Chapter: Short review of nanomedicine as the most exciting challendge of 21. century

Poglavlje: Kratak osvrt na nanomedicinu, kao najuzbudljiviji izazov 21. veka Chapter: Short review of nanomedicine as the most exciting challendge of 21. century Knjiga: Novi materijali i nanotehnologija Book: New materials and nanotechnology Univerzitet Banja Luka 2012

Sadržaj 1. Nanotehnologija 1.1. Istorija 1.2. Termin 1.3. Implikacije nanotehnologije 1.4. Oblast primene nanotehnologija 1.5. Primena u medicini 2. Nanomedicina 2.1. Pregled razvoja nanomedicine 2.2. Dijagnostika 2.3. Isporuka lekova 2.3.1. Osnovni principi ciljane isporuke lekova 2.3.2. Proteinski i peptidni sistemi isporuke lekova 2.3.3. Terapija kancera 2.3.4. Dendrimeri i nanočestično ciljanje 2.3.5. Vizualizacija 3. Egzotične nanostructure kao osnova medicine 3.1. Nanomeš structure 3.2. Nanopin filmovi 3.3. Nanoprsten structure 3.4. Nanošipke i nanožice 3.5. Nanocevi 3.6. Nanotorusi 3.7. Karbonski pupoljci - nanobads 3.8. Kvantne tačke 3.9. Helikoidne nanostrukture 3.10. Nanoopne - nanoshell structure 3.10.1. Nanoopna strukture u tretmanu kancera 4. Biomedicinska dijagnostika 4.1. Biočip 4.2. Proteini kao funkcionalni elementi u dijagnostici 4.2.1. Streptavidin 4.2.2. Biotin

5. Inžinjerstvo tkiva 5.1. Principi inžinjerstva koštanih tkiva 5.2. Hijerarhija strukturnog dizajna koštanih tkiva 5.2.1. Mikrostruktura kostiju 5.2.2. Submikrostruktura koštanih tkiva 5.2.3. Nanostrukturni nivo: kolagenska vlakna veličine 100 nm- 1µm 5.2.4. Subnanostrukturni nivo: kristali i kolagenska vlakna veličine do 10 nm 5.3. Mehanizam nastajanja prirodne kosti 5.4. Kreiranje osnovnih strukturnih elemenata skafolda 5.4.1. Metode sinteze CHA i osobine dobijenih prahova 5.4.2. Skafoldi i inžinjerstvo koštanih tkiva 5.4.2.1. Materijali 5.4.2.2. Matične ćelije 5.4.2.3. Faktori rasta i transfer ćelijskih signala unutar skafolda 5.4.2.4. Bioreaktori - sredina rasta koštanog tkiva 5.4.2.5. Biomimetski materijali 5.4.2.6. Mineralizacija koštanog skafolda 5.4.2.7. Nanotopografija 5.4.2.8. Savremeni koncepti konstrukcije skafolda 5.4.2.9. Različite metode brzog prototajpinga 5.4.3. Dodatne primene nanočestičnih sistema na bazi superparamagnetika i NMR obeleživača 6. Buduće medicinske primene molekulskih nanotehnologija 6.1. Molekulsko asembliranje 6.2. Nanofabrike 6.3. Samoreplikacija 6.4. Molekulske mašine 6.4.1. Savremeni uvidi i studije 6.4.2. Primeri molekulskih mašina 6.4.2.1. Sintetičke mašine 6.4.3. Biološke molekulske mašine 6.4.4. Nanoroboti 6.4.5. Mašine za popravku ćelija 6.4.6. Nanonefrologija 6.4.7. Neuroelektronski interfejsi 7. Zaključna razmatranja 8. Literatura

1. Nanotehnologija 1.1. Istorija Gordon Mur iz Intel kompanije prognozirao je 1965 godine, da će minijaturizacija tranzistora usloviti da oni budu duplo manjih dimenzija nakon svakih narednih 18 meseci. Njegova najoptimističkija predvidjanja, ipak u medjuvremenu su znatno prevazidjena, jer je veličina tranzistora smanjena sa 10 μm na 45-65 nm u 2007; pri čemu najmanji do sada realizovan transistor sastojao se iz grubo samo oko 180 atoma silicijuma. Taj fenomen minijaturizacije elektronskih uredjaja, posebno tranzistora, danas je poznat pod imenom Murov zakon [1]. Pored minijaturizacije elektronskih sklopova, istovremeno desile su se velike promene u oblasti hemije, biohemije i molekularne genetike, čiji je razvoj išao u drugom smeru. Poslednjih četvrt veka došlo je i do izuzetnog napretka u mogućnosti kontrole i manipulacije svetlošću. Naime, danas je moguće generisati svetlosne impulse čije je vreme trajanja manje od femtosekunde (1fs = 10-15 s). Navedene promene u tehnici, hemiji, biohemiji, molekularnoj genetici, sa sve sofisticiranijim tehnikama dijagnostike u medicini vezanim za primenu optoelektronskih i paramagnetnih materijala dovele su do velikog napretka tehnike i tehnologije, menjajući potpuno strategije i koncepte razvoja različitih ljudskih delatnosti [2]. Sa navedenim otkrićima, praktično je započeo novi vek u u primeni nanotehnologija u medicini. Time je i nanomedicina etablirana kao nova grana medicine, medicine koja se zasniva na potpuno novim osnovama primene nanotehnologija. Oblasti primene nanotehnologija u medicini dominatno su vezane za oblasti isporuke lekova, inžinjerstva tkiva i unapredjenja medicinske dijagnostike do nivoa registrovanja potencijalne bolesti detekcijom promena u metabolizmu ćelija pre nego što se bolest i manifestovala na očigledan način. Sve te tri moćne tehnologije koje su se susrele medjusobno na nanoskalnom nivou praktično su revolucionisale elektroniku, biologiju i medicinu. One su omogućile razvoj novih grana u molekulskoj biologiji i medicini kao što je biomolekulska tehnologija, a u nekom bliskijem ili udaljenijem vremenu i molekulsko inžinjerstvo i razvoj molekulskih mašina, njihovih sklopova, inžinjerstvo novih tkiva i organa, itd. [3, 4]. Pored navedenih promena u nanomedicini ovakva istraživanja na fundamentalnom nivou vodiće velikim promenama u molekulskoj biologiji, biofizici,

bioinformatici, genomu, primeni novih nanomaterijala u biosenzorima, kompjuterskim tehnologijama, gustini pohranjivanja informacija, brzini rada kompjutera (neslućeno je povećavajući), promena vezanih za konverziju energije, itd. [5]. Prvi konceptualni koreni nanotehnologija kao posebne vrste tehnologija, tehnologija budućnosti, vezani su za delo There's Plenty of Room at the Bottom Ričarda Fejmana iz 1959, objavljeno 1959 od strane Američkog fizičkog društva u Kalteku. Fejnman predvidja da će u budućnosti biti moguće manipulisati individualnim atomima i molekulima koristeći precizan alat, koji će tokom vremena biti sve unapredjeniji i unapredjeniji, stvarajući mogućnosti rada sa sve manjim i manjim setom preciznih alata, koji će moći da ispunjavaju sve složenije zadatke na sve nižoj dimenzionoj skali [6]. Prelazak na sve nižu i nižu dimenzionu skalu, usloviće na fundamentalnom nivou potpunu promenu u načinu ispoljavanja različitih fizičkih fenomena, time što će u takvim slučajevima za dovoljno male dimenzije nanočestičnih sistema, gravitacija gubiti na značaju, dok će površinski napon i Van der Valsove sile imati sve veći značaj [6, 7, 8]. Kao potencijalne prekretnice u razvoju nanotehnologija i molekulskog inžinjerstva Fejnman je formulisao izazove vezane za konstrukciju nanomotora (prvi izazov), i skaliranje pisma do nivoa da ga je moguće uneti u Enciklopediju Britanika vrhom pera (drugi izazov). Prvi problem razrešio je, na veliko iznenadjenje Fejnemana, Vilijam McLelan 1960. godine, a drugi Tom Njuman 1985 [1, 6, 7] 1.2. Termin Termin nanotehnologija prvi je uveo Norio Taniguchi. Prema njegovoj definiciji nanotehnologija je definisana kao vrsta tehnologije koja obuhvata procesiranje, separaciju, konsolidaciju i deformaciju materijala koji se sastoji od malog broja atoma ili molekula. Danas je ta definicija proširena na tehnologije koje obuhvataju procesiranje čestica dimenzija do 100 nm. Još bolja definicija nanotehnologija bila bi da su to tehnologije koje obuhvataju procesiranje struktura koje pokazuju izražene kvantnomehaničke efekte, kao kod materijala koji se sreću pod nazivom kvantne tačke, za koje je kasnije data potpunija definicija [5]. Kao prekretnice u razvoju nanotehnologija mogli bi biti označeni procesi dobijanja uniformnih tankih filmova debljine jednog atomskog sloja, patentiranim od strane Tuomo Suntole u Finskoj 1974. godine. K.Erik Dreksler 1980. godine, kroz svoju knjigu «Kreativne mašine» promovisao je tehnološki značaj nanoskalnih fenomena i uređaja. Drekslerova vizija nanotehnologija se često naziva molekulska nanotehnologija ili molekulsko procesiranje. On nagoveštava dolazak ere nanotehnologija, nanosistemna: i molekulskog mašinstva [9]. Ričard Džons 2004. napisao je knjigu Sofisticirane mašine (nanotehnologija i život) publikovanu od strane Oksford Univerziteta. U toj knjizi on opisuje radikalnu nanotehnologiju kao deterministički/mehanističku ideju o nano inžinjerstvu mašina, koje se zasnivaju na nanoskalnim izazovima kao što su kvašenje, krutost, braunovsko kretanje, visoka viskoznost. On je objasnio da meke nanotehnologije ili još približnije biomimetske nanotehnologije nisu najpogodnije za dizajniranje funkcionalnih nanouredjaja, jer mogu usloviti brojne probleme pri samoasembliranju na nanoskali [2, 8, 9, 10].

Za eksperimentalni razvoj nanotehnologija i nanonauka najzalužnijim se smatraju dva glavna otkrića 1980. Prvo je otkriće klasternih nauka i tunelske mikroskopije [11, 12], te otkriće fularena u 1985. i strukturno opisivanje karbonskih nanotuba, koje je usledilo nekoliko godine kasnije. Drugo otkriće je razvoj sinteze poluprovodničkih nanokristala, koji je doveo do brzog porasta broja poluprovodničkih nanočestičnih sistema koji su poznati pod nazivom kvantne tačke [13, 14]. Potom sledi niz zanimljivih otkrića, medju kojima su posebno značajna otkrića vezana za sintezu i prečišćavanje fularena iz 1990. od strane Hufman-a i Kretchemer-a sa Arizona Univeziteta, te brojna otkrića vezana za funkcionalizaciju fularena i karbonskih nanotuba [15]. 1.3. Implikacije nanotehnologije Implikacije nanotehnologija prisutne su u svim oblastima delatnosti modernog čoveka: medicini, etici, životnoj okolini, inžinjerstvu, biologiji, hemiji, računarima, nauci o materijalima, vojnoj industriji i komunikacijama. Osnovne prednosti nanotehnologija vezane su za unapredjenje proizvodnje sistema za prečišćavanje voda, energetskih sistema, te unapredjenje nanomedicine, proizvodnje hrane, autoindustrije itd. Nano optimisti, uključujući i mnoge vlade u naprednim delovima sveta procenjuju da će nanotehnologije omogućiti proizvodnju obilja benignih materijala za životnu sredinu, isporuku čiste vode, atomski inžinjeriranu hranu uz veću produktivnost i sa manje radne snage, jeftiniju i veću proizvodnju energije, čistu i visoko profitabilnu industriju, radikalno bolje formulacije lekova, dijagnostiku i zamenu organa, mnogo veće stokiranje informacija i veći komunikacione kapacitete, interaktivnu inteligentnu primenu informacija, porast ljudskih performansi kroz konvergenciju tehnologija itd. Uz sve to proizvodi nanotehnologija zahtevaju manji rad i prostor, lakše održavanje, visoko produktivni su, imaju niže cene i umerenije zahteve za energijom [16, 17]. Pored prednosti, primena nanotehnologija uključuju u sebe i različite do danas nepoznate rizike vezane za čovekovu okolinu, zdravstvenu sigurnost i različite druge negativne efekte primene nanočestica.vreme u kome živimo aktuelizuje tranziciju tradicionalne industrije na proizvode nanotehnologija, kod vojnih primena iznalaženje sredstva za vodjenje bioloških ratova, primene u implantima i sredstvima za nanosenzorsko osmatranje, koja daju mogućnost kao nikad pre u istoriji čovečanstva zloupotrebe i ugrožavanja privatnosti. Potencijalni rizici za zdravlje, negativne efekte primene nanomaterijala na ljudsku biologiju, životnu okolinu, te otvorena socijalna pitanja, i mogući efekti nanotehnoloških uredjaja na politiku i ljudsku interakciju, kao i specifični rizici vezani za spekulativne vizije molekulske nanotehnologije, otvaraju se kao veoma ozbiljne teme, koje zahtevaju mnogo egzaktnije odgovore [2, 5, 9, 18-20]. Sa stanovišta uticaja na zdravlje razlikujemo dva tipa nanostruktura: nanokompozite, nanostrukturno dizajnirane površine i nanokomponente (elektronika, optika, senzori) gde nanoskalne čestice su inkorporirane u substance, material ili uredjaj i tako fiksirane i slobodne nanočestice. Slobodne nanočestice mogu biti elementi nanoskalnih vrsta ili prosto jedinjenja, ali i kompleksnih jedinjenja gde nanočestice pojedinačnih elemenata su prekrivene sa drugom substancom (prekrivene nanočestice ili core-shell» nanočestice. Slobodne nanočestice su opasnije. Njihova toksičnost još uvek

je nepoznata i nema veze sa toksičnošću makromaterijala. Prah ili tečnost koji sadrže nanočestice gotovo nikad nisu monodisperzni i sadrže neku raspodelu. To još više komplikuje analizu rizika primene takvih sistema, jer veće nanočestice mogu imati različite osobine u odnosu na manje. Takodje, nanočestice pokazuju tendenciju agregiranja, a kao što logično sledi agregati imaju različite osobine u odnosu na individualne nanočestice [21-25]. U razvijenim zemljama sveta, brigu o takvim problemima vezanim za zdravlje i okolinu vode nacionalne institucije za zdravlje i sigurnost okoline i komisije za sigurnost proizvoda potrošača [16]. 1.4. Oblasti primene Kao što je već u prethodnim izlaganjima naglašeno, najčešće nanomaterijali i na njima zasnovani poboljšani proizvodi, imaju sasvim drugačije karakteristike od tzv bulk materijala. To se dešava zbog toga što nanočestični materijali imaju mnogo veću specifičnu površinu, tako da njihove brojne osobine, medju kojima su primera radi i optičke osobine, kao što je fluorescencija, postaju funkcije prečnika čestica. Pored toga, kao što je već odavna poznato, u kompaktnim materijalima nonočestice jako utiču na unapredjenje njihovih mehaničkih svojstava, kao što su elastičnost i krtost. Npr. tradicionalni polimeri, ako se ojačaju sa nanočesticama, postaju novi materijali koji zbog svoje male mase i izuzetnih mehaničkih karakteristika mogu zameniti čak i metale. Generalno, nanotehnologije poboljšavaju osobine materijala, smanjuju njihovu masu, povećavajući njihovu stabilnost i unapredjujući njihovu funkcionalnost. Zbog toga, aplikacije nanotehnologija u najrazličitijim oblastima delatnosti čoveka, kao što su medicina, koja uključuje dijagnostiku, isporuku lekova i inžinjerstvo tkiva i organa, su sve raširenije. Pored nanotehnologija koje su direktno ili indirektno vezane za medicinu, nanotehnologije su sve zastupljenije i u oblasti hemije, katalize, nanofiltracije, redukcije potrošnje energije, informacija, komunikacija, kompjutrskih tehnologija, displeja, nano hrane, poljoprivrede itd [21-33]. 1.5. Primena u medicini Biološka i medicinska istraživanja danas su usmerena ka iznalaženju materijala pogodnih za primene u svojstvu kontrastnih agenasa za tzv. imaging ćelija i za terapeutske primene kod tretiranja različitih bolesti, medju kojima poseban značaj ima tretman kancera. Da bi se opisalo ovo hibridno polje primene nanomaterijala i nanotehnologija uvode se nove naučne discipline pod nizom termina, kao što su biomedicinske nanotehnologije, bionanotehnologije i nanomedicina. Konceptualno, funkcionalnost materijala za date primene traba da bude obezbedjena kačenjem na njihovoj površini bioloških molekula i struktura. Sama veličina čestica nanomaterijala, koja je slična veličini bioloških molekula i struktura, upućuje na moguću primenu nanomaterijala u in vivo i in vitro biomedicinskim istraživanjima. Na taj način, integracija nanomaterijala sa biologijom vodi ka razvoju i primeni nanomaterijala u

konstrukciji savremenih dijagnostičkih uredjaja, kontrastnih agenasa, analitičkih alata, primena u fizikalnoj terapiji i nosačima lekova [30, 34-36]. 2. Nanomedicina Nanomedicina je grana medicine koja se zasniva na medicinskoj primeni nanotehnologija, kroz primenu nanomaterijala, nanoelektronskih biosenzora i molekulske nanotehnologije. Neki od aktuelnih problema primene nanomaterijala u nanomedicini povezan je sa razumevanjem toksičnosti nanomaterijala i njihovog uticaja na životnu okolinu. Značaj nanomedicinskih istraživanja i nanomedicine u savremenom svetu je izuzetan i njemu se pridaje sve veći i veći značaj. Zbog toga su definisane strategije takvih istraživanja i primena takvih tehnologija na nacionalnim nivoima. Ova istraživanja pripadaju grupi istraživanja od posebnog interesa za razvoj nacionalnih ekonomija, jer se očekuje da će jedna od najznačajnih grana ljudske delatnosti biti oblast nanomedicine, vezana za uspešnu sanaciju najrazličitijih neizlečevih obolenja i za proizvodnju lekova na potpuno novim osnovama spajanja fitofarmacije i humane medicine, kroz genetska ukrštanja pogodih biljnih vrsta (primer duvana) sa humanom DNK radi proizvodnje vrlo specifičnih biopolimera deficijentnih u organizmima bolesnika, kao i proizvodnju nanočestičnih sistema koji će biti vodjeni pametnim molekulima na mesto bolesti tkiva radi terapije, kao kod terapije kancera [37-40]. Poseban deo nanomedicine predstavlja tzv. nanomedicina usmerena na inžinjerstvo tkiva, koja će omogućiti reparaciju i potpunu zamenu oštećenih tkiva novim tkivima. Time će biti otvoren put sanacije obolelih organa, koji neće zahtevati donatore i koji će imunološki biti u bliskoj vezi sa tkivom pacijenata kod kojih se vrši zamena oštećenih tkiva i organa. Futuristički, jedno od zanimanja za koje se očekuje da će biti posebno atraktivno u decenijama koje dolaze će biti repariranje obolelih tkiva i organa i uzgajanje tkiva pogodnih za njihovu reparaciju. Govori se o tzv. fabrikama tkiva i organa, kao o jednoj potpuno novoj grani delatnosti. U fitofarmaciji to će biti proizvodnja i ekstrakcija humanih biopolimera iz biljaka nastalih ukrštanjem DNK biljaka i čoveka. Takav korak će imati izuzetan značaj u približavanju medicine jednom potpuno novom konceptu koji je umesto na hemiji, zasnovan ne celovitom prilagodjavanju prirodnih resursa čoveku. U nekoj sasvim naprednoj fazi razvoja nanomedicine očekuje se da će čovek ovladati postupcima samoasembliranja vrlo složenih funkcionalnih uredjaja, koji će sledeći logiku bioloških mašina u ljudskom telu biti u stanju (slično enzimima, koji umeju da prepoznaju različite ćelijske receptore), umeti da dijagnostifikuju promene na ćelijama, da se samoorganizuju i samorepliciraju do nivoa koji će obezbediti funkcionalno izvršenje različitih složenih zadataka, vezanih za reparaciju zidova ćelija, a potom i celih organa, kojima te ćelije pripadaju. Zbog svega navedenog, nanomedicinska istraživanja u svetu, posebno u USA imaju apsolutni prioritet u strategijama razvoja i strategijama istraživanja na nacionalnom nivou. U USA ona su kontrolisana od strane Nacionalnog instituta za zdravlje. Sve veći značaj ove grane medicine pokazuje nagli porast broja centara za nanomedinska istraživanja (u 2005 u celom svetu bilo ih je samo 5, da bi do polovine 2006 godine, osnovalo se još dodatnih 130 centara). Danas broj takvih centara lociranih u raznim tehnološki razvijenim delovima sveta broji se već na hiljade [9, 34, 36-40].

2.1. Pregled razvoja nanomedicine Razvoj nanomedicine je izuzetno dinamičan i već danas u njenom okviru koriste se setovi istraživačkih alata i kliničkih uredjaja, svakodnevno, sa sve većim i većim funkcionalnim zahtevima. Inicijative na nivou nacionalnih nanotehnologija, očekuju nove primene nanomaterijala u farmaceutskoj industriji, koja treba da uključi unapredjene sisteme isporuke lekova, nove terapije i in vivo imaging. Neuro-elektronske medjupovršine i drugi nanoelektronski senzori su takodje, posebno atraktivan cilj istraživanja u oblasti nanomedicine. Spekulativno polje nanotehnologija vezano za mašine za popravljanje ćelija, očekuje se da u celosti revolucioniše medicinu. Nanomedicina već danas je i snažna industrija koja je u 2004 godini dosegla prihode od 6.8 milijardi dolara, da bi danas te vrednosti premašivale desetine milijardi dolara. U toj oblasti, rade hiljade kompanija, a sume novca koje se izdvajaju za takvu vrstu istraživanja dosežu desetine milijardi dolara. Nanomedicina kao industrijska grana delatnosti, u izuzetno snažnoj je ekspanziji i svaki dan ima sve veći uticaj na globalna kretanja u ekonomiji [9, 25, 27]. 2.2. Dijagnostika U dijagnostici, u medicini, magnetne nanočestice vezane za odgovarajuća antitela, koriste se da obeleže specifične molekule, strukture i mikroorganizme, dok se čestice nanozlata vezane za kratke segmente DNK koriste za detekciju genetskih sekvenci biološkog uzorka. Pored toga, za višebojno optičko kodiranje za biološke testove primenjuju se različiti sistemi organizovani kao tzv. kvantne tačke u polimernim mikroperlama. Na kraju, nanoporna tehnologija koristi se za analizu nukleinskih kiselina tako što vibracije nukleotidnih žica-struna konvertuje direktno u elektronski zapis [41-43]. 2.3. Isporuka lekova Savremene tendencije u lečenju bolesnika, koje se zasnivaju na što efiksnijem iskorištenju lekova i što manjoj njihovoj potršnji, vode ka tehnologiji primene leka kroz tzv. dirigovano ciljanje lekom obolelog tkiva. Na taj način se značajno smanjuje depozicija leka u organizmu, time što je omogućeno da se deponuje aktivni agens-lek tačno u oboleli organ u dozi koja je za izlečenje potrebna. To smanjuje ukupnu potrošnju leka, cenu lečenja i ljudsku patnju, uzrokovanu necelishodnom potrošnjom lekova. Jedan od primera takvih nosača lekova su specifične vrste biopolimera-dendrimeri i nanoporozni materijali. Oni mogu nositi na sebi nakačene male molekule leka, transportujući ih potom na željenu lokaciju [37, 38, 44-46]. Druga verzija tehnologije ciljane isporuke lekova, zasniva se na primeni malih elektromehaničkih uredjaja, koji aktiviraju lekove koji su uneti na tačno definisanim lokacijama (tretman kancera koloidnim zlatom ili pomoću superparamagnetnih nanomaterijala). Pri tome, neki od takvih aktivnih nanočestičnih sistema delovanjem odgovarajućih magnetnih polja usmerava se na tačno utvrdjene lokacije, na kojima se nalaze obolela tkiva i organi unutar organizma (superparamanetici). Nanotehnologija, na taj način, otvara potpuno nove koncepte lečenja, time što daje mogućnost visoke efikasnosti iskorištenja leka, obezbedjuje kontrolisani pad njegove koncentracije tokom vremena, u okviru granica potrebnih za izlečenje obolelih tkiva-organa, znatno

smanjujući njegovu ukupnu dozu i na taj način toksičnost izazvanu lekom, što je veliki problem konvencionalng načina lečenja, kod koga se lek uvek raspodeljuje na ceo organizam. Zbog toga da bi se obezbedila njegova efikasnost, (zbog veoma velikog pada koncentracije u kratkom vremenu, često i ispod praga nužne koncentracije za izlečenje) danas se uzimaju prevelike doze lekova koje truju ostale zdrave organe i izazivaju brojne neželjene posledice [37, 38]. Medicina zasnovana na ovakvim principima lečenja naziva se i ciljana ili personalizovana medicina, koja je organizovana uvek prema pacijentu i njegovim individualnim potrebama. Pri lečenju pacijenta ona obezbedjuje dovodjenje leka precizno u obolelo tkivo-organ, u potrebnoj dozi. Medicina organizovana na taj način, u budućnosti, znatno će smanjiti potrebe za lekovima, njihovu potrošnju i cenu tretmana lečenja, stvarajući potpuno nove osnove za nove strategije lečenja pacijenata, reformišući posledično organizaciju javnog zdravstvenog sistema, u celosti. 2.3.1. Osnovni principi ciljane isporuke lekova Savremeni pristup distribuciji lekova u nanomedicini stavlja u prvi plan razvoj nanočestica ili molekula poboljšane bioprihvatljivosti unutar organizma. Lokalna bioprihvatljivost nekog leka, znači prisustvo njegovih molekula tamo gde su potrebni u telu i gde će najbolje da deluju. Tako se bioprihvatljivost fokusira na maksimiranje bioprihvatljivosti leka na specifičnom mestu-mestu obolenja tokom datog perioda. Da bi se govorilo o lokalnoj bioprihvatljivosti leka, nužno je prethodno postići njegovo molekulsko ciljanje u izabranu okolinu pomoću dobro dizajniranih nanoinžinjerskih uredjaja. Idealno bi bilo postići da se isporuka leka u zadatu okolinu odvija sa ćelijskom preciznošću. To bi bio ogroman napredak za medicinu, jer danas se više od 65 milijardi dolara baca, zbog rasipanja leka na organizam u celosti, umesto precizne njegove distribucije na dobro definisanu okolinu obolelog tkiva/organa [4, 17, 30, 38]. In vivo imaging je druga vrsta nanoalata i nanouredjaja koji se razvijaju. Primera radi, koristeći nanočestične kontrastne agense, slike sa ultrazvukom i magnetnom rezonancom pokazuju izuzetno dobar kontrast. Pored toga, posebno važan smer razvoja nanomedicinskih tehnologija je tretiranje teških obolenja, kao što je kancer. Šta će se sve desiti u budućnosti u ovoj oblasti je van svake mašte. Tome će doprineti i samoasemblirajući biokompatibilni nanouredjaji koji će detektovati, procenjivati/evaluirati, tretirati i praviti automatski medicinske izveštaje za kliničke lekare. Sistem isporuke lekova, lipidne i polimerne nanočestice, već danas se mogu dizajnirati tako da bitno poboljšaju farmakologiju i terapeutske karakteristike lekova. Takva ciljana primena lekova vodi ka velikim promenama u farmakokinetici i biodistribuciji lekova, jer nanočestice već zbog svoje veličine pokazuju neobične osobine, značajno poboljšavajući efekat isporuke leka. Razvijaju se kompleksni sistemi isporuke lekova sa mogućnošću da predaju lek kroz ćelijske membrane, unutar ćelijske citoplazme. Efikasnost primene leka izuzetno je značajna kod mnogih bolesti koje zavise od efikasnosti procesa koji se odvijaju unutar ćelija. Bioproteini kao delovi leka koji se isporučuje, pomažu da lek lakše i efikasnije udje unutar ćelija. Pri tome takvi bioproteini treba da budu na pogodan način funkcionalizovani da bi mogli izazvati već unapred poželjni odgovor ćelije. To čini lek efikasnijim. Lekovi koji se smeštaju u definisanu okolinu, potom se aktiviraju pomoću posebnog signala okruženja. Npr. lek slabe rastvorljivosti, u sistemu isporuke leka smestiće se na mesto na kome egzistiraju

istovremeno i hidrofilna i hidrofobna sredina. Iako potencijalno lek uvek može uzrokovati i oštećenja odgovarajućih tkiva, regulisanjem sistema isporuke leka i njegovog otpuštanja moguće je eliminisati i takve probleme. Tako, primera radi u konvencionalnoj farmakokinetici ako se lek brzo izdvaja iz tela tela, tada se pacijentima daju najčešće velike doze leka, dok kod lokalne isporuke leka ta se doza značajno redukuje. Slaba biodistribucija leka u konvencionalnoj farmakokinetici je problem koji utiče na normalna tkiva kroz široku distribuciju, dok kod nanočestične ciljane isporuke lekova znatno je smanjena zapremina distribucije leka i redukovan efekat uticaja leka na druga tkiva izvan obolelog tkiva. Tako, potencijalni nanolekovi delovaće vrlo specifično po veoma dobro utvrdjenim mehanizmima. Njihov značaj na razvoj nanotehnologija i nanonauka kroz razvoj potpuno novih lekova čiji su bočni neželjeni efekti veoma mali, već sad je nesporan.[30, 38, 50] 2.3.2. Proteinski i peptidni sistemi isporuke Već identifikovane i dosad istražene proteinske i peptidne multiple biološke aktivnosti u ljudskom telu pokazuju obećavajuće mogućnosti u tretmanu različitih, još uvek neizlečivih, bolesti. Takvi molekuli predstavljaju novu generaciju lekova koji se nazivaju biofarmaceuticima. Za ciljanu i kontrolisanu isporuku takvih biofarmaceutika moguće je koristiti kombinaciju nanomateriala i dendrimera. Tako dobijeni lekovi predstavljaju novu grupu lekova tzv.nanobiofarmaceutika [30, 38] 2.3.3. Terapija kancera Male nanočestice poseduju osobine značajne za onkologiju, posebno kod primene kod imaging tehnika. Kvantne tačke (nanočestice sa kvantnom konfiniranom strukturom, tako da njihova veličina može da tuneluje svetlosnu emisiju, koriste se kod magnetne rezonance (magnetno rezonantni imaging ) dajući izuzetno dobre slike mesta tumora. Takve nanočestice svetlije su mnogo od organskih boja i samo jedan svetlosni izvor je nužan za njihovu ekscitaciju, jer korišćenje fluorescentnih kvantnih tačaka produkuje jak kontrast slike i ima manju cenu, nego kad se organske boje koriste kao kontrastni medij. Jedini nedostatak ovakvih čestica je njihova značajna toksičnost. Danas su već u primeni jeftini test senzori, koji se sastoje od hiljada nanožica sposobnih da detektuju proteine ili druge biomarkere zaostale u ćelijama kancera. Oni mogu dijagnosticirati kancer u ranom stadiju iz svega nekoliko kapi krvi pacijenta. Na osnovu već navedenog, očigledno je da su osnovni zahtevi korišćenja sistema za isporuku lekova efikasna enkapsulacija leka, uspešna isporuka leka na željeno mesto u telu i uspešano oslobadjanje leka na tom mestu. Poznato je, takodje, da nanočestice CdSe (kvantne čestice) kad se izlože UV svetlosti zrače. Kad se injektuju one cure unutar kancera. Hirurg može da vidi zračenje tumora i to mu pomaže da ga preciznije ukloni [3, 10, 18, 51, 52].

Sl. 1: Šematska ilustracija koja pokazuje kako nanočestica ili drugi lek za kancer mora biti korišćen u tretmanu kancera, (Nature nanotechnology 3 (1) (2008): 12 13.) Druga osobina nanočestica je njihova velika specifična površina i odnos površina zapremina, tako da se mnoge funkcionalne grupe mogu nakačiti na nanočesticu, koje kao pametni biopolimeri imaju zadatak da pronadju ćelije tumora i vežu se za njih. Dodatno, male nanočestice (10 do 100 nm) dozvoljavaju preferentno akumuliranje na mestima tumora (jer tumoru nedostaje limfni drenažni sistem). Vrlo uzbudljivo istraživačko pitanje je, kako učiniti da ove čestice koje služe za slikanje tumora, postanu multifunkcionalne, tako da mogu jednovremeno detektovati, slikati i potom terapeutski tretirati tumor (sl.1). Takav obećavajući tretman bi možda mogao uskoro da zameni radijaciju i hemoterapiju. John Kanzius je pronašao radiomašinu koja koristi radiotalase i karbonske ili zlatne čestice da razori ćelije kancera. Prof. Jennifer West sa Rice Univerziteta, pokazao je da nanoopne- nanoshell zlata prečnika 120 nm mogu da ubiju tumor kod miša. Nanoopne mogu se funkcionalizovati tako da se vežu za kancerske ćelije pomoću konjugovanih antitela ili peptida na površini nanopni. Zračenjem potom oblasti tumora sa infralaserom, koji prolazi kroz telo bez grejanja, zagreva se zlato dovoljno da uzrokuje smrt kancerskih ćelija. Beker sa Univerziteta u Mičigenu razvio je nanotehnologiju efikasnog i uspešnog lociranja i eliminacije kancera. Kao polimer za kačenje nanočestica koristio je molekul dendrimera. Dendrimer je polimer vrlo specifične strukture sa velikim brojem petlji, koje su pogodne za kačenje leka. Beker je na dendrimer kačio folnu kiselinu, jer ćelije kancera troše znatno više folne kiselinevitamina B c (vitamin M) od normalnih ćelija. Pored folne kiseline za ostatak petlji dendrimera, Baker je kačio antikancerski lek koji je adsorbovan na dendrimeru. Apsorbovanjem dendrimera na površini kancerske ćelije vrši se isporuka kancerskog leka od jedne kancerske ćelije do druge. Drugi pristup u terapiji kancera je korišćenje fotodinamičke terapije radi aktiviranja nanočestica za terapiju kancera unutar tela. Princip podrazumeva osvetljavanje tkiva izvana, pri čemu svetlost u najvećoj meri apsorbuju nanočestice, i ako je nanočestica metal, energija svetla će ga zagrejati kao i okolno tkivo. Svetlost pored tog osnovnog fotodinamičkog efekta, može takođe proizvesti visokoenergetske kiseonične molekule koji će hemijski reagovati i razoriti mnoge

organske molekule u blizini, uključujući i ćelije tumora. Dobra strana ove metode je njena neinvazivnost tokom tretiranja tumora [3, 10, 18, 51-55]. 2.3.4. Dendrimeri i nanočestično ciljanje Nanočestice su obećavajući alat za unapredjenje isporuke lekova, medicinski imaging i primenu u dijagnostičke svrhe. Zbog složenosti problema biodistribucije nanočestica, još uvek su snažno izražene poteškoće u preciznom ciljanju specifičnih organa u telu. Sadašnja istraživanja u ekskretornim sistemima miša pokazuju da je moguće da zlatni kompoziti selektivno ciljaju neke organe, jer je moguće uspostaviti funkcionalnu vezu izmedju veličine nanočestica i njihovog naelektrisanja. Ovi kompoziti su enkapsulirani dendrimerima i pridruženo im je odgovarajuće naelektrisanje i veličina (sl.2). Pozitivno naelektrisane nanočestice zlata lociraju se najčešće u bubrezima, a negativno naelektrisane u jetri i slezeni. Iz toga sledi da bi pozitivno naelektrisane čestice mogle da utiču na smanjuje brzine osponizacije nanočestica u jetri, utičući tako i na njene ekskretorne funkcije. Napokon, relativno male nanočestice, reda veličine do 5 nm, najčešće se raspodeljuju u periferna tkiva i zbog toga akumuliraju u telu tokom vremena. Najvažniji problem koji je uvek prisutan u terapiji sa nanočesticama je još nedovoljno proučena njihova nanotoksičnost koja je bitan faktor koji odredjuje primenu nekoga leka [3, 10, 18, 37, 55, 56]. a) b) Sl. 2: Tipičan izgled strukture dendrimera i njegove monomerne jedinice dendrona; a) Vodorastvorni dendrimeri kao statičke kovalentne micele, za primenu u sistemima isporuke lekova; b) tipične forme dendrona različitih generacija rasta, (Dendrimeric nanotechnology INC) 2.3.5. Vizualizacija Istraživanje tragova pomeranja leka bitno je da bi se utvrdilo kako se lek distribuira i kako su odredjene aktivne supstance metabolizovane unutar organizma. Budući da je teško pratiti trag male grupe ćelija kroz telo, radi poboljšanja efikasnosti praćenja njihovog kretanja koriste se boje za ćelije, koje se ekscituju svetlom na nekoj talasnoj dužini, da bi potom i same emitovale svetlo. Kako različitim bojama svetla odgovaraju različite frekvence svetlosti, da bi se dobila emisija svetlosti koja odgovara

različitim ćelijama potrebno je imati više svetlosnih izvora koji ekscituju.. Da bi se prevazišao taj problem kao mete koriste se kvantne tačke koje su zakačene na proteine, koji mogu da penetriraju u ćelijsku membranu. Različite dimenzije kvantnih tačaka, koje mogu biti napravljene od bioinertnih materijala, pokazuju optička svojstva koja zavise od veličine nanočestica. Kao rezultat toga frekvenca svetla, koja inicira kvantne čestice na luminescenciju je često multipl frekvencije potrebne za iniciranje druge grupe čestica, pri čemu obe grupe primarno mogu biti osvetljene iz istog izvora svetlosti. 3. Egzotične nanostrukture kao osnova nanomedicine 3.1. Nanomeš strukture Nanomeš struktura je nova neorganska dvodimenzionalna nanostruktura materijala, slična grafenu. Prvi put je otkrivena 2003 na Univerzitetu u Cirihu, na sistemu bornitrida-bn. Ona se sastoji od monosloja B i N-atoma, koji nastaje samoasembliranjem, sa visoko regularnom meš strukturom posle visokotemperaturnog izlaganja čistog Rh ili rutenijumske površine borazonu u ultravisokom vakumu. Nanoskalni meš sličan je ansamblu heksagonalnih pora na nanometarskoj skali. Distanca izmedju pora je reda veličine samo 3.2 nm, pri čemu svaka pora ima prečnik 2 nm i dubinu 0.05 nm (sl.3). Takav material pokazuje izuzetne osobine sa stanovišta mogućnosti kačenja- trapovanja različitih molekula i metalnih klastera, slične veličine nanomeš porama, u unapred dobro definisanom uredjenju. Takve strukture obećavaju interesantne primene u oblasti nanokatalize, površinske funkcionalizacije, spintronike, kvantnog računarstva i medija za pohranjivanje podataka, kao što su hard drajveri [57, 58]. Sl. 3: STM.Tipičan izgled nanomeš strukture BN. Distanca izmedju centra pora je 3.2 nm, dok pore imaju dubinu 0.05 nm.; b) Slika desno pokazuje nanomeš BN meren sa STM na 77K gde svaka lopta predstavlja atom N. Centar svakog prstena odgovara centru pore; c). Naftalocijanin molekuli ispareni na nanomešu, adsorbovani isključivo na porama nanomeša BN.( Nano Lett. 5 (3) (2005): 473 7) Ovakve strukture mogu poslužiti kao replike da bi se na njihovoj površini organizovale strukture slične geometrije, na bazi polimera (naftalocijanin) ili pak na bazi nekih drugih neorganskih ili metalnih nanosistema (Au), kao na sl.

3.2. Nanopin filmovi Nanopin film je ultratanki film materiala specifične nanostrukture, sa izrazitim superhidrofobnim osobinama. Prvi put takav material je dobijen 2005 godine. Kap vode koja je u kontaktu sa površinom takvog nanofilma filma formira gotovo idealnu sferu sa kontaktnim uglom od 178 0, saglasno Kasijevom zakonu. Ta svojstva filma proističu iz strukture koju karakterišu elementi pinovi -nanopera (nanokupe) nanoskalnih dimenzija rasporedjeni na medjusobno dobro definisanim nanoskalnim udaljenostima, na površini filma (sl.4). Površina je, najčešće, kompozitni material sa zarobljenim vazduhom u malim nanofrakcijama, čime je uslovljena takva nanopin struktura filma [59, 60]. Ovakve strukture su tipične prvenstveno za borsilikatna stakla kao substrate, na kojima se dobro kontrolisanim isparavanjem deponuju filmovi organskog porekla (na bazi laurata) ili pak neorganskog porekla (kobaltoksidni filmovi). Sl. 4: SEM (a) ZnO nanopin-struktura, (b) Ga-dopirana nanovlakna, (c) periodične nanoštapićne oblasti (d) vertikalno pružene nanotube (J.Electronic Materials, 36, 5, (2007), 543-548). 3.3. Nanoprsten strukture Nanoprsten struktura je nanostruktura formirana u obliku prstena. Takva struktura prvi put je uočena na kristalima ZnO u Institutu za tehnologiju u Gruziji. Nastaje u procesu spontanog samonamotavanja nanotraka [61]. Kod ovakvih struktura su brojni slojevi nanotraka rolovani, sloj po sloj, u zajednički kalem (sl.5).

Sl. 5: i)struktura ZnO monokristalnog nanoprstena (A i B); c) ED difrakcioni prstenovi prikazuju vertikalnu ogledalsku simetriju prstena; d) HRTEM slika pokazuje centralnu liniju simetrije u (A); e) uvećana TEM slika pokazuje slojeve kalema. Ukupan broj petlji koje formiraju kalem je 100.; f) slika prstena prikazana pomoću dark-field emisone TEM; ii) Strukturni model ZnO a) ravni (0001) B9 i D); prvo se formira nanokaiš/nanotraka, a potom e) struktura nanopetlje i potom nanoprstena sastavljenog iz brojnih nanopetlji; (Science, 303, (2004)1348-1351) 3.4. Nanošipke i nanožice a) b) Sl.6: a) Postulirani mehanizam sinteze nanožica i nanocevi (1-polimerni templejt, 2-homogena nukleacija, 3- heterogena nukleacija, 4- rast samoasembliranjem, 5- formiranje žice, 6- formiranje cevi, strelicaukljanjanje templejta, 7- nanožica, 8- nanocev); b) SEM-primer izolovane nanožice ZnO (A) I ZnO nanožice zaronjene u templejt; C-E) izgled nanožice nakon uklanjanja templejta; F) EDS analiza ZnO nanožice (ACS Nano, 5,2, (2008), 944-958) Nanošipke su nanodimenzioni objekti, reda veličine izmedju 1-100 nm (sl.6). Mada odnosi dužina prema prečniku mogu varirati u širokom opsegu, zavisno od metode sinteze materijala, najčešći odnos se kreće izmedju 3 i 5. Ako je odnos dužina prečnik

veoma veliki, tada takve strukture postaju tzv. jednodimenzionalne strukture, poznate pod nazivom nanožice. Takve strukture mogu se realizovati u širokom opsegu materijala, pri čemi njihove geometrijske karakteristike prvenstveno zavise od izbarane metode sinteze i uslova sinteze [62-65]. One predstavljaju kombinaciju liganada kao agensa kontrole oblika, time što se na razne ravni nastalog nanoobjekta ti ligandi vežu različitim kinetikama, usmeravajući rast kristala nastale nanočestice u odredjenom pravcu. Rastući različitim brzinama različite ravni nanošipke, vode ka izduženoj formi nanoobjekta. U uslovima izrazite preferencije vezivanja za bočne ravni nanoobjekta, ligandi uslovljavaju izrazito preferencijalni rast kristala samo u jednom smeru, formirajući tako strukture nanožica. Primene nanošipki i nanožica su različite, od tehnologija displeja (reflektivnost šipki menja se sa njihovom orijentacijom u primenjenom električnom polju) do mikroelektromehaničkih sistema- MEMS. Nanošipke poluprovodnih materijala korišćene su kod LED uredjaja. Ramanathan je 2006 godine demonstrirao prvi put tunelirajuću fotoluminescencu na primeru ZnOnanošiki. Električno polje ZnO nanošipki, ima potencijalnu primenu i u novim izvorima zračenja bliske-ultraviolentne oblasti [62-65]. 3.5. Nanocevi Nanocevi ili nanotube su specifično strukturirani nanočestični sistemi dobro definisane cevne geometrije sa nanometarskom debljinom zidova, i sa velikim odnosom dužina: prečnik. Medju takvim sistemima veoma veliki biološki značaj imaju sistemi na bazi karbonskih nanocevi, TiO 2 -hidroksiapatitni kompoziti, vanadijum oksidni, niobijum oksidni, magnezijum oksidni, sistemi na bazi proteinskih nanotuba, itd (sl.7 i sl.8). Takvi sistemi svojim specifičnim dizajnom mogu imati podsticajni karakter na uspešnu proliferaciju ćelija unutar takvih struktura [15, 66]. Sl. 7: Proces samoasembliranja helikoidnih rozeta nanocevi koje formira lizin sa DNK molekulama u vodi. (A) DNK blokovi sa molekulima lizina postavljenim bočno na njihove lance, (B) rozeta samoasemblirana iz šest blokova sa 18 H-veza, (C) helikoidna rozeta nanotube prečnika 3.5 nm;.( Nanotechnology 20 (2009) 175101)

a) b) Sl. 8: a) i b gornji deo): Tipičan izgled TiO 2 nanocevi dobijenih anodizacijom površine metalnog titana b) slika b) donji deo. TEM: Izgled TiO 2 nanocevi (Biomaterials 26 (2005) 4938 4943) Karbonske nanocevi (karbonske nanotube (CNTs)) su alotropske forme ugljenika sa cilindričnom nanostrukturom sa odnosom dužina:prečnik više od 28 miliona:1, što je mnogo veći odnos, nego kod bilo kog drugog materijala (sl.9). Zbog specifičnosti svoje strukture molekuli karbonskih nanocevi pokazuju brojne dobre osobine (jedinstvenu čvrstoću i električne osobine, efikasni su kao termički izolatori), što ih sve čini pogodnim za primenu u nanomedicini, elektronici, optici, itd. Nanotube pripadaju familiji fularena, u koju spadaju i tipični fulareni, tzv. backyballs -i. Krajevi nanotuba, najčešće su su zatopljni sa hemisferama backyballs -a. Prirodu veze ugljenikovih atoma unutar nanotuba moguće je opisati, teorijom tzv. orbitalne hibridizacije. Hemijske veze ugljenikovih atoma u nanotubama čine sp 2 veze, slične vezama u grafitu. Ove veze koje su jače nego sp 3 veze u dijamantu, omogućuju molekulima nanotuba jedinstvenu čvrstoću. Nanotube su neka vrsta užadi koja su medjusobno vezana Van der Valsovskim silama [74-78]. Većina jednostenih nanotuba (SWNT) ima prečnik blizu 1 nm i dužinu koja je milionima puta veća. Struktura je realizovana umotavanjem sloja grafita debljine 1 atoma zvanog grafen u cilindar. Način na koji je grafen umotan definisan je parom (n,m) zvanim chiral vektor. Intedžeri-prirodni brojevi n i m označavaju broj jediničnih vektora duž dva medjusobno upravna pravca u strukturi grafenove kristalne rešetke, sličnoj češlju. Ako je m = 0, nanotube imaju cik-cak strkturu a ako je n = m, nanotube imaju strukturu naslona stolice - "armchair strukturu". Zato se one nazivaju "chiral" nanotube.

Sl. 9:. TEM: Tipičan izgled jednostene karbonske nanotube (Azojano, J. Nanotechnology, 1, (2005), 1-11.) Jednostene nanotube su važan varijetet nanotuba jer one poseduju posebne električne osobine koje nisu karakteristične za MWNT-višeslojne nanotube. Kao električne žice one su izvrsni provodnici. Zbog toga se koriste u proizvodnji intermolekularnih (na električno polje senzitivnih) tranzistora (field effect transistors- FET), kao i.intermolekularnog logičkog praga, kombinacijom p-fet i n-fet nanotuba. Jednoslojne nanotube izložene dejstvu kiseonika transformišu se u n-fet, a one koje nisu izložene kiseoniku zadržavaju svojstva p-fet. Kombinacijom jednih i drugih SWNT nanotuba dobija se konstrukcija koja definiše tzv. NE logički prag sa oba tipa p i n-tip FET spoja unutar iste molekule. Višeslojne nanotube-mwnt s : Višeslojne nanotube (MWNT) sastoje se iz višestruko rolovanih slojeva (koncentričnih) tuba grafita. Prema modelu Rusiana Dola, slojevi grafita u nanotubama su aranžirani kao koncentrični cilindri, tj. 0.8 jednostene nanotube unutar većih jednostenih nanotuba (sl.10). S druge strane prema Parčmentovu modelu jednostene nanotube grafita su rolovane jedna u drugu kao novine kad se uviju. Medjuslojne distance su slične distancama grafena u grafitu, reda veličine 3.3 Å (330 pm). Medju višeslojnim nanotubama, specijalan značaj imaju dvoslojne nanotube-dwnt čija je morfologija slična kao kod jednoslojnih, ali je hemijska otpornost znatno veća. To je posebno važno kad se zahteva njihova funkcionalizacija (ugradjivanje hemijskih funkcija na površinu nanotube) da bi se postigle nove njihove osobine. a) b) c) Sl.10. a) SEM: Tipičan izgled MWNT-višeslojnih nanotuba; b) TEM: Tipičan izgled nanotube ; c) šematski izgled slojeva grafena u jednostenoj nanotubi: «armshair» struktura. (Azojano, J. Nanotechnology, 1, (2005), 1-11.) U slučaju SWNT kovalentna funkcionalizacija prekida duple veze C=C ostavljajući šupljine u strukturi nanotuba, čime se postiže modifikacija njihovih hemijskih i električnih osobina. U slučaju dvoslojnih NT-DWNT, samo spoljašnji sloj nanotube je modifikovan [67-76]. 3.6. Nanotorusi

Nanotorus se opisuje teorijski kao nanotuba koja je oblikovana u torus (oblik uštipka) (sl.11). Nanotorusi imaju jedinstvene magnetne osobine ( magnetni momenat koji je 1000 puta veći od očekivanog za takav radijus). Pri tome, njihov magnetni momenat, i termička stabilnost, jako su zavisni od radijusa torusa i radijusa tube [77,78]. Sl. 11: Šematski tipičan izgled nanotorusa; b) TM/AFM: Tipičan izgled na TM/AFM nanotorusa, visina torusa je 10-15 nm (a-digest Journal of Nanomaterials and Biostructures,. 4, 1, (2009), 183 188.; b-appl. Phys. A 72 [Suppl.], (2001), 189 192) 3.7. Karbonski pupoljci- nanobads Karbonski pupoljci- nanobad -si su nove vrste materijala dobijene kombinacijom nanotuba i fularena (sl.12). Fulareni su u ovim materijalima kao pupoljci kovalentno vezani za vanjske zidove duž karbonskih nanotuba. Strukture nanobadsa pokazuju izvrsne emisone osobine [79, 80]. Pored toga, oni preveniraju medjusobno lepljenje nanotuba, poboljšavajući i njihove mehaničke osobine, time što se ponašaju kao ankeri, koji povezuju različite slojeve nanotuba. a) b) Sl. 12: a) Tipičan shematski izgled nanobud strukture; b) TEM nanobud strukture pod različitim uvećanjima; (Computer Physics Communications, 146, (2002): 30.) 3.8. Kvantne tačke Kvantne tačke su nanočestični sistemi čije se dimenzije imaju red veličine svega nekoliko nanometara. Medju takvim sistemima najznačajniji predstavnici su poluprovodnički materijali, kod kojih zbog tako male veličine čestica ekscitoni su

konfinirani u sve tri prostorne dimenzije, zbog čega takvi materijali pokazuju osobine koje su izmedju osobina bulk poluprovodnika i osobina diskretnih molekula. Prvi ih je otkrio Luis Brus, iz Bell Lab. Termin kvantne tačke uveo je Mark Rid. Zbog specifičnih svojih osobina, takvi materijali koriste se u tranzistorima, solarnim ćelijama, LED diodama, diodnim laserima, kao agensi u medicinskom imagingu», itd. [81, 82]. Po Lajmanu kvantne tačke su poluprovodnici čije provodne osobine su usko vezane sa veličinom i oblikom individualnih kristala. Generalno, kod manje veličine kristala, veća je energija procepa-«band gap», tj. veća je razlika izmedju najveće valentne i najmanje kondukcione trake. Zbog toga, potrebno je više energije za ekscitaciju tačke- «dot», što uslovljava da se samim tim više energije i oslobadja kad se kristal vraća u njegovo početno stanje. Npr., kod aplikacija kvantnih tačaka u procesima fluorescencije, emituje se veća frekvencija svetlosti posle ekscitacije ako je kristal manji (karakteristično pomeranje spektra od crvenog ka plavom pri emisiji). Ta pojava omogućuje da se kroz preciznu kontrolu veličine kristala kvantnih tačaka, precizno kontrolišu i provodne osobine materijala [83-86]. Sl. 13 : Šema interakcije kvantnih tačaka CdSe/ZnS (prikazanih na TEM forografiji); koje se koriste za biološka obeležavanja sa molekulskim receptorima. a) poluprovodno jezgro (sivo), hidrofilna opna (crno); b) biološke molekule obeleživači u formi antigena (crveno). Biološke molekule su adsorbovane (b1) na poluprovodno jezgro ili vezane za hidrofilnu opnu (b2); c) biokonjugovane kvantne čestice vezane za specifične molekulske receptore (plav); Kod c2 receptor (plavo) se prvo obeležen sa primarnim ligandom (t.j. primarnim antitelom, zeleno, koje je prepoznato ligandom (t.j. sekundarnim antitelom, crveno) vezanim za kvantnu česticu.; (Nanotechnology 16 (2005) 9 25) Kvantne tačke se koriste sve više i više u modernoj biološkoj analizi, jer signal koji daju znatno je jači od signala koji se dobije primenom organskih boja (sl.13). Kvantne tačke daju signal znatno veće sjajnosti (20 puta su sjajnije), zbog svoga veoma visokog kvantnog doprinosa. Pored toga, znatno je veća stabilnost optičkog signala kvantnih tačaka od signala odgovarajućih organskih boja, jer one omogućuju i znatno veću ekspoziciju materijala (100 puta su stabilnije od organskih boja koje se tradicionalno koriste u fluoroscenciji) (sl.14). Kvantne čestice mogu ostati više od 4 meseca unutar miša da bi se recimo pratilo stanje njegove limfe.

Na ćelijama koje su obeležene sa kvantnim tačkama moguće je pratiti embriogenezu, metastaze kancera, matične ćelije kao terapeutike, imunologiju limfocita. U tumorskim ćelijama zbog slabog limfnog dreniranja one se akumuliraju i osvetljavaju tumor. Zbog svoje izrazite toksičnosti CdSe ne sme biti osvetljen UV radijacijom i treba da bude unutar polimera kao njegovo jezgro postavljen, da bi se mogao koristiti za snimanje tumora i krvnih sudova. Kvantne tačke imaju ulogu i neorganskih fluorofora za unutar-operativnu detekciju tumora koristeći fluorescentnu spektroskopiju. Sl. 14: Označavanje fiksiranih ćelija sa biokonjugovanim kvantnim tačkama; a) fiksirane humane ćelije su prvo inkubirane sa smešom biotinizovanog faloidina i monoklonalnih anti-histon antitela, koji se vežu za aktin vlakna i histon proteine ćelija; U drugom koraku, komercijalno dostupne zelene i crvene polimerom prekrivene kvantne čestice konjuguju se sa streptavidinom i proteinom A koji veže biotinizirani faloidin i anti-histon antitela, se dodaju, da bi vlakna aktina i histon proteina bila vidljiva u zelenoj i crvenoj fluorescenci; b) detekcija humanih epidermalnih faktora rasta receptora 2 (Her2) sa crvenim fluorescentnim polimerom prekrivenim kvantnim česticama konjugovanim sa streptavidinom. Her2 receptori na površini živih ćelija kancera dojke (SK-BR-3) obeleženi su sa streptavidin-obojenim kvantnim tačkama nakon inkubacije ćelija sa rekombinantnim humaniziranim anti-her2 monoklonalnim antitelima i biotiniziranim IgG antitelima; d) HEK ćelije sa serotonin transportnim proteinima (hsers) čija je ekspresija izražena zelenom merkaptosirćetne kiseline prekrivenim CdSe/ZnS kvantnim česticama konjugovanim sa serotoninom ;. (Nanotechnology 16 (2005) 9 25) 3.9. Helikoidne nanostrukture Helikoidna morfologija prisutna je u prirodi kod različitih polimera koji imaju vlaknastu formu, kao i kod DNK lanaca, ali i kod različitih neorganskih materijala. Kalemovi nanotuba konstruisani tako da se periodično medjusobno spajaju u parove koje čine petočlani i sedmočlani atomski prstenovi unutar heksagonalne karbonske mreže su očigledan primer takvih struktura. Poznate su, takodje, i tzv. strukture nanoopruga, koje se sastoje iz helikoidalnih domena SiC, kao i helikoidne mezostrukture koje čine nanokompoziti silika nanovlakana i ZnO sa jasno izraženim domenima u formi heliksa

(sl.15). Uredjeni materijali sa nanodimenzioniranim strukturama, koji se generalno sintetišu kroz samoasembliranje organskih liganada i neorganskih molekula, imaju veliku potencijalnu primenu u katalizi, separaciji, različitim nanouredjajima, itd. [87-91]. i) ii) Sl. 15: i) Šematska ilistracija: a) kristali dvojnikovanja pri pogledu iz perspective; b) osa [100] (t.j. a-osa) i c) [110]-jednoosni kristali koji rastu paralelno centralnoj osi unutar kristalnoh helikoidalnog mikrodomena. Redovi linija pokazuju pravac rasta kristala.( Adv. Funct. Mater. 19, (2009),448 459), ii) TEM. Helikoidna struktura metal organskog kompleksa (C 2 H 9 N 2 ) 2 (C 2 H 10 N 2 ) 0.5 [MoO 2 (OC 6 H 4 O) 2 ]; (Sci China Ser B-Chem., 51, 10, (2008), 971-975.) Takve strukture pokazuju i hibridni materijali, koje sačinjavaju neorganskoorganski kompleksi sagradjeni od metalnih jona sa dobro definisanom kordinacionom geometrijom i organski ligandi, koji imaju veoma obećavajuće primene u brojnim aplikacijama (sl.16). i) ii)

Sl. 16: i) Ilustracija promene structure PLLA od nekristalnog do kristalnog heliksa u različitim uslovima konfirniranja structure (Adv. Funct. Mater. 19, (2009), 448 459); ii) (a) i (b) dva tipa izomera (C 2 H 9 N 2 ) 2 (C 2 H 10 N 2 ) 0.5 [MoO 2 (OC 6 H 4 O) 2 ] i njihove H-veze; c) izgled tabularne kristalne strukture duž c-ose, pokazujući H-vezane tabularne arhitekture; d) kordinaciona geometrija-kompleksa pogled iz perspective (Mo-zelen, O-plav, C-beo, H-zalen). (Sci China Ser B-Chem., 51, 10, (2008), 971-975.) 3.10. Nanoopne- nanoshell strukture Nanoshell-nanoopna je tipična sferna nanočestica koja se najčešće sastoji od dielektričnog jezgra, koje je prekriveno metalnom opnom (često Au). Unutar ovakvih nanoshell-struktura, kvazičestice zvane plazmoni (koji predstavljaju kolektivnu ekscitaciju ili oscilaciju kvantne plazme sa elektronima koji sumultano osciluju u odnosu na druge jone u kristalnoj rešetki materijala), svojim simultanim oscilacijama uslovljavaju tzv. plazmonsku hibridizaciju, čija tunelabilnost odgovara vrednosti energije tunelabilnosti smeše unutrašnje i spoljašnje opne- shell, rezultujući nižom i/ili višom energijom hibridizacije. Niža energija hibridizacije (hibridizacija orbitala gornje i donje opne veznog tipa) pri tome je direktno povezana sa ekscitacionom energijom svetlosti, dok je viša energija koja pripada anti-veznom tipu hibridizacije orbitala, slabije povezana sa ekscitacionom energijom svetlosti. Hibridizacija interakcija je jača za tanje slojeve opne. Principijelno, debljina kore i radijus nanočestica, odredjuje koja se talasna dužina ekscitacionog izvora kupluje -sparuje sa njenim dimenzijama. Nanoopne na taj način poseduju sposobnost sparivanja sa ekscitacionom talasnom dužinom svetlosti u širokom opsegu vidljivog spektra i spektra koji spaja vidljivi deo i blisku infracrvenu oblast. Interakcija svetlosti i nanočestica uslovljava specifična pozicioniranja naelektrisanja koje utiču na jačinu sparivanja različitih hibridnih stanja elektrona unutar nanoshall strukture. Ekscitaciona svetlost koja ima pravac paralelan substratu jače se polarizuje dajući tzv. s-polarizaciju (sl.17 b), dok naelektrisanja dalje od površine substrata daju jače interakcije izmedju opne i jezgra (sl 17 a). Takve interakcije uslovljavaju tzv. p-polarizaciju, koja uslovljava mnogo jače pomeranje vrednosti plazmonske energije-plazmonskog pika, uslovljene slabim interakcijama sparivanja hibridnih orbitala spoljnjeg i unutrašnjeg dela nanoopne[92-95].

a) b) Sl. 17: Šematski prikaz načina pozicioniranja naelektrisanja na površini nanoshell struktura pri interakciji sa upadnom svetlošću (Langmuir 24: (2008), 14166). Zbog svega toga, nanoshell» strukture, poseduju izuzetne optičke i hemijske osobine i često se koriste u biomedicinskom imaging -u, kao i kod površinski pojačane Raman spektroskopije i površinski pojačane infracrvene apsorpcione spektroskopije, za fluorescentno pojačanje slabih molekulskih emitera. 3.10.1. Nanoopna strukture u tretmanu kancera Primera radi, medju brojnim sistemima koji mogu biti korišćeni u terapiji kancera (karbonske nanotube, cis-platine, superparamagnetni ferofluidi), je i jedan od najbolje opisanih primera u literaturi, primer korišćenja nanočestica zlata u formi nanoshell struktura. Zlatne nanoshell strukture smeštaju se u tumor koristeći fagocite, tako što ih fagociti gutaju uvlačeći ih unutar sebe kroz ćelijsku membranu, formirajući tako unutrašnje fagozome ili makrofage. Posle toga, pošto se smeste u ćeliju i enzime koji se najčešće koriste u metabolizmu razmene materija unutar ćelije, oni se ponovo izmeštaju natrag iz ćelije. Pošto je metabolizam odstranjivanja ovakvih nanoshall struktura iz unutrašnjosti ćelija kancera relativno spor, ćelije obolele kancerom u koje su prodrle takve nanoshell zlatne strukture, podvrgavaju se fotoindukciji pre nego što nanočestice zlata napuste ćelije, da bi se izazvala smrt tumorskih ćelija, kao što je to shematski prikazano na sl.18 [3, 10, 37, 55, 56, 96].

Sl. 18: Tipičan prikaz fagotizacije nanočestica nanoshell struktura u ćeliju tumora (Nano letters 7, 12, (2007): 3759 65) Nanočestične lekove- terapeutike, u formi nanoshell struktura, moguće je uspešno isporučiti ćelijama tumora, zbog povećane permiabilnosti i povećanog faktora zadržavanja-retencije nanočestica, koji su karakteristčni za same ćelije tumora. Sve to dozvoljava da nanodimenziona nanoshell struktura bude uzeta pasivno od strane ćelija tumora, bez adekvatnog dejstva antitela na tu strukturu. Ipak, isporuka nanoshell struktura i pored svih navedenih pogodnosti najčešće je veoma tehnički zahtevna. Nanoshell strukture, imaju tu specifičnost u odnosu na sve druge strukture, da budu znatno teže prepoznate kao strana tela od strane imunog sistema pacijenta na putu ka kancerogenim ćelijama. Takve strukture pokazuju izvesne sličnosti sa prirodnim biopolimernim strukturama koje se ne prepoznaju kao strana tela, zbog čega imaju šansu da budu monocitovane od strane tumorskih ćelija, kao što je šematski prikazano na sl.18. Takav sistem isporuke poznat je pod nazivom tzv. trojanskog konja. Taj proces veoma dobro funkcioniše za veličine tumora od približno ¾ -1 makrofage. Tada monociti noseći u sebi nanoshell čestice leka (zlato, superparamagnetici, fulareni, karbonske nanotube), ulaze u tumor, diferenciraju se u makrofagi, koja tada preuzima na sebe ulogu transportnog sredstva nanočestica (sl.19). Nanošelovi formiraju nekrotične centre, koji kad se obasjaju bliskom infracrvenom svetlošću razaraju tumoru pridružene makrofage. Kako se nanoshell-ovi, lako optički tjunuju da absorbuju svetlost u bliskoj infracrvenoj oblasti, oblasti u kojoj je minimalna optička apsorpcija u tkivima, a penetracija radijacijom optimalna za duboke ćelijske tretmane, to je efikasnost ovakvog procesa ozračivanja maksimalna. Osvetljavanje se često vrši laserima čija svetlost ulazi u nanošelove i pretvara svoju energiju u toplotu koja izaziva porast temperature nanošela iznad 50 0 C (terapija fototermalne na nanošelovima zasnovane ablacije na mišu ima uspeh iznad 80%).

Sl.19.:Trodimenzionalna AFM slika fularenskih koloida funkcionalizovanih sa: (a) C 60 /THF/ETOH, (b) C 60 /SDBS, (c) C 60 /SDS, (d) C 60 /EVA EVV; Izgled SWCNT funkcionalizovane sa melaminsulfonatom (Biomaterials, 30, (12), (2009), 2319-2328 4. Biomedicinska dijagnostika Optičke metode nanoshell dijagnostike, poseduju dobru rezoluciju. Pored toga, nisu invazivne, jednostavne su i jeftine. Jedini problem je što dobijeni optički signali imaju relativno slab intenzitet, da bi spektralne razlike obolelih i zdravih delova tkiva bile dovoljno jasne naglašene. Postoji pojačan interes za optičkim tehnologijama zasnovanim na novim egzogenim kontrastnim agensima, dizajniranim tako da definišu molekularni specifični zapis kancera i da unaprede granice detekcije i kliničku efikasnost optičkog imaging -a. 4.1. Biočip Biočip je mali uredjaj analogan integralnom kolu, konstruisan tako da analizira organske molekule u živim organizmima. U njegovoj konstrukciji koriste se velike organske molekule, kao što su proteini, sposobne da obave funkcije skladištenja i procesiranja podataka, kao kod svakog kompjutera. Takodje, u nekim svojim izvedbama biočip zbog mogućnosti praćenja brzih biohemijskih reakcija, koristi se već sada za potrebe identifikacije gena, polutanata, toksina ili drugih biohemijskih konstituenata (sl. 20). U nanomedicini, posebna funkcija biočipa bila bi da poveže nanoelektroniku, fotolitografiju i nove biomaterijale, za razne medicinske primene, kao što su hirurška instrumentacija, dijagnostika i isporuka lekova. Pored toga, primena biočipa daje potpuno nove mogućnosti kontrole i vodjenja nanoelektronskih uredjaja za potrebe telemedicine (tele-operacija), kao i unapredjenja metoda medicinske instrumentacije [97-10 1].

b) a) Sl. 20: a) Razne funkcionalne mogućnosti detekcije aktivnog PDMS-polidimetilsiloksan biočipa; polisaharidni polimer-sepharose na PDMS površini substrata izabran je za posteljicu biočipa, b) DNA biočip; (Biosensors and Bioelectronics 24 (2009) 1146 1152) 4.2. Proteini kao funkcionalni elementi u dijagnostici 4.2.1. Streptavidin Streptavidin je kompozit sastavljen od niza tetramera, kao subjedinica, čija oba kraja poseduju podjednak afinitet prema vezivanju biotina. Jezgro streptavidina komponovano od 13-139 tetramera, dok je sekundarna struktura streptavidin monomera komponovana od 8 antiparalelnih β-strukova, koje se medjusobno povezuju u strukture tzv. β-beta- barela/valjaka. Mesta za vezivanje biotina locirana su na jednom kraju svakog od β-barela, koji pokazuje izrazit afinitet prema biotinu. Četiri identična streptavidin monomera (4 identična β-barela) medjusobno su asocirana-pridružena dajući streptavidin tetramer-kvarternu strukturu [99, 102-104]. Pri tome svaka subjedinica streptavidina učestvuje u procesu vezivanja za susednu subjedinicu. Zbog toga svaki tetramer streptavidina može da se posmatra i kao struktura, koji se sastoji od funkcionalnih dimera (sl.21). a) b) Sl. 21: Tipična struktura streptavidin-biotin kompleksa; a) pet žutih segmenata predstvljaju β-barele, a druga dva segmenta streptavidina su tri lanca postavljena su pod 90 0 u odnosu na pet prvih. Uočavaju se i dva α-heliksa ljubičasto obojena na slici, biotin se ne uočava.b) individualne aminokiseline su vidljive, a veza sa biotinom je zelene boje. (Structural bioinforamtics, www.topsan.org/proteins/2ich)

Naglašena multivalentnost streptavidina daje mu brojne prednosti za neke njegove raznolike aplikacije, kao što je npr. njegova primena za detekciju specifičnih T ćelija. U drugim slučajevima, kao kad imaging -a specifičnih ćelijskih proteina, miltivalentnost streptavidina može biti i problematična, jer može uzrokovati promenu funkcije ispitivanog proteina. Zbog toga se kod takvih primena koristi rekombinovana forma streptavidina čiji je tetramer samo u jednom od 4 mesta za vezivanje funkcionalizovan, tako da dovoljno smanji afinitet vezivanja takvog streptavidina ( da bi se izbeglo njegovo umrežavanje sa ispitivanim proteinom). Monomerni streptavidin, koji predstavlja rekombinatnu formu streptavidina sa mutacijama koje kidaju tetramer u monomere, pokazuje afinitet prema biotinu od 10-7 mol/l. Taj afinitet nije idealan za primene streptavidina kao obeleživača proteina, ali je dobar za prečišćavanje proteina koji su vezani za DNK, kad je reversibilnost procesa poželjna. Među mnogim primenama streptavidina, najvažne su primene u prečišćavanju i detekciji različitih biomolekula. Jaka streptavidin-biotin veza može se iskoristiti da se prikače razne biomolekule, kao što je DNK jedan na drugi ili na čvrste nosače. Jedna od tehnika fiksacije DNK sa streptavidinom je digestija/rastvaranje-apsorpcija DNK sa restriktivnom egzonukleazom, pri čemu nastaje analog dioksiribonukleotida koji se konvencionalno kači na tzv. Klenow-ov fragment holoenzima DNK polimeraze, koji se potom adira na nukleotide na mestu 3 -OH DNK. Kao rezultat takvog procesa dobija se nit DNK sa biotiniziranim krajem, preko koga se obezbedjuje vezivanje površine prekrivene streptavidinom, preko nekovalentnih interakcija. Takvo kačenje DNK za substrat obezbedjuje efikasno izvodjenje različitih hibridizacijskih i imunoloških testova. Kompleksi koje gradi DNK sa biotiniziranim krajem sa streptavidinom koji se nalazi na površini mikrosfera agroze, polistirena ili paramagnetnih materijala imaju veoma važnu ulogu u prečišćavanju i izolaciji za DNK vezanih proteina. Na ovaj način vezu streptavidina sa biotiniziranom DNK moguće je koristiti kao moćan molekulski alat, sa visokim stepenom selektivnosti u odnosu na DNK proteine. U ciljanoj imunoterapiji moguće je korišćenje streptavidina konjugovanog u monoklonalno antitelo protiv kancerskih ćelija (specifični antigen), uz injektiranje radioobeleženeog biotina, da bi se isporučila radijacija samo kancerskim ćelijama. 4.2.2. Biotin Biotin je u vodi rastvorni B-KOMPLEKS VITAMIN, koji se sastoji od ureido (tetrahidroimidiazalonskog) prstena povezanog sa tetrahidrotiofenskim prstenom (sl.22) [98, 105]. On je koenzim u metabolizmu masnih kiselina i leucina (alfa aminoizokapronska kiselina) i igra važnu ulogu u glukoneogenezi. Neophodan je za rast ćelija, produkciju masnih kiselina i metabolizam masti i amino kiselina.

Sl.22. Strukturni izgled biotina (Electrophoresis 26 (3) (2005): 501 10) 5. Inžinjerstvo tkiva Korišćenjem nanotehnologija moguće je i u oblasti tzv. inžinjerstva tkiva, koje podrazumeva procese zamene obolelih tkiva sa tkivima koja su stvorena u in vitro uslovima, korišćenjem pluripotentnih matičnih ćelija i mehanizama supresije imunološkog sistema ili mehanizma sorpcije antigena unutar kolona (koji služe za apsorpciju antigena odgovarajućim bioproteinima kao kod particione hromatografije), ugradnju veštačkih materijala izrazito porozne strukture, tzv. skafolda koji nose u sebi potencijal da svojom poroznošću omoguće nesmetan rad progenitorskih ćelija date vrste u procesu resorpcije veštačkog materijala i izgradnje potpuno novih tkiva ili popravke oštećenih tkiva. Na taj način, inžinjerstvo tkiva podrazumeva veštačku stimulaciju ćelija da proliferuju koristeći na nanomaterijalima bazirane skafolde i faktore rasta. Inžinjerstvo tkiva zamenjuje tradicionalne tretmane kao što su transplantacija organa i veštački implanti. Napredne forme inžinjerstva tkiva, očekuje se da će na taj način dovesti do izrazitog produžetka života [47-49]. Za pacijente sa veoma oštećenim organima, nema dovoljno zdravih ćelija za ekspanziju i transplataciju u ekstracelularni sistem. U ovom slučaju pluripotentne matične ćelije su neophodne. Jedan izvor su indukovane pluripotentne ćelije, ćelije iz tela samog pacijenta koje su reprogramirane u pluripotentno stanje, jer time se postiže prednost da nema odbacivanja (i potencijalnih životnih komplikacija udruženih sa imunosupresivnim tretmanima). Drugi potencijalni izvor su pluripotentne ćelije embriona, što može imati dva bitna nedostatka, koja u sebe uključuju: i) rešenje problema kloniranja, koje je tehnički veoma zahtevna procedura (posebno radi prevencija abnormalnosti) i ii) rešenje zahteva za žrtvovanjem embriona, što je težak etički problem, jer svako od nas je je u svojoj suštini i svome prapočetku jedan embrion [4, 17]. 5. 1. Principi inžinjerstva koštanih tkiva Principi inžinjerstva koštanih tkiva počivaju na konstrukciji dovoljno aktivnih poroznih keramičkih struktura, dobro definisane morfologije zidova koja je kombinovana sa tankim filmovima odgovarajućih polimera ili/i biopolimera da bi se obezbedla dovoljno kvalitetna podloga za iniciranje rada koštanih ćelija i za njihova skladna medjusobna balansiranja kinetike procesa resorpcije materijala i formiranja nove kosti. Da bi mogli sa uspehom da realizujemo takve strukture potrebno je duboko razumevanje,

geometrije njihove strukturne hijerarhije i razumevanje hemijskih i bioloških uslova njihovog samoorganizovanja u strukturu prirodne kosti. Veoma bitnu ulogu ima, ne samo poroznost, njena distribucija i ukupan zapreminski udeo unutar keramičkih nosača/skafolda, nego i njena topologija, izgled strukturnih elemenata koji formiraju njene zidove i njihov medjusobni raspored, razvijenost površine, udeli aktivnih grupa koje pripadaju tankim polimernim, biopolimernim ili koloidnim filmovima nanetim na takve strukture da bi ih funkcionalizovali u željenom pravcu i tako inicirali aktivnost koštanih ćelija. Veliki značaj pri tome mogu imati i različiti faktori rasta, čiji je značaj izuzetan sa stanovišta boljeg i usmerenijeg transporta signala sa ćelije na ćeliju i ćelijske medjusobne komunikacije tokom procesa proliferacije keramičkog-koštanog skafolda. Primarna struktura skafolda, koju je moguće realizovati na brojne načine, kao što su solgel postupak, termički indukovana fazna separacija, posebno pogodna za proizvodnju 3D polimernog skafolda sa kontrolisanom mikrostrukturom i makrostrukturom za nesmetanu proliferaciju mišića, tetiva, nerava, kosti i zuba, konvencionalne tehnike livenja u polimernoj matrici u dobro definisanim formama kalupa uz naknadno uklanjanje polimera rastvaranjem u organskom rastvaraču, fazna separacija, luženje porogena, sinterovanje mikrosfera, koristeći u prvom koraku tehniku isparavanja, a potom sinterovanja u drugom koraku, kreiranje skafolda korišćenjem tehnike templejta polimernih pena, tehnike proizvodnje skafolda primenom vlakana ili tehnika umakanja, elektroforetske depozicije, biomimetskim samoasembliranjem, koristeći tehnike superkritičnih pritisaka, kao npr kod pripreme skafolda iz kompozita PLGA i hidroksiapatita, tehnike membranske laminacije, tehnike visokih pritisaka, freeze drying -a, kao i tehnika brzog štampanja različitih formi skafolda unapred kreiranih uz pomoć odgovarajućih kompjuterskih programa. I pored svih prednosti koje poseduju, sve te nabrojane tehnike, ipak ne omogućuju potpunu simulaciju kompleksne koštane arhitekture, koja je neophodna za slobodnu komunikaciju unutar 3D-skafolda. Zbog toga se površina skafolda funkcionalizuje sa odgovarajućim tankim filmovima-polimerima i biomolekulima, kao što su faktori rasta. Integrin, laminin i RGD proteini su od presudne važnosti za kvalitet ćelijske adhezije i kačenja za zidove skafolda, kao i kvašljivost hidrofobnih polimera kao što je PDDLA. Radi boljeg razumevanja same suštine procesa nastajanja kosti i time definisanja pravilnog koncepta njene konstrukcije posebno su razmotreni bitni strukturni elementi gradje kosti, njena mehanizam nastajanja, a potom definisani različiti načini dobijanja i kombinovanja odgovarajućih gradivnih elemenata veštačkih struktura koje treba da spontano iniciraju nastajanje novih koštanih tkiva u definisanoj unapred dinamici. 5.2. Hijerhija strukturnog dizajna koštanih tkiva Sve kosti obzirom na kompaktnost njihove strukture mogu se podeliti u dve grupe: kortikularne (kompaktne) i kancelozne-trabekularne (porozne) Osnovne osobine kanceloznih kostiju su visoka poroznost, koncentracija krvnih sudova, odnos ćelija:kost, niska gustina i relativno slabe mehaničke osobine. Kod kortikalnih (kompaktnih) kostiju sve osobine su potpuno suprotne: niska poroznost, koncentracija krvnih sudova i odnos ćelija: kost, visoka gustina i dobre mehaničke osobine [106-110].

Mikrostrukturu kanceluozne kosti čine sinusno uvijene lamele nepravilne forme, a kortikalne kosti, lamele cilindričnog oblika. Dubinski mikrostruktura kosti je diferencirana na 6-7 nivoa. Sl.23: Tipični nivoi strkture kosti (Medical Engineering & Physics, (1998), 1-20.) 5.2.1. Mikrostruktura kosti Osnovu mikrostrukture kosti čine mineralizovana kolagenska vlakna, koja formiraju lamele (3-7 μm širine), cilindrično umotane u slojeve, sastavljene iz 3-8 lamela, oko centralnog kanala, formirajući tzv. osteon ili Haversijanov sistem. Osteon ima oblik cilindra prečnika 200 250 μm (sl.23). Kancelozne kosti sastoje se iz mreže trabakula (najmanjih primarnih funkcionalnih jedinica kosti), koje se pojavljuju u raznovrsnim geometrijskim kombinacijama: štapić-štapić, štapić-ploča, ploča-ploča, pri čemu su ti strukturni elementi u trabakulama reda veličine 50-300 μm. Osnovni nivoi strukturiranja na mikronivou kosti su: Haversijanov sistem (tuneli unutar kosti prokopani pomoću osteoklasta, i potom popunjeni pomoću osteoblasta, finim slojem cementa), čiji zidovi su formirani od lamelarnih slojeva kosti (sl.24). On omogućuje vaskularizaciju i inervaciju kosti. Manji kanali- kanalikule u koje se račvaju Haversijanovi kanali ispunjavaju ćelije osteocita (ćelije koje se kružno raspoređuju između lamela, sa citoplazmatičnim nastavcima koji zalaze u kanikule-kanaliće u lamelama). Samim tim, kompletan izgled strukture kanala podseća na lukovicu, sa centralnom šupljinom okruženom višestrukim lamelarnim slojevima i sa dobro definisanom simetrijom.

Sl. 24: Tipična makrostruktura i mikrostruktura koštanih tkiva (Atlas of orthopaedic pathology. Gower Medical Publishing, New York: 1992., Complex Polymer Morphology, 2006) 5.2.2. Submikrostruktura koštanih tkiva Submikrostrukturu koštanih tkiva čine koštane lamele, debljine 3 7 μm (sl.25). Kolagenska vlakna smeštena u u lameli osteona su medjusobno paralelna, sa helikoidnim vezama izmedju lamella [106-110]. Sl.25. Tipičan izgled lamela i kolagrenskih vlakana unutar lamella.( Complex Polymer Morphology, 2006, Materials Science and Engineering R 58 (2007) 77 116) Osteonske lamele, uvijene su, praveći spiralu oko centralnog kanala (Haversijanov kanal). Kolagenska vlakna imaju u osnovi paralelnu medjusobnu orijentaciju, gradeći neprekidnu strukturu u kojoj učestvuje jedna ili više lamela. 5.2.3. Nanostrukturni nivo: kolagenska vlakna od 100 nm do 1 μm

Osnovu strukture kosti kao što je već u prethodnim razmatranjima rečeno čine mineralizovana kolagenska vlakna ( kolagenska vlakna okružena i infiltrirana sa mineralima). Vlakna se sastoje iz pojedinačnih kolagenskih molekula medjusobno paralelno orijentisanih. U sloju ispod i sloju iznad ona su medjusobno udaljena 68 nm, a 1.5 nm u istom sloju (sl.26). Unutar datog sloja, vlakna su medjusobno povezana pomoću dva ortogonalna identična sloja vlakana, koja se nalaze na medjusobnoj udaljenosti od 28 nm [98, 99, 104-110] i) ii) Sl. 26: i) Kolagenska vlakna i koštani minerali; ii) Tipičan raspored kolagenskih vlakana u kosti (Materials Science and Engineering R 58 (2007) 77 116, Complex Polymer Morphology, 2006) Mineralni sastav koštanog tkiva čine kristali dalita-karbonatnog hidroksiapatita, koji se inicijalno formiraju u šupljinama izmedju redova kolagenskih vlakana. Dalitni kristali tokom vremena rastu ekspandirajući i izvan šupljina unutar kolagenskih vlakana, formirajući kontinualne ploče-lamele. Pri tome, usled širenja dalita smanjuje se prostor izmedju kolagenskih vlakana sa 1.5 nm na 1.1 nm. Dalitni kristali rastu paralelno jedan drugome unutar šupljina izmedju kolagenskih vlakana, sledeći pri tome orijentaciju kanala vlakana. U početku, voda ispunjava prostor izmedju vlakana i polako nestaje kako koncentracija dalita raste. Što se tiče pojedinačne orijentacije kolagenskih vlakana, ona je uvek paralelna susednim vlaknima, sa kojima su često spojena-povezana. Sam proces mineralizacije vlakana odvija se linearno, započinjući uvek u blizini jednog od krajeva kolagenskog vlakana. 5.2.4. Subnanostrukturni nivo: Kristali i kolagenska vlakna veličine do 10 nm Nanostrukturni i subnanostrukturni nivo koštanih tkiva čine: kristalna faza, kolagen i nekolagenski organski proteini. Kod mineralizacije kolagenskih vlakana, kod zrelih kostiju, dominantna forma mineralizovane faze-dalita nije forma štapića nego pločice. Pločasti kristali apatita, koji nastaju unutar šupljina kolagenskih vlakana, zbog ograničenja njihove forme formom kolagenskih vlakana u čijim šupljinama nastaju, su diskretni i diskontinuirani. Oni rastu sa specifičnom kristalnom orijentacijom-c ose

kristala koja je grubo paralelna sa dužom osom kolagenskih vlakana. Srednja dužina i širina ploča je 50 25 nm, dok je njihova debljina 2 3 nm [106-110]. Nanokristalni daliti imaju malu, ali značajnu količinu nečistoća, kao što su: HPO 4, Na, Mg, K, citrati, karbonati i dr. čiji položaji i konfiguracije nisu potpuno poznati. Primarna organska komponenta matriksa je kolagen Tip I. Molekuli kolagena sekretovani od strane osteoblasta samoansembliraju se u vlakna sa specifičnom tercijarnom strukturom koja se periodično ponavlja svakih 67 nm i sa pragom ili šupljinama od 40 nm izmedju krajeva molekula. Pored kolagena tipa I u kostima su prisutni i tzv. nekolagenski organski proteini, kao što su fosfoproteini: osteopontin, sialoprotein i osteonektin, koji regulišu veličinu, orijentaciju i kristalnu formu mineralnog depozita, kroz helataciju kalcijuma i enzimske reakcije fosfora, uslovljene tim proteinima, koji služe i. kao neka vrsta rezervoara Ca 2+ i PO 4 3- jona za formiranje mineralne faze koštanog tkiva [106-110]. 5.3. Mehanizam nastajanja prirodne kosti U nastajanju/mineralizaciji prirodne kosti najznačajniju ulogu igraju tzv. polimer indukovani tečni prekursori-pilp, čiji je mahanizam prikazan na sl. 27 [111]. a) b) c) Sl.27: Šematski prikaz mehanizma mineralizacije kolagena. a) negativno naelektrisane polimerne sekvence koje pri kritičnoj koncentraciji jona generišu tečnost-tečnost fazno razdvajanje rastvora koji kristilaše, formirajući nanodimenzione kapi visoko hidratne faze amorfnog kalcijum fosfata. b) Nanodimenzione kapi PILP adsorbovane kolagenskim vlaknima uvučene u njihove šupljine natapaju sa amorfnim mineralnim prekursorom, koji očvršćava kroz process dehidratacije

c) amorfni precursor kristališe, ostavljajući kolagensko vlakno umočeno u nanodimezione kristale hidroksiapatita (Materials Science and Engineering R 58 (2007) 77 116) Prema PILP teoriji polimer indukovani proteini infiltrirani unutar šupljina kolagenskih vlakana odgovorni su za početak nukleacije mineralizovanih faza kostiju unutar šupljih zona kolagenskih vlakana, u koje PILP biva uvučen pod dejstvom kapilarnih sila. Mehanizam formiranja nove kosti, prema PILP teoriji, moguće je ukratko objasniti na sledeći način: negativno naelektrisanje polianjonskih proteina (fosfoproteina osteocaklina, fosforina i koštanog sialoproteina) tzv. kiselih proteina i amino kiselina (aspartinske kiseline), deluju kao aktivna mesta za suprotno naelektrisane Ca 2+ jone, 3- izazivajući potom privlačenje PO 4 jona u polianjonske proteinske micele, smeštene unutar šupljina kolagenskih vlakana. Formiranje mineralne faze koštanih tkiva, potom se odvija kroz difuziju Ca 2+ i PO 3-4 jona u ove šupljine. Tako dobijeni dalit- karbonatni apatit, formule Ca 5 (PO 4 CO 3 ) 3, ima u početku hidratnu amorfnu strukturu, koja se tokom jonske preraspodele u daljim fazama procesa kristalizacije mineralne faze, transformiše u kristalnu strukturu, kroz proces oslobadjanja viška vezane vode. 5.4. Kreiranje osnovnih strukturnih elemenata skafolda Kao što je već u prethodnom poglavlju pokazano, glavni faktori uspešnog inžinjeringa koštanih tkiva su: biokompatibilni skafold pogodan za kačenje osteogenetskih ćelija, njihovu proliferaciju i diferencijaciju i biosredina koja je pogodna za dugotrajno formiranje koštanog tkiva i njegovo održavanje. Ovi faktori imaju izuzetan značaj za ravnotežu izmedju procesa modeliranja (procesa formiranja koštanog tkiva pomoću osteoblasta) i procesa remodeliranja (procesa resorpcije koštanog tkiva pomoću osteoklasta) obezbedjujući koherentnu strukturu koštanog tkiva. Aktivnost osteogenih matičnih ćelija i progenitorskih ćelija, koje su odgovorne za porast koncentracije osteoblasta: ćelijsku deobu-proliferaciju, ćelijsku diferencijaciju i ćelijsku smrt apoptozom, zavisi najčešće ne samo od hemijskog sastava i bioloških osobina kalcijumhidroksiapatita-cha, nego i od njegove morfologije, oblika i raspodele veličine čestica, što je posebno važno za adekvatnu strukturu unutrašnjih zidova skafolda. Pored toga, hemijske i biološke osobine sintetizovanih CHA treba da budu što je moguće bliže odgovarajućim osobinama kod biološkog CHA, koji je glavni konstituent prirodne kosti. Ukratko, optimalne osobine CHA bile bi slaba kristaliničnost, hemijski sastav u većoj ili manjoj meri pomeren u odnosu na hemijski sastav stehiometrijskog CHA, uslovljen odgovarajućim katjonskim i anjonskim izmenama Ca 2+ i PO 3-4 jona u CHA sa drugim vrstama katjona i anjona, kao što su: Mg 2+, Sr 2+, Zn 2+, B 3+, SiO 2-4, CO 2-3 itd. Saglasno hemijskom sastavu bioloških apatita kod kojih je, kao što je dobro poznato, magnezijum prisutan u količini od oko 6 mol% tokom početne faze osteogeneze, u mladim kostima, (dok njegov sadržaj značajno opada kod stare kosti), Mg 2+ joni koji su prisutni u biološkom apatitu stimulišu nukleaciju velikog broja CHA nukleusa, utičući na njihovu dalju kristalizaciju i inhibiciju rasta njihovih kristala. To je od presudne važnosti za bolje mehaničke osobine prirodne kosti. Pored Mg 2+ jona, CO 2-3 joni koji se nalaze u

kristalnoj ćeliji karbonatnih CHA, takodje, poboljšavaju hemijsku i biološku aktivnost prirodnih apatita. Pri tome, ako dodje do zamene PO 4 3- jona sa CO 3 2 jonima, tada nastaje tip CHA, koji preovladava u mladjim kostima, poznat kao B-tip CHA, koji ima veću biološku aktivnost, nego CHA kod koga su OH - joni zamenjeni sa CO 3 2-, kao što je kod tzv. A-tipa CHA, koji prevladava kod starijih kosti. Uz to, tipična veličina kristalita kod prirodne kosti kreće se u opsegu: dužina 30-50 nm, ponekad dosežući 200 nm, širina 15-30 nm i debljina 2-10 nm. Ove vrednosti su uslovljene oblikom i veličinom šupljina unutar mreže kolagenskih vlakana. Sledeće bitne osobine koštanih skafolda su snažna proteinska adhezija i proliferacija osteoblasta. Na osnovu brojnih objavljenih referenci, jasno je da za bolju CHA aktivnost i sledstveno njegovu bolju kompatibilnost sa biološkim apatitom neophodno je imati manje ili više pomeren hemijski sastav sintetizovanog CHA u odnosu na stehiometrijski CHA, što potom treba da obezbedi sličnu brzinu CHA biodegradacije, t.j. brzinu otpuštanja odgovarajućih jonskih vrsta iz kristalne ćelije CHA unutar bioloških medija i njegovu bolju površinsku aktivnost. Drugi važan faktor bioaktivnosti CHA je odgovarajuća modifikacija površinske strukture CHA da bi se njome omogućila bolja adhezivnost i proliferacija koštanih ćelija. To se obezbedjuje odgovarajućim strukturnim dizajnom i hemijskim sastavom CHA čestica, koje se koriste kao odgovarajući gradivni elementi finalne strukture skafolda, kao i sastavom i površinskim svojstvima polimera/bioproteina nanetih na CHA skafold u formi tankih filmova. Da bi se pokazao uticaj varijacija strukture i osobina osnovnih čestica na procese dizajniranja strukture skafolda (u unapred željenom pravcu) biće ukratko dati osnovni podaci seta metoda, sa svojim glavnim specifičnostima, koje su u okviru naših istraživanja korišćene u sintezi čestica CHA, da bi potom u drugoj fazi procesa (u okviru tehnologije templejta polimernih pena na bazi poliuretana) bile prevodjene u krajnje 3D forme skafolda. Te forme su potom površinski dodatno funkcionalizovane pomoću deponovanja tankih filmova različitih polimera na njegovim unutrašnjim zidovima. U procesima sinteze čestica CHA povećane aktivnosti, u našim istraživanjima, korišćene su metode udruženih agenasa polimernih micela hidrogel sistema i površinski aktivnih supstancija-pas, biomimetske metode sinteze u medijima sličnim po sastavu telesnim medijima, hidrotermalna methoda i njena modifikacija sa sudelovanjem povšinski aktivnih supstancija-pas sa i bez njene kombinacije sa mehanohemijskom metodom; metoda refluksa sa dominantnim udelom organskog rastvarača sa i bez učešća spoljašnjih fizičkih polja (radiofrekventno-rf polje); ultrazvučna sprej piroliza, metoda dvostruke inverzne micele i metoda CHA sinteze asistirana sudelovanjem enzima [121-130]. 5.4.1. Metode sinteze CHA i osobine dobijenih prahova Metoda udruženih agenasa: Metoda udruženih agenasa, zasniva se na sintezi nanočestica unutar micelarnih struktura-kaveza koji svojom formom i zapreminom definišu formu i zapreminu nanočestica. Kao udruženi agensi koriste se različite vrste polimera i sa njima udruženih odgovarajućih površinski aktivnih supstanci u dobro definisanim medjusobnim odnosima i koncentracijama, da bi forma i koncentracija micela u što egzaktnijoj meri bila definisana. Unutar takvih micelarnih sistema

organizovane su sinteze CHA, koje u zavisnosti od vrste izabranog micelarnog sistema (udruženih agenasa polimer-površinski aktivna supstanca) pokazuju svoje specifičnosti sa stanovišta forme CHA, koji je samonukleiran unutar odgovarajućih micela, tokom samog procesa CHA sinteze. Udruženi agensi, posebno PAS mogu uzrokovati različite specifične reakcije izmedju polarnih grupa PAS i CHA kroz njihovu elektrostatičku interakciju sa Ca 2+ jonima. Ove polarne grupe deluju kao aktivna mesta, koja imaju presudan uticaj na nukleaciju i orijentisani rast kristala hidroksiapatita. Na taj način, stanje agregacije polimer /surfaktant udruženih agenasa postaje glavni faktor kontrole veličine zrna/kristalita CHA, njihovog oblika, morfologije i polidispreznosti. Tipičan izgled CHA praha sintetizovanog pomoću ovog metoda, koristeći kao udružene agense smešu PVA-polivinil alkohola i EVA/EVV etilen vinil acetat /versatat prikazan je na sl.28a [112]. Najkraće, u ovom specifičnom slučaju, negativno naelektrisanje acetatnih i versatatnih jona (karboksilnih polarnih grupa) igra ulogu aktivnih mesta za suprotno naelektrisane Ca 2+ jone, dok unutar PVA/PAS micela dolazi do orijentisanog rasta CHA, koji se dešava kroz naizmeničnu difuziju PO 4 3- i Ca 2+ jona unutar zapremine micela. Tipičan mehanizam formiranja ovakvih micela, koje igraju ulogu specifičnih inkubatora u kojima se odvija proces samonukleacije CHA prikazan je shematski na sl. 28b. a) b) d)

Sl.28. a) Tipičan izgled čestica CHA dobijenih metodom udruženih agenasa na primeru PVA-EVA/EVV; b) TEM mikrofotografija dobijenih čestica CHA, c) Tipična shema micele u vodenom rastvoru (Serbian Dental Journal, 56, 3, (2009), 130-138) Pored PVA, u našim eksperimentima korišćeni su kao polimeri hidrogelovi alginata, hidroksimetilceluloze, modificiranog skroba, hidroksimetilmetakrilata, a kao površinki aktivne supstance-pas: etilenvinilacetat/versatat, polioksietilen oktil fenil etar, polisorbat 80, polioksietilen-sorbitan monooleat, melaminsulfonat, cetil trimetil amonium bromid, natrijum dodecil benzen sulfonat i natrijum dodecil sulfonat. Veličine dobijenih čestica štapićastog oblika, imale su prečnik 100 do 200 nm i dužinu 0.5 do 2 μm, sa odnosom dužina: prečnik 10:1. Dobro medjusobno razdvojene čestice, kao što je jasno pokazano na Sl.28a, sa veoma izraženim pravilnim rasporedom u redove, koji su medjusobno udaljeni gotovo ekvidistantno, čine ove sisteme izuzetno zanimljivim za modeliranje interakcija izmedju skafolda i koštanih ćelija, što je od suštinskog interesa za istraživanje aktivnosti koštanih ćelija i njihove adaptibilnosti na morfologiju površine skafolda. Za očekivati je da ovakvi sistemi mogu da odigraju ulogu precizno dizajniranih oslonaca mostnih konstrukcija koje je potom lako medjusobno spojiti koristeći biomimetski metod daljeg rasta CHA, koji je u potpunosti stimulisan dejstvom telesnih fluida-sbf koji se sastoje iz smeše različitih jona, naelektrisanih proteina i amino kiselina. Biomimetski metod sinteze: Biomimetski metod sinteze zasniva se na sintezi apatitnih sistema samonukleacijom iz presićenih SBF rastvora (rastvora telesnih fluida) [113-116]. Takva sinteza zahteva prethodnu sintezu aktivne površine substrata ( u našim istraživanjima tankog silicijumdioksidnog filma, koji je dobijen pomoću metode termalne sprej pirolize, iz dobro definisanog sola silicijumdioksida sa lancima dužine 18-20 silika tetraedara deponovanog na površinu čelične trake), da bi se tek nakon toga na površini tako formiranog silicijumdioksida (sl.29) sa mestimično ugradjenim OH - grupama (na svakih 9-10 tetraedara jednom OH - grupom, koja funkcionalizuje površinu tankog silicijumdioksidnog filma) deponovao biomimetski CHA. Koncentracije odgovarajućih jona u našoj recepturi bile su kao što sledi: ( c = 0.054 mol/l; c = 0.0542 mol/l; c 2 = 0.0025 mol/l; c = 0.001 mol/l; Na Ca 3 c 2 = 0.0003 mol/l; c = 0.0006 mol/l and c = 0.0014 mol/l) NO 3 K PO 4 Mg Cl

Sl. 29: AFM:Tanki silicijumdioksidni film na povšini čelične trake (Journal of Optoelectronics and Advanced Materials, 11, 2, 2009, 243-250., Surface and Engineering, DOI 10.1179 / 174329409X439005, (2009)) Za sam mehanizam samonukleacije CHA od presudnog su značaja Si OH grupe, koje se nalaze na krajevima silicijumdioksidnih lanaca, koje indukuju heterogenu nukleaciju CHA na površini tankog silicijumdioksidnog filma. Jednom kad se nukleusi formiraju na mestima OH - grupa, kristali CHA rastu spontano formirajući slojeve apatita slične kostima, zbog toga što je koncentracija karakterističnih jona za CHA u SBF iznad granice zasićenja (posmatrano u odnosu na proizvod rastvorljivosti stehiometrijskog CHA). Na osnovu gore iznetih činjenica, može se zaključiti da na depoziciju apatita sličnih kostima utiču: (1) rast presićenja u odnosu na proizvod rastvorljivosti apatita i (2) postojanje funkcionalnih grupa, kao što je Si-OH grupa, koje indukuju heterogenu nukleaciju apatita na površini materijala. Početna faza nukleacije indukovane sa Si OH grupama opisana je od strane Takadame i saradnika, kao u našim brojnim prethodnim istraživanja. U svim tim istraživanjima, istraživan je proces nukleacije CHA indukovan sa Si OH grupama u SBF. Pokazano je da silanol grupe ne indukuju nukleaciju apatita direktno, nego prethodno inkorporacijom kalcijumovih jona formiraju amorfna kalcijumsilikatna jedinjenja kao što su SiOCa + i ( SiO) 2 Ca. Amorfni kalcijumsilikati potom inkorporiraju u sebe fosfatne jone formirajući CHA nukleuse. Na Sl.30 (SEM), prikazan je CHA film, posle nukleacije u toku 33 dana na površini 22.5 µm debelog SiO 2 filma koji je nanet na površinu čelične trake. Kao što se može videti sa slike 30. CHA film, sastoji se iz malih čestica veličine 0.138-0.41 µm i aglomerata CHA, najčešće veličine izmedju 1.66 i 2.77 µm, dok najveći aglomerati su reda veličine 2.8 do 4.86 µm. Aglomerati imaju izgled, koji podseća na kugle cvetova maslačka sa manjim grančicama koje čine manji aglomerati i male izdužene čestice (reda veličine 200 nm u dužinu, i 20-30 nm u prečniku). Donji tamni slojevi su takodje jasno vidljivi, kao i veoma tamni delovi koji se nalaze ispod njih. Na površini ovih slojeva dobro se uočavaju i novoformirani, svetliji slojevi CHA. Sl.30. SEM; Tipičan izgled samonukleiran filma CHA, nakon 33 dana nukleacije na površini tankoslojnog filma silicijumdioksida nanetoj na površinu čelične trake (Serbian Dental Journal, 56, 3, 130-138)

Trodimezionalni izgled čestica samonukleiranog CHA prikazan je na AFM snimcima, na sl.31. Vrlo se jasno vide slojevi CHA koji rastu sloj po sloj nižući se jedan na drugi, formirajući prvo ostrvca, koja se medjusobno potom spajaju u monolitne strukture kroz procese sekundarne nukleacije, koje prati proces erozije površine ostvaca usled dinamičkih nestabilnosti unutar kanala izmedju ostrvaca, izazvanih dejstvom kapilarnih sila unutar datog SBF fluida. Sl. 31: AFM. Tipičan trodimenzionalni izgled slojeva tankog filma samonuleiranog CHA na površini tankoslojnog filma silicijumdioksida nanetoj na površinu čelične trake (Journal of Optoelectronics and Advanced Materials 10 (2008), 2684-2693) Specifična, malo kompleksnija, varijacija ove vrste sinteze, prikazana je na sl.32, koja pokazuje tipičan izgled samonukleiranog CHA kada se umesto samog SBF, koristi u jednoj od varijacija smeša SBF i EMEM-Eagles minimal essential medium, koji u sebi sadrži soli CaCl 2, KCl, MgSO 4, NaCl i NaHPO 4 u koncentraciji koja prevazilazi proizvod rastvorljivosti stehiometrijskog CHA. Sl. 32: SEM; Tipičan izgled samonukleiranog CHA iz u mešovitom rastvoru presićenog SBF i EMEM ((Serbian Dental Journal, 56, 3, 130-138) Na sl.32. (SEM) i sl.33. (AFM) dat je prikaz samonukleiranog CHA u smeši presićenog SBF i EMEM, čiji je izgled, kao što se jasno vidi kroz poređenje sl.33 i sl.35 vrlo sličan izgledu CHA kad je korišćen samo presićeni SBF. Slike pokazuju vrlo

naglašene grane CHA, koje su veoma medjusobno umrežene, sa odnosom dužina: prečnik čestica =10:1 Sl. 33: AFM; Tipičan trodimezionalni izgled samonukleiranog CHA iz u mešovitom rastvoru presićenog SBF i EMEM (Journal of Engineering & Processing Management, v. 2, (2009), 54-60.) Slična sinteza je izvedena korišćenjem smeše SBF i FBS-fetal bovine serum (sl. 34 i 35), koji sadrži dominantno globularni govedji serum albumin kao protein, koji je veoma važan za preživljavanje, rast i deobu koštanih ćelija. Sl. 34: SEM; Tipičan izgled samonukleiranog CHA u mešovitom rastvoru presićenog SBF i FBS (Serbian Dental Journal, 56, 3, 130-138)

Sl. 35: AFM; Tipičan trodimenzionalni izgled samonukleiranog CHA u mešovitom rastvoru presićenog SBF i FBS (Journal of Optoelectronics and Advanced Materials 10 (2008), 2684-2693) U osnovi eksperimenata sa EMEM i FBS nalazi se inicijalna ideja koja je izvedena iz mehanizma formiranja prave kosti i njene proliferacije unutar kolagenskih vlakana u živom koštanom tkivu. Kao što je prethodno već rečeno, polimer indukovani tečni prekursor-pilp igra dominantnu ulogu u mineralizaciji kosti. PILP je odgovoran za početnu nukleaciju CHA unutar šupljih zona kolagenskih tkiva, u čije šupljine PILP biva uvučen pomoću kapilarnih sila. Mehanizam formiranja nove kosti dat od strane L.B.Gower-a može se ukratko objasniti na sledeći način: negativno naelektrisanje polianjonskih proteina (fosfoproteina ostecaklina, fosforina i koštanog sialoproteina) tzv. kiselih proteina i amino kiselina: aspartinske kiseline, deluju kao aktivna mesta za suprotno naelektrisane Ca 2+ jone, izazivajući potom 3- privlačenje PO 4 jona u polianjonske proteinske micele, smeštene unutar šupljina kolagenskih vlakana. Formiranje CHA odvija se kroz difuziju Ca 2+ i PO 3-4 jona u ove šupljine i tako dobijeni CHA u početku je u obliku hidratne amorfne strukture, koja tokom dalje jonske preraspodele u daljim fazama procesa, oslobadja višak vezane vode, transformišući svoju amorfnu strukturu u kristalnu strukturu. Slično tome, odvija se i proces nukleacije i CHA kristalizacije u EMEM Eagles minimal essential medium i FBS -fetal bovine serum-u. U oba slučaja kod ovih bioloških seruma, posebnu ulogu u formiranju CHA imaju amino kiseline u mešovitom sistemu SBF-EMEM i proteini u sistemu SBF-FBS. Obe vrste ovih seruma značajno utiču na kinetiku rasta kristala CHA, pokazujući da prisustvo amino kiselina (u slučaju EMEM) i naelektrisanih proteina (goveđi albumin u slučaju FBS) značajno ubrzavaju njihov rast (Tabela 1). Kao što se može viditi u tabeli 1, brzina samonukleacije tankog CHA filma je približno dvostruko veća kad se koriste EMEM ili FBS u smeši sa presićenim SBF, nego kad se koristi sam SBF. Sa druge strane, oblik, morfologija i veličina čestica dobijenog praha su slični u svim slučajevima. Tabela 1. Debljina samonukleiranog CHA tankog filma na površini SiO 2 tankog filma SiO 2 film debljina µm Uzorak Vreme CHA nukleaci je, dani Masa CHA, mg Specifiča površina 2 / g Zapremina pora cm 3 /g Debljina CHA filma, µm 22.5 Presićeni SBF 33 1.2 94 0.116 4.2 Presićeni SBF-EMEM Presićeni SBF-FBS 14 1.3 112 0.097 4.8 14 1.1 102 0.107 4.1

Hidrotermalni method sinteze CHA: Hidrotermalni metod sinteze je jedan od najjednostavnijih i najefikasnijih metoda sinteze CHA. Ovo je moguće i najpogodniji metod za dobijanje dovoljno velikih količina praha za komercijalnu proizvodnju praha CHA, koja je osnova proizvodnje CHA skafolda dobro definisane forme i dizajna, sa izuzetno visokom poroznošću i specifičnom površinom unutrašnjih zidova radi efikasnijeg naleganja, adhezije i proliferacije koštanih ćelija unutar njegove strukture. Sam proces adhezije, transporta-migracije, proliferacije ćelija i njihove dalje diferencijacije može biti dodatno podržan depozicijom veoma tankih polimernih i/ili koloidnih filmova na površinu zidova skafolda. Takav koncept istraživanja je dominantan u našim sadašnjim istraživanjima, kao i u konceptima naših budućih istraživanja, obuhvatajući sve nove i nove metode funkcionalizacije površina skafolda, njihovog preciznog strukturiranja i iniciranja procesa na njihovim površinama odgovarajućim fizičkim poljima, kao što su u nekim slučajevima radiofrekventa i magnetna polja [117, 118]. Kod hidrotermalne sinteze CHA čestica kao osnovnih strukturnih elemenata CHA skafolda korišćena su dva pristupa: konvencionalni pristup i njegova modifikacija kombinacijom konvencionalnog pristupa sa metodom udruženih agenasa, uz korišćenje specifičnih polimera i odgovarajućih površinski aktivnih supstanci. Potom je process u nekim varijantama dobijanja konačnog praha naknadno kombinovan sa mehanohemijskom metodom. Pri tome su birani uvek takvi micelarni sistemi, koji su u našim biološkim istraživanjima pokazivali veoma nisku toksičnost, kao što je to slučaj sa EVA/EVV. Kod klasičnog hidrotermalnog postupka sinteze, proces sinteze CHA istraživan je pri različitim uslovima vodjenja procesa, kao što su koncentracije prekursora (najveća i najmanja koncentracija: odnos 4:1), pritisak (3-15 barr), temperature (120-180 0 C) i vreme vodjenja procesa (2-8h). Sl. 36: Karakkteristične mikrostrukture hidrotermalno precipipitiranih hidroksiapatita: a (uzorak 5, dobijen pri T=120 0 C, p=3 barr, t=8h); b (uzorak 9 dobijen pri T=180 0 C, p=15 barr, t=8h); c i d (uzorak 7 dobijen pri T=150 0 C, p=5 barr, t=8h). (Journal of Materials Sciences: Materials in Medicine, 17, (2006), 539-546)

Dobijene karakteristične mikrostrukture bile su vrlo slične u svim slučajevima sinteze, ali veličine CHA čestica (osnovni elementi CHA aglomerata) (sl.36), izvedene na osnovu podataka BET analize, značajno se razlikuju pri korišćenju različitih uslova sinteze (Tabela 2) Tabela 2. Karakteristični geometrijski parametric CHA prahova dobijeni analizom apsorpcionih izotermi azota Broj 1 2 3 4 5 6 7 8 9 uzorka Specifična 48 110 75 77 180 32 62 65 30 površina, m 2 /g D BET(Č), 40 17 23 24 10 59 31 29 63 nm D pore, nm 17 7 10 10 4 25 13 12 27 V pore, cm 3 /g 0.232 0.099 0.132 0.139 0.058 0.342 0.180 0.168 0.365 Razlike u obliku CHA aglomerata su beznačajne pri različitim uslovima sinteze, kao što pokazuju niz SEM mikrofotografija na sl.36. Svi aglomerati imali su veličinu 5-20 μm. Detaljnija analiza mikrostrukture (BET-analiza) pokazala je da su dati aglomerati sastavljeni od čestica čija je veličina približno 200 nm (SEM), koje se sastoje od još manjih čestica veličine 10-63 nm, dok se najmanje čestice sastoje od kristalita reda veličine 8-22 nm (XRD). Modifikacijom metode hidrotermalne sinteze CHA, kroz uvodjenje PAS- EVA/EVV kopolimera, dolazi do jasno naglašene nukleacije i rasta hidroksiapatitnih čestica u dobro definisane heksagonalne poliedarske forme (sl. 37). Sl.37: Tipičan izgled CHA čestica dobijenih modifikacijom klasične hidrotermalne metode sa primenom PAS (EVA/EVV) Da bi se pokazalo da li su poliedri hidroksiapatita složene strukture dimenzija reda 100-200 nm, uzorci hidroksiapatita snimljeni su korišćenjem metoda TEM i HRTEM mikroskopije (sl.38).

Sl. 38: TEM: Hidrotermlano dobijeni CHA asistiran primenom PAS: EVA/EVV Odgovarajući snimci dobijeni TEM mikroskopijom pokazuju specifične veze medju kristalitima kalcijumhidroksiapatita, koje upućuju na dobijanje gusto pakovanih blok mozaika, tokom procesa kristalizacije, sa ravnima koje ukazuju na promene orijentacije, kroz pomicanja slogova pakovanja i srastanja već formiranih embriona kristala unutar zapremine datih micela, u poliedarske forme, sa delimičnom preferencijom rasta u jednom smeru. Sinteza CHA refluks metodom asistiranom primenom PAS: EVA/EVV u radiofrekventnom ili mikrotalasnom polju: U prethodnom izlaganju u najkraćim crtama već je izložen mehanizam nukleacije CHA u zavisnosti od toga koja se vrsta površinski aktivnih substance-pas koristi: substance sa hidrofilnim ili hidrofobnim funkcionalnim grupama. Primer sinteze hidroksiapatita asistirane primenom PAS i mikrotalasnog polja, prelazne faze monetita daje mogućnost realizovanja veoma zanimljivih geometrija monetitnih čestica, kao što je pokazano na sl. 39i, a potom i hidroksiapatitnih čestica u finalnoj fazi u procesu naknadne imerzije monetitnih čestica u rastvoru NaOH, pri ph=10 (sl.39 ii) [119]. i) ii) Sl. 39: i) TEM mikrofotografija monetita dobijenog uz asistenciju mikrotalasnog zagrevanja na 95 0 C, tokom 1h; ii) SEM mikrofotografija dobijenog CHA imerzijom monetita u NaOH, ph=10, toku (a) 15 min; (b) 1 h; (c)4 h; i (d) 8 h.( J.Phys.Chem. B, 110, (2006), 14226-14230) Na sličan način, sledeći koncept sinteze u mikrotalasnom polju izvedena je i sinteza hidroksiapatita naknadnom imerzijom monetita, koji je prethodno sintetizovan uz primenu PAS, primenom metode refluksa (sl.40a). Potom je tako dobijeni hidroksiapatit podvrgnut dejstvu radiofrekventnog polja (sl.40b).

a) b) Sl. 40: AFM: a) Tipičan izgled aglomerata apatitnih čestica CHA; b) Individualne čestice CHA unutar aglomerata CHA, dezaglomerisane pod dejstvom RF polja Kad se uporede metode dobijanja hidroksiapatita kad se koristi kombinacija refluksa asistiranog sa površinski aktivnom substancom EVA/EVV (pri ph=10, u sistemima sa odnosom PEG-voda=10:1, prva kombinacija) i refluksa asistiranog sa površinski aktivnom substancom EVA/EVV, kao u prethodnom slučaju uz asistenciju odgovarajućeg radiofrekventnog polja (u našem slučaju polje frekvencije f=13,86 MHz, snage P=300 W, vreme delovanja t=1h), uočava se da ove dve metode daju čestice hidroksiapatita, različite veličine, kao što je pokazano na sl 43a i 43b. Na slici 40a uočava se da čestice apatite, odnosno njihovi aglomerati imaju gotovo sferni oblik i veličinu 100 do 200 nm, dok veličina čestica prikazana na slici 40b odgovara veličini individualnih čestica apatita, koje su nastale u procesu deaglomeracije čestica hidroksiapatita koje su prvobitno bile medjusobno povezane unutar aglomerata, čija je forma i veličina data na sl.40 a.. Veličina tih osnovnih čestica (sl.40a), iznosila je 20-40 nm. Njihova oblik bio je takodje sferan. Ultrazvučna sprej piroliza: Ultrazvučna sprej piroliza je specifična metoda koja zahvaljujući periodičnom fizičkom polju ekscitacije prekursora, tokom sinteze datog materijala (u našem primeru hidroksiapatita) daje sisteme vrlo specifične strukturne organizacije i dobro definisanog strukturnog dizajna (sl.41). Koristeći ovu metodu moguće je dizajnirati material na različitim nivoima strukturiranja, počev od nivoa elementarne ćelije (osnovnog strukturnog rasporeda atoma u nekom kristalografskom motivu) preko njihovog daljeg samoasembliranja unutar koloidnih čestica sistema, ako se kao prekursor sinteze koristi koloid, te samoasebliranja koloidnih čestica unutar subčestica sistema i njihovog napokon krajnjeg samoasembliranja unutar finalnih čestica sistema. Specifičnosti metode, pored opšte poznate visoke sferičnosti, uske raspodele veličine čestica, hemijske i fazne homogenosti su dobro definisana srednja veličina i raspodela veličina na nivou čestice i subčestice [120-131]. Pored toga, ova metoda omogućuje specifične kombinacije različitih faza, pri čemu jedna od faza može imati ulogu aktivne faze sa datog finkcionalnog stanovišta, a druga faza biti faza u kojoj se nalazi data faza diskretno raspodeljena kao u mreži, čime čestice diskretne aktivne faze na taj način bivaju snažno kontrolisane formama trodimenzionalnih mreža, faze koja je funkcionalno inertna. (npr. kombinacija CHA ili superparamagnetnog Co 3 O 4 ili Co 2 AlO 4 u matricama SiO 2 ).

a) b) Sl.41: Tipičan izgled a) čestica CHA, b) sučestica CHA dobijenih sprej pirolizom (J. Ceramic Processing Research, 5, 2, (2004), 157-162. Ovakve vrste neorganskih kompozita imaju izuzetan značaj za dobijanje biološki aktivnijih sistema, što se postiže pomoću biološki aktivnije SiO 2 faze u koju je uronjena manje aktivna CHA faza, ili pak superparamagnetna faza, kao u slučaju sistema Co 3 O 4 - SiO 2 i Co 2 AlO 4 -SiO 2. Takve faze moguće je dodatno aktivirati primenom homogenih spoljašnjih magnetnih polja da bi se poboljšala ćelijska aktivnost osteoblasta, ćelijska proliferacija i diferencijacija i proizvodnja osteocaklina (nekolagenog proteina koga sekretuju osteoblasti), što sve vodi bržoj osteointegraciji koštanih tkiva. Metod inverzne micele: Osnovni princip metoda dvostruke inverzne micele, koji je korišćen u našim istraživanjima, najjednostavnije je ilustrovati pomoću sl.42. na kojoj je prikazan mehanizam formiranja inverzne micele i parcijalni fazni dijagram njene stabilnosti. Kao rastvarač kod ove metode koristi se nepolarni rastvarač (u našem slučaju cikloheksan), površinski aktivna substanca-surfaktant (u našem slučaju Triton 100), kosurfaktant (u našim eksperimentima n-butanol) koji su odgovorni za formiranje kapljica vode unutar micela surfaktanta i kosurfaktanta, pri čemu su unutar kapljica vode prisutne komponente u stehiometrijskom odnosu za kacijumhidroksiapatit [132, 133]. Sl. 42: Tipična šema načina organizacije PAS pri formiranju inverzne micele vodene faze u nepolarnom rastvaraču cikloheksanu (J Mater Sci (2008) 43:384 389) Parcijalni fazni dijagram komponenata u smeši, prikazan na istoj slici, pokazuje koncentracione oblasti i odnose svih bitnih komponenata za formiranje inverznih micela unutar datog nepolarnog rastvarača. Odnos komponenata u smeši treba da bude odabran saglasno parcijalnom faznom dijagramu u oblasti (prostoru) u kome je dobijena

mikroemulzija vode u ulju-cikloheksanu stabilna (za naš sistem komponenata to odgovara šrafiranom delu dijagrama). Sl. 43: Tipičan tok procesa pri sintezi CHA metodom dvostruke micelle (J Mater Sci (2008) 43:384 389) Sl. 44: TEM mikrofotografije dobijenih čestica hidroksiapatita metodom dvostruke inverzne micele Dobijene čestice korišćenjem date metode inverzne micele kao što se vidi na sl.44 imaju oblik nanožica-nanoiglica, sa izrazitom preferentnom orijentacijom. Dužina nanožica je reda veličine 1-2 μm, a prečnik reda veličine 50-100 nm. Odnos dužina: prečnik je reda veličine 20:1 do 50:1. Metod sinteze CHA asistiran upotrebom enzima: Sinteza hidroksiapatita izvedena je korišćenjem odgovarajućih prekursora Ca 2+ and PO 4 3- jona, uz dodatak uree i

ureaze u odnosu 5:1, na temperaturi 30-40 0 C, tokom 5h, pri ph=9. Nakon odredjenog vremena odležavanja rastvora (24h na sobnoj temperaturi) dobijene su čestice hidroksiapatita, koje su imale pretežno strukturu u obliku nano štapića, dužine 200 nm i prečnika 20 nm, te odnosa dužina: prečnik (5-10):1. Reakcija nukleacije i rasta kristala hidroksiapatita katalizovana je brzom hidrolizom uree u CO 2 i NH 3, koja pogoduje formiranju velikog broja nukleusa čije je rast iznad odredjene granice samim tim bio inhibiran. Sl.45: AFM: Tipičan izgled CHA dobijen metodom hidrolize uree asistiranom ureazom Svi navedeni elementi strukture-čestice hidroksiapatita dobijeni nekom od metoda koje su već opisane koriste se kao potencijalni jedinični blokovi-gradivni elementi keramičke strukture CHA visoke poroznosti-struktura skafolda, koja je osnova inžinjerstva koštanih tkiva. 5.4.2. Skafoldi i inžinjerstvo koštanih tkiva U okviru idealno zamišljenog inžinjerstva koštanih tkiva, razvijane su brojni pristupi i metode unapredjenja kostrukcija koštanih graftova. Skafold kao osnovni element takve konstrukcije, zahteva da bude integrisan sa okolnim koštanim tkivima i da omogući inicijalnu 3D mrežu na koju mogu da adheriraju i proliferuju ćelije, produkujući proteine ekstracelularnog matriksa-ecm. Da bi to moglo biti realno realizovano, nužno je kreirati takve konstrukcije skafolda koje će u što je moguće većoj meri podražavati strukturu i morfologiju prirodne kosti. Kao što je već odavna poznato, prirodna kost se sastoji od neorganskog dela, karbonatnog hidroksiapatita (dalita) i organskog dela u čijem sastavu dominiraju kolagenska vlakna (oko 95%). Poroznost koštanih tkiva je 50-90%, zavisno od tipa kosti. Struktura treba da je biokompatibilna i da je bliska dizajnu priridnog ECM, tj. da poseduje veoma visoku poroznost sa medjusobno povezanim porama u svim pravcima, da bi mogla da omogući rast ćelija i njihovu reorganizaciju i da ima hemiju površine, koja pospešuje kačenje ćelija i njihovu diferencijaciju i proliferaciju. Uz to takva struktura treba da poseduje dobre mehaničke osobine, da bi izdržala statička i dinamička naprezanja i fiziološka oprećenja u uslovima «in vivo». Ona treba da poseduje i kontrolisanu brzinu biodegradacije, koja je optimilano podešena u odnosu na brzinu stvaranja novog koštanog tkiva, koje zamenjuje skafold novom kosti. Veličina pora, distribucija i struktura treba da budu takvi da mogu zadovoljiti specifične zahteve u primeni, od kojih jako zavisi ćelijska adhezija, proliferacija, depozicija matriksa kao i

formiranje krvnih sudova unutar skafolda da bi se potpomogao rast tkiva. Svi ovi faktori zavise, u osnovi, u najvećoj meri od od hemijskih i bioloških svojstava materiala od koga je izgradjen skafold, koštanih ćelija koje naseljavaju njegovu strukturu u «in vitro» ili «in vivo» uslovima i efikasnosti transfera signala izmedju ćelija. 5.4.2.1.Materijali Svi materijali koji se koriste u inžinjerstvu koštanih tkiva dele se u četiri osnovne grupe matrijala: biokeramike, biopolimere, metale i kompozite. Svi oni koriste se u konstrukcijama veštačkih nosača-skafolda, koji imaju funkciju da preuzmu na sebe privremeno ili stalno funkcije oštećenih koštanih tkiva. Za svaki od navedenih materijala, medju najvažnijim biološkim osobinama su osobine resorpcije materijala, njihova površinska aktivnost i biokompatibilnost. Medju navedenim vrstama materijala, biokeramički materijali imaju najveći značaj, zbog svoje visoke efikasnosti u proliferaciji ćelija i resorpciji tokom vremena, koja je praćena formiranjem nove prirodne kosti. U takve materijale spadaju: hidroksiapatit pomerene stehiometrije, biostakla, apatit-volastonitni kompoziti i β- trikalcijum fosfat, koji su svojim sastavom i funkcionalnim svojstvima najbliži sastavu prirodne kosti. Ovi materijali mogu da obezbede okolinu u kojoj će ECM proteini biti adsorbovani, rezultujući adhezijom osteoblasta i znatno bržom proliferacijom nego kod bilo kog drugog materijala, uključujući i titan. Pored biokeramika koristi se i niz biopolimera. Jedana od najčešće korišćenih u poslednjoj deceniji je grupa sintetičkih polimera i kopolimera, koja pripada porodici poliestara. Medju njima najznačajniji su: PLA-polilaktidna kiselina, PGA-poliglikolidna kiselina, i kopolimeri tipa PLGA- poli(laktid-ko-glikolidne) kiselina. Ovi materijali igraju veoma važnu ulogu i u oblikovanju različitih formi skafolda. Bitna osobina navedenih polimera je da njihova resorbilnost i mehaničke karakteristike mogu da zadovolje razne vrste primena u maksilofacijalnoj i ortopedskoj hirurgiji, na zbrinjavanju defekata kritične veličine i kao fiksatori za podršku srasatanju koštanih tkiva bez naknadne hirurške intervencije njihovog uklanjanja, nakon srastanja (kod loma kostiju). Sposobnost degradacije, takve materijale čini veoma podobnim i za razne druge primene, koje obuhvataju i primene vezane za inkapsulaciju lekova sa kontrolisanim brzinama otpuštanja. U idealnom slučaju, kad se koriste takvi materijali za funkcionalizovanje keramičkih struktura skafolda brzina, degradacije takvih polimera, kao i keramičkih nosača na kojima se nalaze naneti kao tanki filmovi, treba da odgovara brzini formiranja novog koštanog tkiva. Skafold koji je inicijalno formiran, tokom procesa osteointegracije tokom primene unutar organizma degradira, pri čemu njegove mehaničke osobine, takodje degradiraju skladno sa rastom mehaničkih osobina novoformiranih koštanih tkiva koja preuzimaju na sebe ulogu nosećih elemenata u konstrukciji nove kosti. Pored PLA, PGA, PLGA polimera, veoma značajnu ulogu u formiranju kompozitne skafold strukture imaju i poli(metal-metakrilati, poli(e-kaprolaktonati), polihidroksibutarati, polietileni, polipropileni, poliuretani, poli(-etilen-tereftalati), polietarketoni i polisulfonski polimeri [134-137]. Kao zamenici kosti, pored biokeramika i polimera, veliki značaj (posebno u oblasti ortopedije) imaju metalne legure, zbog njihovih izuzetnih mehaničkih i korozionih svojstava. Medju najčešće korišćenim metalnim legurama, nalaze se legure koblthroma,

nerdjajućih čelika, aluminijskih i titanovih legura. Metalne legure treba da poseduju što manju specifičnu težinu i što bolje mehaničke i korozione osobine, da ne bi dolazilo do njihovog pucanja i oslobadjanja metalnih jona i korozionih proizvoda unutar tela. Poznato je da metali nikad nisu u punoj meri biokompatibilni i da njihova primena uvek uslovljavaja opasnosti od imflamacija, zbog otpuštanja odgovarajućih metalnih jona i čestica u lokalnu okolinu. Pored toga, oni inhibiraju formiranje nove kosti i stimulišu gubitke koštanog tkiva i njegovu preteranu resorpciju. Primera radi, titan i njegove legure inhibiraju ćelijsku proliferaciju unutar kosti, na što ukazuju povećane koncentracije unutar okolnih tkiva faktora imflamacije, kao što je interleukin-6 i TGF-β1 faktor. Takodje, zbog velike razlike u mehaničkim karakteristikama legura i kosti, veoma je slaba osteointegracija koštanih tkiva sa okolnim tkivima. Zbog toga, u najnovije vreme razvijaju se materijali na bazi kompozita HA/HDPE hidroksiapatit-polietilen visoke gustine i PLGA/HA kompozita, koji su znatno biokompatibilniji od metalnih legura i mogu da oponašaju prirodnu kost, jer su njihove osobine slične osobinama kosti. Time takvi materijali, postaju obećavajuće matrice skafolda nosivih kosti, koje bi mogle da omoguće optimalnu ćelijsku diferencijaciju i mineralizaciju koštanih tkiva. Ćelije se na na takvim materijalima dobro lepe, posebno na hidroksiapatitnoj komponenti, što sve ima za rezultat dobru ćelijsku proliferaciju i integraciju-osteokonduktivnost koštanih implanta, izgradjenih od HA/HDPE i PLGA/HA kompozita [134-140]. 5.4.2.2.Matične ćelije Brojne ćelije mogu se koristiti za zasejavanje koštanih skafolda pre implantacije. To su embrionske matične ćelije, stromalne ćelije koštane srži, matične ćelije izvedene iz mišićnih tkiva. Jedan od vrlo često korišćenih izvora matičnih ćelija kod odraslih su humane ćelije koštane srži, kao autologi koštanih tkiva, da bi se izbegli problemi etičke prirode i imuni odgovor generisan ljudskim telom u odnosu na ćelije izolovane iz različitih izvora. Ćelije koštane srži sadrže homeopatske matične ćelije i mezenhimalne matične ćelije, koje se diferenciraju u različite tipove ćelija uključujući osteoblaste, hondrocite i adipocite. Koštana srž je takodje značajan izvor osteoblasta zbog svoje pristupačnosti i lakoće uzimanja iz životinja za istraživačke svrhe. Prema svojoj biološkoj prirodi, mezenhim je embrionsko vezivno tkivo, izolovano iz mezoderma, koje poseduje sposobnost diferenciranja u hematopoetska i vezivna tkiva, za razliku od menzehimalnih matičnih ćelija koje ne diferenciraju u hematopoetske ćelije. Stromalne ćelije su konektivna ćelijska tkiva, koja igraju veoma važnu ulogu u rekonstrukciji tkiva. Mezenhimalne ćelije mogu da budu izolovane i iz drugih tkiva, a ne samo koštane srži, kao što su mišićna tkiva odraslih ili zubna pulpa mlečnih zuba. Mezenhimalne matične ćelije karakteriše malo ćelijsko telo., koje se sastoji iz velikog okruglog nukleusa, koji je okružen sa fino dispergovanim hromatskim česticama, koje naglašavaju izgled nukleusa. Preostali deo ćelije sadrži malu količinu grubog endoplazmičnog retikuluma, mitohondrija i poliribozoma. Izdužena i tanka ćelija (karakterističan izgled menzihimalnih ćelija) kad se disperguje u ekstracelularni matriks, sadrži neznatnu količinu retikularnih vlakana, dok su kolagenska vlakna sasvim odsutna unutar njene strukture.. Iako ne postoje tipični markeri koji bi mogli da pomognu u klasifikaciji mezenhimalnih ćelija, moguće je indirektno imati grubi uvid u njihovu potentnost, preko

površinskih antigena koji se koriste za izolaciju ćelija sa sličnim kapacitetom samoobnavljanja i diferencijacije (sl.46) [141-145]. Sl.46: a) Žive i mrtve bojene adipozne matične ćelije prikačene na skafold resorbilnih biovlakana (posle 3h): skala 200 μm, zelene ćelije su žive, a crvene mrtve, posle 3 h, b) žive i mrtve bojene adipozne matične ćelije prikačene na skafold resorbilnih biovlakana, c) SEM adipoznih matičnih ćelija prikačenih na skafold resorbilnih biovlakana (nakon 2 ndelje), skala 100 μm (JCDA, 2008, 74, 2, (2008), 176-170) Standardni test koji potvrdjuje njihovu multipotentnost je diferencijacija ćelija u osteoblaste, adipocite i hondrocite, kao i miocite i neuronima slične ćelije. Stepen u kome one diferenciraju varira individualno i zavisi od mehanizma njihove diferencijacije (hemijskog ili mehaničkog tipa). Nije jasno da li je ova varijacija uslovljena razlikom u količini istinskih progenitorskih ćelija ili varijacijama u kapacitetima individualnih progenitora. Kapacitet ćelija da proliferuju i da se diferenciraju, opada sa godinama donora, kao i sa vremenom kultivisanja ćelija. Pri tome, nije sasvim jasno da li je tome uzrok pad broja menzehimalnih ćelija ili je to rezultat promena koje se sa vremenom dešavaju u njima. Brojne studije pokazuju da humane menzehimalne ćelije onemogućavaju alorekognitaciju, interferirajući sa dendritnim i T funkcionalnim ćelijama i generišući lokalnu imunosupresivnost mikrookoline uz sekreciju citokina.poznato je da imunomodularna funkcija humanih ćelija poboljšava se izlaganjem ćelija inflamatornoj okolini, koju karakteriše lokalno povećan nivo γ-interferona. Ćelije koštane srži ili monociti dobijeni prečišćavanjem ćelija koštane srži, pri kultivaciji menzehimalnih ćelija, direktno se postavljaju na ploče za kultivisanje ćelija. Menzehimalne ćelije su adherentne i za kliničku primenu treba ih najčešće dodatno aktivirati i mobilisati, neposredno pre primene. Direktno njihovo injektiranje na mesto oštećenja je preferetan metod medicinskog tretmana sa menzihimalnim matičnim ćelijama [145-149]. Kao što je prethodno već naglašeno, pored menzihimalnih ćelija koštane srži koje su korišćene u nekim našim eksperimentima sa skafoldima (različito funkcionalizovanih površina unutrašnjih zidova), u našim eksprimentima koriste se i menzehimalne ćelije izolovane iz zubne pulpe. Naime, za zubnu pulpu vezane su tri vrste matičnih ćelija: matične ćelije zubne pulpe (engl. Dental Pulp Stem Cells, DPSC), matične ćelije iz eksfoliranih mlečnih zuba (engl. Stem Cells From Human Exfoliated Decidual Teeth, SHED) i nezrele matične ćelije zubne pulpe (engl. Immature Dental Pulp Stem Cells, IDPC). Sve te matične ćelije su ektomezenhimalnog porekla i lokalizovane su u perivaskularnoj niši. One se lako i efikasno izoluju, visoko su proliferativne, klonogene i multipotentne, ispoljavajući visok stepen plasticiteta i slične su mezenhimalnim matičnim ćelijama koštane srži (BMSC). Karakteriše ih visoka ekspresija gena alkalne fosfataze, proteina matriksa dentina i dentin-sijalofosfoproteina. U njima je istaknuta i ekspresija gena koji kodiraju sintezu komponenti ekstracelularnog matriksa, kao i molekula ćelijske

adhezije, faktora rasta, transkripcionih faktora, gena prenosa ćelijskih signala, ćelijske komunikacije i metabolizma. U uslovima in vitro ili in vivo ove ćelije mogu da se diferenciraju u pravcu odontoblasta, hondrocita, osteoblasta, adipocita, neurona/glije, glatkih i skeletnih mišićnih ćelija, endotelnih ćelija i melanocita. U uslovima in vivo, nakon implantacije, pokazuju različit potencijal za formiranje dentina, ali i koštanog, masnog i nervnog tkiva. U našim eksperimentima one se koriste kao konstruktivni delovi skafolda, sa potencijalnom primenom u rekonstrukciji kraniofacijalnih struktura, zbog njihovog značajnog osteogenog potencijala, koji u potencijalnim i očekivanim u našim budućim aplikacijama korišćenjima u in vivo uslovima omogućiće brzu diferencijaciju struktura skafolda u koštana tkiva [150-156] Da bi se detektovala ćelijska proliferacija i diferencijacija unutar skafolda koriste se posebni testovi i biomarkeri. Test ćelijske proliferacije, DNK test, izvodi se fluorometrijski, korišćenjem različitih boja (Hoescht, PicoGeen) vezanih za DNK ćelije, koja je proporcionalna gustini ćelija. H-timidin (H-thymidin) koristi se kao obeleživač ćelija i može se detektovati radioktivno kad ćelija proliferuje. Da bi se studirala ćelijska diferencijacija, koristi se nekoliko markera koji registruju fenotip osteoblasta. Npr. test za osteocaklin, pri čemu ECM je marker formiranja kosti. Zasniva se na korištenju jodom obeleženog osteocaklina, koji je moguće detektovati gama brojačem. Alkalna fosfataza- ALP je enzim nadjen u koštanim tkivima i on predstavlja marker formiranja kosti koristeći ELISA test. Za bojenje, za obeleževanje fosfatnih jona koristi se Von Kossa metod, a kalcijum crveni Alizarin S, a ALP (imunobojenja), za detekciju ovih biomarkera u ćelijskim kulturama i tkivima [145-149]. 5.4.2.3. Faktori rasta i transfer ćelijskih signala unutar skafolda Pored materijala i matičnih ćelija, poseban značaj u procesu osteogeneze imaju specifični signali koji se dobijaju kao rezultat interakcije ćelija sa aditivima sredine u kojoj se ćelije nalaze. Medju njima jedan od najpoznatijih je deksametazon (Dex). On potpomaže diferencijaciju ćelija koštane srži i podstiče formiranje koštanih proteina kao što su ALP, osteopontin i osteocaklin. Drugi dodaci koštanim medijima su β- glicerolfosfat i L -askorbinska kiselina. Takodje, veoma važan doprinos imaju i faktori rasta, kao što su β-tgf (transformacioni faktor rasta-transforming growth factor), govedji morfogenetski proteini-bmps, pleiotrofin, te faktori rasta izolovani iz pločica krvne plazme, faktori rasta slični inzulinu i fibroblast faktori rasta. TGF-β sa svojim izomorfama veoma je značajan za rast/augmentaciju koštanog tkiva. TGF-β3 i TGF-β5 stimulišu proliferaciju osteoblasta, mineralizaciju i nastajanje matrične strukture. Oni igraju veoma važnu ulogu u resorpciji i formiranju nove kosti. Pored toga, oni imaju važnu ulogu i u formiranju hrskavice i vezivnih tkiva. Kod koštanih defekata kritične veličine, BMP-2 je vrlo obećavajući sa stanovišta stimulacije formiranja nove kosti, a kod velikih defekata BMP-7 faktor rasta. Pored toga, pleiotropin, cisteinom bogati peptid poznat kao molekul signalizacije, igra veoma veliku ulogu kod rasta kosti, dok hijaluron značajno poboljšava efikasnost adhezije, migracije i diferencijacije humanih progenitorskih ćelija. Poznato je da, TGF-β) je protein kontroliše proliferaciju, ćelijsku diferencijaciju, kao i druge funkcije ćelija. TGF-beta deluje kao antiproliferativni faktor u normalnim epitelnim ćelijama. Sekretuju ga proteini koji se nalaze u 3 izomorfe: TGF-β1, TGF-β2 i

TGF-β. TGF-β1 je naznačajniji predstavnik porodice TGF-β. On je dio superporodice proteina pod nazivom transformacionih faktora rasta, koja u sebe uključuje inhibin, aktivin, anti-mulerian hormone, morfogenetski govedji protein, dekapentaplegijski i Vg-1 faktor. TGF β faktor su veliki proteinski prekursori, koji imaju peptidnu strukturu 3- članog prstena, koja sadrži 390, a TGF β2 i TGF β3 412 aminokiselina. U njihovoj strukturi prisutni su N-terminalni signalni peptidi, koji se sastoje od 20-30 amino kiselina, koji su odgovorne za sekreciju iz ćelija, u pro-region (region koji čini tzv. latentno asocirani peptid ili LAP) i C-terminalni peptidi koji se satoje od 112-114 amino kiselina, koji sadrži stare TGF β molekule, do čijeg otpuštanja u C-pro-region dolazi usled njihovog protokatalitičkog cepanja. Pri protokatalitičkom cepanju starih-ostarelih TGF β proteina, dolazi do dimerizacije pri kojoj nastaje 25 kda molekulske mase aktivni molekul sa mnoštvom očuvanih strukturnih motiva prethodne strukture. TGF β, sadrži u svojoj strukturi 9 cisteinskih rezidua, od kojih, 8 formira disulfidne veze unutar molekula kreirajući cisteinske čvorne strukture, karakteristične za superporodicu TGF β, dok 9 cisteina formira vezu sa 9 cisteina drugog TGF β molekula, formirajući dimer. Mnoge druge rezidue sadržane u TGF β proteinu, formiraju sekundarne strukture kroz hidrofobne interakcije. Oblast izmedju 5-og i 6-og cisteinskog čvora kao najdivergentnija oblast TGF β molekula, koja se nalazi na površini TGF β molekula, predstavlja aktivno mesto-receptor vezivanja, koje u funkcionalnom smislu daje specifičnost TGF β faktoru rasta. Mada TGF-β je značajan u regulaciji suštinske ćelijske aktivnosti, samo donekle mehanizam njegovog delovanja je poznat. Zna se da proteaze, integrini, ph i reaktivni kiseonik imaju značajnu ulogu u aktivirajnju TGF-β faktora rasta. Sva tri TGF-β faktora rasta mogu se sintetizovati kao prekursori molekula koji sadrže peptidne regione TGF-β-homodimera. Pošto se sintetizuje TGF-β homodimer, on reaguje sa Latency Associated Peptide (LAP) (proteinom deriviranim iz N-terminalnog regiona (TGF-β genskog produkta), formirajući mali latentni kompleks (small latent complex -SLC). Taj kompleks ostaje u ćeliji, sve dok je ona vezana za drugi protein, zvani TGF-β- binding protein (LTBP), formirajući veliki kompleks zvani large latent complex (LLC). Taj kompleks sekretuje ECM (sl.47). U mnogim slučajevima kad je sekretovan large latent complex -LLC, TGF-β prekursor ostaje zalepljen za propeptid (prikačen na njega svojom nekovalentnim vezama). Posle njegove sekrecije, ostaje ekstracelularni matriks kao neaktivirani kompleks koji sadrži i LTBP- binding protein i LAP-asocirani protein, koji se dalje procesiraju da bi otpustili aktivni TGF-β. Kačenje TGF-β na LTBP disulfidnim vezama, dopušta im da ostanu neaktivani, sprečavajući njihovo vezivanje za odgovarajuće receptore. Zato što različiti ćelijski mehanizmi zahtevaju različite razdvojene nivoe TGFβ signalizacije, neaktivni kompleksi ovih citokina, omogućuju optimalnu medijaciju TGF-β signalizacije [168-176]. Postoje 4 različita izmorfa, LAP-1, LAP-2, LAP-3 i LAP-4. Mutacija ili alteracija LAP ili LTBP rezultuje lošem signalizacijom TGF-β. Miševi kojima nedostaju LAP-3 ili LAP-4 pokazuju fenotipe uočene kod fenotipa sa alterniranom TGF-β signalizacijom. Štaviše, specifični LAP izomorfi asociraju na specifične TGF-β izomorfe. Npr. LAP-4 veže se samo na TGF-β1, tako da mutacija u LAP-4 vodi asociranim komplikacijama TGF-β, specifičnim za tkiva koja dominantno sadrže TGF-β1.

Plazmin i brojne matrične metaloproteinaze-mmp igraju ključnu ulogu u ubrzavanju remodeliranja tkiva, indukujući proteolizu nekih EMC komponenti: TGF-β proces aktivacije uključuje otpuštanje LLC iz matriksa, koje sledi potom proteoliza LAPa, da bi se otpustio TGF-β prema njegovim receptorima MMP-9 i MMP-2, za koje je poznato da se lepe latentno za TGF-β. Sl.47: SEM a) Površina citozan/kolagen skafolda, b) skafold sa TGF 1 faktorom rasta obeleženim sa zelenim fluoroscentnim proteinom, c) menzehimalne ćelije na skafoldu sa TGF 1 faktorom rasta obeleženim sa zelenim fluoroscentnim proteinom posle 2 dana kultivacije in vitro (Journal of Bioactive and Compatible Polymers 2007; 22; 232-244) Kiseli mediji pri ekstremnim vrednostima ph (1.5 ili 12), takodje, značajno doprinose aktivaciji TGF-β, dok pri umerenim uslovima kiselosti (ph 4.5) uzrokuju svega 20-30% promene u odnosu na promenu koja se dobije sa ph 1.5. LAP strukture su značajne i sa stanovišta održanja ćelijskih funkcija. Modifikacija LAP struktura vodi ometanju interakcije LAP i TGF-β. TGF-β faktori rasta svojom dodatnom aktivnošću tada mogu da prouzrokuju takvu modifikaciju TGF-β, koja će sadržati hidroksilne radikale reaktivnih kiseoničkih vrsta-ros, kao u slučaju posle ozračivanja in vivo, što ima za posledicu potpuno nekontrolisanu aktivnost TGF-β faktora rasta. Kod aktivacija TGF-β1 faktora rasta posebno važnu ulogu igra integrin: β6, αv, β8 i LAP. Jedan od modela koji objašnjava aktivaciju TGF-β1 sa αv integrinom, predpostavlja da je ona posledica konformacione promene TGF-β1 u latentni TGF-β1 kompleks, pri čemu se oslobadja aktivni TGF-β1, dok drugi modeli predpostavljaju da mehanizam aktivacije latentnog TGF-β1 prvenstveno zavisi od sadržaja i vrste enzima proteaze. αvβ6 integrin je prvi identifikovani integrin kao aktivator TGF-β1. LAPs, takodje, sadrži RGD motiv koji prepoznaje većinu αv integrina. Poznato je da αvβ6 integrin aktivira TGF-β1 vezivanjem za RGD motiv, koji je prisutan u LAP-β1 i LAP-β3. Posle vezivanja on indukuje adheziju prouzrokujući ćelijske sile koje se transformišu u biohemijske signale koji vode aktivaciji TGFb iz njegovog latentnog kompleksa. Drugi mehanizam aktivacije TGF-β1 faktora rasta, uslovljen je matričnim metaloproteinazama MMP-2 i MMP-3, koje mogu da aktiviraju TGF-β, kroz protolitičku degradaciju latentnog TGF-β kompleksa. Pri tome, αv integrin aktivira TGF-β1 kreirajući blisku

vezu izmedju latentnog TGF-β-1 i MMPs. Integrini αvβ6 i αvβ3 simultano se vežu za latentni TGF-β1 kompleks i proteinazu istovremeno indukujući konformacione promene LAP i odvajanje proteaze u bližu okolinu. Drugi važan faktor rasta je vaskularni endotelni faktor rasta- vascular endothelial growth factor - (VEGF), produkovan ćelijama koje stimulišu rast novih krvnih sudova koji hemijski signalizuje potrebe tkiva za novim krvnim sudovima, radi njihovog adekvatnog snadbevanja kiseonikom, kada je cirkulacija krvi neadekvatna (sl.48). VEGF je subfamilija specifično pločastih faktora rasta iz familije citokina-čvornih faktora rasta.. Oni su važni signalni proteini uključeni u vaskulogenezu ( novo formiranje embrionskih cirkulacionih sistema) i angiogenezu (rast krvnih sudova iz preegzistirajuće vaskularizacije). Najznačajniji je član VEGF-A. Drugi članovi su placenta faktori rasta (PIGF), VEGF-B, VEGF-C i VEGF-D. Mnogi VEGF-slični proteini su otkriveni i kodirani u virusima (VEGF-E) i u otrovu zmija (VEGF-F) [166-170]. Aktivnosti VEGF-A, studirane su većinom na ćelijama vaskularnog endotela i imaju efekte i na brojnim drugim ćelijama, kao što su efekti migracije monociti/makrofaga, neurona, kancerskih ćelija, epitelnih ćelija bubrega itd.). U in vitro uslovima pokazano je da VEGF-A uspešno stimuliše mitogenezu endotelnih ćelija i ćelijski migraciju. On je takodje dobar vazodilator, jer povećava mikrovaskularnu permiabilnost preko tzv. faktora vaskularne permiabilnosti. Termin VEGF pokriva brojne proteine dveju familija, koji rezultiraju u altiranativnom spajanju mdnk od pojedinačnih 8-eksona, VEGF gena. Dve različite familije saglasno mestu spajanja njihovog terminalnog eksona (ekson 8), čini dve grupe VEGF gena: gene sa proksimalnim mestom spajanja (označeno sa VEGF xxx ) ili gene sa distalnim mestom spajanja (VEGF xxx b). Uz to alternativno spajanje eksona 6 i eksona 7, alternira njihov heparin-kapacitet vezivanja i aminokiselinski broj ( kod ljudi: VEGF 121, VEGF 121 b, VEGF 145, VEGF 165, VEGF 121 b, VEGF 189, VEGF 206,). Ovi domeni imaju značajne funkcionalne konsekvence koje impliciraju odredjene varijante VEGF povezivanja- spajanja. Na taj način, zavisno od mesta spajanja terminiranog eksona-8 VEGF faktora zavisi da li će protein biti pro-angiogen (proksimalno mesto spajanja) ili anti-angiogen (distalno mesto spajanja, koje je karakteristično za normalna tkiva). Uz to uključenje ili isključenje eksona 6 i 7 iz reakcije spajanja sa DNK, pospešuje interakciju VEGF sa heparan sulfat proteoglikanom (heparan sulfate proteoglycans-hspgs) i neurofilin ko-receptorom na površini ćelije, koja time pokazuje povećavanu sposobnost vezivanja i aktivacije sa VEGF receptorima (VEGFRs) [166-170]. Svi članovi VEGF familije stimulišu ćelijske odgovore vezivanjem na receptor tirozin kinaze- tyrosine kinase receptor (VEGFRs) na površini ćelije, uzrokujući njegovu dimerizaciju i aktivnost, u skladu sa procesom transfoforilacije- transphosphorylation, koji se dogadja na raznim mestima, tokom različitih vremena, pri različitim koncentracijama/sadržajima VEGF. VEGF receptori imaju ekstracelularni udio koji sadrži 7 imunoglobulinu sličnih domena (pojedinačne transmembranske domene spajanja i intracelularne delove, koji sadrže razdvojene/pocepane tirozin-kinaza domene). VEGF-A veže se na VEGFR-1 i VEGFR-2 (KDR/Flk-1), pri čemu izgleda da VEGFR-2 podstiče gotovo sve poznate ćelijske odgovore VEGF. Funkcija VEGFR-1, je još uvek nedovoljno poznata, iako se zna da on modulira VEGFR-2 signalizaciju. Druge funkcije VEGFR-1 mogu se aktivirati kao lažni/mamac receptor, koji odvaja VEGF od VEGFR-2 veze ( to je posebno važno kod vaskulogeneze u embrionu). VEGF-C i VEGF-D, za

razliku od VEGF-A, su ligandi za treći receptor (VEGFR-3), koji podstiče limfoangiogenezu- lymphangiogenesis [168-171].. Sl. 48: Histološka evaluacija skafolda posle 3 nedelje: Hematoksilin-eozin obojena demineralizovana koštana matrica- DBM, i heparinom umrežena demineralizovana koštana matrica- HC-DBM, DBM/VEGF i HC-DBM/VEGF pokazuju ćelije I nove krvne sudove koji prodiru u skafold; Kapilare sa intaktnim granicama su prikazane i crvene ćelije (markirane sa R) sa definisanim zidovima kapilara pokazuju funkcionalizaciju novih krvnih sudova (J Mater Sci: Mater Med (2010) 21:309 317) VEGF xxx proizvodnja može biti indukovana u ćelijama koje ne primaju dovoljno kiseonika. Kada ćelija nema dovoljno kiseonika ona produkuje transkripcioni faktor HIFhipoksija-induktivni faktor- hypoxia-inducible factor. HIP pored mnogih drugih funkcija stimuliše otpuštanje VEGF xxx, (uključujući i modulaciju eritropoeze- eryrhropoesis ). Cirkulišući VEGF xxx tada veže se za VEGF receptor na endotelnim ćelijama, kao okidač ciklusa tirozin kinaze- pathway tyrosine kinase vodeći angiogenezi. HIF1 alfa i HIF1 beta konstantno se produkuju, ali samo HIF1 alfa ima visoku koncentraciju nestabilnog O 2, koji u aerobnim uslovima degradira. Kada ćelija postane hipoksična- hypoxic, HIF1alfa odoleva i HIF1 alfa/beta kompleks stimuliše otpuštanje VEGF. Sadašnje studije pokazuju da nije VEGFs jedini promoter angiogeneze. FGF2 i HGF su takodje potencijalni angiogeni faktori. Proces koji prati kontakt implanta sa specifičnom vrstom tkiva, u prvoj fazi kontakta uslovljava formiranje nefunkcionalnog tkiva. Naime, na mestu kontakta počinju da se luče faktori rasta i citokini indukujući proliferaciju i migraciju fibroblasta. To se dešava u okviru razvoja granulacionog tkiva i novih krvnih sudova i ECM-a koji se formira na početku procesa reparacije. U formiranju tzv. ožiljka učestvuju 3 procesa: proces migracije i proliferacije fibroblasta na mestu oštećenja, depozicija ECM i remodeliranje tkiva. Migracija i proliferacija fibroblasta na mesto oštećenja indukovana je mnogobrojnim faktorima rasta i citokinima, uključujući TGF-β, PDGF, EGF, FGF, IL- 1 i TNF. Izvori ovih faktora su trombociti, razne imflamatorne ćelije (posebno makrofage) i aktivisani endotel. Makrofage su važne ćelije granulacionog tkiva, koje se satoji od ekstracelularnog debrisa, fibrina, i drugih stranih materijala, koji su se našli na mestu reparacije. Ćelije granulacionog tkiva, takodje, stvaraju TGF-β, PDGF i FGF faktore rasta, potpomažući migraciju i proliferaciju fibroblasta. TGF-β je faktor koji ima najveći uticaj na deponovanje fibroznog tkiva, jer uzrokuje migraciju i proliferaciju fibroblasta,

povećava sintezu kolagena i fibronektina, te smanjuje degradaciju ECM pomoću metaloproteinaze. TGF-β je takodje hemotaksični faktor za monocite i indukuje angiogenezu «in vivo», verovatno pomoću indukcije makrofaga. Ekspresija TGF-β se povećava u tkivima u brojnim hroničnim fibroznim bolestima [168-171]. Depozicija ECM napreduje sa odmicanjem reparativnog procesa i smanjenjem broja proliferišućih endotelnih ćelija i fibroblasta. Sinteza kolagena počinje 3-5 dana nakon povrede i traje nekoliko nedelja zavisno od veličine rane. Mnogi od faktora rasta koji regulišu proliferaciju fibroblasta stimulišu i sintezu ECM. Sintezu kolagena stimulišu faktori rasta: PDGF, FGF, TGF-β i citokini IL-1, IL-3, koje sekretuju leukociti i fibroblasti u rani koja zarasta. Na kraju skelet granulacionog tkiva pretvara se u ožiljak sastavljen od vretenastih fibroblasta, gustog kolagena, fragmenata elastičnog tkiva i drugih komponenata ECM. Remodeliranje tkiva je završni proces pri formiranju ožiljka, koji se nastavlja na proces deponovanja ECM. Neki od faktora rasta koji stimulišu sintezu kolagena modulišu sintezu i aktivaciju metaloproteinaza, enzima koji razgradjuju ove komponente ECM. Degradacija kolagena i ostalih ECM proteina desava se pod dejstvom enzima iz familije matriks metaloproteinaza-mmp, čija aktivnost zavisi od prisustva jona Zn. MMP uključuje intersticijalne kolagenaze MMP-1, 2 i 3 koje cepaju fibrilni kolagen tipa I,II i III, gelatinaze MMP-2 i 9, koje razgradjuju amorfni kolagen i fibronektin, stromelizine NMP-3, 10 i 11, koji deluju na razne komponente ECM, uključujući proteoglikane, laminin, fibronektin i amorfne kolagene i familiju MMP vezanih za membrane. MMP se sintetišu kao propeptidi kojima je potrebno protolitičko cepanje za aktivaciju. Njih proizvodi nekoliko tipova ćelija: fibroblasti, makrofage, neutrofili, sinovijalne ćelije i neke epitelne ćelije. Njihovu sekreciju indukuju stimulansi koji uključuju faktore rasta PDGF,FGF, citokine IL-1 i TNF, fagocitozu i fizički stres, dok ih inhibišu TGF-β i stereodi. Kolagenaze cepaju kolagen pod fiziološkim uslovima, sekući trostruki heliks na dva nejednaka dela, koji su onda pogodni za razgradnju od drugih proteinaza. Kolagenaze se sintetišu kao neaktivne prokolagenaze, koje se aktiviraju pomoću hemijskih faktora kao što su slobodni radikali koji se oslobadjaju iz leukocita u toku oksidativne eksplozije proteinaza. Jednom formirane, aktivisane kolagenaze brzo se inhibišu pomoću tkivnih inhibitora metaloproteinaza-timps koje produkuje većina mezenhimalnih ćelija, tako sprečavajući njihovo nekontrolisano delovanje[172-174]. Velika i važna familija enzima povezanih sa MMP naziva se ADAM. ADAMs su zakačeni su za plazma membranu i kroz njihovu protolitičku aktivnost, oni cepaju i oslobadjaju ekstracelularne domene ćelija-površinskih proteina, kao što su prekursorske forme TNF-α. Za prenos ćelijskih signala, dakle, ključni su faktori rasta: TGF-β, PDGF,KGF,VEGF, EGF citokini: TNF-a, IL-1, IL-6, IL-8, IL-4 i IL-10 i interferoni. TGF-β faktor fiziološki uslovljava hemotaksu fibroblasta, monocita, makrofaga i limfocita, proliferaciju makrofaga, limfocita, fibroblasta, stimulaciju keratinocita, indukciju ekspresije Pro-MMP-9 u keratonicitima i sekrecije TIPs-a u fibroblastima, povećanje adhezije ćelija za proteine matriksa putem modulacije integrinskog R, stimulaciju fibroblasta za kontrakciju kolagena ECM. Klinički je pokazano da je prisutan u većoj meri u hroničnoj nego akutnoj rani (TGF-β 1 i TGF-β 2 ako je povećan uslovljava hiperfibrotična oboljenja, dok TGF-β 3 redukuje stvaranje ožiljka itd).

PDGF fiziološki uslovljava hemotaksu monocita, limfocita i neutrofila, sazrevanje monocita, podstiče produkciju VEGF-vaskularnog faktora rasta, stimuliše u fibroblastima produkciju MMP-matriksne metaloproteinaze i miofibroblasta značajnih za kontrakciju kolagena ECM (klinički je to prvi faktor rasta primenjen u lokalnoj terapiji urastanja rane). KGF je fiziološki snažan medijator proliferacije keratinocita, koji reguliše uz pomoć KER2 ekspresiju mnogih gena i stimuliše pokretljivost keratinocita i fibroblasta. EGF fiziološki utiče na direktnu epitalizaciju (autokrino dejstvo), simulaciju sekreta kolagenaze iz fibroblasta, i inhibiciju kontrakcije rane fetusa, a klinički ostareli fibroblasti dermisa pokazuju smanjenu ekspresiju EGFR receptora za EGF, i stvaranje ožiljnog tkiva «in utero». Pored navedenih faktora rasta veoma značajnu ulogu u biohemijskim mehanizmima signalizacije izmedju ćelija igraju citokini, medju koje spadaju faktor tumorske nekroze-tnf i različite vrste interleukina: IL-1, IL-6, IL-8, IL-4, IL-10 i interferona (antifibrogena). Citokin, faktor tumorske nekroze-tnf, fiziološki uslovljavaju hemotaksiju leukocita, sazrevanje monocita, aktivaciju makrofaga, inhibiciju fibroplazije, povećanje aktivnosti MMP-2 i MMP-3, pojačanje produkcije VEGF. Klinički njegova povećana koncentracija upućuje na oštećenu depoziciju kolagena i loše zarastanje rane, posebno kod hronične rane. [173-181] Interleukini predstavljaju grupu citokina (sekretovanih proteina/signalnih molekula) koja je prvi put uočena kod ekspresije belih krvnih zrnaca (leukocita). Termin interleukin vodi od inter-to znači komunikacija i leukin-izveden iz činjenice da mnoge ove proteine produkuju leukociti i deluju u leukocitima. Funkcija imunog sistema zavisi velikim delom od interleukina, čija deficijencija vodi autoimunim bolestima ili imunoj deficijenciji. Brojni interleukini su sintetisani uz pomoć CD4+ T limfocita, kao i monocita, makrofaga i endotelnih ćelija. One ubrzavaju razvoj i diferencijaciju T, B i homeopatskih ćelija. Interleukin-IL-1 fiziološki uslovljavaju hemotaksiju leukocita i fibroblasta, aktivaciju makrofaga, angiogenezu, stimulaciju u fibroblastima produkcije MMP stimulacije migracije keratinocita. Visoka koncentracija IL-1 klinički povezana je sa produženim zarastanjem rane Interleukin-IL-6 fiziološki uslovljava inhibiciju razgradnje ECM i stimuliše sekreciju TIMP iz fiobroblasta. Visoka koncentracija IL-1 klinički povezana je takodje sa lošim zarastanjem rane Interleukin-IL-8. fiziološki uslovljava hemotaksiju leukocita, pojačanje epitelizacije, migraciju keratinocita, inhibiciju kontrakcije kolagena indukovane fibroblastima (ima maksimalnu sekreciju u toku prva 24 h od trenutka povrede). Interleukin-IL-4 i Interleukin-IL-10 fiziološki uslovljavaju inhibiciju hemotaksije leukocita, nishodnu regulaciju ekspresije mnogih pro-imflamantornih citokina (klinički njihova sekrecija je maksimalna u toku prvih 3 do 72 sata) Interferoni-antifibrogeni fizioloki uslovljavaju inhibiciju aktivnosti fibroblasta i posttranslacionih promena kolagena, povećavaju aktivnost kolagenaza (klinički INFγinterferon gama redukuje veličinu keloida kada se da intradermalno).

5.4.2.4.Biorekatori-Sredina rasta koštanog tkiva Novi pristup ubrzanju ćelijske proliferacije je uvodjenje bioreaktorskih sistema u strukturu skafolda. Odgajanje-kultivacija koštanih ćelija tradicionalno se izvodi na polistirenskih flaskovima, kojima su dodati bioaktivni reagensi kao što su deksametoksan i askorbinska kiselina, radi kultivacije koštanih tkiva specifičnog porekla. Pri tome se koriste spinovani flaskovi i kertridži da bi se poboljšala ćelijska proliferacija. Bioreaktori, imaju ulogu da pospeše ćelijsko naseljavanje i cirkulaciju medija kroz 3D skafold, radi uklanjanja otpadaka nastalih u ćelijskom metabolizmu i difuziju nutricijenata potrebnih za dinamičan razvoj ćelija [182-184]. Savremena istraživanja pokazuju da primenom metode oscilatorne perfuzije ćelijske suspenzije postiže se visoka efikasnost naseljavanja ćelija, veoma dobra ćelijska distribucija, sa snažnim vezama izmedju koštanih ćelija i matriksa. Bioreaktori imaju posebnu ulogu u efikasnosti proliferacije koštanih ćelija. Prema zapažanjima neki istraživača, veoma važnu ulogu u procesu proliferacije i posebno diferencijacije ćelija igraju i smicajne sile na granici kontakta ćelija-skafold, jer njihov porast vodi poboljšanju ekspresije osteoblasnog fenotipa, koji potom povećava produkciju mineralizovanog matriksa. 5.4.2.5. Biomimetski materijali Biomimetski materijali imaju izuzetan značaj u povećanju efikasnosti ćelijske adhezije i proliferacije unutar skafolda. Osteoblasti često se kače i adheriraju na površini koja sadrži na sebi proteine ćelijskih membrana. Medju njima glavni su integrini, koji se sastoje iz dva lanca, a-lanac i b-lanca. Aktivnost osteoblasta naglašeno pospešuju a1, a2, a3, a4, a5, a6, av, b1, b3, i b5 subjedinice integrina, tako što dati integrini pospešuju kačenje ćelija, i regulišu ćelijsku migraciju, rast, diferencijaciju i apoptozu. Pravljeni su izvesni istraživački pokušaji da se razviju materijali koji oponašaju integrin-veze u različitim biološkim sistemima [185,186]. Npr., tri peptidna sekvenca arginin-glicinaspartinske kiseline (RGD) vezana su za integrine koji pripadaju ćelijskim membranama, što je imalo za cilj da se inkorporiraju u strukturu skafolda, da bi se poboljšala adhezija koštanih ćelija i njihov rast. Uz to ECM proteini, kao kolagen I, laminin, fibronektin, vitronektin i fibrinogen pripadaju, takodje, grupi adhezionih proteina, koji imaju značajan uticaj na formiranje i rast ćelija osteoblasta. 5.4.2.6. Mineralizacija koštanog skafolda Druga strategija poboljšanja koštanog rasta je generisanje mineralizovanog sloja na koštanom skafoldu. Budući da se u strukturi prirodne kosti nalaze i neorganski materijali-minerali, mnoge istraživačke strategije koriste manipulaciju strukturom implanta da bi indukovali kostima sličnu strukturu (mineralizaciju), koja omogućuje dobijanje nove kosti ili njenu rekonstrukciju, posle implantacije skafolda. Sledeći takve strategije, npr., površine apatitnog implanta modifikuju se tako da bi se favorizovao proces osteogeneze. Materijali koji sadrže funkcionalne grupe Si-OH, Ti-OH, Zr-OH, Nb-OH i Ta-OH, pokazano je da favorizuju formiranje apatitnih slojeva u prisustvu simuliranih telesnih fluida, čak i u uslovima kad oni ne sadrže celularne proteine. U takvim slučajevima, nova kost se formira na datom mineralizovanom sloju, i implant može biti stabilizovan porastom čvrstoće na medjupovršini materijal-kost [187,188].

5.4.2.7. Nanotopografija Neke studije pokazuju da koštani graft sa nanotopografskom površinom ima sličnu strukturu prirodnim kostima, koja je pogodna za bolju integraciju implanta i tkiva. Kod prirodne kosti, koštane ćelije su izložene substratima sa nanoskalnom morfologijom, kao što su ECM proteini, minerali i pore u mebranama i tkivima. Oponašanjem ove nanotopografije, istraživači pokušavaju da poboljšaju rast koštanih tkiva i njihovu integraciju. Nanotopografska površina Ti površine dobijena sa hemijskim tretmanom sa H 2 SO 4 /H 2 O 2 poboljšava rast koštanih tkiva i ALP aktivnost. Slično, TiO 2 prevlake koje sadrže pore dimenzija 15-50 nm ubrzavaju formiranje kostima sličnog kalcijum fosfata koji indukuje kačenje tkiva. Ta nanostrukturna ostrvca (11, 35 i 85 nm) produkovana pomoću tehnike mešanja polistiren/polibromstiren, pokazuju porast ćelijske adhezivnosti i proliferacije, kao i ALP aktivnosti.nanotopografija je značajan faktor kod diferenciranja menzehimalnih matičnih ćelija (ili osteoprogenitora) prema osteoblastnom fenotipu. Na taj način nanotopografija stimuliše formiranje kosti, poboljšava kost-implant integraciju, vodi boljoj reparaciji kosti i regeneraciji na medjupovršini koštani implant-površina biomaterijala [189, 190]. 5.4.2.8. Savremeni koncepti konstrukcije skafolda Primarna struktura skafolda, koju je moguće realizovati na brojne načine, kao što su sol-gel postupak, termički indukovana fazna separacija, posebno pogodna za proizvodnju 3D polimernog skafolda sa kontrolisanom mikrostrukturom i makrostrukturom za nesmetanu proliferaciju mišića, tetiva, nerava, kosti i zuba. U tu svrhu koriste se raznolike tehnike proizvodnje skafolda, kao što su konvencionalne tehnike livenja u polimernoj matrici u dobro definisanim formama kalupa uz naknadno uklanjanje polimera rastvaranjem u organskom rastvaraču, fazna separacija, luženje porogena, sinterovanje mikrosfera, koristeći u prvom koraku tehniku isparavanja, a potom sinterovanja u drugom koraku, kreiranje skafolda korišćenjem tehnike templejta od polimernih pena, tehnike proizvodnje skafolda primenom vlakana ili tehnika umakanja, elektroforetske depozicije, biomimetskim samoasembliranjem, koristeći tehnike superkritičnih pritisaka, kao npr kod pripreme skafolda iz kompozita PLGA i hidroksiapatita, tehnike membranske laminacije, tehnike visokih pritisaka, «freeze drying»-a i tehnika brzog štampanja različitih formi skafolda unapred kreiranih uz pomoć odgovarajućih kompjuterskih programa. Za ubrzavanje procesa formiranja nove kosti i ubrzanje procesa njenog rasta razvijene su bojne strategije. One uključuju generisanje nanotopografije na površini skafolda, razvoj biomimetskih materijala, formiranje mineralizovanih slojeva koštanog skafolda i korištenje bioreaktora za ćelijsko naseljavanje. Ovi pristupi imaju za cilj da obezbede prirodno okruženje u kojima će koštane ćelije rasti. Studije nanotopografije, biomimetskih materijala, faktora rasta, mineralizacije i sredine pogodne za rast koštanih skafolda veoma su bitne da bi bili osvetljeni poželjni aspekti formiranja i rasta koštanih tkiva. Saglasno tome, razvijene su i brojne strategije sinteze skafolda koje uključuju najrazličitije metode i pristupe, koji su u prethodnom tekstu delimično analizirane. U tekstu koji sledi analiziraju se postupci dobijanja skafolda, korišćenjem različitih tehnika

sinteze i različitih pristupa koji kombinuju različite tehnike dobijanja skafolda analizirajući istovremeno ne samo te postupke nego i njihove prednosti i nedostatke. Kod dizajniranja skafolda, saglasno već napred nevedenim osobinama i strukturi faktora rasta koji su odgovorni za procese signalizacije medju ćelija, sa stanovišta naših strateških usmerenja u istraživanjima, oni imaju dvojak značaj. S jedne strane, oni se mogu posmatrati kao faktori čijem uvodjenjem u strukturu skafolfda moguće je dodatno aktivirati i usmeriti ćelije da odredjene vrste medjusobne signalizacije i proliferacije, koja uključuje u sebe i moguće mehanizme uspostavljanja aktivnih struktura, koje omogućuju bržu angiogenezu i proliferaciju krvnih sudova i nutricenata, te na taj način pospešuju brži proces ćelijske prolifereacije i rasta. S druge strane oni daju informacije o stanjima tkiva i veoma su značajni sa stanovišta dijagnostike vezane za promene na tkivima u kontaktu sa implantiranim materijalom. Metoda polimernog temlejta: Medju brojnim već navedenim metodama dizajniranja strukture skafolda, jedna od najčešće korišćenih metoda je metoda polimernog templejta-polimerne pene koja se koristi kao model sistem pri oblikovanju keramičke strukture skafolda. U našoj labaratoriji, kod dizajniranja struktura skafolda preferentno su korišćene dve metode: metoda freeze dryinga /sumblimacionog sušenja i metode temlejta korišćenjem kao model sistema poliuretanske pene (za oblikovanje unutrašnje geometrije keramičke komponente-cha) odredjene veličine poroznosti i veličine okaca. Nakon procesa izgaranja polimerne faze i sinterovanja keramičke faze na 800 0 C, dobijena je struktura skafolda data na sl 49 i 50 [191,192]. Sl. 49: SEM. Tipičan izgled structure skafolda dobijenog metodom templejta polimerne pene. Sl. 50: AFM: Tipičan izgled strukture CHA skafolda dobijenog metodom templejta polimerne pene

Kombinovana metoda polimernog templejta i biomimetske depozicije: Za funkcionalizaciju unutrašnjih zidova skafolda dobijenih metodom polimernog temlejta u našim eksperimentima korišćene su različite vrste polimera, kao što su: PLA-PLGA, HEMA, hidroksi etil celuloza, modifikovani skrob, alginat i metformin, nanotube funkcionalizovane sa DNK i melaminsulfonatom. Biomimetskim tretiranjem unutar odgovarajućih SBF medija, dobijene su visokoaktivirane strukture skafolda vrlo specifičnog strukturnog dizajna, kao što je pokazano na sl. 51. a) b) c) d) e) f) Sl. 51: Skafoldi dobijeni kombinacijom metode temlejta, depozicije tankog polimernog filma i biomimetske metode: a) polimerni film metformina, b) karbonske nanotube sa EVA/EVV, c) alginate, d) hiroksietilceluloze, d) i f) polilaktidkoglikolida različitih udela PLA:PLG Pored ovih polimera niz drugih polimera može biti uključen u funkcionalizaciju unutrašnjih zidova skafolda, kao što su: polikaprolakton, poli(sebabic-co-ricinoleic ester anhidrid), citozana, kao i različiti biopolimeri i faktori rasta. U našim eksperimentima korišćeni su i superparamagnetni materijali-ferofluidi na bazi magnetita, maghemita, kobaltferita, gadolinium oksida i nanometala, kao što je nanozlato, karbonske nanotube itd. funkcionalizovane na različite načine, kao tanki filmovi na površinama poroznih keramičkih hidroksiapatitnih skafolda, koji funkcionalizuju njegovu površinu dajući joj

specifična fizička svojstva i na taj način utiču na biološka svojstva takvih struktura u uslovima kontakta sa koštanim ćelijama, koje adheriraju i naseljavaju se na njihovim površinama (sl.52).[145,193] a) b) c) d) Sl. 52: AFM: koloidne čestice a) superparamagnetni ferofluid kobalferita, b) superparamagnetni ferofluid maghemita, c) koloidno nanozlato, d) karbonske nanotube funkcionalizovane sa melaminsulfonatom (Applied Surface Science, 255, (12), (2009), 6359-6366.) Metoda gas-pena uz dejstvo superkritičnog CO 2 : Kod tehnike pena-gas, za procesiranje skafolda koristi se CO 2 gas pod visokim pritiskom. Makroporozne spužve PLLA (poli-l-laktidna kiselina), PLGA (polilaktid-ko-glikolidna kiselina) i PGA (poliglikolidna kiselina) dobijaju se iz polimernih diskova, koji se podvrgavaju visokim pritiscima CO 2. Pri tome, nastaje smeša polimer-gas.[194-196] Proces nastajanja polimernog skafolda odvija se tako što se gasni molekuli klasteruju, formirajući gasne nukleuse. Potom rastvoreni molekuli gasa unutar tako formiranih nukleusa pora difunduju, kreirajući makropore. Poroznost i struktura pora dobijena tokom tog procesa, zavise od količine gasa rastvorenog u polimeru, brzine gasne nukleacije i brzine difuzije molekula gasa kroz polimer (sl.53). Da bi se poboljšala struktura pora, koriste se i kombinacije tehnika gas-pene i tehnike luženja. Kod takvog procesa, diskovi biodegradibilng polimera i soli oblikuju se pod pritiskom na sobnoj temperaturi, a potom podvrgavaju dejstvu CO 2 gasa pod visokim pritiskom. Posle ekspanzije, so se luži, doprinoseći ukupnom udelu poroznosti unutar polimernog skafolda. Ukupna poroznost i medjusobna povezanost pora regulišu se odnosom mase polimera i soli i veličinom

čestica soli. Najčeće se kao so koristi (NH 4 )CO 3, kao agens za proizvodnju gasa, odnosno porogen. Poroznost se kontroliše preko količine (NH 4 )CO 3 koja se inkorporira u polimer. Sl. 53. PDLLA polimer posle procesiranja sa superkritičnim CO 2 na 240 barra a 35 0 C u toku 12 minunta (a i b) i 60 minuta (c i d) (Current Opinion in Solid State and Materials Science 8 (2004) 313 321.) Ova metoda, može se dodatno unaprediti uvodjenjem u smešu prirodnih ili polimernih vlakna koja su prethodno izatkana u trodimenzionalnu strukturu. PLGA je prvi biokompatibilni i biodegradibilni polimer koji je izvučen u vlakna i korišćen kao sintetički konac. Skafold oblikovan sa PGA, PLGA i PLLA vlaknima koristi se za ćelijsku regeneraciju i transplataciju različitih tkiva, kao što su nervi, koža, ligamenti, hrskavica, lopatice itd. Takva vlakna koriste se i za ojačanje polimernih materijala, primenjenih u ortopedskoj hirurgiji. Prednosti ove vrste hibridnih materijala zasnovane su prvenstveno na njihovoj velikoj specifičnoj površini, koja omogućuje veću efiksanost kačenja ćelija i bržu difuziju nutricijenata, potrebnih za ćelijsko preživljavanje i rast. Nedostatak ovakvih skafolda je njihova strukturna nestabilnost. Ona se delimično prevazilazi toplim izvlačenjem PLLA vlakana, koje omogućuje njihovu usmerenu molekulsku orijentaciju i kristaliničnost. Isparavanjem rastvarača nastaje mreža nevezanih PGA vlakna i PLLA matriksa. Da bi se ostvarila veza vlakana i matriksa potrebna je dodatna termička obrada kompozita na temperaturi iznad temperature topljenja PGA. Radi bolje kontrole poroznosti tako dobijenih skafolda ova tehnika najčešće se kombinuje sa tehnikom raspršivanja/sprejovanja PGA vlakana sa atomiziranim rastvorom PLLA ili PLGA. Tkom tog procesa, debljina polimerne prevlake kontroliše se vremenom raspršivanja. Dobijeni kompozitni material, ovako kombinovanom tehnikom, pokazuje znatno bolja svojstva sa stanovišta efikasnosti kačenja ćelija, njihovog rasta i aktivnosti. Metoda fazne separacije bazira se na termodinamičkom razdvajanju homogenog rastvora polimer-rastvarač, u polimerom bogatu i polimerom siromašnu fazu, najčešće

izlaganjem rastvora drugom nemešljivom rastvaraču ili njegovim hladjenjem ispod tačke binodalne rastvorljivosti. Rastvarač se, potom, uklanja freez draying -om, ostavljajući polimer u formi pene[197-199]. Morfologija tako dobijenog skafolda kontroliše se faznim prelazom koji se dešava tokom stupnja hladjenja, tj. tečne-tečno fazne separacije, koja vodi izotropnoj formi PLA sa visoko medjusobno povezanim porama reda veličine 1-10 μm, dok unutar faze čvrsto-tečnost nastaje anizotropna pena specifične lisnate forme (sl.54). Sl. 54: PLGA/nanohidroxyapatite (95:5) skafold pripremljen iz 10% (w/v) smeše PLGA/dioksan/voda sa različitim sastavima rastvora: a) 1,4-dioksan voda 85:15 i b) 1,4-dioksan voda 87:13 ( Makroporoznost ove faze čine otvorene pore dimenzija iznad 100 μm. Kontrola poroznosti skafolda postiže se kontrolom procesa ukrupnjavanja pora u kasnim fazama termalno indukovane fazne separacije. Metod freeze drying emulzije: Metod freeze drying emulzije je modifikovani metod fazne separacije, koji se koristi u proizvodnji alifatičkih poliesterskih skafolda. Skafoldi dobijeni ovim metodom imaju poroznost iznad 90%, dok je srednja veličina pora izmedju 15 i 35 μm, sa najvećim porama većim i od 200 μm (sl.55). Poroznost skafolda, prvenstveno zavisi od zapreminske frakcije dispergovane faze, koncentracije polimera i njegove molekulske mase. Tehnika freeze drying emulzije koristi se i za inkorporaciju proteina u polimerni skafold. Freeze drying vodenih rastvora biopolimera kao što je kolagen, koristi se i kod dobijanja dobro definisanih poroznih matrica (dobro definisane veličine i orijentacije pora). Takva konstrukcija skafolda zasnovana je na kontrolisanom rastu kristala leda tokom freeze drying -a[200-203].

Sl.55. Skafoldi dobijeni tehnikom freeze drying 10 % (w/v) emulzije a) čisti poli(hidroksibutirat-ko-valerat) skafold-phvb, b) 10% hidroksiapatit-ha:90% PHVB skafold, c i d) 20% HA:90% PHVB; (J Mater Sci: Mater Med (2008) 19:2555 2561) Metoda livenja/luženja porogena: Metoda livenja/luženja porogena uključuje u sebe livenje smeše polimera i porogena u kalup, sušenje smeše, potom luženje porogena sa vodom, da bi se napokon dobile pore. Najčešće se kao porogeni koriste soli i karbohidrati. Pri tome, strukturu pora najlakše je kontrolisati udelom porogena, što čini sam proces reproduktivnim. Visoko porozne PLLA membrane kontrolisane poroznosti, kao i odnosa površina: zapremina, te kristaliničnosti pripremaju se livenjem disperzije kristalne soli u organski rastvor PLLA, da bi nakon toga so bila izlužena vodom, kad rastvarač otpari. NaCl, Na-tartarat i Na-citrat raznih veličina čestica koriste se kao materijali za stvaranje. pora luženjem. Osobine dobijenih pena zavise isključivo od frakcije soli i veličine njenih čestica, a ne zavise od vrste izabranog polimernog rastvarača. Fazna separacija i freeze-drying emulziona tehnika može se iskoristiti i za inkorporaciju proteina u skafold pri niskim temperaturama [204-207]. Budući da tada strukturu pora skafolda nije lako iskontrolisati, teško je dobiti velike otvorene pore unutar matrice skafolda. Nasuprot tome, metoda luženja porogena obezbedjuje laku kontrolu strukture pora i koristi se za pripremu poroznih trodimenzionalnih skafolda pogodnih za inžinjerstvo tkiva (sl.56). Kod metode luženja porogena, PLLA spužve pokazuju visoku poroznost i visoku medjusobnu povezanost pora. Oblik pora i njihova medjusobna povezanost-interkonekcija posebno su dobro naglašeni u slučaju korišćenja čestica leda u svojstvu porogena. Ako je koncentracija polimera manja tada su porozniji zidovi PLGA pena.

a) b) Sl.56. SEM: a) presek PLLA spužve pripremljene primenom frakcije leda (a-70%; b-80%); b) presek PLGA spužvi dobijenih metodom luženja (a-plga, b-hibrid PLGA-kolagen) (Materials Science and Engineering C 17 (2001). 63 69) Hibridna metoda: Kolagen-PLLA hibridni skafoldi sa paralelnim kolagenskim vlaknima umočenim u PLLA matricu dobijeni su umakanjem kolagenskih vlakana u 10% rastvor PLLA u hloroformu i sušenjem u vakuumu, na sobnoj temperaturi. Zbog veoma dobrih mehaničkih osobina, takvi skafoldi mogu se koristiti za regeneraciju nerava, pri saniranju defekata reda veličine do 25 mm.to je obećavajući alat, koji bi trebalo da preuzme na sebe funkciju vodiča nerava pri perifernoj nervnoj regeneraciji.takodje, kolagen gel umočen u PGA mrežu može se iskoristiti za konstrukciju epiteluma, slično ljudskom esofagelnom epitelmu. i) ii) Sl.57: SEM: i) a-plga mreža, b-plga-kolagen hibridna mreža; ii) presek PLGA-kolagen-hidroksiapatit hibridne spužve posle a-2 i b-4 alternirana ciklusa umakanja (Macromol. Biosci. 2002, 2, 67-77.)

Takva vrsta hibridnog materijala ima mehaničke odsobine slične polimernoj mreži i samim tim znatno bolje od same kolagenske spužve. Dobro interaguju sa ćelijama. Mogu se koristiti za regeneraciju ligamenata, jer hibridizacija sa kolagenom olakšava ćelijsko zasijavanje, i prostornu ćelijsku raspodelu i neo-angigenezu. Ona obezbedjuje mikroporoznu strukturu i hidrofilnost, koja je ključna za lako ćelijsko zasejavanje [208-210]. Hibridna spužva sintetičkog polimera, kolagena i hidroksiapatita pogodna je za deponovanje hidroksiapatitnih čestica na površini hibridne spužve sintetičkog polimera i kolagena, jer oponaša strukturu kolagena i hidroksiapatita u prirodnoj kosti (sl.57). Depozicija hidroksiapatita odvija se kroz proces alternirane imerzije PLGA-kolagen spužve u u vodenom rastvoru CaCl 2 i Na 2 HPO 4. PLGA-kolagenska spužva prvo se uranja u rastvor CaCl 2 pod vakuumom, na 37 0 C tokom 12h,da bi se prostor unutar spužve što bolje natopio rastvorom. Posle izvlačenja iz CaCl 2 rastvora, spužva se centrifugira da bi se odstranio višak Na 2 HPO 4 rastvora. Ovaj process alternirane imerzije i centrifugiranja definiše jedan ciklus deponovanja hidroksipatita unutar spužvaste strukture PLGAkolagen skafolda. Proces deponovanja najčešće se izvodi u nizu ponovljenih ciklusa. Metoda elektroforetske depozicije: Metoda elektroforetske depozicije je jedna od najefikasnijih tehnika asembliranja hidroksiapatitnih finih čestica. Vrlo je jednostavna i njome je moguće dobiti vrlo kompleksne forme čestica. Aparatura za izvodjenje elektroforetske depozicije je vrlo jeftina. U prvo vreme ova metoda, pretežno je korišćena za deponovanje HA prevlaka na metal ili keramiku, dok je deponovanje dovoljno debelih slojeva apatita odgovarajuće poroznosti da bi mogao da posluži kao skafold još uvek veliki izazov [211]. Zbog toga se velika pažnja posvećuje dobijanju hidroksiapatitnih stabilnih disperzija, sa visokim.vrednostima zeta potencijala i odgovarajućom koncentracijom, koja bi u pogodno odabranim uslovima deponovanja mogla dati odgovarajuću strukturu strukturi skafolda (sl.58). Sl. 58: SEM sinterovane prevlake dobijene sa EPD u raznim disperzionim medijima pri različitim temperaturama vakumskog sinterovanja a) etanol, 800 0 C; b) glikol, 800 0 C, c) etanol, 1000 0 C, d) ) glikol, 1000 0 C (Journal of Wuhan University of Technology-Mater. Sci..23,.3 ( 2008), 293-297.)

Freeze drying metoda: Freeze drying metoda je jedan od najčešće korišćenih metoda za dobijanje skafolda. Modifikovana sa prirodnim ili veštačkim vlaknima koristi se za dobijanje tro-dimenzionalne vlaknaste strukture. Poroznost strukture skafolda dobijenog freeze drying metodom je ispod 70%, dok je veličina pora dominantno oko 50 μm (sl.59). Skafoldi takve poroznosti, nepodesni su za ćelijsku migraciju [201, 203, 204, 209]. a) b) Sl. 59: SEM: a) presek površinske strukture skafolda od svile sa 6% rastvorom, površinska morfologija (bar 300 μm), b) presek morfologije želatinskog skafolda pripremljenog freeze-drying metodom sa različitim koncentracija a- FD1, b- FD5 (Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials, 79B: 388 397, 2006.) Zato se ova metoda modifikuje, tako što se u strukturu skafolda uvode prirodna ili veštačka vlakna. Koncentracija vlakana u njima je najčešće oko 6% (sl.60). Takvi skafoldi imaju veću poroznost i medjusobno povezane pore veličine iznad 100 μm. a) b) c) Sl.60: a) Skafold citozana: a-pre (20 x 20x 8.3 mm 3 ) i b-posle freeze drying -a (14.8 x 15 x 5.8 mm 3 ) (J Mater Sci: Mater Med DOI 10.1007/s10856-010-4000-1, (2010)) b) Skafold HA dobijen kombinacijom metode udruženih agenasa i freeze drying -a Metoda sinterovanje mikrosfera: Netoksični, neutralni degradacioni produkti estara amino kiselina (polifosfazena) su idealni kandidati za ortopedske primene in vivo. Estri amino kiselina (substituisani polifosfofazeni) koriste se najčešće zbog svojih dobrih mehaničkih osobina kao skafoldi za tkiva koja trpe opterećenje. Medju njima najzanimljiviji su leucin, valin, i etil estar fenilanilina. Medju svim ovim estrima, etil estar fenilamina, pokazuje najveću temperaturu staklastog prelaza (41.6 0 C). Zbog toga se

koristi kao kompozit, u smeši sa hidroksiapatitom čija je veličina čestica reda 100 nm (sl.61) [211-214]. Kompozit prvo formira geometriju u formi mikrosfera, koje se potom sinteruju u 3-dimenzionalni porozni skafold, pomoću tzv. dinamičkog sinterovanja rastvarača, što je je šematski predstavljeno na sl. 61. a) b) Sl. 61: a) Šematski prikaz sinterovanja mikrosfera, b) Morfologija skafolda dobijenog sinterovanjem mikrosfera (Biomacromolecules 2008, 9, 1818 1825) Mikrosfere kompozita, dobijene ovom metodom, imaju modul pritiska 46-81 Mpa i srednju veličinu pora izmedju 86 i 145 μm. 3D polifosfazen nhap kompozit, poseduje izuzetno dobru adhezivnost osteoblasta, i omogućuje njihovu optimalnu proliferaciju, i ekspresiju alkaline fosfataze, zbog čega je veoma pogodan za primenu u rekonstrukciji koštanih tkiva. Kombinovana metoda freeze drying -a i luženja porogena: Porozni 3- dimenzionalni skafoldi prave se od biodegradibilnih polimera kao što su: PGA, PLA i PLGA. Oni su široko zastupljeni u tkivnom inžinjerstvu hrskavice, kosti, kože, ligamenata itd. Medju brojnim metodama, jedna od najčešće korišćenih metoda je metoda luženja porogena, koja obezbedjuje dobru kontrolu poroznosti i strukture pora (sl.62a). Metod uključuje u sebe livenje smeše polimera i porogena u kalup, sušenje smeše i luženje porogena u vodi da bi se generisale pore (sl.62b). Često se kao materijali sa svojstvima porogena koriste vodorastvorne čestice soli i karbohidrata. Strukturom pora lako se manipuliše preko frakcije porogena u smeši. Proces luženja i dobijanja pora je reproduktivan. Zanimljivo je kombinovati tehniku luženja porogena sa freeze drying - om, uz korišćenje čestica leda koje su dobijene injektiranjem dejonizovane vode kroz odgovarajuću kapilaru u tečni azot. Pri tome nastale čestice leda imaju gotovo sferan oblik. Njihov prečnik kontroliše se brzinom raspršivanja vode i rastojanjem raspršivača od površine uzorka [201, 203, 209, 210, 215].

a) b) Sl.62: a) Presek PLLA spužve pripremljene sa 80% i b-90% frakcije ledenih čestica; b) Šematski prikaz pripreme čestica leda i polimernog sunđera (Materials Science and Engineering C 17 (2001). 63 69.) Elektrosprej metoda: Elektrosprej metoda je tipična replikaciona metoda. Koristi se da bi se dobio skafold bez unutrašnjih šupljina i da bi se sasvim limitirao broj mikropukotina. Kod ovog metoda keramička suspenzija se pumpa izmedju igle i spoljašnje elektrode pri čemu se zbog dejstva odgovarajućeg električnog polja, tečnost kida u fine monodisperzne kapljice [216]. a) b) Sl.63: SEM a) sinterovani kompakt na površini dobijen umakanjem (18% pasta) i kombinovanim postupkom umakanja i sprejovanja (18 % pasta, 6% suspenzija za sprejovanje, 30 minuta vreme sprejovanja (Biomed. Mater. 3 (2008) 1-14.) Fine čestice hidroksiapatita koje se deponuju na ovaj način, obezbedjuju dobro kačenje ćelija (sl.63). Metod pripreme keramičkih pena elektrosprejovanjem posebno je

istraživao Chen sa svojim saradnicima. On je pokazao da dobijene prevlake pene sa keramikom su kvalitetnije nego pene dobijene tradicionalnom metodom umakanja [216]. Metoda polimerizacije «in situ»: Biodegradibilni polimer-biokeramički kompozitni skafold može da svojim funkcionalnim mehaničkim svojstvima, potpuno prevazidje tipična ograničenja konvencionalnih koštanih zamenika kao što su krtost i teškoća oblikovanja. Konvencionalni metodi koriste uglavnom organske rastvarače (SC/PL metod) koji mogu oštetiti ćelije i tkiva. Poli (D,L-laktid)/nano-hidroksiapatit (PDLLA/NHA) kompoziti se pripremaju polimerizacijom «in situ», a visoka poroznost se obezbedjuje dejstvom superkritičnog CO 2 (CO 2 -SC CO 2 )- metod i luženjem soli-(sl metod, pri čemu kombinacija ta dva metoda čini tzv. SC CO 2 /SL-metod). Jasno je da je visoka otvorena poroznost poželjna za naseljavanje ćelija i nesmetan prolaz nutricijenata i snadbevanje ćelija kiseonikom unutar 3-dimenzionalnog skafolda. Kombinovana metoda livenja rastvora i luženja soli, zasniva se na primeni odgovarajućih organskih rastvarača za polimere koji se polimerizuju «in situ».. Rezidue tih rastvarača mogu biti veoma štetne za transplantirane ćelije i biološke faktore rasta. Procesi koji podrazumevaju formiranje vlakana zahtevaju više temperature i nisu pogodni za procesiranje amorfnih polimera. Visoke temperature, takodje, denaturišu biološki aktivne molekule, koji treba da se inkorporiraju u matriks. SC CO 2 ima jedinstvene osobine rastvaranja praha u rastop i redukciju temperature faznog prelaza polimera, uslovljavajući relativno nisku kritičnu tačku njihovog faznog prelaza (35 0 C, 8 Mpa). Zbog toga se široko koristi CO 2 kao superkritični fluid. Primećeno je, takodje, da CO 2 produkuje bolju poroznost nego N 2 ili He. On lako formira porozni polimerni matriks, omogućuje da se izbegnu organski rastvarači i visoke temperature, skraćuje vreme saturacije u odnosu na gas-pena metod, itd.[217-219]. Gas-pena metod sa CO 2 pod pritiskom pokazuje slabu medjupovezanost pora, čija je posledica smanjenje viabilnosti naseljenih ćelija i heterogenost njihove distribucije unutar matriksa. Da bi se rešio problem porogena koristi se NaCl. Tako je razvijena kombinovana metoda SC CO 2 /SL dobijanja kompozitne pene PDLLA/NHA (sl.64). Sl. 64: SEM: PDLLA/NHA skafold (2% NHA, dobijen SC CO 2 /SL metodom a) pogled odozgo, b) presek (J Mater Sci: Mater Med (2008) 19:1075 1082. Metoda termički indukovane separacije: Metoda termički indukovane separacije je vrlo pogodna metoda za pripremu mikroporoznih membrana. Metoda je bazirana na fenomenu da efiksnost rastvarača opada sa rastom temperature. Kad se

homogeni rastvor na povišenoj temperaturi ohladi dolazi do fazne separacije, na polimer bogatiju i polimer siromašniju fazu. Kad se rastvarač ukloni, javlja se mikroporoznost (sl.65). Tokom termički indukovane separacije, fazne promene su produkovane kombinacijom separacije tečno-tečno i očvršćavanja kroz procese ostakljivanja, kristalizacije polimera ili zamrzavanja rastvora. Očvršćavanje je važna faza radi fiksiranja strukture rastvarača u datom stadiju procesa separacije tečno-tečno. Krajnja morfologija rastvora odredjena je stepenom separacije tečno-tečno, pre očvršćavanja, zbog čega struktura membrane zavisi od odnosa brzine faznog prelaza, koji se dešava tokom procesa separacije tečno-tečno i brzine očvršćavanja. U procesima termički indukovane separacije kao rastvarač za PDLLA, najčešće se koristi dialkil ftalat. Interakcija izmedju polimera i rastvarača se sistematski kontroliše promenom broja ugljenikovih atoma u alkil lancu ftalata. Zbog polarnosti PLA, jačina rastvarača opada sa rastom alkilnog lanca ftalata, tako da je moguće optimizirati brzinu separacije u odnosu na brzinu očvršćavanja [197-199, 220]. Sl.65. SEM: Presek za 10% PLLA u difenil ftalatu na 10 0 C, M PLLA je 46.000 (Ind. Eng. Chem. Res. 2009, 48, 5310 5316) Metoda trodimenzionalne gel-laminacije: Metoda trodimenzionalne gellaminacije je jedna od brojnih metoda za dobijanje skafolda, kod koje se kao jedan od keramičkih konstituenata koristi prah HA. Prah se meša sa dejonizovanom vodom i disperguje u pastu (sa 45% čvrste faze), pomoću mlevenja kuglama u polietienskim posudama. Pre 3-D gel-laminacije, 4% Na-alginat se meša sa pastom.pripremljena smeša se potom degazira i ubacuje u 3-D gel-laminacionu mašinu, nakon čega se dobijaju sirovi uzorci kompakata (sl.66). Potom se ti uzorci suše na sobnoj temperature, pirolizuju na 300-500 0 C laganim zagrevanjem i sinteruju na oko 1150 0 C [221]. Sl. 66: SEM: Izgled HA skafolda; a) povećanje 50x, b) povećanje 3000x (J Mater Sci: Mater Med (2006) 17:815 823)

Metoda livenja/luženja: Livenje rastvora (posebno luženje) je obećavajuća tehnika za proizvodnju skafolda na sobnoj temperaturi dodavanjem polimernih rastvora (PLA ili PLGA rastvorenog u organskom rastvaraču kao što je metilen hlorid ili hloroform) u kalupu koji sadrži čvrsti porogen (kristale soli). Kristali ovih soli su generalno nerastvorni u organskim rastvaračima. Tokom naknadnog procesiranja, porogen se izlužuje umakanjem skafolda u vodu, da bi se formirala porozna struktura skafolda (sl.67). Prema ovom metodu, veličina pora i poroznost skafolda variraju saglasno promeni veličine i morfologije kristala soli. Osobine skafolda, kao što su vreme degradacije polimera i mehanička čvrstoća mogu se podesiti preko odnosa koncentracije polimera i količine kristala soli. Npr., rastuća koncentracija polimera vodi ka većoj vrednosti pritisne čvrstoće, a manja (posebno kod manje veličine kristala (90% kristala NaCl treba da je reda 0-53 μm) većoj krtosti. Ova metoda može se iskoristiti za proizvodnju dovoljno jakih skafolda za implantaciju, iako izostaje reproduktivnost u dizajnu geometrije pora i njihove morfologije. Jedno od bitnih ograničenja ove metode sastoji se u tome što maksimalna debljina skafolda dobijena ovom metodom može biti do 4 mm. Veoma je teško fabrikovati velike komade [217, 222,223]. a) b) Sl. 67: SEM: Mikrostruktura skafolda dobijena kombinovanom metodom livenja pod pritiskom i luženja sa 65% soli (Materials Science and Engineering C 20 (2002) 19 26) Metoda injektiranja: Paste za injektiranje materijala razvijene su radi fiksiranja materijala ili fabrikovanja koštanih konstrukcionih delova za ćelijski rast ili zasejanje. Ta metoda je minimalno invazivna sa stanovišta hirurške procedure i može se prilagoditi bilo kom obliku. Npr. poli(propilen fumarat)-ni rastvor može se injektirati i polimerizovati na mestu koštanog defekta, popunjavajući ma koji oblik defekta. Studije pokazuju da su citozan-kalcijum fosfatni kompoziti dobri materiali za injektiranje tzv. resorbilnih skafolda. Citozan teži da ostane u pastolikoj formi na ph 6.5 i kad se injektira u telo, kod njega dolazi do fazne transformacije u čvrstu fazu. Šta više, injektiranje hijulorona sa FGF-fibroblast faktor rasta na mestu loma postižu se dobre mehaničke osobine injektiranog materijala već nakon kratkog vremena po injektiranju [224,225]. Uopšteno, osobine materijala za injektiranje, kao što su viskoznost, vreme umrežavanja, početna mehanička čvrstoća, imaju veliki značaj. Najveća prednost ovakvih metoda je u tome što takav material može da u celosti popuni defekte nezavisno od oblika defekta i da inkorporira u sebe bioaktivne i terapeutske agense njihovim mešanjem sa injektirajućim materijalom.hirurške procedure su pojednostavljene, jer nema potrebe za dodatnim hirurškim intervencijama da bi material naknadno bio uklonjen. Tipičan izgled skafolda dobijenih metodom injektiranja prikazan je na sl. 68.

a) b) Sl.68. Skafoldi dobijeni metodom injektiranja asistiranom pritiskom a) 2D PLGA skafold, b)3d PLGA skafold (Biomaterials 24 (2003) 2533 2540.) 5.4.2.9. Različite metode brzog prototyping -a Konvencionalna metoda brzog prototyping-a : Ova metoda omogućuje brzi prototyping -RP skafolda (u čvrste tzv. slobodne forme). Objekat koji se pravi prvo se modeluje koristeći kompjutersku tomografiju-ct skener, u tzv. Computer Aidide Design softveru. CAD fajl se potom konvertuje u tzv. STL-stereolitografski fajl. STL fajl se skalira da kompenzuje skupljanje tokom termičkog tretmana skafolda i omogući optimalnu izradu dela konstrukcije, koji predstavlja model [226-228]. Ova tehnologija ima prednosti nad konvencionalnim tehnologijama proizvodnje skafolda zbog dobre kontrole geomterije materijala (sl.69). Geometrija materijala je reproduktivna, čak i kod proizvodnje materijala zahtevne geometrije, sa stanovišta njene kompleksnosti. a) b) Sl.69: Šematski prikaz poroznog skafolda dobijenog protoriping tehnikom: a1) locira se prvo koštani defect, a2) informacija o koštanom defektu registruje se sa kompjuterskom tomografijom-ct skener, a3) informacija se integriše sa fabričkim softverom, a4) nanose se slojevi jedan na drugi prema programinom modu, a5) finalno dizajniranje unutrašnje i spoljašnje strukture skafolda; Biomed. Mater. 3 (2008), 1-11.b) SEM: Izgled mikrokanala u skafoldu (Rapid Prototyping Journal, 11, 5 (2005) 312 318.) Zahvaljujući geometrijskoj fleksibilnosti, neki metodi brzog prototyping -a mogu poslužiti i za deponovanje živih ćelija unutar date geometrije skafolda. Takodje,

korišćenjem ovog metoda moguće je ostvariti višeslojne funkcionalno raznolike strukture (u svakom novom sloju realizovati funkcionalno potpuno specifičnu strukturu). Ova tehnika se koriste u proizvodnji medicinskih uredjaja, kontrolisanih sistema isporuke lekova i inžinjerstvu tkiva. Stereolitografski metoda: Stereolitografski-SLA metoda zasniva se na sposobnosti fotopolimerizacije tečnih polimera i njihovog očvršćavanja pod dejstvom UV zračenja fokusiranog na površinu tečnosti. Kao izvor zračenja koristi se UV laser, pod čijim dejstvom dolazi do očvršćavanja laseru najbližeg sloja materijala, kroz proces fotopolimerizacije. Potom svetlost polimerizuje novi tečni sloj koji se depunuje-nanosi na prethodno fotopolimerizovani sloj i tako redom, sloj po sloj, proces se nastavlja sve dok se protip potpuno ne oblikuje.u krajnju formu (sl.70). Medju biopolimerima, koji poseduju sposbnost fotopolimerizacije jedan od najčešće korišćenih polimera je poli(etilen glikol)-peg. Korišćenjem PEG metodama stereolitografije moguće je dobiti kompleksne 3D strukture sa bioaktivnim agensima koji se nalaze unutar takvih struktura. Delovi dobijeni kao sirovi delovi keramičkih struktura, prevode se potom u strukture keramičkih skafolda sinterovanjem [225]. a) b) c) Sl. 70: Skafold dobijen mekom litografijom: a) mikromodelovanje, b) mikrofluid, c) spin-coating (Biomaterials 24 (2003) 2533 2540) Metoda selektivnog laserskog sinterovanja-sls: Selektivnim laserskim sinterovanjem polimernog praha, zatapaju se susedne čestice praha i spajaju sa slojevima ispod datog sloja, već prethodno laserski sinterovanih čestica praha polimera (sl.71). Sam proces se odvija tako, što se na površini formiranog sloja polimera, procesom sinterovanja, dodaje sledeći sloj i proces nanovo ponavlja. Pri tome, nesinterovani delovi polimernog praha ostavljaju mikroporoznost unutar zapremine polimernog skafolda [230]. Hidroksiapatit i kalcijum fosfatni materijali koriste se u SLS tehnologiji kao mogući implatni materijali.. SLS tehnika koristi se za hidroksiapatit/plla kompozite, pri čemu PLLA ima ulogu vezivne faze, sa relativno visokom brzinom biodegradacije i niskom temperaturom topljenja. Rezultati pokazuju da modul elastičnosti hidroksiapatit/plla delova je izmedju 140 i 257 Mpa, što je uporedivo sa modulom elastičnosti kanceloznih kosti.

a) b) Sl. 71 : SEM: Poli-(ε- kaprolaktonska) mreža, deponovana selektivnim laserskim sinterovanjem, a) trodimenzionalni izgled, b) izgled odozgo (J Mater Sci: Mater Med (2008) 19:2535 2540.) Metod 3D štampe: Za printanje koriste se «ink-jet printing» tehnologije, da bi se precizno smestilo vezivo u posteljicu praha, lepeći prah unutar datoga sloja, slično SLS tehnologiji. Konceptualno, praškasti materijali uključujući i polimere, metale i keramiku. rastapaju se koristeći toplotu glave ink-jeta, a zatim brzim pothladjivanjem medjusobno zavaruju. Prednosti SLS metoda su visoka rezolucija i tačnost, materijal se lako prilagodjava kompleksnoj formi (sl.72). Materijal se štampa sloj po sloj [231]. a) b) Sl. 72: a) Različite forme skafolda dobijene metodom 3D štampe; b) SEM:Tipičan izgled mikrostrukture skafolda (Materials Science and Engineering C 20 (2002) 49 56) Metoda modelovanja depozicijom rastopa: Metoda modelovanja depozicijom rastopa zasniva se na depoziciji polimera specifičnih svojstava, koji se rastapaju unutar veoma uskih mlaznica, da bi po izlasku iz mlaznice odmah očvrsli, u formi vlakana. Kad se deponuje jedan sloj platforma se pomare naniže da bi se deponovao novi sloj. Skafold tako ima uniformnu strukturu. Na ovaj način, mogu se dobiti delovi kompleksne forme. Promenom smera svakog sledećeg sloja nastaju skafoldi sa velikim brojem slojeva koji mogu da kreiraju kompleksnu unutrašnju geometriju [225]. Postoji dakle, nekoliko varijanti procesa štampanja, koji uključuju štampanje, ekstruziju, tehnike sprejovanja, sa višestepenom depozicijom sa više glava koje služe u te svrhe i hranilica, formirajući multifazne skafolde sa optimiziranom geometrijom. U tabeli 3 date su pregledno prednosti i nedostaci svih metoda brzog prototyping -a

Tabela 3: Prednosti i nedostaci različitih varijanti metoda brzog «prototyping»-a [232] Metod Prednosti Nedostaci Stereolitografija Primena hidrogelnih materijala, visoka rezulucija i tačnost, tečni materijali mogu se lako odstraniti iz kompleksnog skafolda Ograničeni izbor materijala, zahteva dodatno termičko procesiranje (biokeramika), visoka cena materijala, kompleksna i skupa oprema Lasersko sinterovanje 3D štampa Tehnika depozicije stapanjem Širok izbor materijala, dobre mehaničke osobine, niska cena koštanja, dobra tačnost Sirok izbor materijala, niska cena, brz proces, mogućnosti dizajniranja multifaznog materijala kroz veliki broj glava za printanje Nema zarobljenih materijala, minimalni gubici materijala, niska cena Materijal može termički degradirati u toku procesa sinterovanja, neželjena poroznost, teško je odstraniti zarobljene prahove, kompleksna i skupa oprema Teško odstraniti zarobljene prahove, niska do srednja rezolucija,, čestice praha nisu dobro vezane, vezivo je uvek neophodno da veže čestice praha Materijali termički degradiraju tokom procesa, uzak izbor materijala, srednja rezolucija 5.4.3. Dodatne primene nanočestičnih sistema na bazi superparamagnetika i NMR obeleživača Pored primene superparamagnetnih materijala i karbonskih nanotuba za funkcionalizaciju površina unutrašnjih zidova skafolda, kroz formiranje odgovarajućih tankih filmova koji mogu biti aktivirani primenom spoljašnjih fizičkih (magnetnih, električnih, elektromagnetnih, primenom vibracija koje se nalaze u mikrotalasnom i radiotalasnom domenu), takve vrste materijala mogle bi potencijalno biti korišćene za prevenciju, detekciju, dijagnozu i hipertermijski tretman kancera. Naime, veoma su aktuelna istraživanja na koloidnim supermagnetnim substancama, kao što je Gd 2 O 3 koje imaju izuzetan potencijal u NMR dijagnostici, kao mogući savremeni marker kancera. Na osnovu takvih nanosistema moguće je promovisati vrlo uspešne strategije u okviru realnog vremena sa direktnim podacima vezanim za genomske i proteomitske promene na nivou jednog molekula ili jedne ćelije.takodje, moguće je izvesti multiparametarsku analizu stanja ćelija u veoma maloj zapremini uzorka. Zbog toga, Gd 2 O 3 nanosistemi su veoma moćno oružje za dijagnostiku kancera u najranijim stadijima. S druge strane, sistemi kao što su Co-feriti, magnetiti, maghemiti i njima slični sistemi, koji pokazuju veoma naglašene superparamagnetne osobine izuzetno su pogodni za hipertermijsku terapiju kancera (sl. 74). Nanozlato je takodje, jedan od sistema koji se intenzivno istražuje u sličnim primenama. Svi ti sistemi deo su naših

strateških istraživanja. Pored njih u fokusu naših istraživanja nalazili su se funkcionalizovani na različite načine fulareni i karbonske nanotube, koje su bile predmet i široke lepeze bioloških istraživanja vezanih za uticaj takvih nanosistema na bakterije (inflamacije izazvane njima) i terapiju kancera [156, 145, 193]. Posebno važne karakteristike svih navedenih superparamagnetnih sistema dobijenih sintezama ferofluida razvijenim u okviru naše istraživačke grupe su naglašen kvantni efekat vezan za veoma male dimenzije čestica, dimenzije na nivou objekata koji pripadaju dimenzijama tzv. kvantnih tačaka (2-5 nm), karakterističnim kristalnim fazama, veoma uskom distribucijom i niskim stepenom kristaliničnosti. Takve čestice u kombinaciji sa organskim molekulima pametnih biopolimera sa velikim kapacitetom kačenja, su jedan od najbitnih naših istraživačkih pravaca usmerenih na primenu u medicini, kao potencijalni magnetni fluidi, NMR kontrastni agensi, nosači lekova i aktivni terapeutici (ubice ćelija kancera) u hipertermijskoj terapiji kancera. a) b) c) d) e) f) Sl.74: AFM: a) nanokobltferit, b) fulareni funkcionalizovani sa EVA/EVV, c) nanozlato, d) nanomghemit, e) nanogadolinijum marker, f) karbonske nanotube funkcionalizovane sa melaminsulfonatom (Biomaterials, 30, (12), (2009), 2319-2328; Applied Surface Science, 255, (12), (2009), 6359-6366.) 6. Buduće medicinske primene molekulskih nanotehnologija Molekularne nanotehnologije su spekulativno polje nanotehnologija sa stanovišta mogućnosti inžinjeringa molekularnih asemblera (mašina koje mogu preurediti materiju na molekularnom i atomskom nivou). Molekularna nanotehnologija je još uvek u osnovi visoko teorijska nauka, koja pokušava da anticipira mogućnosti koje pružaju otkrića u oblasti nanotehnologija. Naravno, predpostavljeni elementi molekularnih nanotehnologija, kao što su molekularni asembleri i nanoroboti su još uvek daleko od sadašnjih mogućnosti realizacije.

6.1. Molekulsko asembliranje Molekularni asembler definisao je K. Eric Drexler kao "zamišljeni uredjaj koji je sposoban da vodi hemijsku reakciju pozicioniranjem reaktivnih molekula sa atomskom preciznošću [10]. Neki biološki molekuli, kao ribozomi fituju u takvu definiciju, jer radeći u ćelijskoj okolini, oni dobijaju instrukcije od DNK isporučioca asemblirajući potom specifičnu sekvencu aminokiselina, neophodnu za proizvodnju odgovarajućeg molekula proteina. Termin molekulskog ansembliranja često se koristi i za uredjaje koje pravi čovek. Razvoj ribozomu sličnih molekula ostvaren je 2007 u British Engineering and Physical Sciences Research Council-u. Izraz molekularni assembler korišćen je i u naučnoj fantaziji i popularnoj kulturi da bi se opisala fantastična nanomašina za manipulaciju, što je najčešće fizički nemoguće. 1992 Drexler je uveo jasniji pojam molekularnog manifakturinga, koji se definiše kao programirana hemijska sinteza kompleksnih struktura pozicioniranjem reaktivnih molekula, ne manipulišući individualnim atomima. Popularno, to je hipotetička mašina koja manipuliše individualnim atomima i mašina koja se slično živom organizmu replicira, pokreće i ima sposobnost konzumiranja hrane itd [233-235]. I pored toga, što sintetički molekularni asembleri nisu nikad konstruisani, oni ne spadaju u domen čiste naučne fantastike. Brojne su kontraverze vezane za poistovećivanje molekulskog asebliranja sa realnim nanotehnologijama. 6.2. Nanofabrike Nanofabrika predpostavlja sistem nanomašina (slično molekularnom asembleru ili ruci industrijskog robota) koje kombinuju reaktivne molekule kroz mehanosintezu da bi izgradili veće atomski precizne delove. To je moguće izvesti mehanizmima pozicioniranja date veličine, sve dok ne nastane makroskopski vidljiv i atomski precizan proizvod. Tipična nanofabrika je desktop box, u viziji K. Eric Drexler publikovanoj u Nanosystems: Molecular Machinery, Manufacturing and Computation (1992), koji je uveo pojam tzv. ekstrapolacionog inžinjerstva, za ovakav način dizajniranja makroskopskih proizvoda [1,2,28,35,236]. Tokom zadnje dekade drugi istraživači su uveli pojam proširene nanofabrike, koja osim proizvodnje, uključuje analizu funkcionisanja nanofabrike i sistem dizajniranja replika nanofabrike. 2005. kompjuterski je animiran prvi kratkometražni film nanofabrike po konceptu John Burch-a, u saradnji sa Drexler-om. Diskusija vezana za pojam nanofabrike nastavljena je i u članku: Molekularna nanotehnologija [28,35,236]. 6.3. Samoreplikacija Da bi se proizveo neki realni proizvod potreban je ekstremno veliki broj nanomašina. To zahteva sposobnost samoreplikacije jednom proizvedene mašine u brojne kopije sebe same. Sa stanovišta efikasnosti proizvodnje očigledno je da ako imamo dovoljno molekulskih asemblera, oni će biti u mogućnosti da se reprogramiraju na adekvatan način za proizvodnju željenog proizvoda. Jedan od metoda proizvodnje molekularnih asemblera, pruža koncept oponašanja evolucionih procesa kod bioloških sistema. Biološka evolucija nasumičnim varijantama dovodi do kombinacija u kojima manje uspešne vrste nestaju, a uspešnije vrste se uvek

iznova reprodukuju. Proizvodnja kompleksnih molekularnih asemblera polazi od jednostavnijih sistemima, kao elemenata samoasembliranja, tako što se njihovim kombinovanjem dobijaju različite varijante komplikovanijih sistema. Mnogi asembleri mogu se nalaziti izvan fizičkog prostora sistema koji se produkuje asembliranjem. Na svakom koraku procesa manufakture, korak koji sledi u procesu asembliranja, biva pročitan prvo od običnog kompjuterskog fajla i prosledjen svim asemblerima, u čijem sadejstvu nastaje dati kompleksni proizvod. Ako je bilo koji assembler izvan dosega ili ako je njegova veza- link prekinut, asembler će prestati da replicira motiv date strukture. Takav način asembliranja struktura vodi ka uspostavljanju arhitekture struktura pogodnih za brojne praktične potrebe, pri čemu je sam proces repliciranja moguće kontrolisati pažljivo odabranim kvalitetnim dizajnom. 6.4. Molekulske mašine Molekulske mašine ili nanomašine definišu se kao diskretan broj komponenti koje omogućuju mehaničke pokrete i odgovor na specifičnu stimulaciju. To bi suštinski bile molekule koje na makroskopskom nivou imitiraju funkcije sistema kojima pripadaju. Molekulski sistemi pri tome pomeraju procese izvan ravnotežnih stanja čineći time osnovu potencijalno novih grana hemije i nanotehnologija. U literaturi navode se Maksvelov demon i Fejnmanova ili Braunova raketa kao dva osnovna misaona eksperimenta na kojima se zasniva princip rada molekulskih mašina: Posebno je zanimljiv Fejnmanov/Braunov koncept mašine koja se sastoji iz dve elise ili zupčanika povezana krutom osovinom koja drži te dve elise na dve različite temperature. Takva izvedba uredjaja omogućila bi rotaciju kao kod ključa unutar brave, omogućujući kretanje osovine na gore/nasuprot sili zemljine teže, ako se prethodno topliji kraj učini hladnijim i obratno, kao na sl. 75. Tada će razlike u kinetičkim energijama gasova u ta dva rezervoara izazvati rotaciju osovine i njeno penjanje [6,28,1]. Sl.75: Šema Fejnamnove mašine (American Journal of Physics (USA: AIP) 64, 9, (1996): 1125) Ovaj sistem funkcionisao bi slično perpetum mobilu. Pri tome je gradijent toplote ključni element njegove pokretljivosti. Taj gradijent bi se održavao eksterno i sistem ne bi funkcionisao po drugom zakonu termodinamike. Braunovo kretanje čestica gasa obezbedjivalo bi snagu mašini, a temperaturni gradijent njeno ciklično kretanje. Jedini bitni nedostatak takve mašine bio bi nemogućnost održavanja temperaturnog gradijenta na molekulskoj skali distance/geometrije zbog molekulskih vibracija koje utiču

na redistribuciju energije ostalih delova molekula. Zbog toga, takva mašina ne bi bila funkcionalna [6, 237]. 6.4.1. Savremeni uvidi i studije Za razliku od mikroskopskih sistema molekulski sistemi pokazuju značajna dinamička kretanja, saglasno Braunovom zakonu., Na makroskopskom nivou mnoge mašine rade u gasnoj fazi i otpor je često neznatan, ali kod molekulskih sistema to bi ličilo na kretanje u uraganu ili plivanje u melasi. Fejnamanova stategija mašine bila bi korišćenje Braunovog kretanja, a ne suprostavljanje mu. Slično makroskopskim mašinama, molekulske mašine bi posedovale pokretne delove. Ali dok smo mikroskopskim mašinama okruženi u svakodnevnom životu, analogna strategija za molekulske mašine je nemoguća, jer su dinamike procesa na velikoj i maloj skali potpuno različite. Ćelijska membrane su izvanredan primer takvih molekulskih mašina, kod koje liofilna barijera kroz brojne mehanizme transporta omogućuje kretanje specifičnih bioproteina i minerala od jednog do drugog dela ćelije [1,2,28]. 6.4.2. Primeri molekulskih mašina Pristup konstrukciji nanomašine podrazumeva prethodnu konstrukciju njenih elemenata, kojim se potom prema zadatom zahtevu asembliraju u zahtevanu mašinu. Kako osnovne delove svake mašine čine motor i prekidači, kod molekulskih mašina to bi bili molekulski prekidači i molekulski motori. Pri tome prekidač definiše stanje sistema (uključen/isključen), a motor utiče na trajektoriju sistema. Prekidač vrši translatorno kretanje, oslobadjajući svojim kretanjem protok energije, dok motor koristi tu energiju da bi reproduktivno funkcionisao. 6.4.2.1. Sintetičke mašine Glavni konstruktori molekulskih mašina bili bi hemičari. Najjednostavnije takve mašine mogle bi da sadrže samo jedan molekul. Ipak najčešće konstrukcije predstavljale bi veoma precizno definisane arhitekture elemenata/molekula koje se medjusobno povezuju po principu- mechanically-interlocked molecular architectures. Primeri takvih struktura su rotakseni i katenati [2,28,30]. Molekulski motori su molekuli sposobni za rotaciju kad im se da energija iz spoljašnjeg izvora. Brojne molekulske mašine su sintetizovane koristeći svetlost za reakciju sa drugim molekulima. Molekulski propeler je molekul koji može da gura fluid kad rotira, zahvaljujući specijalnom obliku i dizajnu analogno makroskopskim propelerima. Postoji nekoliko noževa na molekulskoj skali prikačenih pod nekim uglom kosine oko periferije nanoskalnog koplja. Molekulski prekidač je molekul koji bi se reversibilno pomerao izmedju dva ili više stabilnih stanja. Molekuli mogu se pomerati izmedju stanja kao odgovor na promene ph, temperature, električne struje, mikrosredine, prisustvo liganada. Molekulska sklopka je molekul sposoban da povezuje molekule ili jone izmedju dve bliske lokacije.

Molekulske pincete su molekuli sposobni da se drže izmedju dva ramena. Otvoreni deo molekula pincete veže drugi molekul koristeći nekovalentne veze uključujući i vodoničnu vezu, metalne kordinativne, hidrofobne sile, Van der Valsove sile, π-π interakcije ili elektrostatičke efekte. Primer molekulskog tvistera je konstrukcija DNK, kao DNK mašine. Molekulski sensor je molekul koji interaguje sa analitom da bi prouzrokovao detektibilnu promenu. Molekulski senzori kombinuju molekulsku rekogniciju sa nekom formom izveštaja. Molekulski logički prag je molekul koji vrši logičke operacije sa jednim ili više logičkih imputa i proizvodi logički output. Takav output daje se tek kad se ispuni posebna logička kombinacija inputa. 6.4.3. Biološke molekulske mašine Najkompleksnije molekulske mašine nalaze se unutar samih ćelija (sl. 76). One uključuju proteinske motore, kao što je miozin, koji je odgovoran za kontakciju mišića, kinezin koji pokreće transport unutar ćelije, izvan nukleusa duž mikrotubula, i dinein koji proizvodi aksonemalni ritam cilia i flagela: Ovi proteini i njihova nanoskalna dinamika su mnogo kompleksniji od svake molekulske mašine koja može biti veštački konstruisana. Detaljan mehanizam ciliarnog kretanja u svome preglednom radu opisao je Satir 2008. Visok nivo apstrakcije unutar njegovih zaključnih razmatranja predpostavlja da su ćelijske nanomašine sastavljene od više od 600 proteina u molekulskom kompleksu, pri čemu se mnogi delovi takvih mašina mogu smatrati, takodje, nezavisnim nanomašinama [7, 28, 30, 35]. Sl.76. Biološka logička mašina; (Trends in Biochemical Sciences 28, (2003): 558 565) Konstrukcija kompleksnijih molekulskih mašina, danas je u centru brojnih teorijskih istraživanja. Brojni molekuli, kao što su molekulski propeleri su teorijski već dizajnirani, mada metodi sinteze takvih molekula, još uvek se nalaze u fazi eksperimentalnih istraživanja. Naime, za konstrukciju ovako kompleksnih molekulskih

mašina, nužno je ovladati konstrukcijama specifičnih mašina, koje bi sa uspehom mogle obaviti ulogu molekulskih asemblera. 6.4.4. Nanoroboti Očekuje se da će uvodjenje u primenu nanorobota u medicini totalno promeniti svet medicine. Njihova funkcija bi bila da repariraju oštećene organe i leče infekcije kad se uvedu u telo pacijenta. Prema Robertu Freitasu sa Instituta za molekulsko inžinjerstvo tipičan takav nanorobot dimenziono bi trebalo da bude izmedju 0.5 i 3 μm, jer maksimalna veličina krvnih kapilara ima tu vrednost. Medju materijalima koji su kandidati za konstrukciju takvog robota, ugljenični materijali (dijamant / fularennanotube kompoziti) nalaze se na prvom mestu,.zbog njihove čvstoće i drugih njihovih fizičkih karakteristika (toplotna provodljivost-dijamanti i električna provodljivostnanotube). Nanoroboti bi bili fabrikovani u desktop nanofabrici specijalizovanoj za takve namene [238]. Nanouredjaji tokom rada mogli bi biti kontrolisani pomoću metode magnetne rezonantne, posebno ako bi njegove komponente bile napravljene od ugljenika 13 C (radije nego prirodnog izotopa 12 C, jer 13 C ima nulti nuklearni magnetni moment). Takve specifične medicinske nanouredjaje trebalo bi prethodno uneti u ljudsko telo, pa tek onda u specifični organ ili tkiva. Sama dijagnoza bolesti bila bi mnogo preciznija, jer bi takvi dijagnostički nanouredjaji mogli korigovati region mete. Zadatak lekara bi bio da skenira željenu sekciju tela i vidi nanouredjaj u okolini mete (tumora) i na taj način sa sigurnošću oceni da li je medicinska terapija tretmana obolelog tkiva (tkivo zahvaćeno kancerom) bila uspešna. Tehnologija nanorobota je tehnologija kreiranja mašina ili nanorobota na skali bliskoj nanometru (sl.77). Još specifičnije, nanoroboti prestavljaju široko raširenu inžinjersku disciplinu dizajniranja i pravljenja nanorobota, uredjaja čije su dimenzije reda veličine izmedju 0.1-10 μm kostruisanih od nanoskalnih ili molekulaskih komponenata. Nema još uvek veštačkog biološkog robota, tako da je to zasad samo hipotetički koncept. Ime nanoroboti, nanoidi, naniti ili nanomiti se takodje koriste za opisivanje ovih hipotetičkih nanouredjaja. a) b) c) Sl.77.: Dizaj potencijalnih nanorobota za reparaciju ćelija, a) i b) konstruktivni delovi nanorobota, c) nanorobot za isporuku lekova (Isaac Asimov, Pictures: Cell Repair By Medical Nanorobots Science Fiction in the News, (2004))