KDR-le spetsiifilised humaansed antikehad ja nende kasutamine

EE - EP1916001 B1 KDR-le spetsiifilised humaansed antikehad ja nende kasutamine TEHNIKAVALDKOND 5 Leiutis käsitleb humaanseid antikehi, mis seonduvad KDR-iga ja blokeerivad KDR-i seondumist vaskulaarse endoteliaalse kasvufaktoriga (VEGF) ning neutraliseerivad KDR-i aktiveerimist. Antikehi kasutatakse neoplastiliste haiguste ja hüperproliferatiivsete häirete ravis ning neid võib kasutada kas eraldi või kombinatsioonis muude VEGFR-i antagonistide ja epidermaalse kasvufaktori retseptori (EGFR) antagonistidega. TEHNIKA TASE 10 15 20 25 Angiogenees on uute veresoonte arengu ülimalt keeruline protsess, mis hõlmab olemasolevates veresoontes olevate endoteelirakkude proliferatsiooni ja migreerumist ning kudedesse kapillaaride kaudu infiltreerumist, rakkudest tubulaarsete struktuuride moodustumist, uute tekkinud tubulaarsete struktuuride liitumist suletud vaskulaarsüsteemiga ning uute moodustunud kapillaarveresoonte küpsemist. Angiogenees on tähtis nii normaalsetes füsioloogilistes protsessides, sealhulgas embrüonaalne areng, follikulaarne kasv ja haavade paranemine, kui ka patoloogilistes seisundites, nagu tuumori kasvamine, ning mitteneoplastilistes haigustes, millega kaasneb ebanormaalne neovaskularisatsioon, sealhulgas neovaskulaarne glaukoom (Folkman, J. and Klagsbrun, M., Science, 235: 442 7 (1987). Muud haigusseisundid hõlmavad mittepiiravalt neoplastilisi haigusi, mis hõlmavad mittepiiravalt soliidtuumoreid, ateroskleroosi ja muid põletikulisi haigusi, nagu reumatoidartriit, ja oftalmoloogilisi seisundeid, nagu diabeetiline retinopaatia ja ealine makuladegenaratsioon. Seisundeid või haigusi, milles osaleb püsiv või kontrollimatu angiogenees, nimetatakse angiogeneessõltuvateks või angiogeneesiga seonduvateks haigusteks. Üks meetod selliste haiguste ja patoloogiliste seisundite kontrollimiseks hõlmab selliste rakkude, mis vahendavad haigust või seisundit ja põhjustavad seda, verevarustuse piiramist tuumoriga organi osi verega varustavate veresoonte

5 10 15 20 25 30 2 EE - EP1916001 B1 sulgemise teel. Sellised meetodid nõuavad tuumori kohapealset identifitseerimist ja on tavaliselt piiratud kas raviga ühes kohas või väikeses arvus kohtades. Verevarustuse vahetu mehaanilise piiramise täiendavaks puuduseks on kollateraalsete veresoonte moodustumine, mis toimub sageli kiiresti, ja sel moel taastub tuumori verevarustus, Järgmised meetodid on suunatud angiogeneesi reguleerimisega hõlmatud faktorite moduleerimisele. Vaskulaarne endoteliaalne proliferatsioon on tavaliselt märkamatult kulgev ja ülimalt reguleeritud protsess isegi angiogeneesi ajal. VEGF on faktor, mis osaleb in vivo angiogeneesis regulaatorina (Klagsbrun, M. and D'Amore, P., Annual Rev. Physiol., 53: 217 39 (1991)). Endoteelirakkude spetsiifiline mitogeen VEGF toimib angiogeneesi indutseerijana, soodustades spetsiifiliselt endoteelirakkude proliferatsiooni. See on homodimeerne glükoproteiin, mis koosneb kahest 23 kd suurusest subühikust. Kindlaks on tehtud VEGF-i neli erinevat monomeerset isovormi, mis tekivad mrna alternatiivse splaissimise tulemusena. Need hõlmavad kaht membraaniga seotud vormi (VEGF 206 ja VEGF 189) ja kaht lahustuvat vormi (VEGF 165 ja VEGF 121). VEGF 165 on kõige levinum isovorm, mida leidub inimese kõikides kudedes, välja arvatud platsenta. VEGF on ekspresseeritud embrüonaalsetes kudedes (Breier jt, Development, 114: 521 32 (1992)), makrofaagides ja prolifereeruvates epidermaalsetes keratinotsüütides haavade paranemise ajal (Brown jt, J. Exp. Med 176: 1375 9 (1992)) ning võib olla vastutav kudede põletikuga seonduva turse eest (Ferrara jt, Endocr. Rev., 13: 18 32 (1992)). In situ hübridiseerimisuuringutega on näidatud VEGF-i suurt ekspressioonimäära inimeste paljudes tuumoriliinides, sealhulgas glioblastoma multiforme, hemangioblastoomi, kesknärvisüsteemi muude neoplasmade ja aidsiga seonduva Kaposi sarkoomi korral (Plate, K. jt, Nature, 359: 845 8 (1992); Plate, K. jt, Cancer Res., 53: 5822 7 (1993); Berkman, R. jt, J. Clin. Invest., 91: 153 9 (1993); Nakamura, S. jt, AIDS Weekly, 13 (1) (1992)). VEGF-i ekspressiooni suurtes kogustes on samuti leitud aterosklerootilistes kahjustustes, naastudes ja põletikulistes rakkudes. VEGF-i bioloogiline toime on vahendatud suure afiinsusega VEGF-i retseptorite

5 10 15 20 25 30 3 EE - EP1916001 B1 kaudu, mis ekspresseeritakse endoteelirakkudes selektiivselt näiteks embrüogeneesi ajal (Millauer, B. jt, Cell, 72:835-46 (1993)) ja tuumori moodustumisel ning mis osaleb angiogeneesi moduleerimises ja tuumori kasvamises. Need retseptorid sisaldavad türosiinkinaasi tsütosoolset domeeni, mis initsieerib raku kasvamises osaleva signaali ülekandetee. VEGF-i retseptorid on tavaliselt III klassi kuuluvad retseptor-tüüpi türosiinkinaasid, mida iseloomustab mitme, tavaliselt 5 või 7 immunoglobuliinilaadse silmuse olemasolu nende retseptori ligandiga seonduva domeeni ekstratsellulaarses amino-otsas (Kaipainen jt, J. Exp. Med., 178: 2077 88 (1993)). Teised kaks piirkonda hõlmavad transmembraanset piirkonda ja karboksüül-otsalist intratsellulaarset katalüütilist domeeni, mis on katkestatud erineva pikkusega hüdrofiilse interkinaasi järjestuste insertsioonidega, mida nimetatakse kinaasi insertsiooni domeeniks (Terman jt, Oncogene, 6: 1677 83 (1991)). VEGF-i retseptorid hõlmavad fms-taolist türosiinkinaasi retseptorit (flt-1) või VEGFR-1, sekveneeritud Shibuya jt, Oncogene, 5: 519 24 (1990) poolt, kinaasi insertsioonidomeeni sisaldavat retseptorit / loote maksa kinaasi (KDR/flk-1) või VEGFR-2, mida on kirjeldatud patendidokumendis WO 92/14248, registreeritud 20. veebruaril 1992, ja töös Terman jt, Oncogene, 6: 1677 83 (1991) ning sekveneeritud Matthews jt, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9026 30 (1991) poolt, kuigi VEGF-i võivad siduda ka muud retseptorid. Järgmine türosiinkinaasi retseptor VEGFR-3 (flt-4) seondub VEGF-i homoloogidega VEGF-C ja VEGF-D ning on tähtis lümfisõlmede arenemises. VEGF-i vabanemine tuumori massis stimuleerib külgnevates endoteelirakkudes angiogeneesi. Kui VEGFR on ekspresseeritud tuumori massis, siis reguleerivad VEGF+ tuumorirakkudega külgnevad endoteelirakud VEGF-i retseptorite, näiteks VEGFR-1 ja VEGFR-2 ekspressiooni üles. Arvatakse, et KDR/VEGFR-2 on peamine VEGF-i signaali ülekandja, mille tulemuseks on endoteelirakkude proliferatsioon, migreerumine, diferentseerumine, torukeste moodustumine, vaskulaarse läbilaskvuse suurenemine ja vaskulaarse terviklikkuse säilimine. VEGFR-1-l on palju nõrgem aktiivsus kinaasina ja see ei ole võimeline genereerima mitogeenset vastust stimuleerimisel VEGF-i poolt, kuigi seondub VEGF-iga afiinsusega, mis on ligikaudu 10 korda suurem KDR-i omast. VEGFR-1

4 EE - EP1916001 B1 osaleb ka VEGF-i ja platsenta kasvufaktori (PlGF) poolt indutseeritud monotsüütide ja makrofaagide migratsioonis ning koefaktori sünteesis. 5 10 15 20 25 30 VEGFR-2 on suurel määral ekspresseeritud näiteks nendes endoteelirakkudes, mis infiltreeruvad glioomidesse (Plate, K. jt, (1992)) ja on spetsiifiliselt ülesreguleeritud VEGF-i poolt, mida toodetakse inimese glioblastoomides (Plate, K. jt (1993)). VEGFR-2 ekspressiooni suure määra esinemine glioblastoomiga seonduvates endoteelirakkudes (GAEC) viitab sellele, et retseptori aktiivsus on indutseeritud tuumori moodustumise ajal, sest VEGFR-2 transkripte on hädavaevalt võimalik tuvastada aju normaalsetes endoteelirakkudes, mis näitab parakriinse VEGF/VEGFR-i silmuse genereerimist. See ülesreguleerimine on piiratud tuumori vahetus läheduses olevate vaskulaarsete endoteelirakkudega. VEGF-i aktiivsuse blokeerimise tulemuseks neutraliseerimisel anti-vegf-i monoklonaalsete antikehadega (mabs) on inimese tuumori ksenograftide kasvu inhibeerimine karvututel hiirtel (Kim, K. jt, Nature, 362: 841 4 (1993), mis viitab VEGF-i vahetule osale tuumoriga seonduvas angiogeneesis. Seega on VEGFR-i antagonistid välja töötatud vaskulariseeritud tuumorite ja muude angiogeensete haiguste ravimiseks. Need hõlmavad neutraliseerivaid antikehi, mis blokeerivad vaskulaarsetes endoteelirakkudes ekspresseeritud VEGF-i retseptorite signaale, et pärssida tuumori kasvu angiogeneesi blokeerimisega endoteelsõltuva parakriinse silmuse kaudu. Vaadake näiteks USA patenti nr 6 365 157 (Rockwell jt), patendidokumente WO 00/44777 (Zhu jt), WO 01/54723 (Kerbel); WO 01/74296 (Witte jt), WO 01/90192 (Zhu), WO 03/002144 (Zhu) ja and WO 03/000183 (Carmeliet jt). VEGF-i retseptoreid on leitud ka mõnedes mitte-endoteelirakkudes, näiteks tuumorirakkudes, mis toodavad VEGF-i, seejuures on endoteelsõltumatu autokriinne silmus genereeritud tuumori kasvu toetamiseks. Näiteks on VEGF peaaegu alati ekspresseeritud kõikides väljakujunenud leukeemiarakkude liinides ning inimese värskelt isoleeritud leukeemiarakkudes. Lisaks on VEGFR-2 ja VEGFR-1 ekspresseeritud inimese teatavates leukeemiarakkudes. Fielder jt, Blood 89: 1870 5 (1997); Bellamy jt, Cancer Res. 59728 33 (1999). On näidatud, et VEGF-i / humaanse VEGFR-2 autokriinne silmus vahendab leukeemiarakkude ellujäämist ja migratsiooni in vivo. Dias jt, J. Clin. Invest. 106: 511 21 (2000); ja

5 10 5 EE - EP1916001 B1 patendidokument WO 01/74296 (Witte jt). Analoogiliselt on teatatud VEGF-i sünteesist ja VEGFR-i ekspressioonist teatavate soliidtuumorite liinides in vitro. (Vaadake Sato, K. jt, Tohoku J. Exp. Med., 185: 173 84 (1998); Ishii, Y., Nippon Sanka Fujinka Gakkai Zasshi,:47: 133 40 (1995); ja Ferrer, F. A. jt, Urology, 54: 567 72 (1999)). Lisaks on näidatud, et VEGFR-1 Mabs inhibeerib rinnakartsinoomi rakkudes autokriinset VEGFR-i / humaanse VEGFR-1 silmust. Wu jt, "Monoclonal antibody against VEGFR1 inhibits fltl-positive DU4475 human breast tumor growth by a dual mechanism involving anti-angiogenic and tumor cell growth inhibitory activities," AACR NCI EORTC International Conference on MolecularTargets and Cancer Therapeutics, Oct. 29 Nov. 2, 2001, Abstract #7. Töös Lu jt (International Journal of Cancer, NY; USA; Vol. 97, Jan 2002, leheküljed 393 399) teatatakse inimese Fab suure afiinsusega fragmentide isoleerimisest, mis on suunatud antikeha faagiteegist pärineva KDR-i vastu. 15 Seega on olemas vajadus toimeainete järele, mis inhibeerivad VEGF-i retseptori aktiivsust, et ravida või ära hoida VEGF-i retseptorist sõltuvaid haigusi või seisundeid sellega, et inhibeerivad näiteks patogeenset angiogeneesi või tuumori kasvu parakriinse ja/või autokriinse VEGF/VEGFR-i silmuse inhibeerimisega. LEIUTISE KOKKUVÕTE 20 25 30 Leiutises pakutakse välja patendinõudluses määratletud humaansed antikehad ja nende osa, mis seonduvad KDR-iga, blokeerivad vaskulaarse endoteliaalse kasvufaktori (VEGF) seondumise KDR-iga ja neutraliseerivad KDR-i aktiveerimise. Leiutises pakutakse välja isoleeritud antikeha või selle fragment, mis seondub selektiivselt inimese kinaasi insertsioonidomeeni sisaldava retseptoriga (KDR), seejuures hõlmab antikeha või selle fragment komplementaarsust määravaid piirkondi, milleks on CDRL1 korral SEQ ID nr 81; CDRL2 korral SEQ ID nr 82; CDRL3 korral SEQ ID nr 83; CDRH1 korral SEQ ID nr 13; CDRH2 korral SEQ ID nr 14 ja CDRH3 korral SEQ ID nr 15, nagu määratletud patendinõudluses. Eelistatavalt hõlmab leiutisekohane antikeha või selle fragment kerge ahela muutuvat domeeni, milleks on SEQ ID nr 53, ja raske ahela muutuvat domeeni, milleks on SEQ ID nr 24.

6 EE - EP1916001 B1 Leiutisekohane antikeha või selle fragment on eelistatavalt valitud rühmast, kuhu kuuluvad üheahelaline antikeha, Fab, üheahelaline Fv, bivalentne dimeer ja trivalentne trimeer. 5 10 15 Leiutise järgmised aspektid käsitlevad isoleeritud polünukleotiidi, mis hõlmab leiutisekohast antikeha või selle fragmenti kodeerivat nukleotiidjärjestust, SEQ ID nr 52 vastavat polünukleotiidi hõlmavat ekspressioonivektorit ja seda ekspressioonivektorit hõlmavat rekombinantset peremeesrakku. Antikehi kasutatakse neoplastiliste haiguste, sealhulgas näiteks soliid- ja mittesoliidtuumorite ravis. Antikehi võib kasutada ka hüperproliferatiivsete haiguste ravis. Vastavalt sellele pakutakse leiutises välja meetodid KDR-i aktiveerimise neutraliseerimiseks, meetodid tuumori kasvu inhibeerimiseks, sealhulgas tuumoriga seonduva angiogeneesi inhibeerimiseks, ja meetodid muude angiogeneesiga seonduvate haiguste raviks. Samuti pakutakse välja komplektid, mis sisaldavad VEGFR-i retseptoritega seonduvaid humaanseid antikehi või antikehad fragmente. Antikehi võib kasutada eraldi või kombinatsioonis muude VEGFR-i antagonistidega ja/või angiogeneesi inhibiitoritega, nagu epidermaalse kasvufaktori retseptori (EGFR) antagonistid. Samuti pakutakse leiutises välja neid antikehi kodeerivad nukleiinhappemolekulid. 20 25 Lühendid VEGF, vaskulaarne endoteliaalne kasvufaktor; bfgf, peamine fibroblastide kasvufaktor; KDR, kinaasi insertsioonidomeeni sisaldav retseptor (tuntud ka kui VEGF-i retseptor 2); FLK-1, loote maksa kinaas 1; scfv, üheahelaline Fv; HUVEC, inimese nabaveeni endoteelirakud; PBS, 0,01 M fosfaatpuhverdatud soolalahus (ph 7,2); PBST, PBS, mis sisaldab 0,1% Tween-20; AP, aluseline fosfataas; EGF, epidermaalne kasvufaktor; V H ja V L, vastavalt immunoglobuliini raske ja kerge ahela muutuv domeen. JOONISTE LOETELU 30 Joonisel fig 1 on kujutatud humaanse anti-kdr Fab fragmentide identifitseerimine ja ekspressioon. Joonis fig 1A: BstN I lõhustumisteed nelja neutraliseeriva anti-kdr Fab korral. Joonis fig 1B: puhastatud Fab fragmentide SDS-PAGE

7 EE - EP1916001 B1 analüüs mitteredutseerivates tingimustes. Rada 1, D1F7; rada 2, D2C6; rada 3, D1H4; rada 4, D2H2. 5 10 15 20 25 30 Joonisel fig 2 on kujutatud seondumine KDR-iga, KDR/VEGF-i vastastiktoime blokeerimine ja Flk/VEGF-i vastastiktoime blokeerimine humaanse anti-kdr Fab fragmentide poolt. Joonis fig 2A: annusest sõltuv humaanse anti-kdr Fab seondumine immobiliseeritud KDR-iga. Joonis fig 2B: KDR-i ja immobiliseeritud VEGF-i seondumise inhibeerimine anti-kdr Fab poolt. Joonis fig 2C: Flk-1 ja immobiliseeritud VEGF-i seondumise inhibeerimine anti-kdr Fab poolt. Erinevad kogused Fab valke inkubeeriti 1 tund lahuses toatemperatuuril koos kindla koguse KDR-AP (2b) või Flk-1-AP-ga (2C). Joonisel fig 3 on kujutatud anti-kdr Fab fragmentide epitoopide kaardistamine. KDR-AP, selle domeeni deletsiooni-ap variandid ja Flk-1-AP koguti 96-süvendilisele plaadile ja inkubeeriti koos humaanse anti-kdr Fab fragmentidega. Andmed on esitatud Fab fragmentide seondumise suhtes täispikkusega KDR-iga. Joonisel fig 4 on kujutatud VEGF-i indutseeritud HUVEC-i mitogenees humaanse anti-kdr Fab fragmentide poolt. Erinevad kogused anti-kdr Fab fragmente lisati kahes paralleelkatses kasutatud süvenditesse ja inkubeeriti 1 tund temperatuuril 37 C, seejärel lisati süvenditesse VEGF kuni lõppkontsentratsioonini 16 ng/ml. Rakud koguti ja määrati DNA-sse sisseviidud radioaktiivsus. Joonisel fig 5 on kujutatud inimese leukeemiarakkude VEGF-i poolt stimuleeritud migratsioon anti-kdr Fab fragmentide toimel. Joonis fig 5A: VEGF soodustab HL60 ja HEL rakkude migratsiooni annusest sõltuval viisil. Joonis fig 5B: inimese leukeemiarakkude VEGF-i poolt stimuleeritud migratsiooni inhibeerimine anti-kdr Fab fragmentide poolt. KDR-Ap kogus, mis seondub immobiliseeritud VEGF-iga, kvantifitseeriti plaatide inkubeerimisel koos AP substraadiga ja lugemisega lainepikkusel 405 nm. Joonisel fig 6 on kujutatud seondumine KDR-iga ja KDR/VEGF-i vastastiktoime blokeerimine humaanse anti-kdr-i antikehade poolt. Joonis fig 6A: anti-kdr-i annusest sõltuv seondumine immobiliseeritud KDR-iga. Erinevad kogused antikehi

8 EE - EP1916001 B1 inkubeeriti 1 tund toatemperatuuril KDR-iga kaetud 96-süvendilistel plaatidel. Joonis fig 6B: KDR-i seondumise inhibeerimine immobiliseeritud VEGF-iga humaanse anti-kdr-i antikehade poolt. Erinevad kogused antikehi inkubeeriti lahuses 1 tund toatemperatuuril koos kindla koguse KDR-Ap-ga. 5 10 15 20 Joonisel fig 7 on kujutatud VEGF-i seondumine ja HUVEC-i VEGF-i indutseeritud mitogenees. Joonis fig 7A: radiomärgisega VEGF-i seondumise inhibeerimine raku pinnal oleva KDR-iga humaanse anti-kdr-i antikehade poolt. Anti-KDR-i antikehade erinevad kogused segati 2 ng 125 I-märgisega VEGF 165 -ga ja lisati 80 90% ulatuses laatunud HUVEC-rakkude monokihile. Rakke inkubeeriti 2 tundi toatemperatuuril, pesti ja määrati seondunud osa radioaktiivsus. Joonis fig 7B: VEGF-indutseeritud HUVEC-i mitogeneesi inhibeerimine humaanse anti-kdr-i antikehade poolt. Humaanse anti-kdr-i antikehade erinevaid koguseid inkubeeriti 1 tund koos HUVEC-rakkudega, seejärel lisati VEGF. Rakud koguti ja määrati DNA-sse sisseviidud radioaktiivsus. Joonisel fig 8 on kujutatud KDR-i ja VEGF-i ekspressioon inimese leukeemiarakkudes. Joonis fig 8: valitud mrna sisaldus määrati RT-PCR-i abil: Rada 1: molekulmassi markerid: 1000, 850, 650, 500, 400 aluspaari; rada 2: negatiivne kontroll; rada 3: rakud HL60 (promüelotsüütsed); rada 4: rakud HEL (megakarüotsüütsed); rada 5: Rakud U937 (histiotsüütsed); rada 6: HUVEC. Joonis fig. 8B: VEGF-i nõristumine inimese leukeemiarakkudest, mida kultiveeriti koos 10% FCS-i või seerumivabas söötmes. Joonisel fig 9 on kujutatud inimese leukeemiarakkude VEGF-i poolt stimuleeritud migratsioon humaanse anti-kdr-i antikehade toimel. Joonis fig 9A: rakud HL60. Joonid fig 9B: rakud HEL. Joonis fig 9C: rakud U937. 25 Joonisel fig 10 on kujutatud elulemusmäära alusel määratud leukeemia arengu inhibeerimine in vivo. Subletaalse kiirgusdoosi saanud NOD-SCID hiired inokuleeriti 2 x 10 7 rakuga HL60 ja neid raviti intraperitoneaalselt süstitud IMC-1C11, IMC-2C6 või IMC-1121 erinevate annustega. LEIUTISE ÜKSIKASJALIK KIRJELDUS 30 Leiutises pakutakse välja patendinõudlusele vastavad antikehad, mis seonduvad

5 10 9 EE - EP1916001 B1 spetsiifiliselt VEGF -2 ekstratsellulaarse domeeniga (KDR). Antikehad hõlmavad humaanse V H ja V L karkassipiirkondi (FW-sid) ja ka humaanset komplementaarsust määravaid piirkondi (CDR-e). Eelistatavalt on terviklikud V H ja V L muutuvad domeenid humaansed või pärinevad humaansetest järjestustest. Näiteks võib leiutisekohast domeeni saada vere perifeersetest lümfotsüütidest, mis sisaldavad ümberkorraldatud muutuva piirkonna geeni. Alternatiivselt võib muutuva domeeni osi, nagu CDR-i ja FW piirkondi saada erinevatest humaansetest järjestustest. Järgmises näites on humaanse V H muutuv domeen kodeeritud humaanse V H geeni segmendi ja sünteetilise järjestuse poolt CDR3H piirkonna jaoks (see tähendab sünteetilise D H -J H geeni segmendi poolt). Samamoodi võib humaanse V H muutuv domeen olla kodeeritud humaanse V L geeni segmendi ja sünteetilise järjestuse poolt CDR3L-i piirkonna jaoks (see tähendab sünteetilise J L geeni segmendi poolt). 15 20 25 30 Seega hõlmavad leiutisekohased antikehad selliseid antikehi, mille seondumisparameetreid on parendatud otsese mutatsiooni, afiinsusküpsemise meetodite, faagmeetodi või ahelate segamise (chain shuffling) abil. Afiinsust ja spetsiifilisust saab modifitseerida või parendada CDR-ide muteerimise ja antikeha soovitud parameetritega seondumiskohtade skriinimisega (vaadake näiteks Yang jt, J. Mol. Biol., 254: 392 403 (1995)). CDR-e muteeriti erineval moel. Üheks viisiks on üksikute jääkide või jääkide kombinatsioonide randomiseerimine nii, et muus suhtes identsetes antigeeni seondavates saitides leiduvad konkreetsetes positsioonides kõik kakskümmend aminohapet. Alternatiivselt indutseeritakse mutatsioonid CDR-i jääkide laias valikus veaaltide PCR-i meetodite abil (vaadake näiteks Hawkins jt, J. Mol. Biol., 226: 889 896 (1992)). Näiteks võib raske ja kerge ahela muutuva piirkonna geene sisaldavaid faagimeetodi vektoreid kopeerida E. coli mutaatortüvedes (vaadake näiteks Low jt, J. Mol. Biol., 250: 359 368 (1996)). Need mutageneesi meetodid näitlikustavad paljusid eriala asjatundjale tuntud meetodeid. Antikehad seonduvad KDR-iga ja neuraliseerivad aktiveerimist näiteks sel teel, et blokeerivad retseptori dimeriseerumist ja/või VEGF-iga seondumist. Leiutisekohaseid antikehi võib kasutada VEGFR-i aktiveerimise neutraliseerimiseks in vitro või in vivo seondumisel VEGF-i retseptori

10 EE - EP1916001 B1 ekstratsellulaarse domeeniga. VEGF-i retseptori ekstratsellulaarsed domeenid hõlmavad näiteks retseptori ekstratsellulaarse osa ligandi seondavat domeeni. Antikehad inhibeerivad in vivo angiogeneesi ja/või pärsivad tuumori kasvu. 5 10 15 20 25 30 Antikehad on valgud, mis tunnevad ära spetsiifilise antigeeni või aine ja seonduvad sellega. Leiutisekohased antikehad seonduvad KDR-iga vähemalt sama tugevalt kui looduslik ligand. Afiinsus, mida väljendatakse antigeeni ja antikeha tasakaalulise dissotsiatsioonikonstandi (K d ) kaudu, on antigeense determinandi ja antikeha seondumissaidi vahelise sideme tugevuse mõõduks. Aviidsus on antikeha ja selle antigeeni vahelise sideme tugevuse mõõduks. Aviidsus on seotud nii epitoobi ja selle antigeeni seondumissaidi vahelise afiinsuse kui ka antikeha valentsiga. Valents vastab antikeha seondumissaitide arvule, mille jaoks on immunoglobuliinil olemas konkreetne epitoop. Näiteks on monovalentsel antikehal konkreetse epitoobi jaoks üks seondumissait. Antigeenne determinant või epitoop on antigeeni sait, millega antud antikeha seondub. K tavalised väärtused on vahemikus 10 5 kuni 10 11 liiter/mol. Kõiki K väärtusi, mis on väiksemad kui 10 4 liiter/mol, loetakse mittespetsiifilise seondumise kohta käivateks. K pöördväärtust tähistatakse kui K d. (K d võib vaadelda ka dissotsiatsioonikonstandina.) Mida väiksem on K d väärtus, seda tugevam on antigeense determinandi ja antikeha seondumissaidi vaheline side. KDR-i looduslik ligand on humaanne VEGF. VEGF seondub KDR-iga afiinsusega (K d ) ligikaudu 0,93 nm. Selleks, et takistada VEGF-i seondumist KDR-iga, peab anti-kdr-i antikeha seonduma KDR-iga vähemalt sama tugevalt kui VEGF. Teiste sõnadega peab anti-kdr-i antikeha seondumisel KDR-iga edukalt konkureerima VEGF-iga. Antikeha, mille K d on kuni 5 nm, loetakse seonduvat sama tugevalt kui looduslik ligand. Eelistatavalt seonduvad leiutisekohased antikehad KDR-iga afiinsusega, mille väärtus on valdavalt kuni 4 nm, eelistatavamalt afiinsusega, mille väärtus on kuni 3 nm, kõige eelistatavamalt afiinsusega, mille väärtus on kuni 2 nm, ja optimaalselt afiinsusega, mille väärtus on kuni 1 nm. Kahevalentsete antikehade aviidsus on loomulikult afiinsusest suurem. Kahevalentsed antikehad seonduvad KDR-iga aviidsusega, mille väärtus on eelistatavalt suurem kui 0,5 nm, eelistatavamalt suurem kui 0,25 nm ja optimaalselt suurem kui 0,1 nm. Leiutisekohased antikehad neutraliseerivad KDR-i (vaadake näiteid). Siin toodud

11 EE - EP1916001 B1 kirjelduses mõeldakse retseptori neutraliseerimise all retseptorile loomuomase signaali ülekandega seotud kinaasi aktiivsuse vähenemist ja/või selle inaktiveerimist. Usaldusväärne katse KDR-i neutraliseerimise kohta on retseptori fosforüülimise inhibeerimine. 5 10 15 20 25 30 Leiutis ei ole piiratud KDR-i neutraliseerimise ühegi konkreetse mehhanismiga. Ühe antikeha korral toimiv mehhanism ei pruugi tingimata olla sama mis teise korral. Mõned võimalikud mehhanismid hõlmavad VEGF-i ligandi seondumise takistamist KDR-i ekstratsellulaarse seondumisdomeeniga ja retseptorite dimeriseerumise või oligomeriseerumise takistamist. Siiski ei saa välistada ka muid mehhanisme. Leiutisekohased antikehad hõlmavad mittepiiravalt looduslikult esinevaid antikehi, kahevalentseid fragmente nagu (Fab ) 2, monovalentseid fragmente nagu Fab, üheahelalisi antikehi, üheahelalisi Fv-sid (scfv), ühe domeeniga antikehi, polüvalentseid üheahelalisi antikehi, dimeere, trimeere ja teisi nendetaolisi, mis seonduvad spetsiifiliselt antigeenidega. Monovalentsed üheahelalised antikehad (see tähendab scfv) hõlmavad antikeha muutuvat raske ahela fragmenti (V H ), mis on aheldatud antikeha muutuva kerge ahela fragmendiga (V L ) peptiidlinkeri kaudu, mis võimaldab kahe fragmendi assotsieerumist antikeha funktsionaalse seondumissaidi moodustumisega (vaadake näiteks USA patenti nr 4 946 778 (Ladner jt, patendidokumenti WO 88/09344, (Huston jt)). Patendidokumendis WO 92/01047 (McCafferty jt) kirjeldatakse scfv fragmentide avaldamist lahustuvate rekombinantsete geneetiliste pakettide nagu bakteriofaagi pinnal. Üheahelalist linkeriga (L) antikeha võib tähistada kujul V L -L-V H või V H -L-V L. Leiutisekohaste antikehade iga domeen võib olla täieliku antikeha raske või kerge ahela muutuv domeen või looduslikult esineva domeeni funktsionaalne ekvivalent või mutant või derivaat, või sünteetiline domeen, mis on konstrueeritud näiteks in vivo sellisel meetodil, nagu seda on kirjeldatud patendidokumendis WO 93/11236 (Griffiths jt). Näiteks on võimalik kokku liita domeene, mis vastavad antikeha muutuvatele domeenidele, milles puudub vähemalt üks aminohape. Tähtsaks iseloomulikuks tunnuseks on iga domeeni võime assotsieeruda

12 EE - EP1916001 B1 komplementaarse domeeniga ja moodustada antigeeni seondumissait. Seega ei tule termineid muutuv raske/kerge ahela fragment tõlgitseda välistavana selliseid variante, millel puudub materiaalne mõju sellele, kuidas leiutis toimib. 5 10 15 20 25 30 Leiutisekohased funktsionaalsed ekvivalendid hõlmavad polüpeptiide, mille aminohappeline järjestus on põhimõtteliselt sama mis täieliku pikkusega KDR-i antikehade muutuva või hüpermuutuva piirkonna järjestus. Põhimõtteliselt sama aminohappeline järjestus on siin määratletud kui järjestus, mis on vähemalt 705, eelistatavalt vähemalt 80% ja eelistatavamalt vähemalt 90% ulatuses homoloogiline teise aminohappelise järjestusega, mis on määratud FASTA otsingu meetodil töö Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444 8 (1988) järgi. Ühe domeeniga antikehadel on üks muutuv domeen, mis on võimeline efektiivselt seonduma antigeeniga. Tehnika tasemes on tuntud selliste antikehade näited, mille seondumise afiinsus ja spetsiifilisus on eelkõige seotud kas ühe või teise muutuva domeeniga. Vaadake näiteks tööd Jeffrey, P. D. jt, Proc. NatI. Acad. Sci. USA 90: 10310 4 (1993), milles avalikustatakse antidigoksiini antikeha, mis seondub digoksiiniga eelkõige antikeha raske ahela kaudu. Seega saab identifitseerida ühe antikeha domeene, mis seonduvad hästi VEGF-i retseptoritega. Antikeha selliseid domeene võib saada näiteks looduslikult esinevatest antikehadest või Fab või scfv faagimeetodi teekidest. Tuleb mõista, et ühe domeeniga antikeha saamiseks V H ja V L domeeni hõlmavast antikehast võib osutuda soovitavaks väljaspool CDR-i piirkondi teatavate aminohapete asendamine, et saada parem seondumine, ekspressioon või lahustuvus. Näiteks võib osutuda soovitavaks selliste aminohappejääkide modifitseerimine, mis vastasel juhul võivad jääda piirpinna V H -V L sisemusse. Hiljuti leiti kaamellastel (kaamelid, dromedarid, laamad) antikehad, mis on raskete ahelate homodimeerid. Sellistel raskete ahelatega antikehadel on täiesti ilma kergete ahelate ja esimese konstantse domeenita. (Vaadake näiteks Muyldermans, S., 2001, J. Biotechnol. 74: 277 302.) Antikeha vähendatud suurusega seondumisfragmendid on hästi ekspresseeritud bakterites, need seonduvad antigeeniga suure afiinsusega ja on väga stabiilsed. Ühe domeeniga antikehade (see tähendab, et neil on üks muutuv domeen, mis on kerge ahela või raske ahela

5 10 15 20 25 30 13 EE - EP1916001 B1 muutuv domeen) faagimeetoditeeke võib saada ja skriinida samal viisil kui scfv ja Fab teeke. Selliste ühe domeeniga antikehade karkasse saab modifitseerida hiire või inimese muutuvateks domeenideks. Tuleb märkida, et üksiku antikeha domeenid võivad seonduda antigeeniga väga mitmel antigeeniga seondumise viisil. See tähendab, et esmased vastastiktoimed antikeha-antigeen ei ole piiratud V H -V L sisaldavate antikehade CDR-idele vastavate aminohapete jääkidega ja selliste antikehade omaduste optimeerimisel tuleb arvesse võtta seondumisega seotud vastastiktoimeid väljaspool CDR-i jääke. Üheahelalistel antikehadel puuduvad mõned või kõik konstantsed domeenid, mis vastavad nendele antikehadele, millest need on saadud. Seega on võimalik vältida mõningaid probleeme, mis kaasnevad täielike antikehade kasutamisega. Näiteks on üheahelaliste antikehade korral olemas tendents olla vaba raske ahela konstantsete piirkondade ja muude bioloogiliste molekulide vahelistest teatavatest soovimatutest vastastiktoimetest. Lisaks on üheahelalised antikehad terviklikest antikehadest palju väiksemad ja neil võib olla suurem permeaablus kui terviklikel antikehadel, mis võimaldab üheahelalistel antikehadel efektiivsemalt lokaliseeruda ja seonduda märklauaks oleva antigeeni seondumissaidiga. Seega on üheahelalisi antikehi võimalik saada suhteliselt suures mastaabis prokarüootsetes rakkudes, mis soodustab nende tootmist. Lisaks on suhteliselt väikeste mõõtmetega üheahelaliste antikehade korral olemas väiksem tõenäosus retsipiendil soovimatu immuunvastuse esilekutsumiseks kui tervikliku antikeha korral. Üheahelaliste antikehade saamiseks kasutatavad peptiidlinkerid võivad olla painduvad peptiidid, mis on valitud nii, et kindlustada V L ja V H domeenide õige kokkuvoltimine nende aheldatuse korral ja säilitada nii täieliku pikkusega anti-kdr-i antikehale omane spetsiifilisus märklaudmolekuli seondamisel. Tavaliselt võib V L või V H järjestuse karboksüülots olla sellise peptiidlinkeri kaudu seotud kovalentselt komplementaarse V H või V L järjestuse amino-otsaga. Linker koosneb tavaliselt 10 kuni 50 aminohappejäägist. Eelistatavalt koosneb linker 10 kuni 30 aminohappejäägist. Eelistatavamalt koosneb linker 12 kuni 30 aminohappejäägist. Kõige eelistatavamalt koosneb linker 15 kuni 25 aminohappejäägist. Selliste linkerpeptiidide näide hõlmab järjestust (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) 3.

5 10 15 20 25 30 14 EE - EP1916001 B1 Üheahelalised antikehad, milles kõigis on üks V H ja üks V L domeen aheldatud kovalentselt esimese peptiidlinkeriga, võivad olla kovalentselt aheldatud vähemalt ühe täiendava peptiidlinkeriga, et saada polüvalentne üheahelaline antikeha. Polüvalentsed üheahelalised antikehad võimaldavad konstrueerida antikeha selliseid fragmente, millel on tervikliku antikeha afiinsus ja aviidsus, kuid millel puuduvad täieliku pikkusega antikeha konstantsed piirkonnad. Polüvalentsed antikehad võivad olla monospetsiifilised või polüspetsiifilised. Termin spetsiifilisus vastab paljudele antigeensete determinantide erinevatele tüüpidele, millega konkreetne antikeha võib seonduda. Kui antikeha seondub üksnes üht tüüpi antigeense determinandiga, siis on antikeha monospetsiifiline. Kui antikeha seondub erinevat tüüpi antigeensete determinantidega, siis on antikeha polüspetsiifiline. Näiteks võimaldab bispetsiifiline polüvalentne üheahelaline antikeha ära tunda kaht eri tüüpi epitoopi. Mõlemad epitoobid võivad olla KDR-il. Alternatiivselt võib üks epitoop olla KDR-il ja teine epitoop võib olla teisel antigeenil. Polüvalentse üheahelalise antikeha kõik ahelad hõlmavad kerge ahela muutuvat fragmenti ja raske ahela muutuvat fragmenti ning on aheldatud peptiidlinkeri kaudu vähemalt ühe muu ahelaga. Peptiidlinker koosneb vähemalt viieteistkümnest aminohappejäägist. Aminohappejääkide maksimaalne arv on ligikaudu sada. Eelistatava teostuse korral on V L ja V H domeenide arv võrdne. Eelistatavalt aheldab peptiidlinker (L 1 ) V H ja V L domeenid nii, et moodustub ahel ja peptiidlinker (L 2 ) aheldab kaks või enam ahelat nii, et moodustub polüvalentne scfv, millel on põhimõtteliselt sama aminohappeline järjestus. Näiteks võib bivalentne üheahelaline antikeha olla järgmisel kujul: V L -L 1 -V H -L 2 -V L -L 1 -V H ; või V L -L 1 -V H -L 2 -V H -L 1 -V H ; või V H -L 1 -V L -L 2 -V H -L 1 -V L ; või V H -L 1 -V L -L 2 -V L -L 1 -V H. Polüvalentsetel üheahelalistel antikehadel, mis on trivalentsed või suurema valentsiga, on üks või mitu antikeha fragmenti liitunud bivalentseks üheahelaliseks antikehaks täiendavate peptiidlinkerite kaudu. Trivalentse üheahelalise antikeha üheks näiteks on järgmine: V L -L 1 -V H -L 2 -V L -L 1 -V H -L 2 -V L -L 1 -V H.

5 10 15 20 25 30 15 EE - EP1916001 B1 Kaht üheahelalist antikeha saab kombineerida nn diakehaks, mis on tuntud ka kui bivalentne dimeer. Bivalentsetel dimeeridel on kaks ahelat ja kaks seondumissaiti ja need võivad olla kas monospetsiifilised või bispetsiifilised. Bivalentse dimeeri mõlemas ahelas on V L domeeniga seotud V H domeen. Domeenid on ühendatud linkeritega, mis on piisavalt lühikesed selleks, et hoida ära samas ahelas domeenide paardumist ning seega soodustada paardumist erinevate ahelate komplementaarsete domeenide vahel ning luua uuesti kaks antigeeni seondumissaiti. Seega hõlmab bispetsiifilise bivalentse dimeeri üks ahel esimese spetsiifilisusega V H -d ja teise spetsiifilisusega V L -i, kuna teine ahel hõlmab teise spetsiifilisusega V H -d ja esimese spetsiifilisusega V L -i. Peptiidlinker hõlmab vähemalt viit aminohappejääki ning mitte enam kui kümmet aminohappejääki, näiteks (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser), (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) 2. (SEQ ID nr 19.) Bivalentse dimeeri struktuur on jäik ja kompaktne. Antigeeni seondumissaidid paiknevad molekuli vastasotstes. Kolme üheahelalist antikeha võib kombineerida nn triakehadeks, mis on tuntud ka kui kolmevalentsed trimeerid. Trimeerid konstrueeritakse nii, et V L või V H domeeni aminohappeline ots sulandatakse vahetult V L või V H domeeni karboksüülotsaga, see tähendab ilma linkerjärjestust kasutamata. Trivalentsel trimeeril on kolm Fv pead, milles polüpeptiidid paiknevad tsükliliselt pea-saba ühenduses. Trivalentse trimeeri võimalik konformatsioon on planaarne, kolm seondumissaiti paiknevad tasapinnal üksteise suhtes 120-kraadise nurga all. Trivalentsed trimeerid võivad olla monospetsiifilised, bispetsiifilised või trispetsiifilised. Eelistatavalt sisaldavad leiutisekohased antikehad kogu antikeha kõiki kuut komplementaarsust määravat piirkonda, kuigi funktsionaalselt toimivad ka need antikehad, mis sisaldavad vähem selliseid piirkondi nagu kolme, nelja või viit CDR-i. VEGF-i retseptoritega seonduvate antikehade immunogeensuse vähendamiseks pakutakse leiutises välja antikehad, mis hõlmavad humaanseid muutuva ja konstantse domeeni järjestusi. Antikehad on saadud inimestelt pärinevast allikast ja seonduvad KDR-i ekstratsellulaarse domeeniga ning neutraliseerivad retseptori aktiveerimise. Humaanseid antikehi kodeerivat DNA-d võib valmistada humaanseid konstantseid piirkondi kodeeriva DNA kombineerimisel inimestelt

5 16 EE - EP1916001 B1 pärinevaid muutuvaid piirkondi kodeeriva DNA-ga. Näiteks võib leiutisekohaseid antikehi saada teekide skriinimisel, mis sisaldavad humaanse kerge ahela ja raske ahela muutuvate domeenide kombinatsioone. Antikehi ekspresseerivad nukleiinhappeid võib muteerida somaatiliselt või on need natiivsetest B-rakkudest saadud iduteele vastavad järjestused. Humaanseid antikehi kodeerivat DNA-d võib valmistada humaanseid konstantseid piirkondi ja CDR-ist erinevaid muutuvaid piirkondi, mis on valdavalt või eranditult vastava humaanse antikeha piirkondades, kodeeriva DNA kombineerimisel inimeselt pärinevaid CDR-e kodeeriva DNA-ga. 10 15 20 25 30 Antikehade fragmente kodeerivate DNA-de sobivad allikad hõlmavad ükskõik milliseid rakke, nagu hübridoomid ja põrnarakud, mis ekspresseerivad täieliku pikkusega antikeha. Järgmiseks allikaks on üheahelalised antikehad, mis saadakse tehnika tasemes tuntud viisil faagimeetodi teekidest. Leiutisekohased antikehad võivad olla ükskõik millise immunoglobuliini klassi liikmed, nagu IgG, IgM, IgA, IgD või IgE või selliste liikmete kombinatsioonid või nende alamklassid. VEGFR-i seondavate antikehade identifitseerimiseks kasutatav valk on tavaliselt KDR ja see on tavaliselt piiratud KDR-i ekstratsellulaarse domeeniga. KDR-i ekstratsellulaarne domeen võib esineda vabal kujul või olla konjugeeritud muu molekuliga. Allpool toodud suure afiinsusega anti-kdr-i antikehade näited, mis blokeerivad VEGF-i seondumist KDR-iga, isoleeriti humaanse raske ahela ja kerge ahela muutuva piirkonna geenidest konstrueeritud faagimeetodi teegist. Pärast kolmekordset valikut saadud kloonidest olid üle 90% spetsiifilised KDR-i suhtes. Skriinitud Fab-ide seondumisafiinsused KDR-i suhtes olid nm suurusjärgus, mis vastab nende mitme bivalentse anti-kdr-i monoklonaalse antikeha omale, mis saadi hübridoommeetodil. Leiutisekohaseid antikehi võib sulandada täiendavate aminohappejääkidega. Sellisteks jääkideks võib olla peptiidmärgis, näiteks isoleerimise soodustamiseks, või võib selleks olla signaaljärjestus polüpeptiidi sekretsiooniks peremeesrakust

17 EE - EP1916001 B1 pärast sünteesi. Sobivaks kasutatavaks sekretoorseks liiderjärjestuseks on aminohapped, mis on liitunud polüpeptiidi N-otsaga polüpeptiidi suunamiseks tsütosoolist väljapoole. 5 10 15 20 25 30 Samuti pakutakse leiutises välja nukleiinhapped, mis hõlmavad leiutisekohast polüpeptiidi kodeerivat järjestust, ning selliste nukleiinhapete mitmesugused kogumid. Leiutisekohased antikehad neutraliseerivad KDR-I aktiveerimise. KDR-i neutraliseerimismäära üheks mõõduks on retseptori türosiinkinaasi aktiivsuse inhibeerimine. Türosiinkinaasi inhibeerimist võib määrata tuntud meetoditega. Leiutisekohased antikehad põhjustavad tavaliselt fosforüülimisprotsesside inhibeerimist või reguleerivad seda. Seega on fosforüülimise analüüs kasulik selleks, et kindlaks teha leiutise kontekstis kasulikke antikehi. Türosiinkinaasi inhibeerimist võib kindlaks teha kinaasi rekombinantse retseptori autofosforüülimise taseme määramise ja/või looduslike või sünteetiliste substraatide fosforüülimisega. Fosforüülimist võib kindlaks teha näiteks ELISA analüüsis fosfotürosiini suhtes spetsiifilise antikeha kasutamisega või western blot i meetodil. Türosiinkinaasi aktiivsuse analüüsi mõningaid variante on kirjeldatud töödes Panek jt, J. Pharmacol. Exp. Thera, 283: 1433 44 (1997) ja Batley jt, Life Sci., 62: 143 50 (1998). Lisaks võib kasutada valgu ekspressiooni tuvastamiseks mõeldud meetodeid, kus määratavad valgud on reguleeritud KDR-i türosiinkinaasi aktiivsusega. Sellised meetodid hõlmavad immunohistokeemilisi (IHC) meetodeid valgu ekspressiooni tuvastamiseks, fluorestsentshübridisatsiooni in situ (FISH) geeni amplifikatsiooni tuvastamiseks, radioligandi konkureeriva seondumise analüüsi, blottimismeetodeid tahkel maatriksil nagu northern ja southern blot, pöördtranskriptaasi-polümeraasi ahelreaktsiooni (RT-PCR) ja ELISA-t. Vaadake näiteks töid Grandis jt, Cancer, 78: 1284 92. (1996); Shimizu jt, Japan J. Cancer Res., 85: 567 71 (1994); Sauter jt, Am. J. Path.,148: 1047 53 (1996); Collins, Glia, 15: 289 96 (1995); Radinsky jt, Clin. Cancer Res., 1: 19 31 (1995); Petrides jt, Cancer Res., 50: 3934 39 (1990); Hoffmann jt, Anticancer Res., 17: 4419 26 (1997); Wikstrand jt, Cancer Res., 55: 3140 48 (1995).

5 10 15 20 25 30 18 EE - EP1916001 B1 Samuti võib kasutada in vivo analüüsi. Näiteks võib türosiinkinaasi retseptori inhibeerimist täheldada mitogeenses analüüsis, milles kasutatakse retseptori ligandiga stimuleeritud rakuliine inhibiitori manulusel ja ilma selleta. Näiteks võib kasutada VEGFR-i inhibeerimise määramiseks VEGF-iga stimuleeritud HUVEC-i rakke (ATCC). Järgmine meetod hõlmab VEGF-i ekspresseerivate tuumorirakkude kasvu inhibeerimise uurimist näiteks inimese tuumorirakkude hiirele süstimise teel. Vaadake USA patenti nr 6 365 157 (Rockwell jt). Leiutisekohaste meetodite järgi manustatakse seda vajavale imetajale terapeutiliselt toimiv kogus leiutisekohast antikeha. Termin manustamine tähendab siin kasutatuna leiutisekohaste antikehade andmist imetajale ükskõik millisel meetodil, millega võidakse saada soovitud tulemus. Neid võib manustada näiteks intravenoosselt või intramuskulaarselt. Kuigi eelkõige on leiutisekohased humaansed antikehad kasulikud manustamiseks inimestele, võib neid manustada ka teisele imetajale. Termin imetaja hõlmab siin kasutatuna mittepiiravalt inimesi, laboris kasutatavaid katseloomi, koduseid lemmikloomi ja kariloomi. Terapeutiliselt toimiva koguse all mõeldakse leiutisekohase antikeha kogust, mis imetajale manustatuna avaldab efektiivselt soovitud terapeutilise toimet, nagu kinaasi aktiivsuse inhibeerimine. Piirdumata ükskõik millise konkreetse mehhanismiga, hõlmavad toodud meetodiga ravitavad või välditavad haigused ja seisundid näiteks selliseid, mille korral on patogeenne angiogenees või tuumori kasv stimuleeritud VEGFR-i parakriinse ja/või autokriinse silmuse poolt. VEGF-i retseptori aktiveerimise neutraliseerimist endoteeli- või mitte-endoteelirakkudes, nagu tuumorirakkudes, võib läbi viia in vitro või in vivo. VEGF-i retseptoris VEGF-i aktiveerimise neutraliseerimine VEGF-i retseptorit ekspresseerivates rakkudes hõlmab rakkude kokkuviimist antagonistiga, näiteks leiutisekohase antikehaga. Rakud viiakse in vitro kokkupuutesse antagonistiga, näiteks antikehaga enne, korraga või pärast VEGF-i lisamist rakuproovile. In vivo viiakse leiutisekohane antikeha kokkupuutesse VEGF-i retseptoriga manustamisel imetajale, eelistatavalt inimesele. In vivo neutraliseerimise mudel on kasulik imetajal tuumori kasvu, tuumori kasvuga seonduva angiogeneesi või muu

19 EE - EP1916001 B1 angiogeneesiga seonduva patoloogilise seisundi inhibeerimisel. Seega on leiutisekohased antikehad antiangiogeensed ja tuumorivastased immunoterapeutilised toimeained. 5 10 15 20 25 30 Ravitavad tuumorid hõlmavad eelkõige tuumoreid ja metastaatilisi tuumoreid ning ka refraktoorseid tuumoreid. Refraktoorsed tuumorid hõlmavad tuumoreid, mis ei reageeri ravile ainult kemoterapeutiliste toimeainete, ainult antikehade, ainult kiiritusega või nende kombinatsioonidega või on selle suhtes resistentsed. Refraktoorsed tuumorid hõlmavad ka tuumoreid, mis näivalt alluvad ravile selliste toimeainetega, kuid ilmnevad uuesti kuni viie aasta, mõnikord kuni kümne aasta või pikema aja möödumisel ravi katkestamisest. Leiutisekohased antikehad on kasulikud selliste tuumorite ravis, mis ekspresseerivad VEGF-i retseptoreid, eelkõige KDR-i. Sellistele tuumoritele on iseloomulik tundlikkus VEGF-i manuluse suhtes keskkonnas ja need võivad lisaks sünteesida VEGF-i ja olla stimuleeritud selle poolt autokriinses stimulatoorses silmuses. Seetõttu on meetod efektiivne soliid- või mittesoliidtuumori ravis, milles puudub vaskularisatsioon või mis ei ole veel olulisel määral vaskulariseerunud. Sellekohaselt ravitavate soliidtuumorite näited hõlmavad rinnakartsinoomi, kopsukartsinoomi, kolorektaalkartsinoomi, kõhunäärmetuumoreid, glioomi ja lümfoomi. Selliste tuumorite mõned näited hõlmavad epidermoidtuumoreid, skvamoosseid tuumoreid, nagu pea- ja kaelapiirkonna tuumorid, kolorektaaltuumoreid, eesnäärmetuumoreid, rinnatuumoreid, kopsutuumoreid, sealhulgas väikeserakulisi ja mitteväikeserakulisi kopsutuumoreid, kõhunäärmetuumoreid, kilpnäärmetuumoreid, munasarjatuumoreid ja maksatuumoreid. Muud näited hõlmavad Kaposi sarkoomi, KNS-i neoplasmasid, neuroblastoome, kapillaarset hemangioblastoomi, meningioome ja tserebraalmetastaase, melanoomi, mao-soolkonna- ja neerukartsinoome ja sarkoome, rabdomüosarkoomi, glioblastoomi, eelistatavalt glioblastoma multiforme ja leiomüosarkoomi. Vaskulariseerunud nahavähkide näited, mille korral on leiutisekohased antagonistid efektiivsed, hõlmavad skvamoosrakulist kartsinoomi, basaalrakulist kartsinoomi ja selliseid nahavähke, mida saab ravida maliigsete keratinotsüütide, näiteks humaansete maliigsete keratinotsüütide kasvu mahasurumisega.

5 10 20 EE - EP1916001 B1 Mittesoliidtuumorite näited hõlmavad leukeemiat, hulgimüeloomi ja lümfoomi. Leukeemia mõned näited hõlmavad ägedat müeloidleukeemiat (AML), kroonilist müeloidleukeemiat (CML), ägedat lümfotsüütleukeemiat (ALL), kroonilist lümfotsüütleukeemiat (CLL), erotrotsüütleukeemiat või monotsüütleukeemiat. Lümfoomide mõned näited hõlmavad Hodgkini ja mitte-hodkini tõbe. Allpool kirjeldatud eksperimentaalsed tulemused näitavad, et leiutisekohased antikehad blokeerivad leukeemiarakkudes spetsiifiliselt VEGF-i poolt indutseeritud KDR-i (VEGFR-2) stimuleerimise. Ka allpool kirjeldatud in vivo uuringud näitasid, et antikehad olid karvututel hiirtel võimelised olulisel määral inhibeerima tuumori kasvu. VEGF-i retseptori antagonistide, näiteks monoklonaalsete antikehade kokteil tagab tuumorirakkude kasvu inhibeerimiseks eriti efektiivse ravi. Kokteil võib hõlmata mitteantikehalisi VEGFR-i antagoniste ja võib sisaldada vähe, näiteks 2, 3 või 4 retseptori antagonisti, või ka palju, näiteks 6, 8 või 10 antagonisti. 15 20 25 30 Leiutise järgmises aspektis kasutatakse anti-kdr-i antikehi angiogeneesi inhibeerimiseks. Vaskulaarse endoteeli stimuleerimine VEGFR-i poolt on seotud angiogeensete haiguste ja tuumori vaskularisatsiooniga. Tavaliselt stimuleeritakse vaskulaarset endoteeli parakriinselt muudest allikatest (näiteks tuumorirakkudest) pärineva VEGF-i poolt. Seega on humaansed anti-kdr-i antikehad efektiivsed isikute ravis, kellel on vaskulariseerunud tuumorid või neoplasmad või angiogeensed haigused. Sellised tuumorid ja neoplasmad hõlmavad näiteks maliigseid tuumoreid ja neoplasmasid, nagu blastoomid, kartsinoomid või sarkoomid ning ülimalt vaskulaarsed tuumorid ja neoplasmad. Leiutisekohaste meetoditega ravitavad vähkkasvajad hõlmavad näiteks aju, kuse-suguteede, lümfisüsteemi, mao, neeru, käärsoole, kõri ja kopsu ning luu vähkkasvajaid. Järgmised mittepiiravad näited hõlmavad epidermoidtuumoreid, skvamoosseid tuumoreid, nagu pea- ja kaelapiirkonna tuumorid, kolorektaaltuumoreid, eesnäärmetuumoreid, rinnatuumoreid, kopsutuumoreid, sealhulgas kopsude adenokartsinoomi ning väikeserakulisi ja mitteväikeserakulisi kopsutuumoreid, kõhunäärmetuumoreid, kilpnäärmetuumoreid, munasarjatuumoreid ja maksatuumoreid. Samuti kasutatakse meetodit

5 10 15 20 25 30 21 EE - EP1916001 B1 vaskulariseerunud nahavähkide, sealhulgas skvamoosrakulise kartsinoomi, basaalrakulise kartsinoomi ja selliste nahavähkide, mida saab ravida maliigsete keratinotsüütide, näiteks humaansete maliigsete keratinotsüütide kasvu mahasurumisega. Muud ravitavad vähkkasvajad hõlmavad Kaposi sarkoomi, KNS-i neoplasmasid (neuroblastoome, kapillaarset hemangioblastoomi, meningioome ja tserebraalmetastaase), melanoomi, mao-soolkonna- ja neerukartsinoome ja sarkoome, rabdomüosarkoomi, glioblastoomi, eelistatavalt glioblastoma multiforme t ja leiomüosarkoomi. Leiutise järgmine aspekt hõlmab meetodeid selliste patoloogiliste seisundite raviks või ärahoidmiseks, mida iseloomustab ulatuslik angiogenees, millega kaasneb näiteks vaskularisatsioon ja/või põletik, näiteks ateroskleroos, reumatoidartriit (RA), veresoonte läbikasvust tekkinud rohekae, proliferatiivne retinopaatia, sealhulgas proliferatiivne diabeetiline retinopaatia, makuladegeneratsioon, hemangioomid, angiofibroomid ja psoriaas. Mitteneoplasmaliste angiogeensete haiguste muud mittepiiravad näited on enneaegsete laste võrkkestahaigestumus (läätsetagune fibroplaasia), sarvkesta grafti hülgamisreaktsioon, insuliinsõltuv diabeet, sclerosis multiplex, myasthenia gravis, Crohni tõbi, autoimmuunne nefriit, primaarne biliaarne tsirroos, äge pankreatiit, allografti hülgamisreaktsioon, allergiline põletik, kontaktdermatiit ja hilinenud ülitundlikkusreaktsioonid, põletikuline soolehaigus, septiline šokk, osteoporoos, osteoartriit, neuronaalsetest põletikest indutseeritud kognitiivsed häired, Osleri-Weberi sündroom, restenoos ning seentest, parasiitidest ja viirustest põhjustatud infektsioonid, sealhulgas tsütomegaloviirustest põhjustatud infektsioonid. Selliste haiguste kindlakstegemine on lihtne eriala asjatundja teadmiste ja võimetega. Näiteks on VEGF-i retseptori kirjeldatud antikehade manustamine sobiv inimestele, kes kannatavad kliiniliselt olulise neoplasmalise või angiogeense haiguse all või kellel on olemas risk kliiniliselt tähtsate sümptomite väljakujunemiseks. Kogenud raviarst saab lihtsalt kindlaks määrata näiteks kliiniliste testide, füüsikaliste uuringute ja haigusloo / perekonna anamneesi alusel, kas isik on sellise ravi jaoks sobiv kandidaat. Lisaks on hõlmatud ka kirjeldatud antikehade kasutamine in vivo ja in vitro tehnika tasemes tuntud uuringutes või diagnostilistes meetodites.

5 10 15 20 25 30 22 EE - EP1916001 B1 Kirjeldatud anti-kdr-i antikehi võib manustada tuumori või angiogeneesiga seonduva patoloogilise seisundi all kannatavale patsiendile terapeutilise ravi eesmärgil koguses, mis on piisav tuumori või patoloogilise seisundi ärahoidmiseks, inhibeerimiseks või arengu pärssimiseks. Areng hõlmab näiteks kasvu, invasiivsust, metastaase ja/või tuumori või patoloogilise seisundi rekurrentsi. Selleks piisav kogus on määratletud kui terapeutiliselt toimiv annus. Selliseks kasutamiseks mõeldud toimiv annus oleneb haiguse raskusastmest ja patsiendi enda immuunsüsteemi üldisest seisundist. Annustamisrežiim oleneb samuti haigusseisundist ja patsiendi seisundist ning jääb tavaliselt vahemikku üksikust boolusannusest või pidevast infusioonist kuni korduvate manustamisteni päeva jooksul (näiteks iga 4 6 tunni järel) või patsiendi seisundi alusel ja raviarsti juhiste järgi. Tuleb märkida, et leiutis ei ole piiratud annuse ükskõik millise konkreetse väärtusega. Anti-KDR-i antikehi võib manustada kombinatsioonis ühe või mitme kasvajavastase toimeainega. Kombinatsioonravi näiteid vaadake näiteks USA patendist nr 6 217 866 (Schlessinger jt) (Anti-EGFR antibodies in combination with antineoplastic agents); patendidokumendist WO 99/60023 (Waksal jt) (Anti-EGFR antibodies in combination with radiation). Kasutada võib ükskõik millist sobivat antineoplasmalist toimeainet, nagu kemoterapeutiline toimeaine või kiiritusravi. Kemoterapeutiliste toimeainete mittepiiravad näited hõlmavad tsisplatiini, doksorubitsiini, paklitakseeli, irinotekaani (CPT-11), topotekaani või nende kombinatsioone. Kui antineoplasmalise vahendina kasutatakse kiiritusravi, siis võib ravitava patsiendi puhul kasutatav kiirgusallikas olla kas väline (välise kiiritusvihuga kiiritusravi EBRT) või sisemine (brahhüteraapia BT). Antineoplasmalise toimeaine annus oleneb paljudest teguritest, sealhulgas näiteks toimeaine tüübist, ravitava tuumori tüübist ja raskusastmest ning toimeaine manustamisteest. Tuleb rõhutada, et leiutis ei ole piiratud annuse ükskõik millise konkreetse väärtusega. Lisaks võib leiutisekohaseid anti-kdr-i antikehi manustada koos antikehadega, mis neutraliseerivad tuumori kasvu või angiogeneesi kaasatud muid retseptoreid. Selliste retseptorite üheks näiteks on retseptor VEGFR-1/Flt-1. Leiutise ühe teostuse korral kasutatakse anti-kdr-i antikeha kombinatsioonis retseptori

5 10 15 20 25 23 EE - EP1916001 B1 antagonistiga, mis seondub spetsiifiliselt VEGFR-1-ga. Eelkõige on eelistatavad antigeeniga seonduvad valgud, mis seonduvad VEGFR-1 ekstratsellulaarse domeeniga ja blokeerivad selle seondumise ühe või mõlema ligandiga VEGF ja PlGF ja/või neutraliseerivad VEGF-i poolt indutseeritud või PlGF-i poolt indutseeritud VEGFR-1 aktiveerimise. Näiteks on mab 6.12 selline scfv, mis seondub lahustuva ja pinnal ekspresseeritud VEGFR-1-ga. scfv 6.12 hõlmab hiire monoklonaalse antikeha mab 6.12 domeene V L ja V H. Hübridoomrakkude liin, mis sünteesib mab 6.12, on deponeeritud ATCC numbri PTA-3344 all mikroorganismide patendiekspertiisiks deponeerimise rahvusvahelise tunnustamise Budapesti lepingu (Budapesti leping) ja selle põhjal antud määruste alusel. Sellise retseptori järgmiseks näiteks on EGFR. Leiutise ühe teostuse korral kasutatakse anti-kdr-i antikeha kombinatsioonis EGFR-i antagonistiga. EGFR-i antagonistiks võib olla antikeha, mis seondub EGFR-i või EGFR-i ligandiga ja inhibeerib EGFR-i seondumist selle ligandiga. EGFR-i ligandid hõlmavad näiteks EGF-i, TGF-α amfireguliini, hepariinseonduvat EGF-i (HB-EGF) ja beetarekulluliini. Arvatakse, et EGF ja TGF-α on põhilised endogeensed ligandid, mille toime tulemuseks on EGFR-vahendatud stimuleerimine, kuigi on näidatud, et TGF-α on suurema võimega angiogeneesi soodustamisel. Tuleb arvestada, et EGFR-i antagonist võib seonduda väljastpoolt EGFR-i ekstratsellulaarse osaga, mis võib ligandi seondumist inhibeerida või mitte, ning seestpoolt türosiinkinaasi domeeniga. EGFR-iga seonduvate EGFR-i antagonistide näited hõlmavad mittepiiravalt EGFR-i suhtes spetsiifilisi bioloogilisi molekule, nagu antikehad (ja nende funktsionaalsed ekvivalendid), ning väikesi molekule, nagu kinaasi sünteetilised inhibiitorid, mis toimivad vahetult EGFR-i tsütoplasmilise domeeniga. Tuumori geneesi kaasatud kasvufaktori retseptori muudeks näideteks on trombotsüütide kasvufaktori retseptorid (PDGFR), insuliinisarnase kasvufaktori retseptorid (IGFR), närvikasvufaktori retseptorid (NGFR) ja fibroblasti kasvufaktori retseptorid (FGFR). 30 Teostuse täiendava alternatiivi kohaselt võib VEGFR-i antagonisti manustada kombinatsioonis ühe või mitme sobiva adjuvandiga, nagu tsütokiinide (näiteks IL-10 ja IL-13) või muude immunostimulaatoritega. Vaadake näiteks Larrivée jt

24 EE - EP1916001 B1 eespool toodud viide. Siiski tuleb mõista, et üksnes anti-kdr-i antikeha manustamine on piisav selleks, et ära hoida, inhibeerida või pärssida tuumori arengut terapeutiliselt toimival viisil. 5 10 15 20 25 30 Kombinatsioonravis manustatakse anti-kdr-i antikeha enne või pärast algavat ravi muu toimeainega või selle ajal, sama kehtib ka ükskõik millise kombinatsiooni korral, see tähendab enne algavat ravi antineoplasmalise toimeainega ja selle ajal, enne ja pärast seda, selle ajal ja pärast seda või enne, selle ajal ja pärast seda. Näiteks võib anti-kdr-i antikeha manustada 1 kuni 30 päeva jooksul, eelistatavalt 3 kuni 20 päeva jooksul, eelistatavamalt 5 ja 12 päeva jooksul enne algavat kiiritusravi. Leiutisekohaselt võib leiutisekohase anti-kdr-i antikehade manustamiseks kasutada ükskõik millist sobivat meetodit või teed, valikuliselt manustades seda koos antineoplasmaliste toimeainete ja/või muude retseptorite antagonistidega. Manustamisteed hõlmavat näiteks suukaudset, intravenoosset, intraperitoneaalset, subkutaanset või intramuskulaarset manustamist. Antagonisti annus oleneb paljudest teguritest, sealhulgas näiteks antagonisti tüübist, ravitava tuumori tüübist ja raskusastmest ning antagonisti manustamisteest. Tuleb mõista, et leiutis ei ole piiratud ükskõik millise konkreetse manustamisteega. Tuleb märkida, et anti-kdr-i antikeha võib manustada konjugaadina, mis seondub retseptoriga spetsiifiliselt ja toimetab pärast ligandi-toksiini internaliseerumist kohale toksilise letaalse koguse. Tuleb mõista, et leiutisekohased anti-kdr-i antikehad manustatakse imetajatele profülaktilise või raviotstarbelise kasutamise korral koostise kujul, mis sisaldab lisaks farmatseutiliselt vastuvõetavat kandeainet. Sobivad farmatseutiliselt vastuvõetavad kandeained hõlmavad näiteks alltoodutest üht või mitut: vesi, soolalahus, fosfaatpuhverdatud soolalahus, dekstroos, glütserool, etanool ja teised nendetaolised, aga ka nende kombinatsioone. Lisaks võivad farmatseutiliselt vastuvõetavad kandeained sisaldada väikestes kogustes selliseid abiaineid nagu märgumist või emulgeerumist soodustavad ained, säilitusained või puhverdavad ained, mis suurendavad seonduvate valkude säilitusaega ja efektiivsust. Süstimiseks kasutatavaid koostiseid võib tehnika tasemes tuntud viisil valmistada

25 EE - EP1916001 B1 nii, et need tagavad pärast imetajale manustamist toimeaine kiire, pideva või viivitatult vabanemise. 5 10 Samuti pakutakse välja tuumori kasvu ja/või angiogeneesi inhibeerimiseks mõeldud komplektid, mis sisaldavad humaanse anti-kdr-i antikeha terapeutiliselt toimivat kogust. Komplektid võivad lisaks sisaldada ükskõik millist sobivat antagonisti, näiteks tuumori geneesi või angiogeneesi kaasatud muu kasvufaktori (näiteks eespool kirjeldatud VEGFR-1/Flt-1, EGFR, PDGFR, IGFR, NGFR, FGFR jms) retseptori jaoks. Komplekt võib alternatiivselt või täiendavalt sisaldada kasvajavastast toimeainet. Leiutise kontekstis sobivaid kasvajavastaseid toimeaineid on siin kirjeldatud. Leiutisekohased komplektid võivad lisaks sisaldada adjuvant, nende näiteid on samuti kirjeldatud eespool. Leiutisekohane anti-kdr-i antikeha võib olla keemiliselt või biosünteetiliselt aheldatud ühe või mitme antineoplasmalise või antiangiogeense toimeainega. 15 20 25 Lisaks käsitletakse anti-kdr-i antikehi, millega on aheldatud märklaud- või reporterstruktuuriühikud. Märklaudstruktuuriühikud on seonduvate paaride esimesed liikmed. Kasvajavastased toimeained on näiteks konjugeeritud selliste paaride teise liikmega ja suunatakse seetõttu kohtadesse, kus on seondunud anti-kdr-i antikeha. Sellise seonduva paari tavaliseks näiteks on avidiin ja biotiin. Biotiin on konjugeeritud anti-kdr-i antikehaga ja kujutab seetõttu märklauda kasvajavastase toimeaine või muu struktuuriühiku jaoks, mis on konjugeeritud avidiini või streptavidiiniga. Alternatiivselt on biotiin või muu selletaoline struktuuriühik aheldatud leiutisekohase anti-kdr-i antikehaga ja seda kasutatakse näiteks reporterina diagnostikasüsteemis, kus määratav signaali tekitav toimeaine on konjugeeritud avidiini või streptavidiiniga. Seega võib retseptori antagoniste kasutada in vivo ja in vitro tehnika tasemes tuntud uurimis-, diagnostika-, ravimeetodites või profülaktilistel eesmärkidel. NÄITED 30 Allpool toodud näited ja võrdlusnäited on mõeldud leiutise paremaks mõistmiseks, kuid need ei ole mõeldud leiutist piiravatena ja neid ei tohi sellisena võtta. Näited ei sisalda üksikasjalikke kirjeldusi selliste tavaliste meetodite kohta, mida

5 26 EE - EP1916001 B1 kasutatakse vektorite ja plasmiidide konstrueerimiseks, sellistesse vektoritesse ja plasmiididesse polüpeptiide kodeerivate geenide insertsiooniks või plasmiidide viimiseks peremeesrakkudesse. Sellised meetodid on eriala asjatundjatele hästi tuntud ja neid on kirjeldatud arvukates publikatsioonides, sealhulgas raamatus Sambrook, J., and Russell, D. W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3 rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Näide I. Näide I(a). Humaanse Fab saamine Valgud ja rakuliinid. 10 15 Esmaselt kultiveeritud HUVEC saadi dr S. Rafii käest, Cornell Medical Center, ja seda säilitati söötmes EBM-2 (Clonetics, Walkersville, MD) temperatuuril 37 C, keskkonnas 5% CO 2. Lahustuv sulandvalk, KDR-aluseline fosfataas (AP), selle immunoglobuliini (Ig) domeen-deleteeritud variandid ja FIk-1-AP ekspresseeriti püsivalt transfekteeritud NIH 3T3-s ja puhastati rakukultuuri supernatantidest afiinsuskromatograafiliselt, milleks kasutati immobiliseeritud monoklonaalset antikeha AP jaoks vastavalt töös Lu jt, J. Biol. Chem. 275: 14321 30 (2000) toodud kirjeldusele. Valk VEGF 165 ekspresseeriti bakuloviiruses ja puhastati vastavalt töös Zhu jt, Cancer Res. 58: 3209 14 (1998) toodud kirjeldusele. Leukeemiarakkude liinid HL60 ja HEL säilitati söötmes RPMI, mis sisaldas 10% veiselooteseerumit. 20 Näide I(b). Faagi analüüs ELISA meetodil. 25 30 Valiti välja üksikud TG1 kloonid ja neid kasvatati temperatuuril 37 C 96-süvendilistel plaatidel ning vabastati vastavalt eespool kirjeldatule helper-faagiga M13K07. Amplifitseeritud faagipreparaat blokeeriti 1/6 mahuosa seguga 18% piim/pbs toatemperatuuril 1 tunni jooksul ning lisati Maxi-sorp 96-süvendilistele mikrotiiterplaatidele (Nunc), mis olid kaetud KDR-AP või AP-ga (1 µg/ml x 100 µl). Pärast 1 tund kestnud inkubeerimist toatemperatuuril pesti plaate 3 korda PBST-ga ja inkubeeriti küüliku anti-m13 faagi ja HPR-i konjugaadiga (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Plaate pesti 5 korda, lisati TMB peroksidaasi substraat (KPL, Gaithersburg, MD) ja määrati neelduvus lainepikkusel 450 nm mikroplaadi lugemisseadme (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) abil.

27 EE - EP1916001 B1 Näide I(c). DNA BstN l struktuurianalüüs ja nukleotiidi järjestamine. 5 Pärast iga valikuringi analüüsiti anti-kdr Fab kloonide mitmekesisust restriktsiooniensüümiga lõhustatud struktuuride (see tähendab DNA sõrmejälgede) abil. Fab geeni sisend üksikutes kloonides amplifitseeriti PCR-i meetodil praimerite abil: pöörd-puc19, 5' AGCGGATAACAATTTCACACAGG 3'; ja fdtet seq, 5' GTCGTCTTTCCAGACGTTAGT 3'. Amplifitseeritud saadus lõhustati restriktsiooniensüümiga BstN I ja analüüsiti 3% agaroosgeelil. Kõikidest lõhustamistest saadud esinduslike kloonide DNA järjestused määrati dideoksünukleotiidide järjestamise alusel. 10 Näide I(d). Lahustuvate Fab fragmentide ekspressioon ja puhastamine. 15 20 Üksikute kloonide plasmiide kasutati mittesupressor E. coli peremehe HB2151 transformeerimiseks. Fab fragmentide ekspressioon HB2151-s indutseeriti rakkude kultiveerimisega söötmes 2YTA, mis sisaldas 1 mm isopropüül-1-tio-β-d galaktopüranosiidi (IPTG, Sigma) temperatuuril 30 C. Rakkudest valmistati periplasmiline ekstrakt rakusademe resuspendeerimisel 25 mm Tris-puhvris (ph 7,5), mis sisaldas 20 massi-mahuprotsenti sahharoosi, 200 mm NaCl, 1 mm EDTA ja 0,1 mm PMSF-i, millele järgnes inkubeerimine 1 tunni jooksul temperatuuril 4 C ettevaatliku loksutamisega. Pärast 15-minutilist tsentrifuugimist 15 000 p/min tingimustes puhastati lahustuv Fab valk supernatandist afiinsuskromatograafiliselt kolonni Protein G abil vastaval tootja juhistele (Amersham Pharmacia Biotech.). Näide 1(e). Humaanse anti-kdr Fab valik faagmeetodi teegist. 25 30 Valikuks kasutati suurt humaanse Fab faagmeetodi teeki, mis sisaldas 3,7 x 10 10 klooni (DeHaard jt, J. Biol. Chem. 274: 18218 30 (1999)). Teek sisaldas PCR-amplifitseeritud antikeha muutuvaid kerge ahela geene ja muutuvaid raske ahela geene, mis olid sulandatud vastavalt humaanse konstantse kerge ahela geenide (Κ ja λ) ja IgG1 raske ahela domeeni C H 1 kodeeriva DNA-ga. Nii raske kui kerge ahela konstruktidele eelnes signaaljärjestus kerge ahela korral peb ja raske ahela korral geeni III signaaljärjestus. Raske ahela konstruktid kodeerisid lisaks geeni III valgu osa faagmeetodi jaoks, heksahistidiinmärgist ja 11 aminohappe pikkust c-muc märgist, millele järgnes amber koodon (TAG).

5 10 15 20 25 30 28 EE - EP1916001 B1 Heksahistidiin- ja c-myc märgiseid võib kasutada kas puhastamiseks või tuvastamiseks. Amber koodon võimaldab faagmeetodi kasutada supressor-peremehi (nagu TG1 rakud) või sünteesida Fab fragmente lahustuval kujul pärast transformeerimist mittesupressor-peremehesse (nagu HB 2151 rakud). Teegi varu kasvatati kuni log-faasini, vabastati helper-faagiga M13-K07 ja amplifitseeriti öö läbi söötmes 2YTAK (2YT, mis sisaldas 100 µg/ml ampitsilliini ja 50 µg/ml kanamütsiini) temperatuuril 30 C. Faagipreparaat sadestati segus 4% PEG / 0,5 M NaCl, resuspendeeriti segus 3% rasvatu piim/pbs, mis sisaldas 500 µg/ml AP valku ja inkubeeriti 1 tund temperatuuril 37 C, et saada faagmeetodil anti-ap Fab fragmente ja blokeerida muud mittespetsiifilised seondumised. KDR-AP-ga (10 µg/ml PBS-is) kaetud Maxisorp Star katseklaasid (Nunc, Roskilde, Taani) blokeeriti esmalt 1 tunni jooksul seguga 3% piim/pbs temperatuuril 37 C ja inkubeeriti seejärel koos faagipreparaadiga 1 tund toatemperatuuril. Katseklaase pesti 10 korda PBST-ga (PBS, mis sisaldas 0,1% Tween-20) ja seejärel 10 korda PBS-iga. Mõlemaid faage elueeriti toatemperatuuril 10 minuti jooksul 1 ml värskelt valmistatud 100 mm trietüülamiini (Sigma, St. Louis, MO). lahusega. Elueeritud faage inkubeeriti 10 ml log-faasi keskosas olevate TG1 rakkudega temperatuuril 37 C 30 minutit statsionaarses režiimis ja 30 minutit loksutamise tingimustes. Nakatatud TG1 rakud sadestati ja kanti mitmele suurele 2YTAG plaadile ning inkubeeriti öö läbi temperatuuril 37 C. Kõik plaatidel kasvanud kolooniad pühiti 3 5 ml söötmesse 2YTA, segati gütserooliga (lõppkontsentratsioon 10%), valmistati alikvoodid ja säilitati temperatuuril 70 C. Valiku järgmise ringi jaoks lisati 100 µl faagi varulahust 25 ml söötmele 2YTAG ja kasvatati kuni log-faasi keskosa saabumiseni. Kultuur vabastati helper-faagiga M13K07, amplifitseeriti, sadestati ja kasutati ülakirjeldatud protseduuri kohaseks valikuks, milles kasutati immunokatseklaasi immobiliseeritud KDR-AP väiksemaid kontsentratsioone ja suuremat arvu pesemisi pärast seondumisprotsessi. Immobiliseeritud KDR-il tehti kokku kolm ringi valikuid, seejuures muudeti valgu kontsentratsiooni ja pesemiste arvu pärast esialgset seondumisprotsessi. Pärast valiku iga ringi valiti juhuslikult 93 klooni ja analüüsiti KDR-iga seondumist faagi

5 10 15 29 EE - EP1916001 B1 ELISA meetodil. Pärast teist valikut valiti 93 kloonist välja seitsekümmend (75%) ja pärast kolmandat valikut saadud kloonidest oli neist enam kui 90% positiivsed seondumisel KDR-iga, mis näitav valikuprotsessi suurt efektiivsust. Kõikide teises valikus identifitseeritud 70 seondujast pärineva Fab-d kodeeriva DNA segmendid amplifitseeriti, lõhustati BstN I-ga ja võrreldi nende sõrmejälgede struktuuri. Kokku saadi 42 erinevat struktuuri, mis näitab isoleeritud anti-kdr Fab suurepärast mitmekesisust. Ristreaktiivsuse uurimine näitas, et 42 antikehast olid 19 spetsiifiliselt seonduvad KDR-iga, kuna ülejäänud 23 antikeha seondusid nii KDR-i kui ka selle hiirest pärineva homoloogiga Flk-1. Täiendavaks valikuks kasutati konkureeriva seondumise katset VEGF-iga, mille käigus määrati lahustuva KDR-i seondumine immobiliseeritud VEGF-iga anti-kdr Fab fragmentide manulusel ja ilma nendeta. Selles katses identifitseeriti neli Fab klooni, mis olid võimelised blokeerima VEGF-i seondumist KDR-iga. Neist kolm olid spetsiifiliselt seonduvad KDR-iga ja üks andis ristreaktsiooni Flk-1-ga. DNA sõrmejälgede ja järjestuse analüüs kinnitas, et kõik neli KDR/VEGF blokeerivat antikeha olid erinevad (joonis fig 1A) ainulaadse DNA ja aminohappelise järjestusega. Nelja võrdlusnäite klooni V H ja V L aminohappelised järjestused CDR1, CDR2 ja CDR3 jaoks on toodud tabelis 1. Tabel 1 Valitud KDR-seonduvate humaansete Fab CDR järjestused Kloon CDR1 CDR2 CDR3 Kerge ahel D2C6 RASQSVSSYLA (SEQ ID nr 1) DSSNRAT (SEQ ID nr 2) LQHNTFPFT (SEQ ID nr 3) D2H2 RASQGISSRLA (SEQ ID nr 4) AASSLQT (SEQ ID nr 5) QQANRFPPT (SEQ ID nr 6) DIH4 AGTTTDLTYYDLVS (SEQ ID nr 7) DGNKRPS (SEQ ID nr 8) NSYVSSRFYV (SEQ ID nr 9) D1F7 SGBTSWGTNTAN (SEQ ID nr 10 NNNQRPS (SEQ ID nr 11) AAWDDSLNGHWV (SEQ ID nr 12)

30 EE - EP1916001 B1 (jätkub) Raske ahel D2C6 GFTFSSYSMN (SEQ ID nr 13 D2H2 GFTFSSYSMN (SEQ ID nr 13) D1H4 GFTFSSYSMN (SEQ ID nr 13) D1F7 GGTFSSYAIS (SEQ ID nr 16) SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID nr 14) SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID nr 14) SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID nr 14) GGHFIFGTANYAQKFQG (SEQ ID nr 17) VTDAFDI (SEQ ID nr 15) VTDAFDI (SEQ ID nr 15) VTDAFDI (SEQ ID nr 15) GYDYYDSSGVASPPD Y (SEQ ID nr 18 5 V H ja V L ahelate täielikud järjestused on toodud järjestuste loetelus. Võrdlusnäite D1F7 korral on V H nukleotiidsed ja aminohappelised järjestused vastavalt SEQ ID nr 19 ja 20 ning V L nukleotiidsed ja aminohappelised järjestused on vastavalt SEQ ID nr 21 ja 22. Võrdlusnäite D2C6 korral on V H nukleotiidsed ja aminohappelised järjestused vastavalt SEQ ID nr 23 ja 24 ning V L nukleotiidsed ja aminohappelised järjestused on vastavalt SEQ ID nr 25 ja 26. 10 Võrdlusnäite D2H2 korral on V H nukleotiidsed ja aminohappelised järjestused vastavalt SEQ ID nr 30 ja 31 ning V L nukleotiidsed ja aminohappelised järjestused on vastavalt SEQ ID nr 32 ja 33. Võrdlusnäite D1H4 korral on V H nukleotiidsed ja aminohappelised järjestused vastavalt SEQ ID nr 27 ja 24 ning V L nukleotiidsed ja aminohappelised järjestused on vastavalt SEQ ID nr 28 ja 29. 15 Teine võrdlusnäidete teek koostati võrdlusnäite D2C6 üksiku raske ahela kombineerimisel originaalteegist saadud kergete ahelate mitmekesise populatsiooniga. Identifitseeriti kümme täiendavat Fab-d, mille tähistused on SA1, SA3, SB10, SB5, SC7, SD2, SD5, SF2, SF7 ja 1121. Kümne Fab V L nukleotiidsed ja aminohappelised järjestused on järgmised.

31 EE - EP1916001 B1 Võrdlusnäite SA1 korral on V L nukleotiidsed ja aminohappelised järjestused SEQ ID nr 34 ja 35. Võrdlusnäite SA3 korral on V L nukleotiidsed ja aminohappelised järjestused SEQ ID nr 36 ja 37. 5 Võrdlusnäite SB10 korral on V L nukleotiidsed ja aminohappelised järjestused SEQ ID nr 38 ja 39. Võrdlusnäite SB5 korral on V L nukleotiidsed ja aminohappelised järjestused SEQ ID nr 40 ja 41. 10 Võrdlusnäite SC7 korral on V L nukleotiidsed ja aminohappelised järjestused SEQ ID nr 42 ja 43. Võrdlusnäite SD2 korral on V L nukleotiidsed ja aminohappelised järjestused SEQ ID nr 44 ja 45. Võrdlusnäite SD5 korral on V L nukleotiidsed ja aminohappelised järjestused SEQ ID nr 46 ja 47. 15 Võrdlusnäite SF2 korral on V L nukleotiidsed ja aminohappelised järjestused SEQ ID nr 48 ja 49. Võrdlusnäite SF7 korral on V L nukleotiidsed ja aminohappelised järjestused SEQ ID nr 50 ja 51. 20 Näite 1121 korral on V L nukleotiidsed ja aminohappelised järjestused SEQ ID nr 52 ja 53. V L CDR järjestused on toodud tabelis 2.

32 EE - EP1916001 B1 Tabel 2 KDR-seonduvate humaansete Fab kergete ahelate CDR järjestused Kloon CDR1 CDR2 CDR3 SA1 TGSHSNFGAGTDV (SEQ ID nr 54) GDSNRPS (SEQ ID nr 55) QSYDYGLRGWV (SEQ ID nr 56) SA3 RASQNINNYLN (SEQ ID nr 57) AASTLQS (SEQ ID nr 58) QQYSRYPPT (SEQ ID nr 59) SB10 TGSSTDVGNYNYIS (SEQ ID nr 60) DVTSRPS (SEQ ID nr 61) NSYSATDTLV (SEQ ID nr 52) SBS TGQSSNIGADYDVH (SEQ ID nr 63) GHNNRPS (SEQ ID nr 64) QSYDSSLSGLV (SEQ ID nr 65) SC7 RASQDISSWLA (SEQ ID nr 66) AASLLQS (SEQ ID nr 67) QQADSFPPT (SEQ ID nr 68) SD2 RASQSIKRWLA (SEQ ID nr 69) AASTLQS (SEQ ID nr 70) QQANSFPPT (SEQ ID nr 71) SD5 SGSRSNIGAEHYEVQ (SEQ ID nr 72) GDTNRPS (SEQ ID nr 73) QSYDTSLRGPV (SEQ ID nr 74) SF2 TGSSSNIGTGYDVH (SEQ ID nr 75) AYTNRPS (SEQ ID nr 76) QSFDDSLNGLV (SEQ ID nr 77) SF7 TGSHSNFGAGTDVH (SEQ ID nr 78) GDTHRPS (SEQ ID nr 79) QSYDYGLRGWV (SEQ ID nr 80) 1121 RASQGIDNWLG (SEQ ID nr 81) DASMLDT (SEQ ID nr 82) QQAKAFPPT (SEQ ID nr 83) Võrdlusnäide II Katsed Võrdlusnäide II(a). KDR-i seondumise ja KDR/VEGF-i vastastiktoime blokeerimise kvantitatiivne analüüs 5 Vahetu seondumise katses lisati lahustuvate Fab valkude erinevad kogused KDR-iga kaetud 96-süvendilistele Maxi-sorp mikrotiiterplaatidele ja inkubeeriti 1 tund toatemperatuuril, seejärel pesti plaate 3 korda PBST-ga. Seejärel inkubeeriti plaate 1 tund toatemperatuuril 100 µl küüliku anti-humaanse Fab antikeha ja HRP

5 10 15 20 25 33 EE - EP1916001 B1 konjugaadiga (Jackson ImmunoResearch Laboratory Inc., West Grove, PA). Plaate pesti ja ilmutati eespool faagi ELISA analüüsi juures kirjeldatud protseduuri kohaselt. Konkureeriva KDR/VEGF-i blokeerimise katses segati Fab valkude erinevad kogused kindla koguse KDR-AP-ga (100 ng) ja inkubeeriti 1 tund toatemperatuuril. Seejärel kanti segud eelnevalt VEGF 165 kaetud 96-süvendilistele mikrotiiterplaatidele (200 ng/süvend) ja inkubeeriti veel 2 tundi toatemperatuuril, seejärel pesti plaate 5 korda ja lisati AP substraat (p-nitrofenüülfosfaat, Sigma). Seondunud KDR-AP molekulide (8) kvantifitseerimiseks määrati neelduvus lainepikkusel 405 nm. Seejärel arvutati IC 50, see tähendab Fab valgu kontsentratsioon, mis on vajalik KDR-i ja VEGF-i seondumise inhibeerimiseks 50% ulatuses. Neli VEGF-i blokeerivat klooni (D2C6, D2H2, D1H4, D1H7) ekspresseeriti lahustuva Fab kujul ja puhastati E. coli periplasmilistest ekstraktidest Protein G kolonnis afiinsuskromatograafiliselt. Nende kloonide puhastatud Fab valkude saagis oli vahemikus 60 kuni 400 µg ühe liitri kultuuri kohta. Kõikide puhastatud Fab preparaatide korral saadi SDS-PAGE analüüsis üks oodatava molekulmassiga valgu riba (joonis 1B). Joonisel fig 2 on kujutatud anti-kdr Fab fragmentide annusest sõltuv seondumine immobiliseeritud retseptoriga, mis määrati otsese seondumise korral ELISA meetodil. Kõige efektiivsemad seondajad olid kloonid D2C6 ja D2H2, neile järgnesid kloonid D1H4 ja D1F7. Seega blokeerisid kõik neli klooni KDR-i seondumist immobiliseeritud VEGF-iga (joonis fig 2B). KDR-i ja VEGF-i seondumise inhibeerimiseks 50% ulatuses vajalikud antikeha kontsentratsioonid olid kloonide D2C6, D2H2 ja D1H4 korral ligikaudu 2 nm ning klooni D1F7 korral 20 nm. VEGF-i ja Flk-1 seondumist blokeeris üksnes kloon D1F7 (joonis 2C), IC 50 väärtus oli ligikaudu 15 nm. Võrdlusnäide II(b). Lahustuva scfv analüüs BIAcore meetodil. 30 Lahustuvate Fab valkude ja KDR-i seondumise kineetika määrati pinnaplasmonresonantsi meetodil BIAcore bioanduri abil (Pharmacia Biosensor). KDR-AP sulandvalk immobiliseeriti anduri kiibil ja sinna süstiti lahustuvaid Fab valke kontsentratsioonide vahemikus 1,5 nm kuni 100 nm. Kõikidel

34 EE - EP1916001 B1 kontsentratsioonidel registreeriti anduri signaalid ja kiiruskonstantide k on ja k off väärtused hinnati programmi BIA Evaluation 2.0 abil. K d väärtus arvutati kiiruskonstantide suhtes k off /k on. 5 10 Kõik kolm KDR-spetsiifilist Fab fragmenti seonduvad immobiliseeritud retseptoriga, K d väärtused on vahemikus 2 kuni 4 nm (tabel 3). Ristreageeriva klooni D1F7 korral on K d 45 nm, mis ligikaudu 10 kuni 15 korda halvem tulemus kui KDR-spetsiifiliste kloonide korral saadu. On märkimisväärne, et kuigi kolme KDR-spetsiifilise Fab fragmendi korral on K d väärtused lähedased, on seondumise konkreetne kineetika, see tähendab k on ja k off väärtused nende antikehade korral küllalt erinevad, näiteks D2C6 korral on otsereaktsioon kõige kiirem, samal ajal on D1H4 korral pöördreaktsioon kõige aeglasem (tabel 3). Tabel 3 Seondumise kineetika nelja neutraliseeriva humaanse anti-kdr Fab fragmendi korral Kloon k on (10 4 M 1 s 1 ) k off (10 4 s 1 ) K d (nm) Hu-2C6 Fab 27,3 ±8,6* 5,38 ±0,54 1,97 Hu-2H2 Fab 12,4 ±29 4,87 ±0,18 3,93 Hu-1H4 Fab 5,55 ±0,59 1,53 ±0,22 2,76 Hu-1F7 Fab 4,14 ±1,21 18,7 ±2,12 45,2 * kõik arvulised väärtused on määratud BIAcore analüüsi tulemusena ja kujutavad endast vähemalt kolmes sõltumatus määramises saadud tulemuste keskväärtust ±SE. 15 20 Võrdlusnäide II(c). Seonduva epitoobi kaardistamine. KDR-i ekstratsellulaarse Ig-laadse domeeni deletsioonivariantide saamist on kirjeldatud varem (Lu jt (2000)). Epitoobi kaardistamise katses immobiliseeriti alul täieliku pikkusega KDR-AP, kahe KDR Ig-domeeni deletsioonivariantide sulandid Ap-ga ja FLk-1-AP 96-süvendilisel plaadil (Nunc) küüliku anti-ap antikeha (DAKO-immunoglobulins, Glostrup, Taani) kui fikseerimisreaktiivi abil. Seejärel inkubeeriti plaati 1 tund toatemperatuuril erinevate anti-kdr Fab valkudega, millele järgnes inkubeerimine küüliku anti-humaanse Fab antikeha ja MP konjugaadiga. Plaat pesti ja ilmutati vastavalt eespool toodud kirjeldusele.

5 10 15 20 25 30 35 EE - EP1916001 B1 Anti-KDR Fab fragmentide seonduvad epitoobid kaardistati täieliku pikkusega KDR-i ja kahe KDR Ig domeeni deletsioonivariantide abil. KDR(1 3) on KDR-i variant, milles on esimesed kolm N-otsa Ig domeeni. KDR(3) on variant, milles on üksnes kolmas Ig domeen. Nagu on näidatud joonisel fig 3, seonduvad kloonid D2C6 ja D1H4 ühtmoodi hästi KDR, KDR(1 3) ja KDR(3)-ga, lokaliseerides seega nende seonduva(d) epitoobi(d) Ig domeenis 3. Kloonid D2H2 ja D1F7 seonduvad efektiivsemalt täieliku pikkusega KDR ja KDR(1 3)-ga, mis näitab KDR Ig domeenides 1 kuni 3 laiema(te) seonduva(te) epitoobi/epitoopide olemasolu. Flk-1-ga annab ristreaktsiooni üksnes kloon D1F7. Võrdlusnäide II(d). Antimitogeensuse määramine HUVEC (5 x 10 3 rakku süvendi kohta) kanti 96-süvendilistele koekultuuriplaatidele (Wallach, Inc., Gaithersburg, MD) 200 µl söötmes BBM-2, mis ei sisaldanud VEGF-i, peamist fibroblastide kasvufaktorit (bfgf) või epidermaalset kasvufaktorit (EGF) ja inkubeeriti 72 tundi temperatuuril 37 C. Kahes paralleelkatses lisati süvenditesse erinevad kogused Fab valke ja eelinkubeeriti 1 tund temperatuuril 37 C, seejärel lisati VEGF 165 kuni lõppkontsentratsioonini 16 ng/ml Pärast 18 tundi kestnud inkubeerimist lisati kõikidesse süvenditesse 0,25 µci [ 3 H] TdR (Amersham) ja inkubeeriti veel 4 tundi. Rakke pesti üks kord PBS-iga, trüpsiiniti ja koguti klaasfiltril (Printed Filtermat A, Walach) rakkude kogumisseadmega (Harvester 96, MACH III, TOMTEC, Orange, CT). Membraani pesti kolm korda H 2 O-ga ja kuivatati õhu käes. Lisati stsintillatsioonivedelik ja stsintillatsiooniloenduriga (Wallach, Model 1450 Microbeta Scintillation Counter). määrati DNA-sse sisseviidud radioaktiivsus. Humaanse anti-kdr Fab võime blokeerida HUVEC-i VEGF-stimuleeritud mitogeenset aktiivsust on kujutatud joonisel fig 4. Humaanse Fab kõik neli fragmenti inhibeerisid DNA VEGF-indutseeritud sünteesi HUVEC-is annusest sõltuval viisil. Fab kontsentratsioon, mis inhibeerib [ 3 H]-TdR-i VEGF-stimuleeritud sisseviimist HUVEC-i 50% ulatuses (EC 50 ), on ligikaudu 0,5 nm kloonide D2C6 ja D1H4 korral, 0,8 nm klooni D2H2 korral ja 15 nm klooni D1F7 korral. Kontrollkatsetes kasutati üksnes VEGF-i (1500 lugemit minutis) ja puhast söödet (60 lugemit minutis). Tehti kaks paralleelkatset. Toodud andmed kujutavad vähemalt kolmes sõltumatus eksperimendis saadud tulemusi.

36 EE - EP1916001 B1 Näide II(e) Leukeemiarakkude migratsiooni määramine 5 10 15 HL60 ja HEL-i rakke pesti kolm korda seerumivaba puhta söötmega RPM11640 ja suspendeeriti söötmes kontsentratsioonis 1 x 10 6 rakku milliliitris. Rakususpensiooni 100 µl alikvoodid lisati kas 3 µm pooridega Transwelli vahetatavatele plaatidele HL60 rakkude puhul või 8 µm pooridega Transwelli vahetatavatele plaatidele HEL-i rakkude puhul (Costar, Corning Incorporated, Corning, NY) ja inkubeeriti anti-kdr Fab valkudega (5 µg/ml) 30 min temperatuuril 37 C. Seejärel pandi vahetatavad plaadi 24-süvendilise plaadi süvenditesse, mis sisaldasid 0,5 ml seerumivaba söödet RPMI 1640 koos VEGF 165 või ilma selleta. Migratsioon toimus temperatuuril 37 C, 5% CO 2 keskkonnas 16 18 tunni jooksul HL60 rakkude või 4 tunni jooksul HEL-i rakkude korral. Migreerunud rakud koguti alumistest kambritest ja loendati loenduriga Coulter (Model Z1, Coulter Electronics Ltd., Luton, Inglismaa). HL60 ja HEL-i rakkude VEGF-indutseeritud migratsioon oli annusest sõltuv ja maksimaalne stimuleerimine saabus 200 ng/ml juures (joonis fig 5A). Anti-KDR Fab kõik fragmendid inhibeerisid olulisel määral HL60 ja HEL-i rakkude VEGF-stimuleeritud migratsiooni. Kontrollkatses ei ilmnenud C225, EGF-retseptori vastase antikeha, Fab fragmendil olulist inhibeerivat toimet. Näide III IgG saamine Näide III(a). Vektorite konstrueerimine IgG ekspressiooniks. 20 25 30 Konstrueeriti eraldi vektorid IgG kerge ahela ja raske ahela ekspressiooniks. Kloonitud V L geenid lõhustati ja ligeeriti vektorisse pkn100 (MRC). Kloonitud V H geenid lõhustati ja ligeeriti vektorisse pgidioj, mis sisaldas humaanse IgG I (γ) raske ahela konstantset domeeni. pkn100 ja pgid105 saadi firmast MRC. Konstrukte uuriti lõhustamisel restriktsiooniensüümiga ja verifitseeriti dideoksünukleotiide järjestuse analüüsi abil. Mõlemal juhul on ekspressioon reguleeritud HCMV promootori poolt ja see lõpetatakse tehisliku terminatsioonijärjestusega. Raske ja kerge ahela koostatud geenid klooniti seejärel Lonza GSi ekspressioonivektoritesse pee6.1 ja pee12.1. Raske ja kerge ahela vektorid ühendati üheks vektoriks, et saada CHO rakkude ja NSO rakkude püsiv

37 EE - EP1916001 B1 transfekteerimine. Transfekteeritud rakke kultiveeriti glutamiin-miinussöötmes ja antikehade ekspressioonimäär oli kuni 1 g/l. Näide III(b). Humaanse anti-kdr IgG saamine ja omadused. 5 10 15 20 25 30 Nii IMC-2C6 kui ka IMC-1121 saadi püsivalt transfekteeritud NSO rakuliinides, mis kasvasid seerumivabades tingimustes ja puhastati rakukultuuri portsjonitest Protein A kolonnis afiinsuskromatograafiliselt. Antikeha preparaatide puhtust analüüsiti SDS-PAGE meetodil ja kontsentratsioonid määrati ELISA abil, kasutades fikseeriva reaktiivina antihumaanset Fc antikeha ning tuvastava reaktiivina antihumaanse κ ahela antikeha ja mädarõika peroksidaasi (HUP) konjugaati. Kaliibrimisstandardina kasutati kliinilise puhtusastmega antikeha IMC-C225. Antikeha kõikides preparaatides määrati endotoksiini sisaldus, et olla kindel selles, et saadused ei ole saastatud endotoksiiniga. Anti-KDR-i antikehi uuriti KDR-iga seondumise ja VEGF-i seondumise blokeerimise suhtes. Vahetu seondumise katses lisati erinevad kogused antikehi KDR-iga kaetud 96-süvendilistele Maxi-sorpi mikrotiiterplaatidele (Nunc, Roskilde, Taani) ja inkubeeriti 1 tund toatemperatuuril (RT), seejärel pesti plaate 3 korda PBS-iga, mis sisaldas 0,1% Tween-20. Seejärel inkubeeriti plaate 1 tund RT-l koos 100 µl küüliku antihumaanse IgG Fc-HRP konjugaadiga (Jackson ImmunoResearch Laboratory Inc., West Grove, PA). Plaadid pesti ja ilmutati vastavalt eespool toodud kirjeldusele. Humaanseid antikehi IMC-2C6 ja IMC-1121 võrreldi IMC-1C11 (hiire antikehaga, mis on spetsiifiline KDR-i suhtes) ja IMC-C225 (kimäärse antikehaga, mis on spetsiifiline EGFR-i suhtes). Anti-KDR-i antikehad seonduvad KDR-iga annusest sõltuval viisil, seejuures seondub kõige tugevamini IMC-1121 (joonis fig 6A). Anti-KDR-i antikehade efektiivsus KDR-i blokeerimisel VEGF-iga seondumisel määrati konkureeriva seondumise katses. Antikehade erinevad kogused segati kindla koguse KDR-AP-ga (100 ng) ja inkubeeriti 1 tund RT-l. Seejärel kanti segud eelnevalt VEGF 165 kaetud 96-süvendilistele mikrotiiterplaatidele (200 ng/süvend) ja inkubeeriti veel 2 tundi toatemperatuuril, seejärel pesti plaate 5 korda ja lisati AP substraat (p-nitrofenüülfosfaat, Sigma), millele järgnes neelduvuse määramine lainepikkusel 405 nm, et kvantifitseerida seondunud KDR-AP molekule. Seejärel

5 10 38 EE - EP1916001 B1 arvutati IC 50, see tähendab antikeha kontsentratsioon, mis on vajalik KDR-i ja VEGF-i seondumise inhibeerimiseks 50% ulatuses. Anti-KDR-i antikehad blokeerivad tugevalt KDR-i ja VEGF-i seondumist (joonis fig 6B) ühesuguse efektiivsusega. Kõige kolme antikeha korral on IC 50 väärtus vahemikus 0,8 kuni 1,0 nm. Kontrolliks kasutatud antikeha IMC-C225 (anti-humaanne EGFR) ei seondu KDR-iga ja ei blokeeri vastastiktoimet KDR/VEGF. Antikeha afiinsus või aviidsus määrati BIAcore analüüsi abil vastavalt eespool kirjeldatule. Määrati seondumise kineetika, see tähendab anti-kdr-i antikehade assotsiatsiooni kiiruskonstant (k on ) ja dissotsiatsiooni kiiruskonstant (k off ) ning arvutati dissotsiatsiooni tasakaalukonstant K d (tabel 4). Tabel 4 Anti-KDR-i antikehade seondumise kineetika Antikeha k on (10 4 M 1 s 1 ) k off (10 4 s 1 ) K d (nm) võrdlus p1c11 scfv 7,7 ±2,1* 1,0 ±0,09 1,4 + 0,3 võrdlus IMC-1C11 13,4 ±2,9 0,37 ±0,13 0,27 ±0,06 võrdlus Hu-2C6 Fab 17,1 ±5,7 5,5 ±0,76 3,6 ±1,7 võrdlus IMC-2C6 IgG 21,2, ±8,1 0,43 ±0,03 0,20 ±0,01 Hu-1121 Fab 29,6 ±7,3 0,31 ±0,06 0,11 ±0,02 IMC-1121 IgG 47,9 ±2,4 0,25 ±0,04 0,05 ±0,01 * kõik arvulised väärtused on määratud BIAcore analüüsi tulemusena ja kujutavad endast vähemalt kolmes sõltumatus määramises saadud tulemuste keskväärtust protsentides ± SE. 15 20 IMC-1c11 seondumisel immobiliseeritud KDR-iga on dissotsiatsioonikonstandi (Kd) väärtus 0,27 nm, mis ületab 5 korda Fab analoogi oma. IMC-2C6 korral on K d väärtus 0,2 nm, mis ületab ligikaudu 18 korda monovalentse Hu-2C6 Fab-le vastava väärtuse, peamiseks põhjuseks on dissotsiatsiooni kiiruse suurenemine. Hu-2C6 afiinsusküpsemisel saadi Hu-1121 Fab, seejuures paranes K d 33 korda (vastavalt 3,6 nm ja 0,11 nm). Hu-1121 Fab üleviimisega bivalentseks IgG, IMC-1121 kaasnes seondumise summaarse aviidsuse suurenemine ligikaudu 2 korda. Näide III(c). VEGF-i rakkudega seondumise inhibeerimine ja HUVEC-i VEGF-stimuleeritud mitogenees

5 10 15 39 EE - EP1916001 B1 Rakupõhise radioimmuunanalüüsi tegemiseks segati erinevad kogused anti-kdr-i antikehi kindla koguse (2 ng) 125 I-märgisega VEGF 165 -ga (R&D Systems) ja lisati 96-süvendilistel mikrotiiterplaatidel 80 90% laatumiseni kasvatatud HUVEC-i monokihile. Plaati inkubeeriti 2 tundi toatemperatuuril, pesti 5 korda külma PBS-iga ja määrati endoteelirakkudega seondunud radioaktiivsus. Nagu on näidatud joonisel fig 7, konkureerivad anti-kdr-i antikehad HUVEC-iga seondumisel efektiivselt radiomärgisega VEGF-iga. Toodud andmed vastavad kolmes paralleelkatses määratud keskväärtustele protsentides ±SD. Samuti blokeerivad antikehad VEGF-stimuleeritud HUVEC-i mitogeneesi annusest sõltuval viisil (joonis fig 7B). Vastavalt eespool toodud kirjeldusele Fab-ide korral inkubeeriti erinevaid koguseid anti-kdr-i antikehi esmalt kasvufaktori defitsiidiga HUVEC-idega (5 x 10 3 rakku süvendi kohta) 1 tund temperatuuril 37 C, seejärel lisati VEGF 165 lõppkontsentratsioonini 16 ng/ml. Pärast 18 tundi kestnud inkubeerimist lisati igasse süvendisse 0,25 µci [ 3 H]-TdR (Amersham) ja inkubeeriti veel 4 tundi. Rakud pesti, koguti ja DNA-sse sisseviidud radioaktiivsus määrati stsintillatsiooniloenduriga. Suurima afiinsusega antikeha IMC-1121 on kõige efektiivsem inhibiitor, milleed 50, see tähendab kontsentratsioon, mille tulemuseks on [ 3 H]-TdR sisseviimise inhibeerimine 50% ulatuses, on ligikaudu 0,7 nm võrreldes IMC-1C11 ja IMC-2C6-le vastava väärtusega 1,5 nm. 20 Näide IV Leukeemiarakkude inhibeerimine ja leukeemia areng Näide IV(a) VEGF-i ja KDR-i ekspressioon leukeemiarakkudes. 25 30 Me uurisime VEGF-i ja KDR-i ekspressiooni RT-PCR-i meetodil müeloidleukeemia kolme rakuliini korral: HL60 (promüelotsüütne); HEL (megakarüotsüütne) ja U937 (histiotsüütne). VEGF-i, Flt-1, KDR-i ja sisekontrollina kasutatava α-aktiini amplifitseerimiseks kasutati järgmisi praimereid: VEGF päripidine: 5'-TCGGGCCTCCGAAACCATGA-3' (SEQ ID nr 86) ja äraspidine: 5'-CCTGGTGAGAGATCTGGTTC-3' (SEQ ID nr 87); Flt-1 päripidine: 5'-TTTGTGATTTTGGCCTTGC-3' (SEQ ID nr 88) ja äraspidine: 5'-CAGGCTCATGAACTTGAAAGC-3' (SEQ ID nr 89); KDR päripidine: 5'-GTGACCAACATGGAGTCGTG-3' (SEQ ID nr 90) ja äraspidine: 5'-CCAGAGATTCCATGCCACTT-3' (SEQ ID nr 91); α-aktiin päripidine:

5 10 15 40 EE - EP1916001 B1 5'-TCATGTTT-GAGACCTTCAA-3' (SEQ ID nr 92) ja äraspidine: 5'-GTCTTTGCGGATGTCCACG-3' (SEQ ID nr 93). PCR-i saadusi analüüsiti 1% agaroosgeelil. Nagu on näidatud joonisel fig 8A, olid kõik kolm liini positiivsed VEGF-i ekspressiooni suhtes ning HL60 ja HEl, kuid mitte U937, olid positiivsed ka KDR-i ekspressiooni suhtes. Samuti olid kolm rakuliini positiivsed ka RT-PCR-i abil tuvastatud Fil-1 ekspressiooni suhtes (ei ole siin näidatud). VEGF-i saamist uuriti ka leukeemiarakkude kolme liini korral, mida kultiveeriti kas 10% FCS-is või seerumivabades tingimustes. Leukeemiarakud koguti, pesti puhta RPMI 1640 söötmega ja külvati 24-süvendilistele plaatidele tihedusega 5 x 10 5 rakku milliliitris kas koos 10% FCS-i lisandiga või ilma selleta. Rakke kultiveeriti 72 tundi temperatuuril 37 C, seejärel loendati rakkude koguarv Coulteri loenduri abil (Model Z1, Coulter Electronics Ltd., Luton, Inglismaa) ja VEGF-i kontsentratsioon supernatandis määrati ELISA komplektiga (Biosource International, Camarillo, CA). Leukeemiarakud nõristasid märgatava koguse VEGF-i kultiveerimisel in vitro (joonis fig 8B) ning HL60 ja U937 rakud tootsid rohkem VEGF-i seerumi defitsiidi tingimustes. Näide IV(b) Leukeemiarakkude VEGF-indutseeritud migratsiooni inhibeerimine 20 25 30 Leukeemiarakkude migratsiooni uurimine viidi läbi leukeemiarakkude kolme liini korral vastavalt näites II(e) kirjeldatule. Migratsioon toimus 16 18 tunni jooksul HL60 rakkude või 4 tunni jooksul HEL ja U937 rakkude korral. Kõigi kolme liini leukeemiarakud migreerusid VEGF-i toimel (joonis fig 9). Inkubeerimine anti-kdr-i antikehadega inhibeeris annusest sõltuval viisil HL60 ja HEL-i rakkude VEGF-indutseeritud migratsiooni (joonised fig 9A ja 9B), kuid ei avaldanud mõju U937 rakkudele, mis ei ekspresseeri KDR-i (joonis fig 9C). U937 rakkude VEGF-indutseeritud migratsiooni inhibeeris efektiivselt antihumaanne Fit-1 antikeha Mab 612 (joonis fig 9C). Nagu oodatud, ei avaldanud anti-egfr-i antikeha IMC-C225 mingit mõju inimese leukeemiarakkude VEGF-indutseeritud migratsioonile.

41 EE - EP1916001 B1 Näide IV(b) Leukeemiarakkude kasvu inhibeerimine in vivo. 5 10 15 20 25 Kõikides katsetes kasutati 6 kuni 8 nädala vanuseid ühest soost (emaseid) NOD-SCID hiiri. Hiiri kiiritati 137 Cs gammakiirguse allikast pärineva neeldumisdoosiga 3,5 Gy kiiritusintensiivsusega 0,9 Gy/min ja inokuleeriti intravenoosselt 2 x 10 7 HL60 rakuga. Kolm päeva pärast tuumori inokuleerimist raviti 7 kuni 9 hiirest koosnevaid rühmi kaks korda nädalas erinevate annuste IMC-1C11, IMC-2C6 või IMC-1121 antikehade intraperitoneaalse süstimisega. Hiiri jälgiti iga päev toksilisuse sümptomite suhtes ja registreeriti elulemusaeg. Statistilise analüüsi tegemiseks kasutati mitteparameetrilist ühepoolset Mann-Whitney astaksummatesti. Kõik ravi mittesaanud hiired surid 17 päeva jooksul (joonis fig 10: keskmine elulemusaeg 14 ±3 päeva). Sellise suure tuumorikoormuse korral suurendas ravi IMC-1C11 annusega 200 µg/hiir/süst mõõdukalt elulemust, kuid kõik hiired surid 35 päeva jooksul (keskmine elulemus: 21 ±7 päeva, elulemuse mediaan vastavalt 19 päeva, p = 0,03 kontrollrühmaga võrdlemisel). Samas annuses 200 µg/hiir/süst manustatud IMC-2C6 pikendas oluliselt hiire elulemust kuni 34 ±12 päevani (mediaan = 29 päeva, p < 0,01 võrreldes kontrollrühmaga ja p = 0,01 võrdlemisel IMC-1C11-ga ravitud rühmaga). Suurima afiinsusega antikeha IMC-1121 avaldas palju tugevamat leukeemiavastast toimet, eelkõige just IMC-1C11-ga võrdlemisel. IMC-1121-ga ravitud hiirte elulemus oli 63 ±12 päeva (mediaan 60 päeva, p < 0,001 võrdlemisel nii IMC-1C11 kui ka IMC-2C6-ga ravitud rühmadega). IMC-1121 osutus efektiivsemaks ka katsetes antikeha väiksema annusega (100 µg/hiir/süst). IMC-1121 väiksema annusega ravitud hiirte elulemus oli 46 ±16 päeva (mediaan = 41 päeva). Kogu eksperimendi käigus ei ilmnenud antikehadega ravitud loomadel mingeid ilmseid toksilisuse nähte.

42 EE - EP1916001 B1 Patendinõudlus 5 10 1. Isoleeritud antikeha või selle fragment, mis seondub selektiivselt inimese kinaasi insertsioonidomeeni sisaldava retseptoriga (KDR), seejuures hõlmab antikeha või selle fragment komplementaarsust määravaid piirkondi, milleks on CDRL1 korral SEQ ID nr 81; CDRL2 korral SEQ ID nr 82; CDRL3 korral SEQ ID nr 83; CDRH1 korral SEQ ID nr 13; CDRH2 korral SEQ ID nr 14 ja CDRH3 korral SEQ ID nr 15. 2. Antikeha või selle fragment vastavalt punktile 1, mis erineb selle poolest, et antikeha või selle fragment hõlmab kerge ahela muutuvat domeeni, milleks on SEQ ID nr 53, ja raske ahela muutuvat domeeni, milleks on SEQ ID nr 24. 3. Antikeha või selle fragment vastavalt punktile 1 või 2, mis erineb selle poolest, et antikeha või selle fragment on valitud rühmast, kuhu kuuluvad üheahelaline antikeha, Fab, üheahelaline Fv, bivalentne dimeer ja trivalentne trimeer. 15 4. Isoleeritud polünukleotiid, mis sisaldab nukleotiidjärjestust, mis kodeerib ükskõik millisele punktile 1 kuni 3 vastavat antikeha või selle fragmenti. 5. Polünukleotiid vastavalt punktile 4, mis erineb selle poolest, et nukleotiidjärjestus hõlmab SEQ ID nr 52. 6. Ekspressioonivektor, mis sisaldab punktile 5 vastavat polünukleotiidi. 20 7. Rekombinantne peremeesrakk, mis sisaldab punktile 6 vastavat ekspressioonivektorit. 8. Rekombinantne peremeesrakk vastavalt punktile 7, mis erineb selle poolest, et sünteesib polüpeptiidi, mis hõlmab SEQ ID nr 24, ja polüpeptiidi, mis hõlmab SEQ ID nr 53. 25 9. Antikeha või selle fragment vastavalt ükskõik millisele punktile 1 kuni 3 kasutamiseks teraapias. 10. Antikeha või selle fragment vastavalt ükskõik millisele punktile 1 kuni 3

43 kasutamiseks neoplastiliste haiguste teraapias. EE - EP1916001 B1 11. Antikeha kasutamiseks vastavalt punktile 10, mis erineb selle poolest, et neoplastiline haigus on käärsooletuumor, rinnatuumor või mittesoliidtuumor. 5 12. Antikeha kasutamiseks vastavalt punktile 10 või 11, mis erineb selle poolest, et neoplastiline haigus on tuumor, mis üleekspresseerib KDR-i. 13. Ravimkoostis, mis hõlmab ükskõik millisele punktile 1 kuni 3 vastavat antikeha või selle fragmenti ja farmatseutiliselt vastuvõetavat kandeainet. 10 14. Antikeha või selle fragment vastavalt ükskõik millisele punktile 1 kuni 3 kasutamiseks enne või pärast algavat ravi või selle ajal koos muu toimeainega, mis on valitud VEGFR-1 antagonisti, EGFR-i antagonisti, kemoterapeutilise toimeaine hulgast või koos kiiritusraviga neoplastilise haiguse raviks.

EP 1 916 001 B1 58

EP 1 916 001 B1 59

EP 1 916 001 B1 60

EP 1 916 001 B1 61

EP 1 916 001 B1 62

EP 1 916 001 B1 63

EP 1 916 001 B1 64

EP 1 916 001 B1 65

EP 1 916 001 B1 66