoretične/eksperimentalne študije, s katero bi lahko z uporabo teh metod dobili nove uporabne informacije za nadaljnje raziskave. predelite, katere podatke potrebujemo, katere metode, ki smo jih spoznali na predavanjih, bi uporabili, kakšne rezultate lahko pričakujemo, ter kako jih interpretiramo. 1. Stabilnost in preiskovanje sekundarne strukture S pomočjo kemometričnih metod domnevamo, da se sekvenca 18 aminokislin zvije v strukturo beta prepognjene verige. pišite študijo in uporabljene metode, s katero bi lahko teoretično obravnavali stabilnost take strukture, ter kako bi jo lahko kasneje tudi eksperimentalno potrdili. 2. Modeliranje prehodov med različnimi konformacijami proteinov Strukturne študije so pokazale, da je encim prisoten v dveh različnih konformacijah. Glavna razlika med strukturama je položaj ene izmed domen, ki se nahaja v dveh različnih pozicijah. pišite študijo in uporabljene metode, s katerimi bi lahko teoretično obravnavali fleksibilnost te domene in opazovali prehod iz ene strukture v drugo. 3. Modeliranje interakcij med proteinom in ligandom Znana je nova kristalna struktura med zdravilno učinkovino in proteinom, ki je pomemben pri nastanku bolezni. Zaradi opaženega stranskega učinka, ki je posledica vezave na sorodni protein, je bila določena še ena kristalna struktura, kjer je ta molekula vezana na protein, ki je odgovoren za stranski učinek. Pred kemijsko optimizacijo molekule, ki bi odpravila stranski učinek, bi radi podrobno razumeli energetiko prepoznavanja med proteinoma in ligandom. pišite teoretično študijo in metode, s katerimi bi lahko dobili več informacij o medmolekulski prepoznavi liganda in obeh proteinov. 4. Virtualno rešetanje za identifikacijo novih potencialnih zdravilnih učinkovin: MurE ligaza je protein, ki sodeluje v sintezi bakterijskega peptidoglikana, ki je ključna komponenta bakterijske celične stene in bakteriji omogoča preživetje. Zaradi vedno večje rezistence bakterij na znane antibiotike želimo uporabiti določeno kristalno strukturo MurE ligaze za načrtovanje novih protibakterijskih zdravilnih učinkovin. Predlagajte protokol virtualnega rešetanja, s katerim bi lahko identificirali nove biološko aktivne spojine na tej tarči. 126

127 10. PRIPRČENA LITERATURA ZA NADALJNJI ŠTUDIJ 1. Proteinska kristalografija 127

128 2. Proteinska NMR spektroskopija 128

129 3. Molekulsko modeliranje 129

130 4. Načrtovanje biološko aktivnih molekul 130