IZOLACIJA I IDENTIFIKACIJA SEKUNDARNIH METABOLITA

Transcript

1 IZOLACIJA I IDENTIFIKACIJA SEKUNDARNIH METABOLITA

2 Odabir procedure za izolaciju sekundarnih metabolita zavisi od Biljnog materijala Spojeva koji se izoliraju Prije odabira metode, potrebno je utvrditi cilj izolacije, koji može biti: nepoznata bioaktivna komponenta poznata komponenta grupa spojeva koji su strukturno slični 2

3 Fitohemijski screening uključuje; Izbor odgovarjućeg biljnog materijala Adekvatno prikupljanje biljnog materijala Determinacija biljnog materijala Sušenje Pakovanje i skladištenje Ekstrakcija Separacija Identifikacija 3

4 PRIKUPLJANJE BILJNOG MATERIJALA Potrebno je kod prikupljanja biljnog materijala voditi računa o; Odgovarajuća fenološka faza (količina i vrsta konstituenata zavisi od stepena razvoja biljke) Prikupljena biljka treba biti zdrava (npr. da nije inficirana nekim virusom, bakterijom ili gljivicom) Determinaciju biljnog materijala treba izvršiti stručno lice Obavezno ostaviti voucher (reprezentativan uzorak) 4

5 PRIKUPLJANJE BILJNOG MATERIJALA Divlje biljke Kultivirane biljke Limitirano prirodno stanište (rijetke i endemične vrste), rašireni na velikom prostoru Teško dostupni Moguće da dođe do nedostatka matrijala zbog konstatnog prikupljanja Osoba koja vrši prikupljane mora biti iskusan botaničar Daje pravu sliku hemijskog sastava na prirodnom staništu Neistražen biljni materijal koji pruža mogućnost identifikacije novih aktivnih komponenata Prisutni na limitiranom području Lako dostupni Dostupni kontinuirano Osoba koja vrši prikupljanje ne mora biti botaničar Uticaj kontroliranih uslova života 5

6 Izolacijski proces za biljne materijale uključuje sljedeće korake: sušenje i usitnjavanje j biljnog materijala (homogenizacija) odabir i primjena prikladne metode izolacije: ekstrakcija, destilacija ili presovanje pročišćavanje ekstrakta koncentriranje (npr. uparavanjem) sušenje ekstrakata k t 6

7 Sušenje biljnog materijala obično se obavljau prostorijama koje nisu direktno izložene sunčevoj svjetlosti Pakuju se u papirne vrećice Čuvaju se u sredini u kojoj su kontrolirani uslovi 7

8 Izolacija volatilnih sekundarnih metabolita vrši se različitim metodama npr; Headspace tehnikom Destilacijom ij Cijeđenjem Anfleranž (enfleurage) 8

9 HEADSPACE TEHNIKA Headspace tehnika je razvijena u 80-tim godinama XX vijeka za određivanje mirisnih komponenati prisutnih u zraku koji okružuje različite objekte. Headspace predstavlja zrak iznad ili oko mirisnog uzorka koji sadrži volatilne spojeve. Ova metoda nije destruktivna Primjenjene tehnike često se kalsificiraju prema različitim principima uzorkovanja, na statičku dinamičku 9

10 HEADSPACE TEHNIKA (HS) Statička HS metoda se sastoji u tome da se tečni ili čvrsti uzorak stavi u vijalicu, koja se zagrijava do određene temperature prije zatvaranja. Termin statička metoda se odnosi na zatvoreno okruženje gdje se sakupljaju nastale volatilne komponente. Nakon što uzorak dostigne ravnotežu sa gasovitom fazom, alikvot se prebacuje siringom za GC na hromatografsku analizu. Osjetljivost statičke headspace tehnike je u mikrogramskim količinama, a zavisi i od prirode volatilnih komponenata. 10

11 HEADSPACE TEHNIKA (HS) Dinamička HS analiza koristi purge and trap (čišćenje i zamka) tehniku, provodi se povlačenjem volatilnih komponenata sa materijala strujom prečišćenog zraka ili inertnog gasa kroz cjevčicu napunjenu nekim čvrstim adsorbentom. Nakon određenog vremena cjevčica se prebacuje u jedinicu za toplotnu desorpciju gdje se zagrijava, a adsorbovane komponente nošene inertnim gasom se sakupljaju u jedinici trap, u kojoj je temperatura mnogo niža. Kada susvekompnente desorbovane purge, i sakupljene idu dalje na GC/MS analizu. Osjetljivost dinamičke headspace tehnike je reda veličine nanograma. 11

12 DESTILACIJA Vrste destilacija destilacije vodenom parom, vodene destilacije (hidrodestilacije), vodeno-parne destilacije. Sve tri metode se zasnivaju na istim teorijskim principima destilacije, a razlika je u primarnom kontaktu biljnog materijala i vode, tj. vodene pare. 12

13 CIJEĐENJE Cijeđenjem se dobija esencijalno ulje iz svježe kore npr. limuna i narandže, jer se nalazi ispod same epiderme. I ova ulja se mogu dobiti destilacijom vodenom parom, ali zbog njihove lake dostupnosti vrši se cijeđenje na običnoj temperaturi. Spugna-proces se sastoji u cijeđenju ulja iz svježe kore agruma na spužvu. Na kori se napravi nekoliko rezova i cijedi. Kada se spužva napuni uljem, iscijedi se u sud u kome se kasnije, stajanjem, ulje postepeno odvaja od mutne vode i pliva na njoj. j Na ovaj način se dobije najbolje ulje, ali je metoda spora, ima mnogo gubitaka, tako da je prinos mali. Odvojeno ulje se filtrira da se dobije bistar proizvod. Cijeli plodovi se pritišću i taru u posebno izbušenim posudama od nerđajućeg lima koje na unutrašnjoj strani imaju sitne, vrlo oštre iglice. Ove iglice izbuše spoljni, žuti dio kore u kome se nalaze velike šupljine sa uljem. 13

14 ANFLERANŽ (ENFLEURAGE) (enfleurage) je francuski način izdvajanja esencijalnih ulja. Metoda je spora i skupa. Primjenjuje se za slučajeve kada je količina esencijalnih ulja tako mala, da se drugi načini ne mogu primjeniti. Princip se zasniva na tome da se koristi osobina masti da vrlo lako upijaju mirisne materije bilja na običnoj temperaturi. Metoda se zasniva na adsorpciji mirisnih sastojaka na prečišćenom bezmirisnom loju. Dobvena mirisna mast se obrađuje odgovarajućim otapalom. Na ovaj način se dobiju najfinija i najskupocjenija esencijalna ulja. Pošto se radi na običnoj temperaturi i s neutralnim materijama za upijanje, praktično se dobija prirodno esencijalno ulje, onakvo kakvo se nalazi u biljci, jer se pod tim okolnostima ekstrakcije ne mijenjaju ni organoleptičke osobine, niti fizičke i hemijske konstante. 14

15 EKSTRAKCIJA proces razdvajanja j komponenata iz biljnog materijala, na osnovu različite topljivosti u otapalu kojim se vrši ekstrakcija. Ekstrakcija uključuje nekoliko istovremenih procesa: difuzija otapala u stanice biljnog materijala otapanje metabolita u otapalu difuzija otapala s otopljenim tvarima izvan stanica ispiranje 15

16 EKSTRAKCIJA Faktori koji utičunaekstrakcijusu temperatura, veličina čestica, kretanje otapala i ph-vrijednost. Poželjna svojstva otapala za ekstrakciju: selektivnost za spojeve koje se žele ekstrahirati, veliki ekstrakcijski kapacitet, nereaktivnost s biljnim komponentama, neškodljivost za ljude i opremu, potpuna hlapljivost i niska cijena. 16

17 EKSTRAKCIJA Često se metode esktrakcije sotapalima dijele na kontinuirane i nekontinuirane postupke. Maceracija Ultarzvučna ekstrakcija Perkolacija Ekstrakcija po Soxhletu Ekstrakcija s otaplaom pod pritiskom Ekstrakcija pod refluksom Ekstrakcija superkritičnim fluidima 17

18 MACERACIJA usitnjeni biljni materijal u pogodnom otapalu u zatvorenoj posudi se ekstrahira na sobnoj temperaturi. Povremeno ili konstantno miješanje može povećati brzinu ekstrakcije (maceracija uz miješanje ili vrtložna maceracija). 18

19 ULTRAZVUČNA EKSTRAKCIJA ovo je modificirana maceracija, gdje je ekstrakcija olakšana upotrebom ultrazvuka (visoko-frekventni pulsevi, 20 khz) Ultrazvuk se koristi za mehanički stres na stanice stvarajući kavitacije u uzorku. Raspadanje stanica povećava topljivost metabolita u otapalu i poboljšava ekstrakciju. 19

20 PERKOLACIJA usitnjeni biljni materijal se postavlja u perkolator (cilindrični kontejner s slavinom na dnu) i natapa u otapalu. Dodatno otapalo se zatim dodaje na vrh biljnog materijala i pušta da «perkolira» polako (kapajući) sa dna perkolatora. 20

21 EKSTRAKCIJA U SOXHLET-u Biljni materijal se postavlja u cilindar u ekstrakcijskoj komori koja se postavlja iznad posude za sakupljanje, a ispod refluksirajućeg hladila. Glavna prednost ove vrste ekstrakcije je kontinuirana ekstrakcija. Svježe otapalo se kondenzira i ekstrahira biljni materijal kontinuirano. Otapalo s ekstrahiranim tvarima prelazi u balon gdje se koncentrira. Nedostatak je u tome što se ekstrakt kontinuirano zagrijavanatemperaturuvrenjaotapala,štomože dovesti termičkih razlaganja. 21

22 EKSTRAKCIJA POD REFLUKSOM biljni materijal se uranja u otapalo u tikvici koja je spojena na hladilo. Otapalo se zagrijava do ključanja. Kako otapalo otparava ulazi u hladilo gdje se kondenzira i vraćaseutikvicu. 22

23 EKSTRAKCIJA SUPERKRITIČNIM FLUIDIMA (engl. supercritical fluid extraction, SFE) superkritični fluidi (SCFs) zamjenjuju organska otapala. Kritična tačka čiste tvari se definiše kao najviša temperatura i pritisak na kojima tvar može postojati u parno-tekućoj ravnoteži. Na temperaturama i pritiscima iznad ove tačke nastaje jedan homogen fluid, poznat kao superkritični fluid. SCF je težak kao tekućina, ali ima svojstvo prodiranja kao gas. SCF nastaju zagrijavanjem gasova iznad kritične temperature ili komprimiranjem tekućina iznad kritičnog pritiska. Promjenom pritiska i temperature mijenja se sposobnost otapanja superkritičnog CO 2 (visokokomprimirani CO 2 (t > tk i p > pk), bez mijenjanja sastava otapala. Ekstrakcija se obično vrši na o C i pritisku bara. 23

24 ANALIZA SEKUNDARNIH METABOLITA Volatilni sekundarni metaboliti GC/MS analizom Rt, RI, upoređivanjem spektara Nevolatilni sekundarni metaboliti ukupni spektrofotometrijski, fluorimetrijski... HPLC uz upotrebu različitih detektora 24

25 GASNA HROMATOGRAFIJA (GC) Kapilarne kolone, (dužina m sa unutrašnjim dijametrom mm i debljinom filma stacionarne faze od 0.25 μm). Stacionarna faza može biti polarna- spojevi se razdvajaju na osnovu njihove polarnosti, što rezultira različitim vremenom zadržavanja komponenata u koloni nepolarna - dolazi do separacije zbog različitih tačaka ključanja Esencijalna ulja sastoje od terpena i njihovih derivata koji imaju slične tačke ključanja, eluiraju se u vrlo uskom rasponu na nepolarnim kolonama. Da bi se prevazišao ovaj limit, analitička metoda se modificira primjenom sporijeg rasta temperature u pećnici, kako bi se proširio eluacioni opseg komponenata ulja. 25

26 GC Osnovni kriterij za identifikaciju kada se koriste detektori koji ne daju informaciju o strukturi jesu retencioni indeksi. Sistem retencionih indeksa baziran je na činjenici da je svaki analit definisan pozicijom između dva susjedna alkana u homolognom nizu. Metoda računanja RI bazira se na logaritamskoj jednačini koju je razvio Kovats godine za izotermalne uslove, kao i na jednačini koju su objavili van den Dool i Kratz godine koja nema logaritamsku formu, a uzima u obzir temperaturno programirane uslove. ( RIn+ 1 + RIn) f ( tr, x) f ( tr, n) RIn = f ( trn, + 1 ) f ( trn, ) Zavisno od funkcije f(t R ), koriste se različiti RI sistemi: Logaritamska [f(t R ) =log t R`], R prema Kovatsu Linearna [f(t R )=t R ], što odgovara prijedlogu van den Doola i Kratza. 26

27 Općenito sistem retencionih indeksa bazira se na vezi struktura-retenciono vrijeme (n-alkani i metilni ili etilni esteri masnih kiselina, tj svaka homologna serija koja predstavlja linearnu vezu između retencionih vremena i broja karbonovih atoma) 27

28 Brza gasna hromatografija, fast gas chromatography (FGC), koja ima dovoljnu moć razdvajanja u kraćem vremenu, upotrebom adekvatnih kolona i instrumentacije u kombinaciji sa optimiziranim uslovima koji omogućavaju 3-10 puta brže analize. Ova vrsta hromatografije izvodi se u kratkim kolonama 5-10 m, promjera kolone mm, uz hidrogen kao gas nosač, i bržim temperaturnim programom. S obzirom na brzinu izvođenja analize ovaj vid gasne hromatografije može se podijeliti na brzu u trajanju 3 12 min, veoma brza 1 3 min, ultrabrza manje od 1 min. 28

29 Najčešće upotrebljavani detektor kod analize volatilnih spojeva je spektrometar masa Kombinovani sistem gasna hromatografija/masena spektrometrija GC/MS, predstavlja najefikasnijiju jj tehniku za separaciju, detekciju i karakterizaciju komponenata u kompleksnim organskim smjesama. Spektrometar masa predstavlja osjetljiv i specifičan analitički instrument, a ujedno i jednu vrstu hemijskog reaktora u kome se dešava različita razgradnja molekula. Primjena spektrometrije masa je neophodna pri ispitivanju strukture supstanci dobijenih sintezom ili izolacijom iz biljnog materijala, praćenju metabolizma, određivanju strukture metabolita. 29

30 Satureja montana L. Headspace; 37 komponentata Esencijalno ulje; 66 komponenata 1.25e6 H 3 C CH 3 [SM-HS] TIC #1 [8P07SM] TIC #2 CH 3 p-cimen (37.1 %) 0.75e6 CH e OH (15.5%) 0.25e6 H 3 C CH 3 karvakrol Headspace Esencijalno ulje 0.25e6 0.50e6 0.75e6 100 CH (59.1%) e H 3 C CH OH 77 (20.1%) timol

31 Određivanje ukupnih fenola Folin-Dennis (redukcija smjese fosfovolframatno-fosfomolibdatnog reagensa u prisustvu fenolskih hidroksilnih grupa tirozina, što rezultira stvaranjem plavog produkta) Folin-Ciocalteu (Dodatak litijum sulfata sprječava formiranje precipitata koji bi interferirali u kvantifikaciji utičući na intenzitet boje nastalih kompleksa. Folin-Ciocalteu reagens je po hemijskom sastavu heksavalentni fosfomolibdo/fosfovolframatni kiseli kompleks) 3 HO 2 PO WO 3 5MoO MO3 10 HO 2 3H 2O P2O 5 14WO3 4MoO3 10H 2O Mo VI žut ArOH Mo V plav nm ( )( ) + ( )( ) λ =

32 REDUCIRAJUĆA MOĆ eng. Reducing power (RP) odnosi se na praćenje redukcije nekih prelaznih metala koji se mogu kompleksirati i na taj način stvoriti obojeni kompleks, a koji ima različitu boju u oksidovanoj i redukovanoj formi. Smjesa K 3 Fe(CN) 6 i FeCl 3 u kiseloj sredini se koristi za određivanje ukupnih fenola u biljnom materijalu, ali i kao antioksidacijska metoda. Fenolski spojevi reaguju sa ovom smjesom dajući obojeni produkt reakcije, čiji intenzitet je proporcionalan količini prisutnih fenola, a koji su odgovorni za antioksidacijsku aktivnost. Reakcija se izvodi u prisustvu viška Fe 3+ iona. Ova redoks reakcija poznata je pod nazivom berlinsko plavo, brza je, ekonomična i jednostavna. Uklanjanje atoma hidrogena sa fenolske hidroksilne grupe je prvi korak reakcije, što rezultira stvaranjem fenoksil radikala ArO, koji nakon toga može stvarati dimere ili može reagovati sa drugim radikalom. 32

33 Određivanje ukupnih flavonoida Taloženje sa formaldehidom + Folin Ciocalteu Metoda sa AlCl 3 OH O Al + O OH HO O AlCl 3 HO O O Glu Ram O Glu Ram OH O O 2+ Al O Rutin 33

34 Metoda sa 2,4-dinitrofenilhidrazinom Princip ove metode zasniva se na reakciji aldehida i ketona sa 2,4-dinitrofenilhidrazinom. Flavoni i izoflavoni sa dvostrukom vezom između C2-C3, ne daju pozitivnu reakciju, dok flavanoni npr. naringin, naringenin i hesperetin, formiraju hidrazone čiji je maksimum apsorpcije na 495 nm. Zbog selektivnosti reakcija flavonoida sa AlCl 3 i 2,4-dinitrofenilhidrazinom, bilo bi dobro određivati sadržaj aj specifičnih č grupa gupaflavonoida ao odapo obje metode, a njihova suma bi dala realniju vrijednost za sadržaj ukupnih flavonoida. 34

35 METODE ODREĐIVANJA ANTOCIJANINA ph - diferencijalna metoda, bazira se na mjerenju apsorpcije na jednoj valnoj dužini, obično između nm, što je daleko od uobičajenevalnedužinena kojoj se nalazi maksimum apsorpcije za ostale fenole, a koji apsorbuju u UV području. Mjerenje se vrši pri različitom ph; pri ph 1 su u obliku obojenih oksonijum soli, dok pri ph 4.5 su prisutni kao bezbojni hemiketali 35

36 VANILINSKI TEST Ovaj test specifičan je za proantocijanine, flavan-3-ol i dihidrokalkone koji imaju jednostruku vezu na pozicijama C2-C3. C H 3 HO O O HO + O OH OH OH H + vanilin OH Flavan-3-ol OH OH C H 3 O HO O OH H 3 C O HO O OH HO OH OH OH OH HO OH OH OH prelazni spoj crveno obojeni produkt reakcije 36

37 HPLC Najčešće korištene kolone pri analizi prirodnih produkata su kolone obrnutih faza gdje su porozne čestice silika gela presvučene nepolarnim materijalom, a najčešće korištena otapala za eluiranje su polarne prirode kao što su voda, metanol, acetonitril, izopropanol. Dodatkom mravlje, sirćetne kiseline, trifluoroacetatne kiseline, amonijum acetata ili fosfatnog pufera u mobilnu fazu moguće je optimizirati separaciju. Uobičajeno kolone imaju dijametar mm i dužinu mm, dok veličina čestica stacionarne faze varira od 2 7 mm. 37

38 HPLC Čestice u slučaju obrnutih faza su presvučene ugljikovodicima čija dužina lanca može biti od C 4 C 18. Separacija na obrnutim fazama je najefikasnija tehnika za separaciju fenolskih spojeva i to na C 18 stacionarnim fazama. Razdvajanje je moguće izvršiti u izokratskom i gradijentnom režimu. Izokratski režim podrazumjeva ravnomjernu mobilnu fazu tokom razdvajanja, a separacija je dobra za polarnije spojeve. Gradijentno eluiranje se bazira na modifikaciji organskog otapala, a najčešće acetonitrila i metanola tokom analize. Ovakav režim rada je pogodan kada se fenoli nalaze u širokom rasponu polarnosti. Obično je potrebno više vremena da se stabilizira kolona i može doći do promjena na baznoj liniji usljed promjena sastava mobilne faze. 38

39 HPLC Mora se voditi računa i o ph vrijednosti mobilne faze, gdje može doći i do parcijalne disocijacije, što rezultira dodatnim pikovima, širenju i asimetriji pikova, zbog koeluiranja kisele forme i baznog konjugovanog oblika. Najčešće korišten ph otopine za razdvajanje j fenolskih spojeva je 2.5 3, kada se razdvajaju kisele forme, a 5 7, kada se fenolski spojevi razdvajaju u disociranom obliku. 39

40 ANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOST U zdravom organizmu postoji ravnoteža između nastajanja slobodnih radikala i antioksidativne odbrane samog organizma Slobodni radikali nastaju pucanjem veza unutar molekula u stanicama našeg organizma, pod uticajem različitih faktora, kao što su: pušenje, izloženost ionizirajućem zračenju, UV zrakama, zagađenom zraku, kao posljedica metaboličkih procesa te upala Slobodni radikali u lančanoj reakciji stvaraju nove nestabilne molekule, što rezultira stvaranjem sve većeg broja slobodnih radikala koji oštećuju stanice organizma. 40

41 Antioksidansi neutraliziraju slobodne radikale donirajući im svoj elektron te na taj način prekidaju lančanu reakciju «krađe» elektrona drugim molekulama, donirajući im svoj elektron, antioksidansi ne postaju nestabilni 41

42 ANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOST Oksidativni stres predstavlja pretjeran debalans reaktivnih oksigenovih ili nitrogenovih vrsta, npr. superoksid anion, hidrogen peroksid, hidroksil radikal ili peroksinitrit, u odnosu na antioksidativni kapacitet, što vodi oksidaciji različitih biomolekula, kao što su enzimi, proteini, DNA i lipidi. Antioksidativni kapacitet označava učinkovitost, snagu, potencijal i aktivnost neke čiste hemijske supstance da spriječi oksidaciju neke druge supstance. 42

43 ANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOST Pro-oksidans je supstanca koja može izazvati oksidativna oštećenja na različitim biološkim biomakromolekulama kao što su nukleinske kiseline, lipidi, proteini itd. Antioksidans je supstanca koja može efikasno reducirati prooksidans, pri čemu kao produkti nastaju supstance koje nemaju štetno djelovanje. Antioksidansi se definišu kao spojevi koji mogu odgoditi, inhibirati ili spriječiti oksidaciju hvatanjem slobodnih radikala i smanjiti oksidativni stres. 43

44 ANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOST Određivanje (antioksidativne aktivnosti) AOA Metode bazirane na prenosu elektrona, eng. Electron Transfer (ET) ROO + AH / ArOH ROO + AH / ArOH + + AH / ArOH + H O A / ArO + H O ROO H O ROOH H O Metode bazirane na prenosu atoma hidrogena, eng. HydrogenAtom Transfer (HAT) ROO + AH / ArOH ROOH + A / ArO 44

45 ANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOST Svaki antioksidans prati različit uticaj koncentracije, pa se antiradikalska aktivnost definiše kao količina potrebnog antioksidansa da smanji početnu koncentraciju radikala na 50% ili kao ekvivalenti nekog standarda. Rezultati se izražavaju kao (inhibiciona koncentracija) IC 50, minimalna koncentracija potrebna da izvrši 50%-tnu inhibiciju radikala. 45

46 METODE Neke od najčešće upotrebljavanih metoda za određivanje antioksidacijske aktivnosti su; DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) 1-difenil-2-pikrilhidrazil) ABTS (2,2'-azino-bis(3-etilbenztiazolin-6-sulfonska kiselina) ORAC (Oxygen radical absorbance capacity) RP (Reducing power) 46

47 ANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOST - DPPH DPPH (1,1 difenil 2 pikrilhidrazil) λ max = 517 nm ( ) % AA = A0 At / A0 100 IC 50 47

48 ANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOST - ABTS ABTS (2,2' azino bis(3 etilbenztiazolin 6 sulfonska kiselina) λ max = 743 nm max NH SO3 - S S - + SO 3 + NH4 N N N NC2 H5 H 5 C 2 ABTS -e - +e - ( ) % AA = A A / A 100 NH SO3 - N 0 t 0 C 2 H 5 H 5 C 2 S. + ABTS N N HO N S SO NH4 + CH 3 COOH H 3 C O CH 3 CH 3 Trolox NH SO3 - H S N + N N C 2 H 5 H 5 C 2 N S SO NH4 + + O C H 3 CH 3 O COOH CH 3. + ABTSH CH3 48

49 49

50 Slijedeće predavanje; TERPENI... 50