HR P A2 OPIS IZUMA. Referenca na srodnu prijavu

Transcript

1 OPIS IZUMA Referenca na srodnu prijavu Ova prijava ima prednost pred U.S. privremenom prijavom No. 60/386,61, koja je podnesena. lipnja 02., a ovdje je u potpunosti obuhvaćena kao referenca. Izjava o istraživanju sponzoriranom od Vlade Ovaj izum je napravljen uz potporu Vlade prema odobrenjima Nacionalnog Instituta za Zdravlje, brojevi HL3, HL60234 i AI4236. Vlada ima određena prava na ovaj izum. Područje izuma 1 Izum se općenito odnosi na liječenje raka i angiogeneze. Pozadina Ugljik monoksid je plin otrovan u visokim koncentracijama. Ipak, sada se prepoznaje kao važna signalna molekula (Verma i sur., Science 9: ,1993). Također se misli da ugljik monoksid djeluje kao neuronska prijenosna molekula u mozgu (Id.), te kao neuro-endokrini modulator u hipotalamusu (Pozzoli i sur., Endocrinologv 73: , 1994). Poput dušikovog oksida (NO), ugljik monoksid opušta glatke mišiće (Utz i sur., Biochem Pharmacol. 47:19-1, 1991; Christodoulides i sur., Circulation 97:26-9, 199) i inhibira aregaciju krvnih pločica (Mansouri i sur., Thromb Haemost. 48:286-8,1982). Pokazalo se da udisanje niskih razina ugljik monoksida ima antiinflamatorne učinke kod nekih modela. Rak je bolest koju karakterizira proliferacija stanica s nepravilnim staničnim regulacijskim sustavima. Stanični regulatorni sustavi koji ne funkcioniraju pravilno, mogu dovesti do nekontroliranog rasta stanica, smanjene diferencijacije stanica, invazije stanica u okolna tkiva i do metastaza. Liječenje postojećih tumora i stanica raka koje su razasute po organizmu (metastaze), temeljni je problem kliničke medicine. Angiogeneza je pojava stvaranja novih kapilara i važan je dio u patološkim procesima kao što su kronična upala, određeni imuni odgovori i rak. Angiogeneza je također uključena u normalne procese kao što su razvoj embrija i zacjeljivanje rana. Sažetak Predstavljeni izum se temelji, jednim dijelom, na otkriću da primjena CO može inhibirati rast stanica tumora in vitro i cijelih tumora in vivo. Dalje, pronađeno je da primjena CO može smanjiti angiogenezu. Predstavljeni izum omogućuje npr. postupke za liječenje tumora i metastaza korištenjem farmaceutskih smjesa koje sadrže CO. Prema tome, predstavljeni izum se odnosi na postupak liječenja raka, prevenciju raka ili smanjenja rizika od nastanka raka kod pacijenta, npr. raka koji se prirodno polako razvija. Postupak uključuje davanje (i/ili propisivanje) terapijski učinkovite količine smjese koja sadrži CO, pacijentu koji je identificiran (npr. onome kojemu je dijagnosticiran rak) da pati od (ili postoji povećani rizik) raka. Farmaceutska smjesa, koja se koristi u ovom ili bilo kojem drugom postupku liječenja koji je ovdje opisan, može biti u plinovitom ili tekućem obliku, i može se dati pacijentu bilo kojim postupkom poznatim u struci za primjenu plinova i/ili tekućina pacijentu, npr. preko inhalacije, upuhivanja, infuzije, injekcije, i/ili gutanja. U jednom ostvarenju predstavljenoga izuma, farmaceutska smjesa je u plinovitom ili tekućem obliku (npr. u obliku maglice ili spreja) i daje se pacijentu inhalacijski. Ako je u tekućem obliku, farmaceutska smjesa se pacijentu može dati i oralno. U drugom ostvarenju, farmaceutska smjesa je u plinovitom i/ili tekućem obliku i daje se pacijentu topikalno na organ. U još jednom ostvarenju, farmaceutska smjesa je u plinovitom i/ili tekućem obliku i daje se izravno u abdominalnu šupljinu pacijenta. Farmaceutska smjesa se pacijentu može dati putem vantjelesnog membranskog uređaja za izmjenu plinova ili preko umjetnih pluća. Postupci se mogu koristiti sami ili u kombinaciji s drugim metodama za liječenje raka kod pacijenata. Prema tome, u drugom ostvarenju, ovdje opisani postupci mogu uključiti liječenje pacijenta gdje se koristi operacija (npr. uklanjanje tumora ili njegovog dijela), kemoterapija, imunoterapija, genska terapija i/ili zračenje. Farmaceutska smjesa koja sadrži CO, kako je ovdje opisana, može se pacijentu dati u bilo kojem trenutku, npr. prije, za vrijeme i/ili nakon operacije, kemoterapije, genske terapije i/ili zračenja. 2

2 Pacijent može biti životinja, čovjek ili ne-čovjek, glodavac ili ne-glodavac. Npr. pacijent može biti bilo koji sisavac, npr. čovjek, drugi primati, svinje, glodavci kao što su miševi i štakori, kunići, zamorci, hrčci, krave, mačke, psi, ovce i koze, ili ne-sisavac kao što je ptica. Rak može biti posljedica raznih faktora, npr. karcinogeneze; infekcija, npr. virusnih infekcija; zračenja; i/ili je nasljedan, ili može biti nepoznatog porijekla. Farmaceutska smjesa može biti u bilo kojem obliku, npr. plinovitom ili tekućem. Ovdje opisani postupci se mogu izvesti zajedno s najmanje jednim od slijedećih tretmana: uvođenjem HO-1 ili feritina u pacijenta; ekspresijom rekombinantne HO-1 ili feritina kod pacijenta; i davanjem pacijentu farmaceutske smjese koja sadrži HO-1, bilirubin, biliverdin, feritin, željezo, desferoksamin, željezo dekstran i/ili apoferitin. Također je u izum uključen postupak za liječenje raka kod pacijenta, a koji uključuje utvrđivanje postojanja ekspresije p21 u stanicama tumora, i davanje pacijentu terapijski učinkovite količine smjese koja sadrži ugljik monoksid ako stanice tumora proizvode p21. Postupak po želji može uključivati i korak identifikacije (npr. dijagnozu) pacijenta koji pati od raka. Predstavljeni izum također uključuje postupak provođenja kemoterapije, imunoterapije, genske terapije i/ili zračenja kod pacijenta. Postupak uključuje primjenu kemoterapije, imunoterapije, genske terapije i/ili zračenja pacijentu, i davanje pacijentu terapijski učinkovite količine smjese koja sadrži ugljik monoksid. Smjesa se pacijentu može dati u bilo kojem trenutku postupka, npr. prije i/ili za vrijeme i/ili nakon primjene kemoterapije, imunoterapije, genske terapije i/ili zračenja. Postupak po izboru može uključivati korak identificiranja (npr. dijagnozu) pacijenta kojemu je potrebna kemoterapija, zračenje, imunoterapija i/ili genska terapija. Također je u izum uključen postupak izvođenja operacije uklanjanja tumora, npr. prirodno nastalog raka, iz pacijenta. Postupak uključuje identificiranje pacijenta kojemu je potrebna operacija za uklanjanje raka, i/ili identificiranje najmanje jednog organa s tumorskim tkivom kod pacijenta, izvođenje operacije na pacijentu da se ukloni tumorsko tkivo, i davanje pacijentu (ili sistemski (npr. inhalacijom) ili lokalno na mjesto operacije) terapijski učinkovite količine smjese koja sadrži CO. Smjesa se može dati u bilo kojem trenutku postupka, npr. prije i/ili za vrijeme i/ili nakon izvođenja operacije na pacijentu. Izum se odnosi i na postupak liječenja ili prevencije (tj. smanjenja rizika) raka kod pacijenta, a uključuje identificiranje pacijenta koji pati od raka ili postoji rizik od raka, korištenje spremnika koji sadrži plin pod pritiskom koji uključuje CO plin, oslobađanje komprimiranog plina iz spremnika da bi nastala atmosfera koja sadrži CO plin, te izlaganje pacijenta toj atmosferi, pri čemu je količina CO u atmosferi dovoljna za liječenje ili smanjenje rizika od raka. Pacijent može biti izložen farmaceutskoj smjesi ili atmosferi koja sadrži CO, kroz bilo koji vremenski period, uključujući i neograničeno vrijeme. Poželjni periodi uključuju najmanje 1 sat, npr. najmanje 6 sati; najmanje kroz jedan dan; najmanje kroz 1, 2, 4, 6, 8, ili 12 tjedana; najmanje kroz 1, 2 i godina. Pacijent može biti izložen atmosferi kontinuirano ili s prekidima kroz te vremenske periode. Kod ovdje opisanih postupaka, tumor može biti u bilo kojem dijelu (ili dijelovima) tijela pacijenta, npr. to može biti rak želuca, tankog crijeva, kolona, rektuma, usta/ždrijela, jednjaka, larinksa, jetre, gušterače, pluća, grudi, grlića maternice, maternice, jajnika, prostate, testisa, mjehura, kože, bubrega, mozga/središnjeg živčanog sustava, glave, vrata, grla, ili bilo koja kombinacija. Koncentracija CO u inhaliranom plinu može biti bilo koja ovdje opisana koncentracija, npr. oko % do oko 0.% po težini. U poželjnim ostvarenjima, koncentracija CO u inhalacijskom plinu je najmanje oko 0.00% do oko 0.24%, ili oko 0.01% do oko 0.22% po težini. Još je poželjnije da je koncentracija CO u inhalacijskom plinu oko 0.0% do oko 0.1% po težini. S druge strane, izum omogućuje postupak liječenja neželjene angiogeneze kod pacijenta. Postupak uključuje davanje terapijski učinkovite količine smjese koja sadrži CO, pacijentu kojemu je dijagnosticirana ili postoji rizik od neželjene angiogeneze. Postupak može po izboru uključiti i korak identifikacije (npr. dijagnozu) pacijenta koji boluje ili kod kojeg postoji rizik od neželjene angiogeneze. Smjesa može biti u plinovitom obliku i dana pacijentu preko inhalacije, topikalno na organ i/ili u abdominalnu šupljinu pacijenta. U drugom ostvarenju smjesa može biti tekuća i dana pacijentu oralno, topikalno na organ i/ili u abdominalnu šupljinu pacijenta. Izum se odnosi i na postupak liječenja stanja koja su povezana s neželjenom angiogenezom. Postupak uključuje davanje terapijski učinkovite količine smjese koja sadrži CO, pacijentu kojemu je dijagnosticirano ili postoji rizik od oboljenja povezanog s neželjenom angiogenezom, pri čemu to stanje povezano s neželjenom angiogenezom nije rak. Postupak po izboru može uključiti i korak identifikacije (npr. dijagnozu) pacijenta koji boluje ili kod kojeg postoji rizik od stanja 3

3 povezanih s neželjenom angiogenezom. U jednom ostvarenju to oboljenje je reumatoidni artritis, lupus, psorijaza, dijabetična retinopatija, retinopatija novorođenčadi, makularna degeneracija, odbijanje presađene rožnice, neovaskularni glaukom, retrolentalna fibroplazija, rubeoza, Osler-Weberov sindrom, miokardijalna angiogeneza, neovaskularizacija plaka, telangiekastija, angiofibrom, ili bilo koja njihova kombinacija. Izum predstavlja spremnik koji sadrži komprimirani CO plin medicinske klase. Spremnik može na sebi imati oznaku koja ukazuje na to da se plin može koristiti za liječenje raka kod pacijenta. Aiterativno ili dodatno, spremnik može imati oznaku da se plin može primjenjivati pacijentu za liječenje (npr. prevenciju ili smanjenje) neželjene angiogeneze, ili stanja koja su povezana s neželjenom angiogenezom. CO plin može biti u smjesi s plinom dušika, s plinom dušik oksida i dušika, ili s bilo kojim plinom koji sadrži kisik. CO plin može biti prisutan u smjesi pri koncentraciji od najmanje oko 0.0%, npr. pri najmanje od oko 0.0%, 0.%, 0.0%, 1.0%, 2.0%, %, 0% ili 90%. Unutar izuma je i upotreba CO za proizvodnju lijeka za liječenje ili prevenciju ovdje opisanih poremećaja, npr. raka, neželjene angiogeneze i/ili stanja koja su povezana s neželjenom angiogenezom (npr. druga stanja osim raka). Lijek se može koristiti u postupku liječenja raka, sprečavanja angiogeneze i/ili za liječenje stanja koja su povezana s neželjenom angiogenezom, a u skladu s ovdje opisanim metodama. Lijek može biti u bilo kojem ovdje opisanom obliku, npr., kao tekuća ili plinovita CO smjesa. Ako nije drugačije definirano, svi ovdje korišteni tehnički i znanstveni pojmovi imaju isto značenje koje obično podrazumijeva stručnjak područja na koje se ovaj izum odnosi. Prikladni postupci i materijali su opisani poslije, iako se mogu za provedbu ili ispitivanje predstavljenoga izuma koristiti postupci i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovdje opisani. Sve publikacije, patentne prijave, patenti, i ostale ovdje spomenute reference, su u svojoj cijelosti uključeni ovdje kao reference. U slučaju nesporazuma, prevladati će predstavljene specifikacije, uključujući definicije. Materijali, metode i primjeri su samo ilustrativni i ne ograničavaju. Detalji jednog ili više ostvarenja izuma su predstavljeni u slijedećem opisu i priloženim slikama. Druge značajke, objekti i prednosti izuma biti će jasni iz opisa, slika i zahtjeva. Kratki opis slika Slika 1 Slika 2 Slika 3 Slika 4 Slika Slika 6 Slika 7 Slika 8 je linijski graf koji ilustrira kako CO inhibira proliferaciju mezoteličnih stanica (AC29) kod miševa. Kružići predstavljaju stanice izložene zraku. Kvadrati predstavljaju stanice izložene CO. Strelica pokazuje u kojem su trenutku stanice maknute iz okoline koja sadrži CO. je graf sa stupcima koji ilustrira kako stanice humanog adenokarcinoma (A49), koje su transficirane s HO-1 genom (što uzrokuje prekomjernu ekspresiju HO-1 proteina), pokazuju smanjenje volumena tumora kod miševa. Dt= divlji tip A49 stanice (kontrola); NEO= A49 stanice transficirane samo s vektorom (kontrola); HO-1 klonovi A i L1= dvije različite linije A49 stanica transficirane s HO-1 genom. je linijski graf koji ilustrira kako izlaganje CO produžuje preživljavanje miševa kojima je injiciran letalni broj mezotetičnih stanica. Kružići predstavljaju miševe izložene zraku. Kvadrati predstavljaju miševe izložene CO. Strelica pokazuje u kojem je trenutku uklonjeno pola CO-izlaganih miševa iz CO-komore. je linijski graf koji ilustrira kako izlaganje CO produžuje preživljavanje miševa kojima je injiciran letalni broj mezoteličnih stanica, kada izlaganje CO počinje jedan tjedan nakon injiciranja. Kružići predstavljaju miševe izložene zraku. Kvadrati predstavljaju miševe izložene CO. je graf sa stupcima, a ilustrira kako je CO-inducirano smanjenje rasta A49 stanica ovisno o cgmp. Stanice su izložene in vitro: zraku; CO; CO+1H-[1,2,4] oksadiazol [4,3-a] kinoksalin-1-on (ODQ); ili CO+Rp-8- brom-cgmp (Rp8-Br). je graf sa stupcima, a ilustrira kako je CO-inducirano smanjenje rasta manje značajno kod humanih stanica tumora kolona (HTC) kojima nedostaje p21. Dt= divlji tip HTC stanica; Dt+CO= divlji tip stanica koje su izložene CO; p21-/-= HTC stanice kojima nedostaje p21; p21-/- + CO= HTC stanice kojima nedostaje p21 i izložene su CO. je graf sa stupcima koji ilustrira kako CO inhibira nastanak faktora rasta vaskularnog endotela (VEGF) u A49 stanicama. zrak= A49 stanice izložene zraku; CO= A49 stanice izložene CO. je graf sa stupcima koji ilustrira kako je volumen tumora smanjen kod miševa kojima su injicirane A49 stanice i koji su bili izloženi CO uz zrak (CO), u odnosu na miševe kojima su injicirane A49 stanice i koji su bili izloženi samo zraku (zrak). Slika 9A prikazuje imunobojenje, a vidi se da izlaganje A49 stanica CO kroz 24 sata, uzrokuje promjene u ekspresiji p21, p27, antigena jezgre za proliferirajuće stanice (PCNA), Cdcb i ciklina D1. Linija 1= stanice izložene CO kroz 0 sati; Linija 2= stanice izložene CO kroz 24 sata. Slika 9B prikazuje imunobojenje, a vidi se da izlaganje A49 stanica CO kroz 4, 8 i 24 sata uzrokuje promjene u ekspresiji p21. 4

4 Detaljan opis Pojam "ugljik monoksid" (ili "CO"), kako je ovdje korišten, opisuje molekulski ugljik monoksid u plinovitom stanju, komprimiran u tekući oblik, ili otopljen u vodenoj otopini. Pojam "smjesa ugljik monoksida" ili "farmaceutska smjesa koja sadrži ugljik monoksid" se kroz ovu specifikaciju koristi da bi se opisala plinovita ili tekuća smjesa koja sadrži CO, a može se primijeniti pacijentu i/ili na organu, npr. organu koji je zahvaćen tumorom. Stručnjak će prepoznati koji je oblik farmaceutske smjese, npr. plinoviti, tekući, ili i plinoviti i tekući, najprikladniji za određenu primjenu. Pojmovi "učinkovita količina" i "učinkovito za liječenje", kako su ovdje korišteni, odnose se na koncentraciju CO koja se koristi, i to kroz određeni vremenski period (uključujući akutnu ili kroničnu, te periodičnu ili kontinuiranu primjenu), a koja je učinkovita u smislu da njena primjena uzrokuje željeni učinak ili fiziološki odgovor. Učinkovite količine CO za upotrebu u predstavljenome izumu uključuju, npr. količine koje sprečavaju razvoj raka, npr. tumora i/ili tumorskih stanica, poboljšavaju ishod za pacijenta koji boluje od raka ili kod kojeg postoji rizik za razvoj raka, i poboljšavaju učinak ostalih tretmana za tumore. Za plinove, učinkovite količine CO općenito su unutar raspona od oko % do oko 0.3%, težinski, npr % do oko 0.%, težinski, poželjno najmanje oko 0.001%, npr. najmanje oko 0.00%, 0.0%, 0.02%, 0.0%. 0.03%, 0.04%, 0.0%, 0.06%, 0.08%, 0.%, 0.1%, 0.%, 0.22%, ili 0.24% CO težinski. Poželjni rasponi uključuju npr % do oko 0.24%, oko 0.00% do 0.22%, oko 0.00% do 0.0%, oko 0.0% do 0.2%, oko 0.02% do 0.1%, oko 0.0% do 0.%, iii oko 0.03% do 0.08%, oko 0.04% do 0.06%. Za tekuće otopine CO, učinkovite količine općenito su unutar raspona od oko do oko g CO/0g tekućine, npr. najmanje oko , , , , , , , 0.001, , , 0.00, , , , 0,0026, , 0.00, , 0.003, , 0.00, ili g CO/0g vodene otopine. Poželjni rasponi uključuju, npr. oko 0.00 do oko 0.00 g CO/0 g tekućine, oko do oko g CO/0 g tekućine, ili oko do oko g CO/0 g tekućine. Stručnjak će uvidjeti da se količine izvan ovih raspona mogu koristiti ovisno o primjeni. Pojam "pacijent" se kroz ovu specifikaciju koristi da bi se opisala životinja, čovjek ili ne-čovjek, kojemu se daje tretman prema postupcima predstavljenoga izuma. Veterinarske primjene jasno su predviđene u predstavljenom izumu. Pojam uključuje, ali nije time ograničen, ptice, gmazove, vodozemce i sisavce, npr. ljude, ostale primate, svinje, glodavce kao što su miševi i štakori, kuniće, zamorce, hrčke, krave, konje, mačke, pse, ovce i koze. Poželjni subjekti su ljudi, domaće životinje i kućni ljubimci kao npr. psi i mačke. Pojam "liječiti (liječenje)" se koristi da bi se opisalo odgađanje početka, inhibicija, ili ublažavanje učinaka poremećaja, ili produljenje života pacijenta koji pati od poremećaja, npr. raka. Primjeri staničnih proliferativnih i/ili diferencijacijskih poremećaja uključuju rak, npr. karcinom, sarkom, metastatske poremećaje i hematopoetske neoplastične poremećaje, npr. leukemije. Metastazirajući tumor može nastati iz raznih primarnih tipova tumora, uključujući, ali bez ograničavanja na njih, tumor prostate, kolona, pluća, dojki, kostiju i jetre. Metastaze nastaju, npr. kada stanice odijeljene od primarnog tumora dopru do vaskularnog endotela i prodru u druga tkiva, te rastu i razviju novi tumor neovisan i odvojen od primarnog tumora. Pojam "rak" se odnosi na stanice koje imaju sposobnost autonomnog rasta. Primjeri takvih stanica uključuju stanice u abnormalnom stanju koje je karakterizirano brzim proliferacijskim rastom stanica. Pojam uključuje i tumorske izrasline, npr. tumore; onkogene procese, metastatska tkiva i maligno promijenjene stanice, tkiva ili organe, bez obzira na histopatološki tip ili stupanj invazivnosti. Također su uključene maligne promjene raznih organskih sustava, kao što su respiratorni, kardiovaskularni, renalni, reproduktivni, hematološki, neurološki, hepatički, gastrointestinalni i endokrini sustav; zatim adenokarcinomi koji uključuju maligne promjene kao što su većina tumora kolona, karcinomi stanica bubrega, rak prostate i/ili testisa, rak velikih stanica pluća, rak tankog crijeva i rak jednjaka. Rak koji se "javlja prirodno" uključuje bilo koji rak koji nije izazvan eksperimentalno usađivanjem stanica tumora, i uključuje, npr. tumore koji se javljaju spontano, rak koji je izazvan time što je pacijent bio u dodiru s karcinogenom tvari, rak koji nastaje zbog insercije transgenog onkogena ili nestanka gena za supresiju tumora, i rak koji je posljedica infekcije, npr. virusne. Pojam "karcinom" je poznat i koristi se na maligne promjene epitelnih i endokrinih tkiva. Taj pojam također uključuje karcinosarkome koji uključuju maligne tumore koji se sastoje od karcinomnog i sarkomnog tkiva. Pojam "adenokarcinom" se odnosi na karcinom koji nastaje iz žljezdanog tkiva ili kod kojeg tumorske stanice tvore prepoznatljive žljezdane strukture. Pojam "sarkom" je poznat i odnosi se na maligne tumore mezenhimskog postanka. Pojam "hematopoetski neoplastični poremećaji" uključuje bolesti koje zahvaćaju hiperplastične/neoplastične stanice hematopoetskog porijekla. Hematopoetski neoplastični poremećaj može nastati iz mijeloičnih, limfnih ili eritro linija, ili njihovih stanica prekursora. Rak koji se može tretirati pomoću postupaka i smjesa iz predstavljenoga izuma uključuje npr. rak želuca, kolona, rektuma, usta/ždrijela, jednjaka, larinksa, jetre, gušterače, pluća, grudi, grlića maternice, maternice, jajnika, prostate,

5 testisa, mjehura, kože, kostiju, bubrega, mozga/središnjeg živčanog sustava, glave, vrata, grla; Hodgkinovu bolest, ne- Hodgkinovu leukemiju, sarkome, koriokarcinome i limfome, između ostalih Pojedinci za koje se smatra da posjeduju rizik za razvoj raka, mogu posebno imati koristi od izuma, prvenstveno jer preventivni tretman može početi prije javljanja dokaza o postojanju poremećaja. Pojedinci "kod kojih postoji rizik" su npr. osobe izložene karcinogenim tvarima, npr. konzumacijom, npr. inhaliranjem i/ili gutanjem, u količinama za koje se statistički pokazalo da potiču razvoj raka kod podložnih pojedinaca. Također su uključene osobe kod kojih postoji rizik zbog izlaganja UV zračenju, njihove okoline, profesije i/ili nasljeđa, kao i oni koji pokazuju znakove prekaceroznih stanja, kao što su polipi. Slično, i osobe u vrlo ranoj fazi raka ili razvoja metastaza (tj. kada je prisutna samo jedna ili nekoliko takvih stanica u tijelu, ili na točno određenom mjestu tkiva) mogu imati koristi od takvih preventivnih tretmana. Stručnjaci će znati da liječnik (ili veterinar, ovisno o pacijentu) može pacijentu dijagnosticirati da boluje, ili da postoji rizik od ovdje opisanih poremećaja, bilo kojom metodom poznatom u struci, npr. proučavanjem povijesti bolesti, dijagnostičkim testovima i/ili metodama slikanja. Stručnjaci će također vidjeti da CO smjese treba dati pacijentu ista osoba koja je postavila dijagnozu (ili je propisala CO smjese). CO smjese može dati (i/ili primjena može biti pod nadzorom), npr. osoba koja je dijagnosticirala i/ili propisala, i/ili drugi pojedinci, uključujući samog pacijenta ako je sposoban sam primijeniti tretman. Postupci predstavljenog izuma se mogu koristiti za inhibiciju neželjene angiogeneze i liječenje poremećaja koji su povezani/ovisni o angiogenezi. Pojam "angiogeneza", kako se ovdje koristi, odnosi se na nastanak novih krvnih žila u tkivu ili organu. "Poremećaji ovisni ili povezani s angiogenezom" uključuju bilo koji proces ili stanje koje ovisi ili je povezano s angiogenezom. Pojam uključuje poremećaje koji se odnose na rak, i one koji se ne odnose samo na rak. Poremećaji ovisni ili povezani s angiogenezom mogu biti posljedica neželjene angiogeneze, kao i željene (korisne) angiogeneze. Pojam uključuje npr. solidne tumore; metastatske tumore; benigne tumore, npr. hemangiom, akustične neurome, neurofibrome, trahome i piogenične granulome; reumatoidni artritis, lupus i ostale poremećaje vezivnog tkiva; psorijazu; rosaceu; očne angiogenične bolesti, npr. dijabetičnu retinopatiju, retinopatiju novorođenčadi, makularnu degeneraciju, odbijanje presađene rožnice, neovaskularni glaukom, retrolentalnu fibroplaziju, rubeozu; Osler-Weberov sindrom; miokardijalnu angiogenezu; neovaskularizaciju plaka; telangiekastiju; hemofilične zglobove; angiofibrom i granulaciju rane. Ostali procesi u kojima je prisutna angiogeneza uključuju reprodukciju i zacjeljivanje rana. Zbog svojih anti-vegf svojstava, CO također može biti koristan u liječenju poremećaja prekomjerene iii abnormalne stimulacije stanica endotela. Takve bolesti uključuju, npr. intestinalne adhezije, aterosklerozu, sklerodermu i hipertrofične ožiljke, npr. keloide, kao i rak endotelnih stanica koje su osjetljive na VEGF stimulaciju. Količine CO, učinkovite za liječenje raka, poremećaja ovisnih/povezanih s angiogenezom (npr. drugi poremećaji osim raka), ili za inhibiciju neželjene angiogeneze, može pacijentu dati (ili prepisati), npr. liječnik ili veterinar, na dan kada je dijagnosticiran bilo koji od tih poremećaja ili stanja, ili ako je otkriven bilo koji faktor rizika koji je povezan s povećanom vjerojatnošću da će se kod pacijenta razviti ti poremećaji ili stanja (npr. pacijent je nedavno bio, ili je, ili će biti izložen karcionogenoj tvari). Pacijenti mogu inhalirati CO u koncentracijama koje su u rasponu od ppm do 00 ppm, npr. oko 0 ppm do oko 800 ppm, oko ppm do oko 600 ppm, ili oko 0 ppm do oko 00 ppm. Poželjne koncentracije uključuju, npr. oko ppm, 0 ppm, 7 ppm, 0 ppm, 1 ppm, 0 ppm, 0 ppm, 00 ppm, 70 ppm ili oko 00 ppm. CO se može pacijentu dati, s prekidima ili kontinuirano. CO se može davati kroz oko 1, 2, 4, 6, 8,, 12, 14, 18 ili dana, ili više od dana, npr. 1, 2, 3, ili 6 mjeseci, ili sve dok pacijent ne prestane pokazivati simptome bolesti, ili dok se pacijentu ne dijagnosticira da više ne postoji rizik za razvoj tih poremećaja ili stanja. U određenom danu se CO može davati kontinuirano kroz cijeli dan, ili s prekidima, npr. jedan udah CO po danu (kada se koriti visoka koncentracija), ili do 23 sata po danu, npr. do, 1, 12,, 6, 3 ili 2 sata na dan, ili do 1 sat na dan. Ako je pacijentu potrebno liječenje kemoterapijom, zračenjem, imunoterapijom, genskom terapijom, i/ili operacijom (npr. jer je tako propisao liječnik ili veterinar), pacijent tada može biti tretiran s CO (npr. plinovitom CO smjesom) prije, za vrijeme i/ili nakon primjene kemoterapije, zračenja, i/ili operacije. Npr. u odnosu na kemoterapiju, zračenje, imunoterapiju i gensku terapiju, CO se pacijentu može dati, s prekidima ili kontinuirano, počevši 0 do dana prije kemoterapije, zračenja, imunoterapije, ili genske terapije (i kada se daju višekratne doze, tada prije svake pojedinačne doze), npr. počevši najmanje minuta, npr. oko 1, 2, 3,, 7 ili sati, ili oko 1, 2, 4, 6, 8,, 12, 14, 18 ili dana, ili više od dana, prije davanja. Alternativno ili dodatno, CO se pacijentu može dati zajedno s primjenom kemoterapije, zračenja, imunoterapije, ili genske terapije, npr. odmah nakon primjene i zatim, kontinuirano ili s prekidima, kroz oko 1, 2, 3,, 7 ili sati, ili oko 1, 2,, 8,,,, 0 ili 60 dana, ili neograničeno, ili sve dok liječnik ne utvrdi da primjena CO nije više potrebna. S obzirom na operacijske zahvate, CO se može pacijentu dati sistemski ili lokalno, prije, za vrijeme i/ili nakon zahvata. Pacijenti mogu inhalirati CO u koncentracijama koje su u rasponu od ppm do 00 ppm, npr. oko 0 ppm do oko 800 ppm, oko ppm do oko 600 ppm, ili oko 0 ppm do oko 00 ppm. Poželjne koncentracije uključuju, npr. oko ppm, 0 ppm, 7 ppm, 0 ppm, 1 ppm, 0 ppm, 0 ppm, 00 ppm, 70 ppm ili oko 00 ppm. CO se može 6

6 pacijentu dati, s prekidima ili kontinurano, kroz 1, 2, 3, 4( 6,12 sati, ili kroz oko 1, 2, 4, 6, 8,, 12, 14, 18 ili dana, ili više od dana prije zahvata. Može se dati u vremenu neposredno prije operacije i po izboru se može primjena nastaviti kroz zahvat, ili primjena može prestati najmanje 1 minuta prije početka operacije (npr. najmanje minuta, 1, 2, 3, 6, ili 24 sata prije početka operacije. Alternativno ili dodatno, CO se pacijentu može dati za vrijeme operacije, npr. inhalacijom i/ili topikalnom primjenom. Alternativno ili dodatno, CO se pacijentu može dati nakon zahvata, npr. odmah nakon zahvata i zatim kroz oko 1, 2, 3,, 7 ili sati, ili oko 1, 2,, 8,,,, 0 ili 60 dana, ili neograničeno, ili sve dok pacijent više ne boluje od raka ili više ne postoji rizik za razvoj raka nakon završetka operacije. Priprema plinovitih smjesa CO smjesa može biti smjesa plinovitog ugljik monoksida. Komprimirani ili stlačeni plin, koristan u postupcima izuma, može se dobiti iz bilo kojeg komercijalnog izvora, i u bilo kojoj vrsti spremnika prikladnog za držanje komprimiranog plina. Npr. komprimirani ili stlačeni plinovi se mogu dobiti iz bilo kojeg izvora koji dobavlja komprimirane plinove, kao što je kisik, za medicinsku primjenu. Pojam plina "medicinske klase", kako se ovdje koristi, odnosi se na plin koji je prikladan za primjenu kod pacijenata kako je ovdje definirano. Plin pod tlakom koji uključuje ugljik monoksid, a koji se koristi u postupcima predstavljenoga izuma, može biti takav da su svi plinovi za željenu konačnu smjesu (npr. CO, He, NO, CO 2, O 2, N 2 ) u istoj posudi, osim što NO i O 2 ne mogu biti pohranjeni zajedno. Po izboru, postupci predstavljenoga izuma se mogu izvesti uz korištenje više posuda koje sadrže pojedine plinove. Npr. jedna posuda može sadržavati ugljik monoksid, sa ili bez drugih plinova, a njezin sadržaj se može po izboru miješati sa sobnim zrakom ili sa sadržajem drugih posuda, npr. posuda koje sadrže kisik, dušik, ugljik dioksid, komprimirani zrak, ili bilo koji drugi prikladan plin ili njihove smjese. Plinovite smjese koje se daju pacijentu prema predstavljenom izumu, obično sadrže 0% do oko 79% dušika po težini, oko 21% do oko 0% kisika po težini i oko % do oko 0.3% CO po težini (to odgovara oko 1 ppb ili ppm do oko ppm). Poželjno, količina dušika u plinovitim smjesama je oko 79% po težini, količina kisika je oko 21% po težini i količina CO je oko % do oko 0.% po težini. Količina CO je poželjno najmanje oko 0.001%, npr. najmanje oko 0.00%, 0.0%, 0.02%, 0.0%. 0.03%, 0.04%, 0.0%, 0.06%, 0.08%, 0.%, 0.1%, 0.%, 0.22%, ili 0.24% po težini. Poželjni rasponi uključuju oko 0.00% do oko 0.24%, oko 0.01% do oko 0.22%, oko 0.01% do oko 0.%, oko 0.08% do oko 0.%, i oko 0.0% do oko 0.1% po težini. Zabilježeno je da se plinovite smjese ugljik monoksida koje imaju koncentracije ugljik monoksida veće od 0.3% (1% ili više), mogu koristiti u kratkom periodu (npr. jedan ili nekoliko udana), ovisno o primjeni. Plinovita smjesa CO se može koristiti da se stvori atmosfera koja sadrži plin CO. Amosfera koja sadrži odgovarajuće količine plina CO se može stvoriti, npr. upotrebom posude koja sadrži komprimirani plin koji uključuje plin ugljik monoksida, i oslobađanjem komprimiranog plina iz posude u komoru ili prostor gdje će nastati atmosfera koja uključuje plin ugljik monoksida unutar komore ili prostora. Alternativno, plinovi se mogu osloboditi u uređaj koji završava maskom za disanje ili cijevi za disanje, pri čemu se atmosfera koja uključuje plin ugljik monoksida stvara u maski ili cijevi za disanje, i tako je osigurano da je pacijent jedina osoba u sobi koja je izložena znatnim količinama ugljik monoksida. Razine ugljik monoksida u atmosferi se mogu mjeriti ili pratiti uz korištenje bilo kojeg postupka poznatog u struci. Takvi postupci uključuju elektrokemijsku detekciju, plinsku kromatografiju, brojanje radioizotopa, infracrvenu apsorpciju, kolorimetriju i elektrokemijske metode koje se temelje na selektivnim membranama (vidi npr. Sunderman i sur., Clin. Chem. 28:26-32, 1982; Ingi i sur., Neuron 16:83-842,1996). Pod-dijelovi po milijunu razine ugljik monoksida se mogu detektirati, npr. plinskom kromatografijom i brojanjem radioizotopa. Dalje, poznato je u struci da se razine ugljik monoksida u sub-ppm rasponu mogu mjeriti u biološkom tkivu pomoću midinfracrvenog senzora plina (vidi npr. Morimoto i sur., Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol 280:H482-H488, 01). Senzori ugljik monoksida i uređaji za detekciju plina su široko dostupni iz mnogih komercijalnih izvora. Priprema tekućih smjesa Smjesa ugljik monoksida također može biti tekuća smjesa ugljik monoksida. Tekućina se može napraviti u smjesu ugljik monoksida bilo kojom metodom poznatom u struci kojom se plinovi mogu otopiti u tekućinama. Npr. tekućina se može staviti u tzv. "CO 2 inkubator" i izložiti kontinuiranom protoku ugljik monoksida, poželjno uravnoteženog s ugljik dioksidom, sve dok se u tekućini ne postigne željena koncentracija ugljik monoksida. Kao drugi primjer navodimo da se ugljik monoksid može izravno uvoditi u tekućinu sve dok se u tekućini ne postigne željena koncentracija ugljik monoksida. Količina ugljik monoksida koja se može otopiti u određenoj vodenoj otopini, povećava se sa smanjenjem temperature. Kao još jedan primjer, prikladna tekućina se može propustiti kroz cijevi koje omogućuju difuziju plina, pri čemu cijevi prolaze kroz atmosferu koja sadrži ugljik monoksid (npr. korištenjem uređaja kao što je vantjelesni membranski oksigenator). Ugljik monoksid difundira u tekućinu tako da nastaje tekuća ugljik monoksid smjesa. 7

7 Vjerojatno je da će takva tekuća smjesa, koja je namijenjena uvođenju u živu životinju, biti na oko 37 C u trenutku kada će se uvoditi u životinju Tekućina može biti bilo koja tekućina poznata stručnjacima, a da je prikladna za davanje pacijentima (vidi npr. Oxford Textbook of Surgery, Morris i Malt, Eds., Oxford University Press (1994)). Općenito, tekućina će biti vodena otopina. Primjeri prikladnih otopina uključuju fiziološku otopinu puferiranu fosfatom (Phosphate Buffered Saline, PBS), Celsior, Perfadex, Collinsovu otopinu, otopinu citrata i otopinu Sveučilišta u VVisconsinu (UW) (Oxford Textbook of Surgery, Morris i Malt, Eds., Oxford University Press (1994)). U jednom ostvarenju predstavljenoga izuma tekućina je Ringerova otopina, npr. Ringerova otopina s laktatom, ili bilo koja druga tekućina koja se može koristiti kao infuzija za pacijenta. U drugom ostvarenju tekućina uključuje krv, npr. punu krv. Krv može biti potpuno ili djelomično zasićena s CO. Bilo koja prikladna tekućina se može zasititi do željene koncentracije ugljik monoksida preko plinskih difuzera. Alternativno, mogu se koristiti prije napravljene otopine koje su ispitane da kvalitetno sadrže određene razine ugljik monoksida. Točna kontrola doze se može postići mjerenjem s membranom propusnom za plin, a nepropusnom za tekućinu, koja je spojena na analizator ugljik monoksida. Otopine se mogu zasititi do željenih učinkovitih koncentracija i održavati na tim razinama. Liječenje pacijenta sa smjesama ugljik monoksida Pacijent se može liječiti sa ugljik monoksid smjesom bilo kojom metodom poznatom u struci za primjenu plinova i/ili tekućina pacijentu. Smjese ugljik monoksida se mogu propisati za primjenu pacijentima s dijagnozom npr. raka, ili onima za koje je utvrđeno da postoji rizik od raka. Predstavljeni izum razmatra sistemsku primjenu tekućih ili plinovitih ugljik monoksid smjesa pacijentima (npr. inhalacijom i/ili gutanjem), i topikalnu primjenu smjesa u pacijentov organ in situ (npr. gutanjem, upuhivanjem i/ili uvođenjem u abdominalnu šupljinu). Smjese može dati i/ili primjenu nadzirati bilo koja osoba, npr. zdravstveni djelatnik, veterinar ili skrbnik (npr. vlasnik životinje (npr. psa ili mačke)), ovisno o tome koji pacijent se liječi, i/ili pacijent sam može primijeniti smjesu ako je za to sposoban. Sistemska primjena ugljik monoksida Plinovite smjese ugljik monoksida se mogu pacijentu primijeniti sistemski, npr. pacijentu s dijagnozom raka ili onomu za kojeg je utvrđeno da postoji rizik od raka. Plinovite smjese ugljik monoksida se obično daju inhalacijom kroz usta ili nazalne putove do pluća, gdje se ugljik monoksid može brzo apsorbirati u krvotok pacijenta. Koncentracija aktivne tvari (CO), koja se koristi u terapijskim plinovitim smjesama, će ovisiti o brzinama apsorpcije, distribucije, inaktivacije i izlučivanja (općenito putem disanja) ugljik monoksida, kao i o drugim faktorima koji su poznati stručnjacima. Dalje će biti razumljivo da se za svaki posebni slučaj moraju s vremenom prilagoditi specifični režimi doziranja, a u skladu s individualnim potrebama i profesionalnom procjenom osobe koja daje ili nadgleda davanje smjese, i da su ovdje postavljeni rasponi koncentracija samo primjeri i nije im namjera ograničiti opseg ili izvođenje izuma. Liječenje se može pratiti i doze CO se mogu prilagoditi radi osiguravanja optimalnog liječenja za pacijenta. Akutna, subakutna i kronična primjena ugljik monoksida se također razmatraju u predstavljenom izumu, a ovisno o npr. ozbiljnosti ili perzistentnosti poremećaja kod pacijenta. Ugljik monoksid se može pacijentu dati kroz vrijeme (uključujući neodređeno) koje je dovoljno za liječenje stanja i izazivanje željenog farmakološkog ili biološkog učinka. Slijede primjeri nekih postupaka i uređaja koji se mogu koristiti za davanje plinovitih ugljik monoksid smjesa pacijentima. Ventilatori Ugljik monoksid medicinske klase (koncentracije mogu varirati) se može kupiti miješan sa zrakom ili drugim plinom koji sadrži kisik, u standardnom tanku komprimiranog plina (npr. 21% O 2, 79%N 2 ). Nereaktivan je i koncentracije koje su potrebne za postupke predstavljenoga izuma su dosta ispod razine zapaljivosti (% u zraku). U bolničkom okruženju će se vjerojatno plin postaviti uz krevet gdje će se miješati s kisikom ili okolnim zrakom u mješalici do željene koncentracije u ppm (parts per million, dijelovi na milijun). Pacijent udiše smjesu plinova kroz ventilator koji se postavi na brzinu protoka ovisno 0 potrebama i ugodi pacijenta. To se utvrđuje pulmonalnim grafovima (tj. brzina disanja, volumeni itd.). Mehanizmi za sigurnost od kvara se mogu ugraditi u sustav primjene, a radi sprečavanja da pacijent nepotrebno primi doze ugljik monoksida veće od potrebnih. Razina ugljik monoksida kod pacijenta se može pratiti motrenjem (1) karboksihemoglobina (COHb), koji se može mjeriti u venskoj krvi, i (2) mjerenjem izdahnutog ugljik monoksida koji je sakupljen iz bočnog otvora ventilatora. Izlaganje ugljik monoksidu se može podesiti na temelju pacijentovog zdravstvenog stanja i na temelju markera. Ako je potrebno, ugljik monoksid se može isprati iz pacijenta uključivanjem inhalacije 0% O 2. Ugljik monoksid se ne metabolizira; tako, sve što se udahne će se konačno i izdahnuti osim vrlo malog postotka koji prelazi u CO 2. Ugljik monoksid se također može miješati s bilo kojom razinom O 2 da se osigura terapijska primjena ugljik monoksida bez posljedičnih stanja hipoksije. 8

8 1 3 Maska za lice i gaza Plinovita smjesa koja sadrži ugljik monoksid se pripremi kao i gore da se omogući pasivna inhalacija pacijenta preko maske za lice ili gaze. Inhalirana koncentracija se može promijeniti i isprati jednostavnim prelaskom na 0% O 2. Praćenje razina ugljik monoksida će se javiti uz ili blizu maske ili gaze s mehanizmom za sigurnost od kvara koji će spriječiti da se ne udahnu prevelike koncentracije ugljik monoksida. Prijenosni inhalator Komprimirani ugljik monoksid se može pakirati u prijenosne uređaje za inhaliranje i inhalirati u odmjerenoj dozi, npr. da se omogući liječenje s prekidima pacijentu koji nije u bolničkom okruženju. U spremnike se mogu pakirati različite koncentracije ugljik monoksida. Uređaj može biti jednostavan kao mali spremnik (npr. ispod kg) prikladno razrijeđenog CO s on-off pregradom i cijevi kroz koju pacijent uzima udah CO prema standardnom režimu ili prema potrebi. Intravenska umjetna pluća Umjetna pluća (kateterski uređaj za izmjenu plinova u krvi) izrađena za O 2 dopremanje i CO 2 uklanjanje, se mogu koristiti za dopremanje ugljik monoksida. Kada se umetnuti kateter smjesti u jednu od većih vena sposoban je dopremiti ugljik monoksid u danim koncentracijama bilo za sistemsku ili lokalnu primjenu. Dopremanje može biti lokalno davanje visokih koncentracija ugljik monoksida kroz kratko vrijeme na mjesto tumora (ta visoka koncentracija će se brzo razrijediti u krvotoku), ili relativno dugo izlaganje nižim koncentracijama ugljik monoksida (vidi npr. Hattler i sur., Artif. Organs 18(11): (1994); i Golob i sur., ASAIO J., 47(): (01)). Normobarična komora U određenim slučajevima je poželjno izložiti cijelog pacijenta ugljik monoksidu. Pacijent se nalazi unutar hermetičke komore koja se napuni s ugljik monoksidom (u razini koja neće ugroziti pacijenta, ili u razini koja nosi prihvatljiv rizik bez rizika da će biti izloženi oni koji stoje pokraj). Kada je izlaganje gotovo, komora se može isprati s kisikom (npr. 21% O 2, 79%N 2 ) i analizatori ugljik monoksida mogu analizirati uzorke da se provjeri da nije zaostalo ništa ugljik monoksida prije nego što se pacijentu dopusti da izađe iz sustava izlaganja. Sistemska primjena tekućih CO smjesa Predstavljeni izum dalje razmatra kako se mogu napraviti vodene CO smjese za sistemsku primjenu pacijentu, npr. oralno i/ili infuzijom u pacijenta, npr. intravenski, intraarterijski, intraperitonealno i/ili subkutano. Npr. tekuće CO smjese, kao što je CO zasićena Ringerova otopina, se mogu infuzijom uvesti u pacijenta koji boluje od raka ili postoji rizik za rak. Alternativno ili dodatno, u pacijenta se može infuzijom uvesti CO-parcijalno ili potpuno zasićena puna (ili djelomična) krv. Predstavljeni izum također razmatra kako se mogu koristiti sredstva sposobna za primjenu doza CO plina ili tekućine (npr. gume koje oslobađaju CO, kreme, masti ili flasteri) Topikalno liječenje organa s ugljik monoksidom Alternativno ili dodatno, ugljik monoksid smjese se mogu primjeniti izravno na organe, npr. na kožu i unutarnje organe. Plinovita smjesa se može izravno primjeniti u unutrašnjost ili izvana na tijelo pacijenta, a da se liječi izravno organ. Plinovita smjesa se može izravno primjeniti na unutarnje organe pacijenta, putem bilo kojeg postupka, poznatog u struci, za upuhivanje plinova u pacijenta. Npr. plinovi, npr. ugljik dioksid, se često upuhuju u abdominalnu šupljinu pacijenata da bi se olakšao pregled za vrijeme laparoskopskih postupaka (vidi, npr. Oxford Textbook of Surgery, Morris i Malt, Eds., Oxford University Press (1994)). Stručnjak će vidjeti da se mogu koristiti slični postupci i za davanje smjesa ugljik monoksida izravno na unutarnji organ pacijenta. Koža se može tretirati topikalno s plinovitom smjesom, npr. izlaganjem zahvaćenog dijela kože plinovitoj smjesi u normobaričnoj komori (gore opisano), i/ili ispuštanjem smjese CO izravno na kožu. Ako pacijent ne udiše plin, koncentracija CO u plinovitoj smjesi može biti visoka po želji, npr. od 0.% pa sve do 0%. Vodene ugljik monoksid smjese se također mogu primjeniti topikalno na organ pacijenta. Vodeni oblici smjesa se mogu dati putem bilo kojeg postupka, poznatog u struci, za davanje tekućina pacijentima. Kao i plinovite smjese, vodene smjese se mogu primjeniti izravno u ili na tijelo za liječenje pacijentovog organa. Npr., tekuće smjese se mogu dati oralno, npr. tako da pacijent proguta kapsuliranu ili nekapsuliranu dozu vodene smjese CO. Kao drugi primjer, tekućine, npr. fiziološke otopine koje sadrže otopljeni CO, se mogu dati injekcijom u abdominalnu šupljinu pacijenata za vrijeme laparoskopskih zahvata. Alternativno ili dodatno, in situ izlaganja organa se mogu izvesti bilo kojim postupkom poznatim u struci, npr. in situ ispiranjem s tekućom ugljik monoksid smjesom za vrijeme operacije (vidi, npr. Oxford Textbook of Surgery, Morris i Malt, Eds., Oxford University Press (1994)). Koža se topikalno može tretirati tekućom smjesom, npr. injiciranjem tekuće smjese u kožu. Kao drugi primjer, koža se topikalno može tretirati primjenom tekuće smjese izravno na površinu kože, npr. ljevanjem ili sprejanjem tekućine na kožu, i/ili potapanjem kože u tekuću smjesu. 9

9 Ostale izvana dostupne površine, kao što su oči, usta, grlo, vagina, radnica, urinarni trakt, kolon i anus, mogu se slično tretirati topikaino s tekućim smjesama Upotreba hemoksigenaze-1 i ostalih spojeva Također se u predstavljenom izumu razmatra indukcija, ekspresija i/ili primjena hemoksigenaze-1 (HO-1) povezano s davanjem ugljik monoksida. Npr. HO-1 se može kod pacijenta osigurati tako da se inducira ili proizvodi HO-1, ili davanjem egzogene HO-1 izravno pacijentu. Kako je ovdje korišten, pojam "inducirati" znači izazvati povećanu proizvodnju proteina, npr. HO-1, u izoliranim stanicama ili stanicama tkiva, organa ili životinje uz korištenje staničnih vlastitih endogenih (npr. nerekombinantnih) gena koji kodiraju protein. HO-1 se može inducirati u pacijentu bilo kojom metodom poznatom u struci. Npr. proizvodnja HO-1 se može inducirati heminom, željezo protoporfirinom, ili kobalt protoporfirinom. Mnoštvo ne-hemskih tvari, uključujući teške metale, citokine, hormone, NO, COCl 2, endotoksin i toplinski šok, su također jaki induktori HO-1 ekspresije (Otterbein i sur., Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol 279: L29-L37, 00; Choi i sur, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1:9-19, 1996; Maines, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37:17-4, 1997; i Tenhunen i sur., J. Lab. Clin. Med. 7:4-421, 1970). HO-1 se također jako inducira nizom tvari koje stvaraju oksidativni stres, uključujući vodikov peroksid, uklanjače glutationa, UV zračenje i hiperoksiju (Choi i sur., Am. J, Respir. Cell Mol. Biol. 1:9-19, 1996; Maines, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37:17-4, 1997; i Keyse i sur., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:99-3, 1989). "Farmaceutska smjesa koja sadrži induktor HO-1" odnosi se na farmaceutsku smjesu koja sadrži bilo koju tvar koja može inducirati HO-1 kod pacijenta, npr. bilo koju gore opisanu tvar, npr. NO, hemin, željezo protoporfirin, i/ili kobalt protoporfirin. HO-1 ekspresija u stanici se može povećati preko prijenosa gena. Kako se ovdje koristi, pojam "ekspresija" se odnosi na povećanje proizvodnje proteina, npr. HO-1 ili feritina, u izoliranim stanicama ili stanicama tkiva, organa ili životinje uz korištenje egzogeno danog gena (npr. rekombinantni gen). HO-1 ili feritin je poželjno od iste vrste (npr. ljudske, mišje, štakori, itd.) kao i primalac, a u svrhu smanjenja imunološke reakcije. Ekspresija može biti vođena konstitutivnim promotorom (npr. citomegalovirusnim promotorima) ili tkivno-specifičnim promotorima (sirutka promotor za mliječne stanice ili albumin promotor za stanice jetre). Odgovarajući vektor genske terapije (npr. retrovirus, adenovirus, adeno povezani virus (AAV), virus (npr. vakcina) vodenih kozica, virus humane imunodeficijencije (HIV), mišji virus, virus raka B, virus gripe, herpes simplex virus-1, i lentivirus) koji kodira HO-1 ili feritin se daje pacijentu oralno, inhalacijski, ili injekcijom lokalno na mjesto prikladno za liječenje ovdje opisanih poremećaja. Posebno je poželjna lokalna primjena izravno na mjesto poremećaja, npr. na tumor i/ili organ u kojem se počeo stvarati ili se tek počinje stvarati tumor. Slično, plazmidni vektori, kodirajući za HO-1 ili apoferitin, se mogu dati, npr. kao gola DNA, u liposomima ili u mikročesticama. Dalje, egzogeni HO-1 protein se izravno može dati pacijentu bilo kojom metodom poznatom u struci. Egzogeni HO-1 se može izravno dati dodatno, ili kao alternativa indukciji ekspresije HO-1 kod pacijenta kako je opisano prije. HO-1 protein se pacijentu može dati, npr. u liposomima, i/ili kao fuzijski protein, npr. kao TAT-fuzijski protein (vidi npr. Becker-Hapak i sur., Methods 24:247-6, 01). Alternativno ili dodatno, bilo koji produkt metabolizma u kojem sudjeluje HO-1, npr. bilirubin, biliverdin, željezo i/ili feritin, se može dati pacijentu zajedno s ugljik monoksidom da bi se spriječio ili liječio poremećaj. Dalje, predstavljeni izum razmatra kako se mogu pacijentu dati željezo-vezujuće molekule druge osim feritina, npr. desferoksamin (DFO), željezo dekstran, i/ili apoferitin. Predstavljeni izum također razmatra kako se enzimi (npr. biliverdin reduktaza), koji kataliziraju razgradnju bilo kojeg od tih produkata, mogu inhibirati da bi se stvorio/potaknuo željeni učinak. Bilo što od gore navedenog se može primijeniti npr. oralno, intravenski, intraperitonealno, ili topikalno. Predstavljeni izum razmatra kako se spojevi koji oslobađaju CO u tijelu nakon primjene spoja (npr. COoslobađajući spojevi, npr. fotoaktivirajući CO-oslobađajući spojevi), npr. dimangan dekakarbonil, trikarbonil diklororutenij (II) dimer, i metilen klorid (npr. u dozi između 0 do 600 mg/kg, npr. oko 00 mg/kg), također mogu koristiti u postupcima predstavljenoga izuma, kao i zamjene karboksihemoglobina i CO-donirajućeg hemoglobina. Gore navedene tvari se mogu pacijentu dati bilo kojim putem, npr. oralno, intraperitonealno, intravenski ili intraarterijski. Bilo koji od gornjih spojeva se može dati pacijentu lokalno i/ili sistemski, i u bilo kojoj kombinaciji.

10 Kombinirana terapija 1 U izumu se također razmatra primjena CO zajedno s najmanje jednim tretmanom, npr. kemoterapijom, zračenjem, imunoterapijom, genskom terapijom, i/ili operacijom, a za liječenje ovdje opisanih poremećaja i stanja (npr. raka). Npr. CO se može dati pacijentu upotrebom bilo koje ovdje opisane metode u kombinaciji s operacijom kojom se uklanja kancerozno tkivo iz pacijenta. Alternativno ili dodatno, ovdje opisani postupci se mogu dati u kombinaciji s kemoterapijom. Kemoterapija može uključivati primjenu bilo koje vrste slijedećih spojeva: alkilirajuća sredstva, antimetabolite, npr. antagoniste folata, antagoniste purina i/ili pirimidina; biljne otrove, npr. vinka alkaloide (npr. paklitaksel) i podofilotoksine; antibiotike, npr. doksorubicin, bleomicin i/ili mitomicin; nitrozoureu; anorganske ione, npr. cisplatin; modifikatore biološkog odgovora, npr. tumor nekrozis faktor-α (TNF-α) i interferon; enzime, npr. asparaginazu; proteinske toksine konjugirane za ciljne spojeve; i hormone, npr. tamoksifen, leuprolid, flutamid i megestrol. Alternativno ili dodatno, ovdje opisani tretmani se mogu primijeniti u kombinaciji sa zračenjem, npr. γ-zračenjem, neutronskim zrakama, elektronskim zrakama, i/ili radioaktivnim izotopima. Alternativno ili dodatno, ovdje opisani tretmani se mogu primijeniti u kombinaciji s imunoterapijom, npr. davanjem specifičnih stanica, tumorskih antigena, i/ili antitumorskih antitijela. Alternativno ili dodatno, ovdje opisani tretmani se mogu primijeniti u kombinaciji s genskom terapijom, npr. davanjem DNA kodirajućih tumorskih antigena i/ili citokina. Postupci za liječenje raka, npr. operacija, kemoterapija, imunoterapija i zračenje, su detaljno opisani u The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17. izdanje, Dio 11, Poglavlja 143 i 144, a taj sadržaj je u potpunosti ovdje obuhvaćen kao referenca. Izum je dijelom ilustriran slijedećim primjerima koji ne ograničavaju izum na bilo koji način. Primjer 1. CO inhibira rast tumora i stanica raka, i in vivo i in vitro, te inhibira angiogenezu Životinje Za istraživanja humanih tumora su korištene ženke SCID miševa (težine do g), kupljene od Taconic (White Plains, NY), koje su puštene da se aklimatiziraju 1 tjedan prije pokusa. Za istraživanja tumora glodavaca korišteni su mužjaci CBA i C7B1/6 miševa (težine do g), kupljeni od Jackson Labs (Bar Harbor, ME) i pušteni da se aklimatiziraju 1 tjedan prije pokusa. Stanične linije Za ovdje opisana istraživanja su korištene humana stanična linija adenokarcinoma označena A49, stanična linija AC29 iz mezotelioma glodavaca i humana stanična linija raka kolona HCT. Izlaganje CO Stanične kulture i miševi su izlagani CO pri koncentraciji od 0 ppm. Ukratko, 1% CO u zraku se miješa sa zrakom (21% kisika) u cilindru za miješanje od nehrđajućeg čelika, i zatim se uvodi u 3.70 ft 3 staklenu komoru za izlaganje pri brzini protoka 12 L/min. Za kontinuirano mjerenje CO u komori, korišten je CO analizator (Intrescan, Chatsworth, CA). Koncentracije CO su cijelo vrijeme održavane na 0 ppm. Miševi i kulture stanica su smješteni u komoru za izlaganje prema potrebi. Općeniti postupci Od R&D Svstems su kupljeni ELISA setovi za VEGF razine, i korišteni prema uputama proizvođača. Imunobojenje je izvedeno za utvrđivanje ekspresije proteina pomoću standardnih metoda poznatih u struci. Antitijela su kupljena od Santa Cruz, StressGen and Cell Signaling. Za istraživanja inkorporacije [ 3 H] timidina, stanice su preko noći izgladnjele u serumu, a zatim su stimulirane s % seruma koji sadrži mci/ml [ 3 H] timidina (New England Nuclear, Boston, MA), [ 3 H] timidin inkorporacija je mjerena scintilacijskom spektroskopijom. CO inhibira rast stanica raka in vitro Humane i mišje stanične linije raka su korištene za ispitivanje učinaka CO na brzine rasta stanica u kulturi. Humane stanice adenokarcinoma (A49), stanice mezotelioma miševa (AC29), i A49 i AC29 stanice transformirane hemoksigenaza-1 (HO-1) genom (koji uzrokuje da stanice pojačano proizvode HO-1), izložene su niskim razinama CO (0 ppm) u kulturi. Rađene su krivulje rasta kroz 4 dana. Stanice koje su bile izložene CO uz zrak, pokazale su obrazac rasta sličan stanicama koje prekomjerno ekspresiraju HO-1, npr. smanjenje broja stanica % u tri dana (podaci nisu prikazani), u odnosu na kontrole. Ovi smanjeni brojevi nisu zbog toksičnosti jer je sličnost postignuta s vremenom i to u znatno smanjenoj brzini. Slika 1 je krivulja rasta u 6 dana i pokazuje da CO inhibira proliferaciju stanica raka mezotelioma glodavaca AC29. Na. dan su CO-izložene stanice maknute iz atmosfere koja sadrži CO, nakon čega je opažena proliferacija normalne brzine. 11