Nίκη Μάργαρη Ιατρός Κυτταρολόγος Επιστημονικός Συνεργάτης Εργαστηρίου Διαγνωστικής Κυτταρολογίας Π.Γ.Ν. «ΑΤΤΙΚΟΝ»

ΒΙΟΧΗΜΙΚΗ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ Διίδρωμα Εξίδρωμα Μακροσκοπική εμφάνιση Υδαρής, διαυγής Ποικίλλει, νεφελώδης Ειδικό Βάρος <1,015 >1,015 Πρωτεϊνες Γαλακτική Δεϋδρογενάση <3 gr/100ml (<2 σε ασκιτικά υγρά) <200u/l >3 gr/100ml (>2 σε ασκιτικά υγρά) (ιδιαίτερη σημασία στην κακοήθεια) >200u/l Πήξη Όχι Μπορεί Κυτταρικότητα Πτωχή. Συνήθως καλοήθη κύτταρα Μέτρια έως υψηλή

ΒΙΟΧΗΜΙΚΗ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ Διίδρωμα Αύξηση της υδροστατικής πίεσης Μείωση της κολλοειδοσμωτικής πίεσης Εξίδρωμα Βλάβη των τριχοειδών αγγείών 1. Συμφορητική καρδιακή ανεπάρκεια 2. Νεφρωσικό σύνδρομο και άλλα αίτια υπολευκωματιναιμίας (ασιτία). 3. Ηπατική κίρρωση 4. Μυξοίδημα. 5. Διαπεριτοναϊκή κάθαρση. 6. Συμπιεστική περικαρδίτιδα. 7. Πνευμονική εμβολή 1. Νεόπλασμα 2. Λοίμωξη 3. Πανγκεατίτιδα 4. Φάρμακα 5. Πνευμονικό έμφρακτο 6. Σαρκοείδωση, συστηματικός ερυθηματώδης λύκος 7. Άλλα

ΒΙΟΧΗΜΙΚΗ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ Γλυκόζη Αμυλάση Αμμωνία PH Κρεατινίνη Αλκαλική Φωσφατάση Χολή Υαλουρονικό οξύ Καρκινοεμβρυϊκό Αντιγόνο

ΒΙΟΧΗΜΙΚΗ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ Γλυκόζη Φυματίωση, ρευματοειδής αρθρίτιδα, βακτηριακή λοίμωξη Καρκίνος Αμυλάση Παγκρεατίτιδα, διάτρηση οισοφάγου Καρκίνος Αμμωνία Νεκρωση εντερου Διάκριση ασκιτικού υγρού από ελεύθερα ούρα στην ασκιτική κοιλότητα Κρεατινίνη Διάκριση ασκιτικού υγρού από ελεύθερα ούρα στην ασκιτική κοιλότητα

ΒΙΟΧΗΜΙΚΗ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ PH <7.3 Ρευματοειδής Αρθρίτιδα Φυματίωση Διάτρηση οισοφάγου Σε νεοπλασματικά υγρά σωματικών κοιλοτήτων κακή πρόγνωση Αλκαλική Φωσφατάση Νεκρωση εντερου, διάτρηση εντέρου Χολή Υαλουρονικό οξύ >8mg/dl Ενδεικτικό μεσοθηλιώματος

ΒΙΟΧΗΜΙΚΗ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ Καρκινοεμβρυϊκό Αντιγόνο Ενδεικτικό αδενοκαρκινώματος Εμφύσημα Φυματίωση Κίρρωση Παγκρεατίτιδα Καλλιέργεια Απαραίτητη διαδικασία για τη διάγνωση ποικίλλων λοιμώξεων

ΣΥΜΒΑΤΙΚΗ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ

Αναπαραγωγιμότητα Αντικειμενοποίηση Εφαρμογή τεχνικών: Κυτταροχημείας Ανοσοκυτταροχημείας Μοριακής Βιολογίας Αυτοματοποιημένης Κυτταρολογίας

Η συλλογή μπορεί να γίνει είτε σε δοχείο με προεπεξεργασία των τοιχωμάτων του με σιλικόνη και ηπαρίνη είτε απευθείας σε 30 ml διαλύματος CytoLyt.

Διάλυμα Orange G Orange G Φωσφοβολφραμικό οξύ όχι ΕΑ 36 Light green Brun Bismark Ηωσίνη Φωσφοβολφραμικό οξύ Ανθρακικό λίθιο

χωρίς air drying artifact μείωση φλεγμονωδών κυττάρων, αιμορραγικών στοιχείων όμοια κατανομή κυττάρων πυρηνικά χαρακτηριστικά: βελτιωμένα σταθερή παρασκευαστική διαδικασία επιπλέον επιχρίσματα όμοιας κυτταρικότητας επικουρικές τεχνικές

Εγκλεισμός σε παραφίνη

Η διάγνωση Πορογενές αδενοκαρκίνωμα μαστού Χρώση Α/Η Υποδοχείς οιστρογόνων

Η διάγνωση Ενδομητριοειδές καρκίνωμα ωοθήκης Ki-67 p53 Χρώση Α/Η

Papillo et al. Acta Cytol. 1994 20000 15000 10000 5000 CS TP 0 CS TP

Miller et al. Acta Cytol. 1994 10 9,5 8 6 4 5,17 3,1 Slides/case min/case 2 1,04 0 CS TP

Leung et al.diagn. Cytol. 1996 Ποιότητα χρώσης Υπόστρωμα Μορφολογία Αρχιτεκτονική TP>CS TP=CS TP<CS Κυτταρικότητα 0% 20% 40% 60% 80% 100%

Μεσοθηλιακά κύτταρα Ιστιοκύτταρα Κύτταρα προερχόμενα από το περιφερικό αίμα Ηωσινόφιλα (πνευμονία, φυματίωση, πνευμονοθώρακας, παράσιτα, αλλεργία, φάρμακα, λέμφωμα Hodgkin ) Λεμφοκύτταρα Φλεγμονώδη κύτταρα - PMN

Τεμάχια κολλαγόνου σε συνάφεια με μεσοθηλιακά κύτταρα Κυλλινδρικό επιθήλιο (σάλπιγγες- Δουγλάσειος χώρος/ αναπνευστικό επιθήλιο) Curschmann s spirals Ηπατοκύτταρα Κύτταρα Γυν.Γενν. Συστ. (ενδομητρίωση) Ψαμμώδη σωμάτια Κύτταρα Μυλλεριανής προέλευσης

Μεμονωμένα Σε αθροίσεις Κενοτόπια στην περιφέρεια του κυτταροπλάσματος (γλυκογόνο, PAS +) Υαλουργικό οξύ στο κυτταρόπλασμα ή στο υπόστρωμα (PAS +) Διάμετρος: 15-30 μm (1.5-2 φορές το μέγεθος ουδετερόφιλων) ή πυρηνοκυτταροπλασματική αναλογία

Περιοχή γύρω από τον πυρήνα περισσότερο πυκνή ( ενδιάμεσα νηματια), ενώ στην περιφέρεια περισσότερο διαυγής «Παράθυρο» Μονοπύρηνες, διπύρηνες, πολυπύρηνες μορφές Πυρήνες : τυπικά κεντρικά τοποθετημένοι ή ελαφρά έκκεντρα τοποθετημένοι (όμως όχι στο έξω όριο του κυττάρου αδενοκαρκίνωμα)

Κενοτοπίωση κυτταροπλάσματος (εκφυλιστικά κενοτόπια-διαυγή signet ring cells-προιον έκκρισης) Πυρήνιο: διακριτό έως έντονο n/c - πυρηνική πολυμορφία Μιτώσεις (καλό μέσο καλλιέργιας) Χρωματίνη: λεπτοκοκκώδης έως αδρή Στα μεταστατικά διπλός πληθυσμός

PAS (+) PAS διαστάση (-)

More and bigger cells, in more and bigger clusters Κυτταρικότητα: κυτταροβριθές (υποκυτταρικό στον σαρκωματώδη τύπο) αντιδραστικά/καλοήθη υγρά λιγότερο κυτταροβριθή Σφαιρικοί σχηματισμοί, morules- 3D, θηλώδεις σχηματισμοί αντιδραστικά μεσοθήλια: μικρότεροι και λιγότερο πολύπλοκοι σχηματισμοί Μεμονωμένα κύτταρα

Αύξηση κυτταροπλασματικής αναλογίας (όχι απαραίτητο), πολυμορφία Διπύρηνες- Πολυπύρηνες -Γιγάντιες μορφές Κυτταρόπλασμα: διαυγές στην περιφέρεια-πυκνό γύρω από το πυρήνα Παράθυρο

Κυτταροπλασματικά κενοτόπια: λιπιδια, υαλουργικό οξύ, το οποίο παρατηρείται πιο συχνά από τα καλοήθη, γλυκογόνο κενοτόπια βλέννης σε αδενοκαρκίνωμα (PAS, PAS-D, mucicarmine Πυρήνες: κεντρικά τοποθετημένοι ή ελαφρά έκκεντρα τοποθετημένοι (όμως όχι στο έξω όριο του κυττάρου αδενοκαρκίνωμα) διαταραχή πυρηνικής μεμβράνης, αδρή χρωματίνη, ανώμαλη κατανομή, υπερχρωμασία, προβάλλον πυρήνιο, μακροπυρήνιο

HBMe-1 Thromb Leu M1/cd15 Calretinin Thromb CEA

Συμβατικό επίχρισμα Επίχρισμα ThinPrep

Διερεύνηση πρωτοπαθών όγκων ΔΔ πρωτοπαθών από μεταστατικούς κακοήθεις όγκους Διερεύνηση όγκων αγνώστου πρωτοπαθούς εστίας Διερεύνηση δυναμικού κακοηθείας Διερεύνηση ανταπόκρισης στη θεραπεία

Δείκτες Κυτταρικής Διαφοροποίησης Αντιγόνα Κυτταρικής Κινητικής Υποδοχείς στεροειδών ορμονών Ογκογονίδια-Ογκοκατασταλτικά γονίδια Chemotherapy resistance factors

Παρασκευαστική τεχνική Μέγεθος του δείγματος Ετερογένεια του όγκου Επιλογή περιοχής ανάλυσης Επιλογή QIC τεχνικής

1. Calretinin: Ευαισθησία-ειδικότητα για μεσοθήλια Μεμβρανική-πυρηνική Έκφραση στους περισσότερους τύπους του ΜΜ Έκφραση: έντονη και διάχυτη πυρήνας και κυτταρόπλασμα Αδενοκαρκίνωμα 0-38% (συνήθως εστιακή) 2. Wilms tumor 1 protein: 93% των μεσοθηλιωμάτων - πυρηνική Ορώδες ωοθήκης ν.ο. μεσοδερμικής προέλευσης

3. Keratins 5/6: 64-100% των μεσοθηλιωμάτων Έκφραση: κυτταροπλασματική SQCC, Ορώδες ωοθήκης, αδενοκαρκίνωμα πνευμονα (0-19%) 4. Thrombomodulin: 34-100% των μεσοθηλιωμάτων Έκφραση: έντονη και διάχυτη μεμβρανική Αδενοκαρκίνωμα πνευμονα (5-77% εστιακή-ασθενής), SQCC, αγγειοσάρκωμα

5. Mesothilin: 100% των μεσοθηλιωμάτων Έκφραση: έντονη και διάχυτη μεμβρανική + αδενοκαρκίνωματα (ωοθήκη, πάγκρεας) 6. CK 7 - CK 20 CK 7: επιθηλιοειδές ΜΜ, αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα/ωοθήκης CK 20: αρνητικό (σπάνια εστιακά θετικό στο ΜΜ)

A. MOC-31: Αρνητικός δείκτης για τα μεσοθήλια (ο πιο ευαίσθητος-ειδικός) 5-10% θετικό στο ΜΜ Αδενοκαρκίνωμα, έκφραση: έντονη και διάχυτη - μεμβρανική B. CD 15: Adenocarcinoma RS cells

C. Ber-EP 4: Έκφραση: έντονη και διάχυτη στο αδενοκαρκίνωμα Χαρακτηριστική έντονη μεμβρανική 20% θετικό στο ΜΜ, εστιακή D. CEA : Αδενοκαρκίνωμα Στο ΜΜ, όμως με χαρακτηριστική έκφραση thick cell membrane ) E. B72.3, CA 19-9

CEA (-) EMA (-) (μεμβρανική) Leu M1 (-)

Cadherin (+) Vimentin (+) κυτταροπλασματική

Ανοσοϊστοχημική προσέγγιση διερεύνησης αδιαφοροποιήτων όγκων

Ανοσοϊστοχημική προσέγγιση διερεύνησης χαμηλής διαφοροποίησης καρκινωμάτων

CK 20+ CK 7- Μεταστατικό αδενοκαρκίνωμα παχέως εντέρου CK 20+ Ca 19-9 Μεταστατικό ουροθηλιακό καρκίνωμα

Eκφράζεται σε διάφορα επιθηλιακά νεοπλάσματα Δεν εκφράζεται Μελανώματα Λεμφώματα (?) Σαρκώματα Συνήθως αρνητικό στο ΜΜ Ορισμένα ΜΜ όμως είναι +, με έκφραση ασθενή και εστιακή CEA

Πολλά επιθηλιακά νεοπλάσματα Φυσιολογικά και νεοπλασματικά λεμφοδικτυωτά κύτταρα Περινευρικά κύτταρα Μηνιγγιώματα Σαρκώματα (επιθηλιοειδές, συνοβιακό, χόρδωμα, χονδροσάρκωμα)

Μεταστατικό καρκίνωμα ωοθηκών Ca 125 B 72,3 Leu M1/CD15 Ca 19-9 BerEp 4

SCC-L CD 56 Μεμβρανική CD 57 Syn

Μεταστατικό Μελάνωμα S100 ΜelanA HMB45

Calcitonin

p53 OeR Ki-67 EGFR PrR

Ενίσχυση (PCR) τμήματος DNA που αντιστοιχεί στο τμήμα VDJ της υπερμεταβλητής περιοχής της βαριάς αλυσίδας της ανοσοσφαιρίνης H (IgH) Το επιλεγόμενο τμήμα (Fr2/J) χρησιμεύει σαν μήτρα για δεύτερη ενίσχυση (seminested PCR) ευαισθησία, ειδικότητα Το προϊόν της δεύτερης PCR (μεγέθους 240-260 bp) οπτικοποιείται με ηλεκτροφόρηση γέλης πολυακρυλαμίδης

A B C D E F G A : Δείκτης μοριακού βάρους (50bp) B : Προϊόν PCR αντίδρασης για τη μελέτη του ανασυνδυασμού των γονιδιακών τμημάτων της βαριάς αλυσίδας της ανοσοσφαιρίνης (IgH) (θετικό) C : Μάρτυρας ελέγχου ποιότητας DNA του δείγματος (exon 5 του p53)(274bp) D : Θετικός μάρτυρας (240-260 bp) Ε : Μάρτυρας ελέγχου ποιότητας DNA του θετικού μάρτυρα (exon 5 του p53) (274bp) F : Αρνητικός μάρτυρας G :Μάρτυρας ελέγχου ποιότητας DNA του αρνητικού μάρτυρα (exon 5 του p53) (274bp)

A B C D E F G A : Δείκτης μοριακού βάρους (50bp) B : Προϊόν PCR αντίδρασης για τη μελέτη του ανασυνδυασμού των γονιδιακών τμημάτων της βαριάς αλυσίδας της ανοσοσφαιρίνης (IgH) (αρνητικό) C : Μάρτυρας ελέγχου ποιότητας DNA του δείγματος (exon 5 του p53)(274bp) D : Αρνητικός μάρτυρας Ε : Μάρτυρας ελέγχου ποιότητας DNA του θετικού μάρτυρα (exon 5 του p53) (274bp) F : Θετικός μάρτυρας (240-260 bp) G :Μάρτυρας ελέγχου ποιότητας DNA του αρνητικού μάρτυρα (exon 5 του p53) (274bp)

Ενίσχυση (PCR) τμήματος DNA που αντιστοιχεί στο τμήμα VJ της υπερμεταβλητής περιοχής του του γονιδίου TCRγ Οι ανασυνδυασμοί των TCRγ και δ γονιδίων προηγούνται του ανασυνδυασμού του TCRβ και του α. Το προϊόν της PCR (μεγέθους 170-130 bp) οπτικοποιείται με ηλεκτροφόρηση πήκτωμα πολυακρυλαμίδης

A B C D E F G A : Δείκτης μοριακού βάρους (50bp) B : Προϊόν PCR αντίδρασης για τη μελέτη του ανασυνδυασμού των γονιδιακών τμημάτων της γ αλυσίδας του TCR (αρνητικό) C : Μάρτυρας ελέγχου ποιότητας DNA του δείγματος (exon 5 του p53) (274 bp) D : Θετικός μάρτυρας (170-230bp) E : Μάρτυρας ελέγχου ποιότητας DNA του θετικού μάρτυρα (exon 5 του p53) (274 bp) F : Αρνητικός μάρτυρας G : Μάρτυρας ελέγχου ποιότητας DNA του αρνητικού μάρτυρα (exon 5 του p53) (274 bp)

A B C D E F G A : Δείκτης μοριακού βάρους (50bp) B : Προϊόν PCR αντίδρασης για τη μελέτη του ανασυνδυασμού των γονιδιακών τμημάτων της γ αλυσίδας του TCR (θετικό) C : Μάρτυρας ελέγχου ποιότητας DNA του δείγματος (exon 5 του p53) (274 bp) D : Θετικός μάρτυρας (170-230bp) E : Μάρτυρας ελέγχου ποιότητας DNA του θετικού μάρτυρα (exon 5 του p53) (274 bp) F : Αρνητικός μάρτυρας G : Μάρτυρας ελέγχου ποιότητας DNA του αρνητικού μάρτυρα (exon 5 του p53) (274 bp)

Μυκοβακτηριδιακή λοίμωξη M. intracellulare M. avium complex

Επιλογή ιχνηθετών

Βιολογική Συμπεριφορά Τρισωμία 20 υποδηλώνει μετάσταση ορθοκωλικού καρκινώματος στο ήπαρ CHR 20 Τρισωμία των 11 και 17 σχετίζεται με επιθετική βιολογική συμπεριφορά ορθοκωλικού καρκινώματος Μονοσωμία 11 υποδηλώνει μετάσταση ορθοκωλικού καρκινώματος στους λεμφαδένες CHR 11

Στοχευμένη Θεραπεία Πορογενές Καρκίνωμα Μαστού Αδενοκαρκίνωμα Παχέος Εντέρου ΜΜΚ Πνεύμονα

Μεταλλάξεις Καρκίνωμα παχέος εντέρου KRAS Wild type (Codon 12 GGT Codon 13 GGC) KRAS Gly13Asp (GGC>GAC)