Chk1 inhibeerimiseks kasulikud heteroarüüluurea derivaadid TEHNIKAVALDKOND 5 Leiutis käsitleb ühendeid, mis on kasulikud selliste ensüümide inhibeerimisel, mis säilitavad ja parandavad geneetilise materjali terviklikkust. Täpsemalt öeldes käsitleb leiutis 1-[5-bromo-4-metüül-2-(S)-]morfoliin-2-üülmetoksü)fenüül]-3-(5- metüülpürasiin-2üül)uureat ja selle farmatseutiliselt vastuvõetavaid sooli ning nende kasutamist terapeutiliste toimeainetena näiteks vähktõve ja muude haiguste ravis, mida iseloomustavad vead desoksüribonukleiinhappe (DNA) replikatsioonis, kromosoomide lahknemises või rakkude jagunemises. TEHNIKA TASE Palju haigusi, seisundeid ja häireid (edaspidi näidustusi ) iseloomustab see, et need hõlmavad ebatavaliselt prolifereeruvaid rakke. Siin kasutatuna tähendab ebatavaliselt prolifereeruvad rakud (või rakkude ebatavaline prolifereerumine ) rakkude sellist prolifereerumist, mis kaldub kõrvale tavalisest, õigest või oodatud teest. Näiteks hõlmab rakkude ebatavaline prolifereerumine rakkude sobimatut prolifereerumist, mille korral DNA või muud rakulised komponendid kahjustuvad või muutuvad defektseteks. Seega saab rakkude ebatavalist prolifereerumist iseloomustada ka selliste kliiniliste näidustustega, mis on põhjustatud rakkude jagunemise sobimatult suure määra, rakkude hukkumise (see tähendab apoptoosi) sobimatult väikese määra või nende mõlema poolt, mis on nendega vahendatud või mille tagajärjeks need on. Selliseid näidustusi saab iseloomustada näiteks rakkude, rakurühmade või koe/kudede üksikute või mitmete lokaalsete ebanormaalsete proliferatsioonidega ning need hõlmavad vähktõvega (healoomulise või pahaloomulise) seonduvaid ja mitteseonduvaid näidustusi. Määratluse kohaselt hõlmavad kõik vähkkasvajad (healoomulised ja pahaloomulised) rakkude ebatavalise prolifereerumise mõningaid vorme. Ka mõned vähktõvega mitteseonduvad näidustused hõlmavad rakkude ebatavalist prolifereerumist. Rakkude ebatavalise prolifereerumisega kaasnevate vähktõvega mitteseonduvate näidustuste näited hõlmavad reumatoidartriiti, psoriaasi, vitiliigot, Wegeneri granulomatoosi ja dissemineerunud erütematoosluupust.
2 Üks viis selliste näidustuste raviks, mis hõlmavad rakkude ebatavalist prolifereerumist, hõlmab DNA-d kahjustavate toimeainete kasutamist. Need toimeained on ette nähtud selleks, ebatavaliselt prolifereeruvad rakud häviksid rakkude eluliselt tähtsate protsesside, nagu DNA metabolismi, DNA sünteesi, DNA transkriptsiooni ja mikrotuubulite käävniidistiku moodustumise katkestamise tagajärjel. Samuti võivad need toimida näiteks DNA-sse selliste kahjustuste sisseviimise teel, mis häirivad kromosoomide struktuurilist terviklikkust. DNA-d kahjustavad toimeained on välja töötatud ja neid manustatakse viisil, mis püüab indutseerida maksimaalset kahjustust ning seega ka ebatavaliselt prolifereeruvate rakkude hukkumist, kuid kahjustab minimaalselt normaalseid terveid rakke. Praeguseks on välja töötatud suur hulk DNA-d kahjustavad tegureid, sealhulgas kemoterapeutikume ja kiiritusravi, ning mitmed on väljatöötamise staadiumis. Kahjuks on DNA-d kahjustavate toimeainete efektiivsus rakkude ebatavalist prolifereerumist hõlmavate seisundite ravis oodatust väiksem, eelkõige vähktõve ravi korral. Sageli on selliste toimeainete selektiivsus ebatavaliselt prolifereeruvate rakkude suhtes marginaalne võrreldes tervete rakkudega (seda nimetatakse mõnikord terapeutiliseks indeksiks). Lisaks on kõikides rakkudes olemas tuvastamiseks ja parandamiseks mõeldud mehhanismid, mis võivad DNA-d kahjustavatele toimeainetele vastu töötada. Sellised tuvastusmehhanismid, mida nimetatakse rakutsükli kontrollpunktideks, aitavad säilitada raku replikatsioonistaadiumite järjekorda ja tagavad iga staadiumi toimumise suure täpsusega (Hartwell jt, Science, 246: 629 634 (1989); Weinert jt, Genes Dev., 8: 652 (1994)). Kui rakk tuvastab DNA kahjustuse, sealhulgas sihipäraselt DNA-d kahjustava toimeaine poolt indutseeritud kahjustuse, aktiveerivad signaali teatavad ülekanderajad rakutsükli kontrollpunktid ja raku replikatsioonitsükkel lakkab ajutiselt ( seiskub ). See seisak annab rakule aega DNA parandamiseks sageli sellises ulatuses, mis on piisav raku elutegevuse ja prolifereerumise jätkumiseks. Ebatavaliselt prolifereeruvate rakkude korral on selline parandamine soovimatu, sest see võib takistada jõupingutusi selliste DNA kahjustuste indutseerimiseks, mis on piisavad selliste rakkude hävitamiseks. Näiteks kemoterapeutikum nimega GEMZAR TM (gemtsitabiin või 2,2 -difluoro-2 - deoksütsütidiin) kahjustab DNA-d sel teel, et liitub ise sünteesi käigus DNA-ga.
3 Paardumisvõimetu kahjustatud DNA ei ole tavaliselt võimeline elutegevust säilitama. Paljudes sihtrakkudes tuvastavad rakutsükli kontrollpunktid vale ehitusega (või muul viisil kahjustatud) DNA. Rakutsükli aktiveeritud kontrollpunktid vallandavad rakutsükli seisaku ajavahemikuks, mis on piisav kahjustatud DNA parandamiseks. See on üks teoreetiline võimalus selleks, mil viisil ebatavaliselt prolifereeruvad rakud on võimelised vastu seisma DNA-d kahjustavate tegurite nagu kemoterapeutikumide, kiirguse ja muude ravimeetodite rakke hukkavale toimele. Muud DNA-d kahjustavad toimeained põhjustavad tuumorirakkude arengu seiskumise S-faasis. On täheldatud, et tuumorirakud ei allu teatavate kemoterapeutikumide toimele seetõttu, et areng seiskub pärast kemoterapeutilise toimeaine manustamist S-tsüklis. Kohe pärast ravimi eemaldumist ja DNA kahjustuse parandamist lõpeb rakutsükli seisak ja rakud läbivad kogu ülejäänud rakutsükli (Shi jt, Cancer Res. 61: 65 72, 01). Teised terapeutilised toimeained võivad põhjustada rakutsükli seisaku muudes kontrollpunktides, sealhulgas G1-s ja G2-s. Seetõttu võib arvata, et DNA kahjustuste erinevate kontrollpunktide inhibeerimine võib kaasa aidata rakkudes DNA terapeutiliselt indutseeritud kahjustuste parandamise vältimisele ja sihtrakkude sensibiliseerimise suurendamisele DNA-d kahjustavate toimeainete suhtes. Eeldatavalt suurendab selline sensibiliseerimine ka selliste ravimite terapeutilise indeksi väärtust. Rakutsükkel on kõikide eukarüootsete liikide korral põhiprotsessi ja reguleerimisviisi poolest struktuuriliselt ja funktsionaalselt ühesugune. Mitootiline (somaatiline) rakutsükkel koosneb neljast faasist: G1-faas (vahemik), S-faas (süntees), G2-faas (vahemik) ja M-faas (mitoos). G1-, S- ja G2- faase nimetatakse ühiselt rakutsükli interfaasiks. G1-faasis toimub rakus suure kiirusega biosüntees. S-faas algab DNA sünteesi käivitumisega ja lõpeb siis, kui DNA sisaldus tuumas on replitseerunud ja on moodustunud kromosoomide kaks identset komplekti. Seejärel siseneb rakk G2-faasi, mis kestab kuni mitoosi alguseni. Mitoosi ajal kromosoomid paarduvad ja lahknevad, tekib kaks uut tuuma ja toimub tsütokinees, mis seisneb raku jagunemises kaheks tütarrakuks, millest kumbki saab ühe tuuma, mis sisaldab üht kromosoomikomplekti kahest. Tsütokinees lõpetab M-
4 faasi ja tähistab järgmisele rakutsüklile vastava interfaasi algust. Rakutsükli sündmuste toimumise järjestus on rangelt reguleeritud, nii et rakutsükli ühe sündmuse initsieerimine oleneb rakutsükli eelmise sündmuse lõpetamisest. See võimaldab somaatiliste rakkude korral geneetilise materjali duplitseerimise ja lahknemise täpsust üleminekul ühest põlvkonnast teise. On teatatud, et rakutsükli kontrollpunktid hõlmavad vähemalt kolme erinevat polüpeptiidide klassi, mis toimivad järjestikku vastusena rakutsükli signaalidele või defektidele kromosoomsetes mehhanismides (Carr, Science, 271: 314 3, 1996). Esimene klass on valkude perekond, mis tuvastab või tunneb ära rakutsüklis DNA kahjustuse või ebanormaalsused. Need andurid hõlmavad teleangiektaasataksia mutatsiooniga valku (Atm) ja teleangiektaasataksia Radlaadset valku (Atr). Polüpeptiidide teine klass amplifitseerib ja edastab detektori pool tuvastatud signaali ja selle näiteks on Rad53 (Alen jt, Genes Dev. 8: 2416 2488,1994) ja Chk1. Polüpeptiidide kolmas klass hõlmab selliseid rakutsükli faktoreid nagu p53, mis vahendavad rakulist reaktsiooni, näiteks peatab mitoosi ja apoptoosi. Suur osa arusaamadest rakutsükli kontrollpunktide funktsioonist on saadud tuumorist pärinevate rakuliinide uurimisel. Paljudel juhtudel on tuumorirakud kaotanud rakutsükli olulised kontrollpunktid (Hartwell jt, Science 266: 1821 28, 1994). On teatatud, et võtmeetapiks rakkude evolutsioonis kuni neoplastilise seisundini on selliste mutatsioonide tekkimine, mis inaktiveerivad rakutsükli kontrollpunkti rajad, näiteks need, mis hõlmavad p53 (Weinberg, Cell 81: 323 3, 1995; Levine, Cell 88: 3234 331, 1997). Rakutsükli selliste kontrollpunktide kadumise tagajärjeks on tuumorirakkude replikatsioon vaatamata DNA kahjustusele. Mittevähkkasvajalised koed, milles on rakutsükli muutusteta kontrollpunktid, on tavaliselt isoleeritud üksiku kontrollpunkti raja ajutisest katkestusest. Kuid tuumorirakkudes on rakutsükli kulgemist kontrollivates radades defektid, mistõttu häiritused teistes kontrollpunktides annavad neile eelkõige tundlikkuse DNA-d kahjustavate toimeainete suhtes. Näiteks sellised tuumorirakud, mis sisaldavad mutantset p53, on defektsed nii G1 DNA kahjustuse kontrollpunkti kui ka võime suhtes säilitada G2 DNA kahjustuse kontrollpunkti (Bunz jt, Science, 282: 1497
5 501, 1998). Eeldatakse, et need kontrollpunkti inhibiitorid, mille sihtmärgiks on G2 kontrollpunkti initsieerimine või S-faasi kontrollpunkt, halvavad lisaks nende tuumorirakkude võime parandada DNA kahjustust ja on seetõttu kandidaatideks terapeutilise indeksi suurendamisel nii kiiritusravi kui ka süsteemse kemoteraapia korral (Gesner, Abstract at SRI Conference: Protein Phosphorylation and Drug Discovery World Summit, March 03). DNA kahjustuse olemasolul või ükskõik millise takistuse esinemisel DNA replikatsioonis initsieerivad kontrollpunkti valgud Atm ja Atr signaali ülekanderaja, mis viib rakutsükli seiskamisele. On näidatud, et Atm osaleb DNA kahjustuse kontrollpunktis vastusena ioniseeriva kiirguse (IR) toimele. Atr-i stimuleerivad sellised toimeained, mis põhjustavad DNA kaksikahelalisi katkeid, DNA üksikahelalisi katkeid, ning toimeained, mis blokeerivad DNA kiiritamise mõju. Chk1 on proteiinkinaas, mis paikneb DNA kahjustuse kontrollpunkti signaali ülekanderajas Atm-i ja/või Atr-i suhtes pärisuunaliselt (Sanchez jt, Science, 277: 1497 01, 1997; USA patent nr 6 218 9). Imetajate rakkudes fosforüülitakse Chk1 vastusena sellistele teguritele, mis põhjustavad DNA kahjustust, sealhulgas ioniseeriv kiirgus (IR), ultraviolettkiirgus (UV) ja hüdroksüuurea (Sanchez jt, supra; Lui jt, Genes Dev., 14: 1448 1459, 00). See imetajarakkudes Chk1 aktiveeriv fosforüülimine oleneb Atm-ist (Chen jt, Oncogene, 18:249-6, 1999) ja Atr-ist (Lui jt, supra). Lisaks on näidatud, et Chk1 fosforüülib nii wee1 (O'Connell jt, EMBO J., 16: 545 554, 1997) kui ka Pds1 (Sanchez jt, Science, 286: 1166 1171, 1999) geeniprodukte, mis on tuntud rakutsükli kontrollimisel olulistena. Need uuringud näitasid, et imetajate Chk1 osaleb Atm-sõltuvas DNA kahjustuse kontrollpunktis, mis toob kaasa seiskamise S-faasis. Hiljuti selgitati välja Chk1 osa imetajarakkude S-faasis (Feijoo jt, J. Cell Biol., 4: 913 923, 01; Zhao jt, PNAS U.S.A, 99: 14795 800, 02; Xiao jt, J. Biol. Chem., 278(24): 21767 21773, 03; Sorensen jt, Cancer Cell, 3(3): 247 58, 03), milles tõsteti esile Chk1 osa DNA sünteesi terviklikkuse jälgimises. Chhk1 kutsub esile S-faasi seiskamise, fosforüülides CdcA, mis reguleerib tsükliin-a/cdk2 aktiivsust (Xiao jt, supra ja Sorensen jt, supra). Samuti kutsub Chk1 esile G2 seiskamise, fosforüülides ja inaktiveerides CdcC, kaheti spetsiifilist fosfataasi, mis tavaliselt defosforüülib tsükliin-b/cdc2 (tuntud ka kui Cdk1) siis, kui rakk läheb G2-st üle
6 mitoosi (Fernery jt, Science, 277: 1495 7, 1997; Sanchez jt, supra; Matsuoka jt, Science, 282: 1893 1897, 1998 ja Blasina jt, Curr. Biol., 9: 1 (1999). Mõlemal juhul indutseerib Cdk aktiivsuse reguleerimine rakutsükli seiskamise, et vältida rakkude sisenemist mitoosifaasi DNA kahjustuse või replitseerumata DNA olemasolul. Rakutsükli kontrollpunkti inhibiitorite ülejäänud klassid toimivad kas G1- või G2/Mfaasis. UCN-01 või 7-hüdroksüstaurosporiin isoleeriti algselt kinaasi mittespetsiifilise inhibiitorina, mis avaldab esmast toimet proteiinkinaasile C, kuid hiljuti leiti, et see inhibeerib ka Chk1 aktiivsust ja kaotab ära rakutsükli G2 kontrollpunkti (Shi jt, supra). Seega on UCN-01 rakkudele suurtes kontsentratsioonides toksiline, sest on Chk1 mitteselektiivne inhibiitor. Väikestes annustes inhibeerib see mittespetsiifiliselt mitmeid rakulisi kinaase ja seega inhibeerib ka G1 kontrollpunkti (Tenzer jt, Curr. Med. Chem. Anticancer Agents, 3: 35 46, 03). UCN-01 on piiratud edukusega kasutatud koos selliste vähktõve ravimeetoditega nagu kiiritusravi, vähktõvevastase toimeaine kamptotetsiini (Tenzer jt, supra) ja gemtsitabiiniga (Shi jt, supra). Lisaks on UCN-01 kasutatud temosolomiidi (TMZ) poolt indutseeritud DNA mittevastavuse parandamisega seotud toime tugevdamiseks glioblastoomi rakkudes (Hirose jt, Cancer Res., 61: 5843 5849, 01). Kliinikus ei ole UCN-01 nii efektiivne kemoterapeutikum kui loodeti, võimalikuks põhjuseks on ravirežiimi nurjumine ja konkreetsete oluliste molekulaarsete sihtmärkide identifitseerimise puudumine (Grant jt, Drug Resistance Updates, 6: 26, 03). Nii teatasid Mack jt tsisplatiini toime rakutsüklist olenevast võimendamisest UCN-01 poolt kultiveeritud mitteväikeserakulise kopsuvähi rakuliini korral, kuid ei tehtud kindlaks spetsiifilisust UCN-01 poolt tabatud rakutsükli olulis(t)e kontrollpunkti(de) suhtes (Mack jt, Cancer Chemother. Pharmacol., 51(4): 337 348, 03). On olemas mitmeid muid strateegiaid tuumorirakkude sensibiliseerimiseks rakutsüklit mõjutavate kemoterapeutikumide suhtes. Nii näiteks tühistab 2- aminopuriini manustamine rakutsükli mitmete kontrollpunktide mehhanismid, nagu mimosiin-indutseeritud G1 seiskamine või hüdroksüuurea-indutseeritud S-faasi seiskamine, mis võimaldab rakul areneda kuni mitoosini ja seda läbida
7 (Andreassen jt, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86: 2272 2276, 1992). Kofeiini, metüülksantiini on samuti kasutatud DNA-d kahjustavate tegurite nagu tsisplatiini ja ioniseeriva kiirguse tsütotoksilisuse võimendamiseks, et vahendada läbiminekut G2 kontrollpunktist ja seega indutseerida raku hukkumist (Bracey jt, Clin. Cancer Res., 3: 1371 1381, 1997). Siiski ületab kofeiini annus, mis on vajalik rakutsükli tühistamiseks, kliiniliselt vastuvõetava taseme ja see ei ole teostatav terapeutiline variant. Lisaks on topoisomeraasi inhibiitori BNP1350 suhtes tundlikkuse suurendamiseks kasutatud Chk1 kinaasi antisenss-nukleotiide BNP1350 (Yin jt, Biochem. Biophys. Res. Commun., 295: 435 44, 02), kuid seejuures ilmnesid antisenss-ravi ja geeniteraapiaga seonduvad tavalised probleemid. Avalikustatud on Chk1 inhibiitorid, sealhulgas arüül- ja heteroarüülasendatud uureaühendid, mida on kirjeldatud USA patenditaotluses nr /087 7 ja USA patendi eeltaotlustes nr 60/583,080, 60/585,292 ja 60/602,968; diarüüluurea ühendid, mida on kirjeldatud USA patenditaotluses nr 04/0014765, USA patenditaotluses nr US03/199511, USA patenditaotluses nr 04/0014765 ja patendidokumendis WO 03/1444; metüülksantiinid ja nendega sarnased ühendid, mida on kirjeldatud töös Fan jt, Cancer Res. 55:1649-54. 1995; ureidotiofeenid, mida on kirjeldatud patendidokumentides WO 03/029241 ja WO 03/028731; N-pürrolopüridinüülkarboksamidid, mida on kirjeldatud patendidokumendis WO 03/028724; antisenss-chk1 oligonukleotiidid, mida on kirjeldatud patendidokumendis WO 01/576 ja USA patendis nr 6 211 164; Chk1 retseptori antagonistid, mida on kirjeldatud patendidokumendis WO 00/16781; heteroaromaatsed karboksamiidderivaadid, mida on kirjeldatud patendidokumendis WO 03/037886; aminotiofeenid, mida on kirjeldatud patendidokumendis WO 03/029242; (indasolüül)bensimidasoolid, mida on kirjeldatud patendidokumendis WO 03/004488; bensimidasoolkinolinoonid, mida on kirjeldatud in USA patendipublikatsioonis nr 0400935 ja patendidokumendis WO 04/018419; heterotsüklilised hüdroksüiminofluoreenid, mida on kirjeldatud patendidokumendis WO 02/16326; skütonemaanderivadid nagu skütonemiin, mida on kirjeldatud in USA patendis nr 6,495,586; heteroarüülbensamiidid, mida on kirjeldatud patendidokumendis WO 01/53274; indasoolid, mida on kirjeldatud patendidokumendis WO 01/53268; indoalakarbasoolid, mida on kirjeldatud töös Tenzer jt, supra; kromaanderivaadid,
8 mida on kirjeldatud patendidokumendis WO 02/0705; paulloonid, mida on kirjeldatud töös Schultz jt, J. Med. Chem., Vol: 2909 2919,1999; indenopürasoolid, mida on kirjeldatud patendidokumendis WO 99/17769; flavoonid, mida on kirjeldatud töös Sedlacek jt, Int. J. Oncol., 9: 1143 1168, 1996; seriini-treoniini kinaaside peptiidsilmuse peptiidderivaadid, mida on kirjeldatud patendidokumendis WO 98/550; oksindoolid, mida on kirjeldatud patendidokumendis WO 03/051838; diasepinoindoloonid, mida on kirjeldatud patendidokumendis WO 04/063198; pürimidiinid, mida on kirjeldatud patendidokumendis WO 04/048343; uureaühendid, mida on kirjeldatud patendidokumendis WO 04/014876 ja pürrolokarbasoolid, bensofuroisoindoolid ja asatsüklopentafluoreenid, mida on kirjeldatud patendidokumendis WO 03/0915. Siiski on tehnika tasemes olemas vajadus Chk1 efektiivsete ja selektiivsete inhibiitorite järele. Leiutis on suunatud selle ja muude vajaduste rahuldamisele. LEIUTISE KOKKUVÕTE Leiutis käsitleb kontrollpunkti kinaasi Chk1 tõhusaid ja selektiivseid inhibiitoreid, millel on avalduvad biokeemilistes ja/või rakupõhistes katsetes ootamatud omadused. Need Chk1 inhibiitorid on kasulikud näidustustuste ravis, mis hõlmavad rakkude ebatavalist prolifereerumist ja kemosensibiliseerivate ja radiosensibiliseerivate toimeainetena DNA kahjustuste või DNA replikatsioonivigadega seonduvate näidustuste ravis. Seega pakutakse leiutises välja ühend, milleks on 1-[5-bromo-4-metüül-2-(S)- ]morfoliin-2-üülmetoksü)fenüül]-3-(5-metüülpürasiin-2üül)uurea ja selle farmatseutiliselt vastuvõetavad soolad. Muuhulgas on need ühendid kasulikud Chk1 inhibeerimise meetodis, mis hõlmab 1-[5-bromo-4-metüül-2-(S)-]morfoliin-2- üülmetoksü)fenüül]-3-(5-metüülpürasiin-2üül)uurea või selle farmatseutiliselt vastuvõetava soola toimiva koguse manustamist seda vajavale isikule. Leiutise järgmise aspektina pakutakse välja ravimkoostis, mis hõlmab 1-[5-bromo- 4-metüül-2-(S)-]morfoliin-2-üülmetoksü)fenüül]-3-(5-metüülpürasiin-2üül)uureat või selle farmatseutiliselt vastuvõetavat soola ja koostiste kasutamine näidustuse
9 raviks, seejuures avaldab Chk1 inhibeerimine in vivo või ex vivo terapeutilist kasu või pakub uurimuslikku või diagnostilist huvi. 5 Leiutise veel ühe järgmise aspektina pakutakse välja meetod rakkude sensibiliseerimiseks isikul, kes allub näidustuse kemoterapeutilisele või radioterapeutilisele ravile, mis hõlmab 1-[5-bromo-4-metüül-2-(S)-]morfoliin-2- üülmetoksü)fenüül]-3-(5-metüülpürasiin-2üül)uurea või selle farmatseutiliselt vastuvõetava soola manustamisele koos kemoterapeutilise toimeaine, radioterapeutilise teguri või nende mõlemaga. Selle meetodiga ravitava näidustuse mittepiiravaks näiteks on vähktõbi. Leiutise järgmise aspektina pakutakse välja meetod rakkude ebatavalise prolifereerumise inhibeerimiseks või vältimiseks. Ühe teostuse korral hõlmab meetod ebatavaliselt prolifereeruvatest rakkudest rakupopulatsiooni kokkupuudet vähemalt ühe Chk1 aktivaatoriga sellises koguses ja sellise aja jooksul, mis on piisav ebatavaliselt prolifereeruvate rakkude rakutsükli seisaku sünkroniseerimiseks. Pärast rakupopulatsioonis rakutsükli seisaku põhimõttelist sünkroniseerimist viiakse rakupopulatsioon kokkupuutesse vähemalt ühe Chk1 leiutisekohase inhibiitoriga sellises koguses ja sellise aja jooksul, mis on piisav rakutsükli seisaku põhimõtteliseks tühistamiseks. Leiutise järgmise aspektina pakutakse välja inimestele farmatseutiliseks kasutamiseks mõeldud valmistoode, mis hõlmab: (a) ravimkoostist, mis hõlmab 1-[5-bromo-4-metüül-2-(S)-]morfoliin-2- üülmetoksü)fenüül]-3-(5-metüülpürasiin-2üül)uurea või selle farmatseutiliselt vastuvõetav sool; (b) pakendi infoleht, milles on näidatud koostise kasulikkus selliste näidustuste ravis, milles osaleb rakkude ebatavaline prolifereerumine ja (c) konteiner. Leiutise järgmise aspektina pakutakse välja:
(a) ravimkoostist, mis hõlmab 1-[5-bromo-4-metüül-2-(S)-]morfoliin-2- üülmetoksü)fenüül]-3-(5-metüülpürasiin-2üül)uurea või selle farmatseutiliselt vastuvõetav sool; 5 (b) (c) pakendi infoleht, milles on näidatud koostise kasulikkus kemosensibilisaatori või radiosensibilisaatorina selliste näidustuste ravis, mis seonduvad DNA kahjustuste või DNA replikatsiooniga ja konteiner. Leiutise need ja muud aspektid selguvad järgnevast üksikasjalikust kirjeldusest. ÜKSIKASJALIK KIRJELDUS Leiutisekohase ühendi 1-[5-bromo-4-metüül-2-(S)-]morfoliin-2-üülmetoksü)fenüül]- 3-(5-metüülpürasiin-2üül)uurea struktuurivalem on:. DNA-d kahjustavaid toimeaineid, mis aktiveerivad rakutsükli kontrollpunkte, nimetatakse siin üldjuhul kontrollpunkti aktivaatoriteks. DNA-d kahjustavaid toimeaineid, mis aktiveerivad tähistusega Chk1 (hääldatakse tšekk-üks ) kontrollpunkti, nimetatakse siin Chk1 aktivaatoriteks. Analoogiliselt nimetatakse siin selliste kontrollpunktide inhibiitoreid vastavalt kontrollpunkti inhibiitoriteks ja Chk1 inhibiitoriteks. Siin kasutatuna on Chk1 inhibiitorid ühendid, mis on võimelised vähemalt osaliselt kõrvaldama vähemalt rakutsükli ühes kontrollpunktis valgu Chk1 aktiivsuse. Rakutsükli kontrollpunkti tühistamine saavutatakse siis, kui rakulise kontrollpunkti mehhanism kutsutakse esile sellises ulatuses, mis on piisav raku üleminekuks rakutsükli järgmisesse faasi, kus see peatub rakutsükli järgmise faasini või võimaldab vahetult rakul hukkuda. Rakutsükli kontrollpunkti tühistamine võimaldab
11 rakul viia kahjustatud või vigast geneetilist materjali rakutsükli järgmistesse faasidesse ja sel viisil indutseerida või soodustada raku hukkumist. Raku hukkumine võib toimuda ükskõik millise mehhanismi kaudu, sealhulgas apoptoosi või mitootilise katastroofi teel. Leiutisekohased ühendid on Cgk1 inhibiitorid. 5 Chk1 aktivaator hõlmab ükskõik millist tuntud või hiljem avastatavat faktorit, millel on võime aktiveerida Chk1 kinaasi aktiivsust ja seega indutseerida vähemalt rakutsükli osalist seiskamist. Chk1 aktivaatorid hõlmavad faktoreid, mis on võimelised rakutsüklit seiskama rakutsükli ükskõik millises faasis, seda faasi võib nimetada antud aktivaatori suhtes märklaud-faasiks. Märklaud-faasid hõlmavad rakutsükli ükskõik millist faasi, välja arvatud mitoos, see tähendab ükskõik millist faasi G1-, S- ja G2-faasidest. Leiutisekohased kasulikud Chk1 aktivaatorid hõlmavad DNA-d kahjustavaid faktoreid, nagu kemoterapeutilised toimeained ja/või kiirgus. Radiatsioonilised Chk1 aktivaatorid hõlmavad mittepiiravalt ioniseerivat kiirgust. Ioniseeriv kiirgus hõlmab elektromagnetilist kiirgust või korpuskulaarkiirgust, mis on ainega vastastiktoimes võimeline tekitama ioonipaare. Ioniseeriv kiirgus hõlmab röntgeni- ja gammakiirgust, alfa- ja beeta-osakesi, neutroneid ja laetud tuumi. Kiirgus hõlmab ultraviolettkiirgust, nähtavat valgust, infrapunakiirgust, mikrolainelist kiirgust ja nende segu. Selleks, et määrata, kas faktor on Chk1 aktivaator, võib kasutada katseid, nagu on kirjeldatud näites 8. Rakkude ebatavalise prolifereerumise inhibeerimine tähendab ebatavaliselt prolifereeruvate rakkude prolifereerumiskiiruse aeglustumist või sellise prolifereerumise täielikku elimineerimist. Inhibeerimine võib olla replikatsioonikiiruse vähenemise, rakkude hukkumiskiiruse suurenemise või nende mõlema tagajärjeks. Raku hukkumine võib toimuda ükskõik millise mehhanismi kaudu, sealhulgas apoptoosi või mitootilise katastroofi teel. Rakkude ebatavalise prolifereerumise vältimine tähendab rakkude ebatavalise prolifereerumise inhibeerimist enne selle toimumist või selle taastumise inhibeerimist. "In vivo" tähendab toimumist elusolendis nagu loomas või inimeses. Antud kontekstis võib faktoreid terapeutiliselt kasutada in vivo selleks, et aeglustada või elimineerida ebatavaliselt replitseeruvate rakkude prolifereerumist. Neid faktoreid
12 võib seega kasutada in vivo profülaktiliselt, et vältida rakkude ebatavalist prolifereerumist või sellega seonduvate sümptomite ilmnemist. 5 "Ex vivo" tähendab väljaspool elusolendit. Ex vivo rakupopulatsioonide näited hõlmavad rakukultuure ja bioloogilisi proove, nagu inimestel ja loomadelt võetud vedelike ja kudede proovid. Selliseid proove võib võtta tehnika tasemes hästi tuntud meetoditega. Bioloogiliste vedelike proovide näited hõlmavad verd, tserebrospinaalvedelikku, uriini, sülge. Koeproovide näited hõlmavad tuumoreid ja biopsiaproove. Antud kontekstis võib kõnealuseid ühendeid kasutada paljudel eesmärkidel nii terapeutilises kui ka eksperimentaalses mõttes. Radiosensibilisaator tähendab siin kasutatuna ühendit, mida manustatakse inimesele või muule loomale terapeutiliselt toimivas koguses selleks, et suurendada rakkude tundlikkust elektromagnetilise kiirguse suhtes ja/või soodustada elektromagnetilise kiirgusega ravitavate haiguste ravi. Kiirgus hõlmab siin kasutatuna mittepiiravalt kiirgust, mille lainepikkus on vahemikus kuni 0 meetrit. Termin konteiner tähendab ükskõik millist anumat ja sulgurit selle jaoks, mis on sobiv farmatseutilise toote hoidmiseks, transportimiseks, doseerimiseks ja/või käitlemiseks. Termin pakendi infoleht tähendab tootega kaasasolevat teavet, milles antakse kirjeldus selle kohta, kuidas toodet manustada koos ohutuse ja efektiivsuse kohta käivate andmetega, mis on arstile, farmatseudile ja patsiendile vajalikud selleks, et langetada teadlik otsus toote kasutamise kohta. Pakendi infolehe all mõeldakse tavaliselt farmatseutilise toote "etiketti". Leiutisekohast ühendit võib saada kas lõpptoote lahutamise või stereospetsiifilise sünteesi teel, lähtudes isomeerselt puhtast lähteainest või kiraalse abireaktiivi kasutamisega, vaadake näiteks Z. Ma jt, Tetrahedron: Asymmetry, 8(6), 883 888(1997). Lõppsaaduse, vaheühendi või lähteaine lahutamist võib teha ükskõik millise tehnika tasemes tuntud meetodiga. Nagu allpool näidatud, võib spetsiifilistel stereoisomeeridel olla erakordne võime Chk1 inhibeerimiseks kombinatsioonis kemoterapeutilise või kiiritusraviga. 1-[5-bromo-4-metüül-2-(S)-]morfoliin-2-
13 üülmetoksü)fenüül]-3-(5-metüülpürasiin-2üül)uurea võib esineda sooladena. Tavaliselt on leiutisekohases meetodis eelistatavad 1-[5-bromo-4-metüül-2-(S)- ]morfoliin-2-üülmetoksü)fenüül]-3-(5-metüülpürasiin-2üül)uurea soolad. Siin kasutatuna vastab termin "farmatseutiliselt vastuvõetavad soolad" ühendi sooladele või tsvitterioonsetele vormidele. Sooli võib valmistada ühendi lõpliku eraldamise ja puhastamise teel või eraldi, lastes ühendil reageerida sobivat katiooni omava happega. Sobivad farmatseutiliselt vastuvõetavad katioonid hõlmavad leelismetallide (näiteks naatriumi või kaaliumi) ja leelismuldmetallide (näiteks kaltsiumi või magneesiumi) katioone. Lisaks on 1-[5-bromo-4-metüül-2- (S)-]morfoliin-2-üülmetoksü)fenüül]-3-(5-metüülpürasiin-2üül)uurea farmatseutiliselt vastuvõetavad soolad farmatseutiliselt vastuvõetavate hapetega moodustunud liitsoolad. Hapete näited, mida võib kasutada farmatseutiliselt vastuvõetavate soolade moodustumiseks, hõlmavad anorgaanilisi happeid, nagu vesinikkloriidhape, vesinikbromiidhape, väävelhape ja fosforhape, ning orgaanilisi happeid, nagu oksaalhape, malehape, merevaikhape, maloonhape ja sidrunhape. Leiutisekohase ühendi soolade mittepiiravad näited hõlmavad mittepiiravalt vesinikkloriid-, vesinikbromiid-, vesinikjodiid-, sulfaat-, vesiniksulfaat-, 2- hüdroksüetaansulfonaat-, fosfaat-, vesinikfosfaat-, atsetaat-, adipaat-, alginaat-, aspartaat-, bensoaat-, butüraat-, kamforaat-, kampersulfonaat-, tsitraat-, diglükonaat-, glütseroolfosfaat-, hemisulfaat-, heptanoaat-, heksanoaat-, formiaat-, suktsinaat-, malonaat-, fumaraat-, maleaat-, metaansulfonaat-, mesitüleensulfonaat-, naftüleensulfonaat-, nikotinaat-, 2-naftaleensulfonaat-, oksalaat-, pamoaat-, pektinaat-, peroksüdisulfaat-, 3-fenüülproprionaat-, pikraat-, pivalaat-, propionaat-, trikloroatsetaat-, trifluoroatsetaat-, glutamaat-, vesinikkarbonaat-, paratolueensulfonaat-, undekanoaat-, laktaat-, tsitraat-, tartraat-, glükonaat-, benseensulfonaat- ja p-tolueenesulfonaatsooli. Lisaks võib leiutisekohases ühendis olevaid aminorühmi üle viia kvaternaarseteks rühmadeks metüül-, etüül-, propüül- ja butüülkloriidi, -bromiidi ja -jodiidiga; dimetüül-, dietüül-, dibutüül- ja diamüülsulfaadiga; detsüül-, laurüül-, müristüül- ja stearüülkloriidi, -bromiidi ja - jodiidiga ning bensüül- ja fenetüülbromiidiga. Eelöeldu valguses on tekstis ükskõik milline viitamine leiutisekohastele ühenditele mõeldud hõlmama nii 1-[5-bromo-4- metüül-2-(s)-]morfoliin-2-üülmetoksü)fenüül]-3-(5-metüülpürasiin-2üül)uureat kui ka selle farmatseutiliselt vastuvõetavaid sooli.
14 Leiutisekohaseid ühendeid võib terapeutilistel eesmärkidel manustada puhta kemikaalina, kuid eelistatavalt manustatakse ühendeid ravimkoostise või valmistisena. Seega pakutakse leiutises välja ravimkoostis, mis hõlmab 1-[5- bromo-4-metüül-2-(s)-]morfoliin-2-üülmetoksü)fenüül]-3-(5-metüülpürasiin- 2üül)uureat või selle farmatseutiliselt vastuvõetavat soola koos selleks mõeldud farmatseutiliselt vastuvõetava lahjendusaine või kandeainega. Seega pakutakse leiutises välja ravimkoostis, mis hõlmab 1-[5-bromo-4-metüül-2-(S)-]morfoliin-2- üülmetoksü)fenüül]-3-(5-metüülpürasiin-2üül)uureat või selle farmatseutiliselt vastuvõetavat soola koos selleks mõeldud farmatseutiliselt vastuvõetava lahjendusaine või kandeainega. Seega pakutakse leiutises lisaks välja ravimkoostised, mis hõlmavad 1-[5-bromo- 4-metüül-2-(S)-]morfoliin-2-üülmetoksü)fenüül]-3-(5-metüülpürasiin-2üül)uureat või selle farmatseutiliselt vastuvõetavat soola koos ühe või mitme farmatseutiliselt vastuvõetava kandeaine ja valikuliselt muude terapeutiliste ja/või profülaktiliste koostisainetega. Kandeained peavad olema vastuvõetavad selles mõttes, et need peavad kokku sobima koostise muude koostisainetega ega tohi olla patsientidele kahjulikud. Leiutisekohased ühendid avaldavad erakordselt tugevat toimet. Toime väljendatakse tavaliselt ühendi kontsentratsioonina, mis on vajalik teatava tulemuse saamiseks. Mida tugevam on toime, seda väiksem on ettenähtud funktsiooni tagamiseks vajalik ühendi kogus. In vitro toime avaldatakse tavaliselt IC 50 väärtustena ning see määratakse annuse-efekti katses. IC 50 väärtusi võib määrata tundliku katsesüsteemi kokkuviimisel huvipakkuva ühendiga selle kontsentratsioonide laias vahemikus, alates kontsentratsioonidest, kus toime puudub või on minimaalne, seejärel suuremates kontsentratsioonides, mille korral ilmneb osaline toime, kuni küllastuskontsentratsioonideni, mille korral ilmneb maksimaalne toime. Teoreetiliselt saab selliseid annuse-efekti katseid inhibiitorühendite korral kirjeldada S-kujulise kõveraga, mis vastab inhibeerimismäära sõltuvusele kontsentratsiooni logaritmist. Seega läbi kõver teoreetiliselt punkti, kus kontsentratsioon on piisav kontrollpunkti ensüümi aktiivsuse vähendamiseks väärtuseni, mis vastab 50% ensüümkatses täheldatud minimaalse ja maksimaalse
aktiivsuse erinevusele. See kontsentratsioon on määratletud kui 50% inhibeerimisele vastav inhibeeriv kontsentratsioon või IC 50 väärtus. 5 IC 50 väärtusi saab määrata tavaliste biokeemiliste (rakuliste) katsemeetoditega või eriala asjatundjatele hästi tuntud rakupõhiste katsemeetoditega. Ühe sellise katse näide on toodud allpool näites 1. Eelistatavalt saadi IC 50 väärtused asjakohase katse läbiviimisel vähemalt kaks korda, seejuures avaldatakse IC 50 väärtus saadud üksikute väärtuste keskmise tulemusena (aritmeetilise keskmise või "keskväärtusena ). Eelistatavamalt korrati katset 3 kuni (või enam) korda, seejuures avaldatakse IC 50 väärtus saadud üksikute väärtuste keskväärtusena. Kõige eelistatavamalt viidi katse läbi nii mitu korda, kui see on piisav IC 50 statistiliselt usaldusväärse keskväärtuse saamiseks eriala asjatundjale tuntud statistiliste meetoditega. Leiutisekohastel ühenditel on ootamatult väikesed IC 50 väärtused, mis vastavad ootamatult tugevale toimele in vitro. Leiutisekohastel ühenditel on teiste proteiinkinaasidega võrreldes selektiivsus Chk1 inhibeerimise suhtes. Selektiivsus võib olla kasulik kõrvalnähtude vähendamise ja/või terapeutilise indeksi suurendamise seisukohalt. Selektiivsus avaldatakse siin kordse selektiivsusena. Tavaliselt tähendab siin kasutatud kordne selektiivsus võrdlusensüümi korral saadud uuritava ühendi IC 50 väärtuse ja võrdlusensüümi IC 50 jagatist. Täpsemalt öeldes on siin kasutatuna Chk1 inhibiitori kordne selektiivsus Chk1 inhibiitori (uuritava ühendi) IC 50 Chk1 korral (võrdlusensüüm) jagatuna võrdlusensüümi IC 50 -ga. Võrdlusensüümid, mille suhtes võib leiutisekohaseid ühendeid mõõta, hõlmavad vähemalt järgmisi proteiinkinaase: Cdc2, Chk2, CTAK, EphA1, EphA2, Erk1, FGFR1, FGFR4, IR, JNK1, c-kit, p38alfa, p38beeta, p38delta, Ros, Rse, Rsk2, TrkA, TrkB, proteiinkinaas A, proteiinkinaas C, pp60v-src, proteiinkinaas B/Akt-1, p38mapk, p70s6k, kaltsium-kalmoduliini poolt reguleeritav kinaas II ja ab1 türosiini kinaas. Katseid uuritava ühendi IC 50 määramiseks võrdlusensüümi suhtes on kirjeldatud näites 2 ja need on eriala asjatundjale hästi tuntud.
16 Leiutisekohastel ühenditel on ootamatult tugev toime rakupõhises katses. Chk1 inhibiitori rakupõhise toime määramiseks töötati välja katse, mis võimaldab määrata Chk1 inhibiitori kontsentratsiooni, mis on vajalik DNA-d kahjustava aine kasvu inhibeeriva toime suurendamiseks rakupõhise mudeli korral, milles kasutatakse ebatavaliselt prolifereeruvaid rakke. Selline rakupõhine võime on siin avaldatud kui EC TFS väärtus, seejuures on EC TFS Chki1 inhibiitori selline toimiv kontsentratsioon, mis põhjustab ebatavaliselt prolifereeruvate rakkude populatsiooni sensibiliseerimise kahekordse suurenemise DNA-d kahjustava faktori kasvu inhibeeriva toime suhtes. EC TFS arvutatakse Chk1 inhibiitori kontsentratsioonina, mis vähendab kaks korda DNA-d kahjustava toimeaine kogust, mis on vajalik rakkude kasvu inhibeerimiseks 90% ulatuses. Taotlejad leidsid, et leiutisekohastel ühenditel on ootamatult väikesed EC TFS väärtused, mis vastavad ootamatult tugevale rakupõhisele toimele. Järgmine määratav parameeter on kordne sensibiliseerimine, mis esineb Chk1 inhibiitorühendi LD 50 korral (ainult ühendi annus, mis inhibeerib 50% rakkude kasvu). Need kaks väärtust, EC TFS ja kordne sensibiliseerimine LD 50 korral võimaldavad vahetult reastada Chk1 inhibiitorid üksteise suhtes toime tugevuse ja toksilisuse alusel. EC TFS väärtuste määramiseks kasulikku katset on kirjeldatud allpool näites 3. Lühidalt öeldes kasutatakse selles katses ebatavaliselt prolifereeruvate rakkude populatsioonina inimese käärsoolevahi rakke HT29, DNA-d kahjustava toimeainena / Chk1 aktivaatorina gemtsitabiini ja Chk1 inhibiitorina leiutisekohast ühendit. Ebatavaliselt prolifereeruvate rakkude populatsiooni kultiveeriti ja lasti kasvada sobivas söötmes. Seejärel allutati rakud DNA-d kahjustava toimeaine erinevate kontsentratsioonide toimele. DNA-d kahjustav toimeaine eemaldati pärast eelnevalt kindlaksmääratud aja möödumist ja rakud allutati eelnevalt kindlaksmääratud ajaks Chk1 inhibiitori erinevate kontsentratsioonide toimele. Seejärel koguti plaatidelt kultiveeritud rakud ja loendamisega määrati ellujäänud rakkude suhteline arv. Andmed normaliseeriti ainult Chk1 inhibiitoriga saadud tulemuste kui kontrollkatse suhtes ja koostati log-log-teljestikus graafik DNAkahjustava toimeaine kontsentratsiooni ja rakkude suhtelise elulemuse (0% võrdub 1,0) vahelise sõltuvuse kohta. Kordne sensibiliseerimine määrati DNA-d
17 kahjustava toimeaine koguste erinevusest, mis on vajalik kasvu inhibeerimiseks 90% ulatuses Chk1 inhibiitori manulusel ja ilma selleta Chk1 inhibiitori kõikide kasutatud kontsentratsioonide korral. Nende andmete alusel koostati graafik Chk1 inhibiitori kontsentratsiooni ja kordse sensibiliseerimise vahelise sõltuvuse kohta, millest arvutati EC TFS. Eelistatavalt saadi EC TFS väärtused katse läbiviimisel vähemalt kaks korda, seejuures avaldatakse EC TFS väärtus saadud üksikute väärtuste keskväärtusena. Eelistatavamalt korrati katset 3 kuni (või enam) korda, seejuures avaldatakse EC TFS väärtus saadud üksikute väärtuste keskväärtusena. Kõige eelistatavamalt viidi katse läbi nii mitu korda, kui see on piisav EC TFS statistiliselt usaldusväärse keskväärtuse saamiseks eriala asjatundjale tuntud statistiliste meetoditega. EC TFS katses kasutatud leiutisekohastel ühenditel oli EC TFS väärtused väiksemad kui 00 nm. Erinevalt sellest oli eelnevalt tuntud analoogilise struktuuriga ühenditel EC TFS väärtused ligikaudu 11 000 nm. Leiutisekohaseks kasutamiseks sobivad ühendid ja ravimkoostised hõlmavad selliseid, mille korral toimeaine manustatakse ettenähtud eesmärgi saavutamiseks vajalikus toimivas koguses. Täpsemalt öeldes vastab terapeutiliselt toimiv kogus kogusele, mis on piisav näidustuse alla kannatava isiku raviks või näidustuse olemasolevate sümptomite leevendamiseks. Terapeutiliselt toimiva koguse määramine on eriala asjatundajele jõukohane, eelkõige siin toodud üksikasjalik avalikustamise alusel. Lisaks Chk1 inhibiitorile (1-[5-bromo-4-metüül-2-(S)-]morfoliin-2-üülmetoksü)- fenüül]-3-(5-metüülpürasiin-2üül)uureale või selle farmatseutiliselt vastuvõetavat soolale) võib leiutisekohast ravimkoostist valmistada nii, et see hõlmab bioloogiliselt aktiivseid aineid, nagu tsütokiinid, lümfokiinid, kasvufaktorid, muud hematopoeetilised faktorid või nende segu, et vähendada kõrvalnähte, mis tulenevad või on seotud üksnes ravimkoostise manustamisega. Alternatiivselt võivad selliseid bioloogiliselt aktiivseid aineid viia leiutisekohasesse ravimkoostisesse soovitud terapeutilise toime kiirendamiseks. Leiutisekohastes ravimkoostistes adjuvandina kasutatavad bioloogiliselt aktiivsed ained hõlmavad mittepiiravalt M-CSF, GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-
18 9, IL-, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-, IL-16, IL-17, IL-18, IFN, TNF, G-CSF, Meg-CSF, GM-CSF, trombopoietiini, tüvirakkude faktorit, erütropoietiini, angiopoietiine, sealhulgas Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, ja/või inimese angiopoietiini sarnast polüpeptiidi, vaskulaarset endoteliaalset kasvufaktorit (VEGF), angiogeniini, luu morfogeenset proteiin-1 (BMP-1), BMP-2, BMP-3, BMP- 4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14, BMP-, BMP retseptorit IA, BMP retseptori IB, ajus neurotroofset faktorit, tsiliaarset neutroofset faktorit, tsiliaarse neutroofse faktori retseptori tsütokiin-indutseeritud neutrofiilset kemotaktilist faktorit 1, tsütokiin-indutseeritud neutrofiilset kemotaktilist faktorit 2, tsütokiin-indutseeritud neutrofiilset kemotaktilist faktorit 2, endoteliaalrakkude kasvufaktorit, endoteliin 1, epidermaalset kasvufaktorit, epiteelist pärinevat neutrofiilset atraktanti, fibroblasti kasvufaktorit (FGF) 4, FGF 5, FGF 6, FGF 7, FGF 8, FGF 8b, FGF 8c, FGF 9, FGF, happelist FGF, aluselist FGF, gliiarakkude liinist pärinevat neutroofse faktori retseptorit 1, gliiarakkude liinist pärinevat neutroofse faktori retseptorit 2, kasvuga seotud valku, kasvuga seotud valku, kasvuga seotud valku, kasvuga seotud valku, hepariiniga seonduvat epidermaalset kasvufaktorit, hepatotsüütide kasvufaktorit, hepatotsüütide kasvufaktori retseptorit, insuliinisarnast kasvufaktorit I, insuliinisarnase kasvufaktori retseptorit, insuliinisarnast kasvufaktorit II, insuliinisarnase kasvufaktoriga seonduvat valku, keratinotsüütide kasvufaktorit, leukeemiat inhibeeerivat faktorit, leukeemiat inhibeeeriva faktori retseptorit, närvide kasvufaktorit, närvide kasvufaktori retseptorit, neurotrofiin-3, neurotrofiiin- 4, platsenta kasvufaktorit, platsenta kasvufaktorit 2, trombotsüütidest pärinevat endoteliaalrakkude kasvufaktorit, trombotsüütide kasvufaktorit, trombotsüütide kasvufaktori A ahelat, trombotsüütide kasvufaktorit AA, trombotsüütide kasvufaktorit AB, trombotsüütide kasvufaktori B ahelat, trombotsüütide kasvufaktorit BB, trombotsüütide kasvufaktori retseptorit, trombotsüütide kasvufaktori retseptorit, pre-b rakkude kasvu stimuleerivat faktorit, tüvirakkude faktorit, tüvirakkude faktori retseptorit, kasvaja kasvutegurit (TGF), TGF, TGF 1, TGF 1.2, TGF 2, TGF 3, TGF 5, latentset TGF 1, TGF, seondumisvalku I, TGF-iga seonduvat valku II, TGF-iga seonduvat valku III, tuumorinekroosifaktori I tüüpi retseptorit, tuumorinekroosifaktori II tüüpi retseptorit, urokinaasi tüüpi plasminogeeni aktivaatori retseptorit, vaskulaarset endoteliaalset kasvufaktorit ja
19 kimäärseid valke ning nende bioloogiliselt või immunoloogiliselt aktiivseid fragmente. 5 Samuti võib 1-[5-bromo-4-metüül-2-(S)-]morfoliin-2-üülmetoksü)fenüül]-3-(5- metüülpürasiin-2üül)uureat või selle farmatseutiliselt vastuvõetavat soola konjugeerida või aheldada terapeutilise kasutusmeetodi korral selliste abistruktuuriühikutega, mis soodustavad kasulikku omadust (või nõrgendavad soovimatut omadust). Sellised konjugaadid võivad kergendada ühendite kohaletoimetamist konkreetsesse huvipakkuvasse kohta või piirkonda (näiteks tuumorisse), võimaldada ühendite püsiva terapeutilise kontsentratsiooni säilitamist sihtrakkudes, muuta ühendite farmakokineetilisi ja farmakodünaamilisi omadusi ja/või parandada ühendite terapeutilist indeksit või ohutusprofiili. Sobivad abistruktuuriühikud hõlmavad näiteks aminohappeid, oligopeptiide või polüpeptiide, näiteks antikehi, nagu monoklonaalsed antikehad või muud geneetiliselt muundatud antikehad; ning looduslikke või sünteetilisi ligande sihtrakkude või kudede retseptorite jaoks. Muud sobivad abistruktuuriühikud hõlmavad rasvhapete või lipiidide struktuuriühikuid, mis soodustavad ühendite biojaotumist ja/või omastamist sihtrakkudest (vaadake näiteks Bradley jt, Clin. Cancer Res. 7: 3229, 01). Leiutisekohaseid koostiseid võib manustada näidustatud haiguste jaoks standardsel viisil, nagu oraalselt, parenteraalselt, transmukosaalselt (näiteks sublingvaalselt või bukaalse manustamisega), toopiliselt, transdermaalselt, rektaalselt, inhaleerimise teel (näiteks ninakaudselt või sügavale kopsudesse inhaleerimise teel). Parenteraalne manustamine hõlmab mittepiiravalt intravenoosset, intraarteriaalset, intraperitoneaalset, subkutaanset, intramuskulaarset, intratekaalset ja intraartikulaarset manustamist. Parenteraalselt manustada võib samuti kõrgsurvemeetodiga, nagu POWDERJECT TM (Powderject Pharmaceuticals, Plc, Oxford, Inglismaa). Suukaudseks ja bukaalseks manustamiseks võib koostis olla tavalisel viisil valmistatud tablettide või losengide kujul. Tabletid ja kapslid võivad sisaldada tavalisi abiaineid, nagu sideained (näiteks siirup, kummiaraabik, želatiin, sorbitool, tragakant, tärklisepasta või polüvinüülpürrolidoon), täiteained (näiteks laktoos, sahharoos, mikrokristalne tselluloos, maisitärklis, kaltsiumfosfaat või sorbitool),
libiained (näiteks magneesiumstearaat, stearhape, talk, polüetüleenglükool või ränidioksiid), desintegreerivad ained (näiteks kartulitärklis või naatriumtärklisglükolaat) või niisutavad ained (näiteks naatriumlaurüülsulfaat). Tablette võib katta tehnika tasemes tuntud meetoditega. 5 Alternatiivselt võib leiutisekohaseid ühendeid kasutada suukaudsetes vedelates valmististes, näiteks vesi- või õlisuspensioonides, lahustes, emulsioonides, siirupites või eliksiirides. Lisaks võib neid ühendeid sisaldavad valmistised olla enne kasutamist vees või muus sobivas vehiikulis lahustatava kuivtoote kujul. Sellised vedelad valmistised võivad sisaldada tavapäraseid lisaaineid, näiteks suspendeerivaid aineid, nagu sorbitoolsiirup, metüültselluloos, glükoosi- /suhkrusiirup, želatiin, hüdroksüetüültselluloos, hüdroksüpropüülmetüültselluloos, karboksümetüültselluloos, alumiiniumstearaatgeel, ja hüdrogeenitud toidurasvad, emulgeerivaid aineid, nagu letsitiin, sorbitaanmonooleaat või kummiaraabik; mittevesivehiikuleid (mis võivad hõlmata toiduõlisid), nagu mandliõli, fraktsioonitud kookosõli, õliestrid, propüleenglükool ja etüülalkohol; ja säilitusaineid, nagu metüül- või propüül-p-hüdroksübensoaat ja sorbhape. Valmistise võib valmistada ka suposiitidena, mis sisaldavad näiteks tavapäraseid suposiidialuseid, nagu kakaovõi või muud glütseriidid. Inhaleerimiseks mõeldud koostiseid võib tavaliselt valmistada lahuse, suspensiooni või emulsiooni kujul, mida saab manustada kuiva pulbri või aerosooli kujul, kasutades selleks tavapärast propellenti nagu difluorodiklorometaan või triklorofluorometaan. Toopilised ja transdermaalsed koostised hõlmavad tavapäraseid vesi- või mittevesivehiikuleid, nagu silmatilgad, kreemid, salvid, losjoonid ja pastad, või on need raviplaastrite, -mähiste või -membraanide kujul. Lisaks võib leiutisekohaseid koostiseid valmistada manustamiseks süstimise või pidevinfusiooni teel. Süstimiseks mõeldud koostised võivad olla sellisel kujul nagu suspensioonid, lahused või emulsioonid nii õli- kui ka vesivehiikulites ja võivad sisaldada selliseid abiaineid nagu suspendeerivad, stabiliseerivad ja/või dispergeerivad ained. Alternatiivselt võib toimeaine olla pulbrilisel kujul lahustamiseks enne kasutamist sobivas vehiikulis (näiteks steriilses pürogeenivabas vees).
21 Leiutisekohast koostist võib valmistada ka depoovalmistisena. Selliseid pikaajalise toimega valmistisi võib manustada implanteerimise (näiteks subkutaanselt või intramuskulaarselt) või intramuskulaarse süstimise teel. Seega võivad leiutisekohaste ühendite valmistised olla saadud sobivate polümeersete materjalide (näiteks vees lahustuvate polümeeride), hüdrofoobsete ainete (näiteks emulsioonina vastuvõetavas õlis), ioonivahetusvaikude või vähelahustuvate derivaatide (näiteks vähelahustuvate soolade) baasil. Veterinaarias kasutamiseks manustatakse 1-[5-bromo-4-metüül-2-(S)-]morfoliin-2- üülmetoksü)fenüül]-3-(5-metüülpürasiin-2üül)uureat või selle farmatseutiliselt vastuvõetavat soola sobiva vastuvõetava valmistisena tavalise veterinaarpraktika kohaselt. Veterinaar saab konkreetse looma jaoks lihtsalt määrata kõige sobivana annustamisrežiimi ja manustamistee. Siintoodud ühendite ja meetoditega ravitavad loomad hõlmavad mittepiiravalt lemmikloomi, kariloomi, näituseloomi ja loomaaialoomi. SÜNTEETILISED MEETODID Leiutisekohaseid ühendeid võib valmistada järgmiste sünteesiskeemide alusel. Esiteks või siinkirjeldatud Chk1 inhibiitorite valmistamiseks kasutatud alkoksüarüülamiine valmistada erinevate üldiste sünteesiskeemide alusel. Näiteks on üldises sünteesiskeemis 1 kokkuvõtlikult esitatud nitrofenooli reaktsioon in situ moodustunud või sõltumatult valmistatud ja isoleeritud alkoholi aktiveeritud vormiga, et saada saadusena nitrofenüüleeter. Eetri redutseerimisel standardsetes tingimustes saadakse arüülamiin, mida kasutatakse leiutisekohase ühendi saamiseks. Üldine skeem 1 Alternatiivselt saadakse nitroarüüleetrid vastavalt üldisele skeemile 2 ka halonitrobenseeni reageerimisel alkoholiga tugeva aluse nagu naatriumhüdriidi või kaaliumbis(trimetüülsilüül)amiidi manulusel. Neid eetreid võib seejärel redutseerida vastavalt üldise skeemi 1 korral toodud kirjeldusele.
Üldine skeem 2 22 5 Arüülamiini üleviimist uureaks võib teha mitmest sünteesiskeemist ühe järgi. Näiteks võib uurea saamiseks lasta arüülamiinil reageerida pürasiinkarbamaadiga üldise skeemi 3 kohaselt. Üldine skeem 3 Alternatiivselt saadakse üldise skeemi 4 kohaselt atsüülasiidi termiliselt indutseeritud lagunemisel reaktsioonivõimeline arüülisotsüanaat, millel lastakse soovitud uurea saamiseks seejärel reageerida arüülamiiniga. Üldine skeem 4 Järgmise võimaluse kohaselt, mis on toodud üldise skeemina 5, kasutatakse kahe arüülamiini sidestamiseks ja uurea saamiseks fosgeeni või fosgeeniga samaväärset ühendit. Üldine skeem 5 Siinkirjeldatud sünteesides kasutatud lühendid on tund (h), min (min), naela ruuttolli kohta (psi), küllastunud (küll.-d), vesi (H 2 O), deioniseeritud (Dl), isopropüülalkohol (i-proh), platineeritud süsi (Pt/C), lämmastik (N 2 ), vesinik (H 2 ),
23 palladeeritud süsi (Pd/C), plaatinaoksiid (Pt 2 O), magneesiumsulfaat (MgSO 4 ), vesinikkloriidhape (HCI), diisopropüülasodikarboksülaat (DIAD), metüleenkloriid (CH 2 CI 2 ), kloroform (CHCI 3 ), metanool (MeOH), ammoniaakhüdraat (NH 4 OH), tetrahüdrofuraan (THF), N-metüülpürrolidoon (NMP), äädikhape (AcOH), NaOH (NaOH), EtOAc (EtOAc), etanool (EtOH), dimetüülsulfoksiid (DMSO), deuteeritud dimetüülsulfoksiid (d 6 -DMSO), naatriumkarbonaat (Na 2 CO 3 ), deuteeritud kloroform (CDCI 3 ), naatriumvesinikkarbonaat (NaHCO 3 ), naatriumhüdriid (NaH), TEA (TEA), tseesiumkarbonaat (Cs 2 CO 3 ), süsinikdioksiid (CO 2 ), pallaadiumhüdroksiid (Pd(OH) 2 ), väävelhape (H 2 SO 4 ), lämmastikhape (HNO 3 ), naatriumkloriid (NaCI), naatriumsulfaat (Na 2 SO 4 ) ja dimetüülformamiid (DMF). Ühendite valmistamine Järgmised ühendid valmistati eespool avalikustatud üldiste skeemide alusel. Võrdlusühend 1 1-[5-kloro-2-(S)-([1,4]oksasepaan-2-üülmetoksü)fenüül]-3-(5-metüülpürasiin- 2üül)uurea Etapp 1: 2-amino-5-metüülpürasiin. Kolbi lisati aminomaloonnitriil-p-tolueensulfonaatsool (,0 g, 79 mmol) ja püruvaldehüüd-1-oksiim (6,88 g, 79 mmol). Lisati i-proh (140 ml) ja saadud kollast suspensiooni segati toatemperatuuril 18 h, selle aja jooksaul kogunes kollane sade. Segu filtriti ja sadet pesti i-proh (2 x 50 ml) ja DI H 2 O-ga ( ml), seejärel lüofiliseeriti, et saada 2-amino-3- tsüano-5-metüülpürasiin-n-oksiid (,7 g). Pürasiin-N-oksiid suspendeeriti MeOH (22 ml) ja AcOH (5 ml) segus. Sinna lisati ettevaatlikult 5% Pt/C (1,6 g) ja Darco KB-B (8 g). Segust juhiti läbi 18 h jooksul H 2 rõhul 60 psi. Reaktsioon peatati % NaOH (34 ml) abil ja segust puhuti min
24 jooksul läbi N 2. Segu filtriti läbi niiske tseliitpadruni ja pesti MeOH-ga (4 x 0 ml). Filtraat kontsentreeriti in vacuo kuni veerandini esialgsest mahust. Filtraat lahjendati EtOAc-ga (0 ml) ja pesti 5% NaOH-ga ( ml) ning ekstraheeriti uuesti EtOAc-ga (2 x 70 ml). Orgaanilised kihid ühendati ja pesti NaCl küll.-d lahusega ( ml), filtriti ja kontsentreeriti in vacuo, et saada oranž kleepuv aine (5,16 g). Etapp 2: (5-metüüpürasiin-2-üül)karbaamhappe fenüülester. 2-amino-5- metüülpürasiin (5,16 g, 47 mmol) lahustati CH 2 CI 2 -s (52 ml), segati ja jahutati N 2 atmosfääris temperatuurini 0 C. Sinna lisati püridiin (4,8 ml, 59 mmol) ja seejärel tilkhaaval min jooksul fenüülkloroformiaat (6,2 ml, 59 mmol), tekkis sade. Segu segati 1 h temperatuuril 0 C. Seejärel peatati reaktsioon 0, M HCI (40 ml) ja veevaba eetriga (50 ml) ja segati min temperatuuril 0 C. Sade eraldati filtrimisega, pesti Dl H 2 O ( ml) ja eetriga (2 x ml) ja kuivatati vaakumis, et saada saadus valge koheva pulbrina (7,4 g). Etapp 3: (S)-2-hüdroksümetüül-[1,4]oksasepaan-4-karboksüülhappe tertbutüülester. 0 ml ümarkolbi lisati (S)-(+)-bensüülglütsidüüleeter, (1,31 g, 7,9 mmol), 3-bensüülaminopropaan-1-ool (1,3 g, 7,9 mmol) ja ml EtOH. Segu kuumutati h temperatuuril 40 C. Reaktsioonisegu jahutati ja kontsentreeriti in vacuo ning saadud õlijat saadust kasutati täiendava puhastamiseta. Diool viid 0 ml ümarkolbi ja lahustati 75 ml kuivas püridiinis. Lahus jahutati temperatuurini 0 C ja ühe portsjonina lisati tolueensulfonüülkloriid (5,27 g, 27,7 mmol). Segu segati 6 h, seejuures hoiti reaktsioonisegu temperatuur rangelt 0 C juures. Reaktsioon peatati külmas segu 50 ml NaHCO 3 küll.-d vesilahusega. Lisati täiendavalt ml vett ja segu ekstraheeriti kolm korda EtOAc 0 ml portsjonitega. Ühendatud orgaanilised ekstraktid kuivatati Na 2 SO 4 -ga ja kontsentreeriti in vacuo. Alkohol puhastati kolonnkromatograafiliselt gradientelueerimisega 50% EtOAc ja heksaanide seguga. Tulemusena saadi 1,39 g tosüülalkoholi kollase õlina. Alkohol lahustati 50 ml DMF-is ja jahutati temperatuurini 0 C. Külmale segatavale segule lisati ettevaatlikult 95 massiprotsendiline NaH (0,29 g, 11,5 mmol). Reaktsioonisegu segati min temperatuuril 0 C, seejärel lasti aeglaselt soojeneda toatemperatuurini ja segati 6 h. Reaktsioon peatati segus ettevaatlikult