Transmembranski transport iona i malih B. Mildner Transmembranski transport iona i malih Plazmatska membrana regulira promet. Osim plinova (O 2 i CO 2 ) i malih hidrofobnih, većina ne može čistom difuzijom prolaziti dovoljno brzo kroz fosfolipidni dvosloj kako bi se zadovoljile stanične potrebe. U membrani različiti transporteri istovremeno i zajednički funkcioniraju te omogućavaju transport tvari. 1
Transmembranski transport iona i malih Relativna permeabilnost različitih kroz čisti fosfolipidni dvosloj. Dvosloj je permeabilan za male hidrofobne molekule i male nenabijene polarne molekule, slabo je propustan za vodu i ureju a gotovo nepropustan za ione i velike polarne molekule. TRANSPORT NEUTRALNIH MOLEKULA KROZ PERMEABILNU MEMBRANU 2
KOLIČINA ENERGIJE POTREBNE ZA TRANSPORT NEUTRALNE SUPSTANCIJE MOŽE SE IZRAČUNATI IZ GRADIJENTA KONCENTRACIJA Opća jednadžba za promjenu slobodne energije u kemijskom procesu za pretvorbu supstrata S u produkt P je: G = G o + RT ln([p] / [S]) Kod transporta supstancije iz koncentracijskog područja c 1 u koncentracijsko područje c 2, G o = 0 (nije došlo do kemijske reakcije!) pa je: G t = RT ln (c 2 /c 1 ) R = plinska konstanta = 8,315 J mol -1 K -1 TRANSPORT IONA KROZ PERMEABILNU MEMBRANU 3
KOLIČINA ENERGIJE POTREBNE ZA TRANSPORT IONA Energija potrebna za transport iona ovisi o membranskom (elektrokemijskom) potencijalu, a to je suma slobodnih energija koncentracijskog i električnog gradijenta G t = RT ln (c 2 /c 1 ) + ZF V Pri čemu je Z = naboj iona, F = Faradayeva konstanta, 96 480 J. V -1. mol -1 V = transmembranski električni potencijal, obično mv Biološke membrane Fosfolipidni dvosloj je osnovna struktura svih bioloških membrana. To je dvodimenzionalni lipidni dvosloj koji se sastoji od dvije vanjske hidrofilne strane i hidrofobne unutrašnjosti. Čisti lipidni dvosloj slabo je propustan za supstancije i ione topljive u vodi. Povećanje permeabilnosti Brzina difuzije, permeabilnost (propusnost) kroz membranu u jedinici vremena: V = P[ A], gdje P koeficijent permeabilnost, a A razlika u koncentracijama između tvari koje su odijeljene membranom. 4
Transmembranski transport iona i malih Tri vrste transmembranskih proteina omogućavaju transport iona, šećera, aminokiselina i drugih metabolita kroz staničnu membranu a to su transporteri, ATP pumpe i kanali. U olakšanoj difuziji, transporter ili specifični ionski kanal, pomažu u kretanju specifičnog supstrata (molekule ili iona) niz njegov koncentracijski gradijent. U aktivnom transportu hidroliza ATP je povezana s prijenosom supstrata suprotno njegovom gradijentu koncentracije. U sekundarnom aktivnom transportu, tzv. ko-transport, transporter povezuje kretanje supstrata suprotno njegovom gradijentu koncentracije s kretanjem drugog supstrata niz njegov gradijent koncentracije. VRSTE TRANSPORTA RAZLIČITIH SUPSTANCIJA KROZ MEMBRANU 5
Transmembranski transport iona i malih Sumarni prikaz mehanizma transporta Transmembranski transport iona i malih Uniportni prijenos glukoze Transport supstancija uniporterima, olakšana difuzija, razlikuje se od jednostavne difuzije kroz lipidni dvosloj: 1) Brzina prijenosa supstancije uniporterima daleko je brža od prijenosa supstancija jednostavnom difuzijom. 2) Transportirana nikada ne ulazi u hidrofobni dvosloj, pa koeficijent particije nije bitan. 3) Transport se odvija pomoću ograničenog broja uniportera. Postoji maksimalna brzina transporta, V max, koja se postiže kada je gradijent koncentracije kroz membranu vrlo velik i tada uniporter radi maksimalnom brzinom. 4) Transport je specifičan. Svaki transporter prenosi samo jednu vrstu ili vrlo srodnih. Mjera afiniteta uniportera za molekulu koja se prenosi (supstrat) je K m, a to je koncentracija supstrata kod koje je brzina ½ V max. 6
PROMJENA SLOBODNE ENERGIJE TIJEKOM PROLASKA HIDROFILNIH SUPSTANCIJA KROZ BIOLOŠKU MEMBRANU Transmembranski transport iona i malih Uniportni prijenos glukoze Uniporteri kao što su transporteri glukoze (GLUT) vjerojatno postoje u dvije različite konformacije u jednoj u kojoj su mjesta vezanja supstrata okrenuta na egzoplazmatsku stranu i jednu u kojoj su vezna mjesta okrenuta na citsolnu stranu. Svi članovi GLUT porodice uniportera, prenose šećere i imaju slične strukture. Razlike u njihovim K m vrijednostima, ekspresija u različitim vrstama stanica, te specifičnost prema supstratima važni su za metabolizam šećera. Dva su uobičajena eksperimentalna sustava za proučavanje transportnih proteina liposomi koji sadrže purificirani transporter ili stanice koje eksprimiraju veću količinu određenog transportnog proteina. 7
Transmembranski transport iona i malih Uniportni prijenos glukoze Model transporta glukoze pomoću GLUT1. U jednoj konformaciji mjesto koje veže glukozu orijentirano je na egzoplazmatski prostor, a u drugoj konformaciji vezno mjesto glukoze orijentirano je prema citosolu. Vezanjem glukoze na mjesto koje je orijentirano prema staničnom okolišu (1) potiče se konformacijska promjena tako da dolazi do promjene orijentacije veznog mjesta i vezno mjesto je orijentirano prema citosolu (2). Glukoza se otpušta u unutrašnjost stanice (3). Na kraju, transporter podliježe konformacijskoj promjeni kojom regenerira početna konformacija veznog mjesta (4). Ako je koncentracija glukoze veća unutar stanice nego u izvanstaničnom okolišu promjene konformacije transportera mogu se odvijati u obratnom smjeru ( od 4 1) pa se transport glukoze odvija iz stanice u stanični medij. Stvarne konformacijske promjene vjerojatno su manje nego što je to prikazano na shemi. PRETPOSTAVLJENA STRUKTURA GLUT1 (PASIVNI TRANSPORTER) 8
DISTRIBUCIJA POLARNIH I NEPOLARNIH BOČNIH ORGANAKA U JEDNOJ α-uzvojnici (AMFIPATSKA UZVOJNICA GLUT1) POVEZIVANJE ČETIRIJU AMFIPATSKIH UZVOJNICA GLUT1 9
Transmembranski transport iona i malih Uniportni prijenos glukoze Prijenos glukoze u stanicu odvija se pomoću GLUT proteina za koje vrijedi jednostavna enzimska kinetika. U ovom prikazu, pretpostavka je da je početna koncentracija glukoze u stanici jednaka nuli. GLUT1 kojeg eksprimiraju eritrociti i GLUT2 koji se nalazi u stanicama jetara jako povećavaju brzinu ulaska glukoze (crvena i smeđa krivulja) u odnosu na ulazak glukoze jednostavnom difuzijom (plava crta).kao i kod enzimski kataliziranih reakcija, GLUT olakšava ulazak glukoze i dostiže se maksimalna brzina (V max ). K m je koncentracija kod koje je brzina prijenosa glukoze polovica maksimalne brzine. m V v = C + max C Km C = koncentracija glukoze u staničnom okolišu Transmembranski transport iona i malih - aktivni transport Ako se kreće suprotno svom gradijentu koncentracije, te je za to potrebna dodatna energija, ovaj transport se naziva aktivnim transportom. Aktivni transport često se vrši na račun hidrolize ATP. Četiri vrste membranskih proteina povezuju energiju koja se dobiva hidrolizom ATP s energijom koja je potrebna za transport supstanci suprotno njihovom gradijentu koncentracije: P-, V-, F-pumpe i ABC proteini. 10
Transmembranski transport iona i malih - aktivni transport Pumpe koje pokreće hidroliza ATP i unutarstanična koncentracija iona (Opis pumpi je na nerednom dijapozitivu) Transmembranski transport iona i malih - aktivni transport Pumpe koje pokreće hidroliza ATP i unutarstanična koncentracija iona P-pumpe su izgrađene od dvije katalitičke α-podjedinice koje se fosforiliraju tijekom transporta iona. Dvije β-podjedinice prisutne su kod nekih P-pumpi i one reguliraju transport. Na prethodnom dijapozitivu, prikazane su samo po jedna α- i jedna β- podjedinica. V- i F-pumpe ne fosforiliraju se tijekom transporta. Obje vrste pumpi transportiraju samo protone. Strukture ovih pumpi su slične, pa tako i sadrže slične proteine, ali niti jedna podjedinica V- ili F-pumpe nije srodna podjedinicama P-pumpi. V-pumpe povezuju hidrolizu ATP s transportom protona suprotno njegovom gradijentu koncentracije, a F-pumpe uobičajeno rade u suprotnom smjeru budući da koriste gradijent koncentracije protona i elektrokemijski gradijent kako bi sintetizirale ATP. Svi članovi superporodice ABC transportera sadrže dvije transmembranske domene (T) i dvije citoplazmatske domene koje povezuju domenu za hidrolizu ATP sa domenama odgovornim za prijenosom tvari. Ove osnovne domene kod nekih ABC pumpi prisutne su kao odvojene podjedinice, dok su kod nekih drugih ABC proteina sve tri domene nalaze u jednom polipeptidu. 11
Transmembranski transport iona i malih Pumpe koje pokreće hidroliza ATP i unutarstanična koncentracija iona P-pumpe-aktivni transport P-pumpe: fosforilacijom α-(katalitičke)-podjedinice i promjenom konformacije dolazi do hidrolize ATP, a oslobođena energija omogućava transport H +, Na +, K + ili Ca 2+ iona. Transmembranski transport iona i malih Pumpe koje pokreće hidroliza ATP i unutarstanična koncentracija iona P-pumpe (aktivni transport) Zajedničkim radom P-pumpi, Na + /K + ATPaza u plazmatskoj membrani te homolognom Ca 2+ ATPazom u membrani sarkoplazmatskog retikula stvara se uobičajena koncentracija iona u životinjskoj stanici velika K +, mala Ca 2+ i mala Na + koncentracija u citosolu, te mala K +, ali velike Ca 2+ i Na + koncentracije u staničnom okolišu. 12
Uloga Na + K + transportera (aktivni transport). U stanicama životinja uloga aktivnih transportera je da se održe intracelularne koncentracije iona i da se istovremeno održava membranski potencijal. Električni potencijal kroz membranu bitan je za signalizaciju u neuronima, a gradijent Na + iona koriste mnogi transporteri za uzvodni kotransport mnogih spojeva. Transmembranski transport iona i malih Pumpe koje pokreće hidroliza ATP i unutarstanična koncentracija iona P-pumpe-aktivni transport Shema rada Ca 2+ ATPaze u sarkoplazmatskom retikulu (SR) stanica mišića. Samo je jedna katalitička α-podjedinica P-pume prikazana. E1 i E2 su dvije različite konformacije u kojima se Ca 2+ može vezati na vezna mjesta koja su dostupna ili s citoplazmatske ili s egzoplazmatske strane. Slijed reakcija 1-6, nužan je za povezivanje hidrolize ATP i transporta Ca 2+ kroz membranu. Na slici ~P označava energijom bogatu aspartil-fosfatnu vezu, a P označava energijom siromašnu vezu. Kako je afinitet Ca 2+ za citoplazmatsko vezno mjesto u E1 tisuću puta veći od afiniteta vezanja Ca 2+ na egzoplazmatsko mjesto u E2, ova pumpa prenosi Ca 2+ u jednom smjeru, tj. iz citoplazme u lumen SR. 13
Ionski kanali U stanicama, plazmatske membrane imaju i kanalne proteine koji omogućavaju da se većina iona (Na +, K +, Ca 2+, i Cl - ) kreće niz koncentracijski gradijent. U životinjskim stanicama membranski potencijal nastaje uglavnom zbog kretanja K + iona kroz nepobuđene, otvorene K + kanale u izvanstanični medij. Za razliku od mnogobrojnih ionskih kanala koji su zatvoreni i imaju vrata koja otvaraju kada se pobude različitim signalima, nepobuđeni ( mirujući ) K + kanali nemaju vrata te su oni stalno otvoreni. Usporedba primarnih struktura ionskih kanala Shaker ime dobiveno po mutantu Drosofile mušica se trese kad se anestezira eterom Jednake boje ukazuju na strukturno slične sekvence natrijevog, kalijevog i kalcijevog kanala. Svaki od ovih proteina četiri puta prolazi kroz membranu (natrijevi i kalcijevi kanali) ili grade tetramere (kalijev kanal). 14
Transmembranski transport iona i malih Otvoreni ionski kanali i potencijal nepobuđene membrane K + kanali izgrađeni su od četiri identične podjedinice od kojih su barem dvije transmembranske domene, i od P segmenta, koji obavija ionsku poru i izgrađuje selektivni filtar. Specifičnost kalijevih kanala nastaje zbog toga što K + ioni selektivno reagiraju s karbonilnim kisikovim ionima specifičnih aminokiselina koje se nalaze u P segmentu i time se smanjuje energija aktivacije koja je potrebna za prolaz K + iona u odnosu na druge ione. Shematski prikaz strukture K + kanala 15
Put K + iona kroz kanal Solvatizirani K + može ući 22 Å u kanal (plavo). Nakon toga pora se sužava (žuto) tako da se uklanja hidratni sloj kako bi K + mogao reagirati s karbonilnim skupinama aminokiselina (crveno) selektivnog filtera (P segment). Selektivni filtar K + kanala (prikazane su dvije od četiri podjedinice) K + reagira s karbonilnim skupinama sekvencija TVGYG (selektivni filter) koji je širine 3 Å u pori kanala. 16
Karakteristike alkalnih kationa Osnove za selektivnost iona Kalijev ion 17
Energetske osnove za selektivnost iona Natrijev ion Na + ion je premalen da bi povoljno reagirao s karbonilima selektivnog filtera pa ne dolazi do prolaska Na + iona kroz kalijev kanal. Model prolaza K + kroz kanal i specifično elektrostatsko odbijanje K + iona u selektivnom filtru Zbog elektrostatskog odbijanja pojedinih K + iona u selektivnom filtru dolazi do pomicanja iona. 18
K + kanali kontrolirani naponom Pozitivno nabijeni peptidni lanci Model ionskog kanala kontroliranog naponom (voltage gating) 19
Model strukture acetilkolinskog receptorskog kanala primjer Na + kanala kontroliranog ligandom Shematski prikaz kako acetilkolin kontrolira otvaranje i zatvaranje kanala 20
Sekundarni aktivni transporteri Transmembranski transport iona i malih održavanje elektrokemijskog gradijenta na plazmatskim membranama Različiti transportni proteini prisutni su u membranama te istovremeno obavljaju transport različitih i iona. Gradijenti su prikazani kao trokuti, a vrhovi trokuta označavaju manju koncentraciju. Na + /K + ATPaza u plazmatskoj membrani koristi energiju dobivenu hidrolizom ATP da pumpa Na + iz stanice, a K + u stanicu. Ovaj transport stvara gradijent koncentracije K +, budući da je koncentracija K + veća u stanici. Izbacivanje pozitivno nabijenih K + iona iz stanice putem K + kanala stvara električni potencijal citosolna strana membrane je negativno nabijena u odnosu na egzoplazmatsku stranu membrane. Transporter Na + i lizina, tipični simporter Na + i aminokiselina, unosi Na + ione zajedno s lizinom u stanicu. Kretanje aminokiseline, lizina, suprotno gradijentu njihove koncentracije, omogućava kretanje Na + iona niz gradijent koncentracije kao i negativni potencijal koji je na unutarnjoj staničnoj membrani te privlači pozitivno nabijene Na + ione. Glavni izvor energije koji omogućava ulazak aminokiselina u stanicu dolazi od hidrolize ATP što provodi Na + /K + ATPaza. Kako ova pumpa stvara gradijente Na + koncentracije, a putom K + kanala nastaje i gradijent električnog potencijala, ulazak Na + iona u stanicu značajno je olakšan. 21
Gradijenti iona ko-transportirane tvari (koja se uvijek prenosi niz gradijent) daju energiju sekundarnim aktivnim transporterima za prijenos druge tvari (prenosi se suprotno svom koncentracijskom gradijentu) Transmembranski transport iona i malih Kotransport pomoću simportera i antiportera Kotransporteri koriste energiju koja se oslobađa prijenosom iona (obično H + ili Na + ) niz njihov elektrokemijski gradijent kako bi omogućili ili ulazak ili izlazak supstrata (malih ili iona) suprotno njihovom gradijentu koncentracije. Stanice koje okružuju tanko crijevo i tubule bubrega eksprimiraju simportere koji povezuju energetski povoljan ulazak Na + kako bi u stanicu prenjeli glukozu ili aminokiseline suprotno njihovom gradijentu koncentracije. 2 Na + out + glukoza out 2 Na + in + glukoza in G = RTln[glukoza in ]/[glukoza out ] +2RTln[Na + in ]/[Na+ out ]+ 2F E 22
Transmembranski transport iona i malih Kotransport pomoću simportera Shema rada 2Na + /1glukoza simportera. Simultano vezanje 2Na + i glukoze odvija se u konformaciji koja je orijentirana u egzoplazmatski prostor (1) i to vezivanje uzrokuje konformacijsku promjenu koja ne dozvoljava da vezani supstrati disociraju s proteina (2). U (3), protein zauzima treću konformaciju i u ovoj konformaciji vezna mjesta supstrata orijentirana su prema citosolu. (4) Disocijacija vezanih Na + i glukoze u citosol, omogućava da se protein vrati u početnu konformaciju (5) koja omogućava da protein započne s prijenosom novih supstrata. Transmembranski transport iona i malih Kotransport pomoću simportera i antiportera Osim simportera, stanica ima različite antiportere. U stanicama srčanog mišića, 3Na + /1Ca 2+ antiporter održava nisku razinu Ca 2+ u citosolu, a ne Ca 2+ ATPaza kao što je to u drugim stanicama. Niska koncentracija Ca 2+ u stanicama mišića je potrebna za relaksaciju mišića, a visoke koncentracije Ca 2+ dovode do kontrakcije mišića. U stanicama kotransporteri reguliraju ph citosola. Na + /H + antiporter iz stanice izbacuje višak protona, a drugi, HCO 3- /Cl - kotransporter u stanicu unosi HCO 3- koja u citosolu disocira i time stvara HO - ione koji podižu ph citosola. Prema pokusima s prugastim ribicama (zebra fish) kao i utvrđivanjem polimorfizma u humanom genomu, ustanovilo se da mutacije u Na + /Ca 2+ kotransporteru određuje boju kože. 23
Transmembranski transport iona i malih Transepitelni transport zajednički rad različitih transportera Transcelularni prijenos glukoze iz crijevne šupljine (lumena) u krv. Na + /K + ATPaza nalazi se na bazolateralnoj strani membrane te stvara koncentracijski gradijent Na + i K + iona (1). Dodatno, K + se iz stanice izbacuje otvorenim kanalom (nije prikazano na shemi) te na citosolnoj strani membrane nastaje negativni membranski potencijal. Koncentracijski gradijent Na + i membranski potencijal koriste se za unos glukoze iz lumena crijeva pomoću 2Na + /glukoza simportera koji se nalazi na apikalnoj strani membrane (2). Glukoza se iz stanice prenosi olakšanom difuzijom koju katalizira GLUT2 koji se nalazi na bazolateralnoj strani membrane. Transmembranski transport iona i malih Transepitelni transport zajednički rad različitih transportera Zajedničkim djelovanjem ugljične anhidraze i četiri druga transportera omogućava se da parietalne stanice želuca izlučuju HCl u lumen želuca a da pri tome ph u citosolu parietalnih stanica bude oko ph 7. 24
Transmembranski transport iona i malih Transepitelni transport zajednički rad različitih transportera Zakiseljavanje lumena želuca provode parietalne stanice. Apikalne membrane ovih stanica sadrže H + /K + ATPazu (Ppumpu) kao i Cl - i K + kanalne proteine. U stanici na apikalnoj membrani postoji kružni tok K + iona. U stanicu K + ione unosi H + /K + ATPaza a iz stanice K + ioni odlaze putem kanala. Na bazolateralnoj strani membrane nalazi se antiporter koji izbacuje HCO 3- i Cl - ione. Zajedničkim djelovanjem četiri različita transportera i ugljične anhidraze zakiseljava se lumen želuca a da pri tome citosol parietalne stanice ostaje neutralnog ph. U stanici tijekom ovog procesa ne nastaje električni potencijal. Shematski prikaz tijesnog spoja (gap junction) 6 koneksina čine molekulu koneksona. Koneksin je član transmembranskih proteina, tako da lanac četiri puta prolazi kroz membranu. Tijesni spoj između dvije stanice čine 2 koneksona (ukupno 12 koneksina). U slojevima stanica i organima moguća je brza izmjena malih spojeva (do 1000 Da) pomoću tzv. tijesnih spojeva. 25
VALINOMICIN IONOFOR KOJI PRENOSI K + IONE KROZ MEMBRANU Prijenosom iona ionofori narušavaju gradijent iona u stanici te time sprečavaju sekundarni aktivni transport drugih supstancija. 26