Funkcionalna genomika i proteomika Doc. dr. sc. Ivana Novak Nakir
Što je genomika? Grana genetike proučava genom* nekog organizma Definira cjelokupni DNA sadržaj tj. nasljedni materijal Mapira interakciju između lokusa i alela Definira gensku strukturu kromosoma *Naziv genom 1920. (gen + kromosom) Naziv gen 1909. Johannsen 2
Craig Venter 3
Temelji genomike 1953 1965 1972 1975 1985 J.Watson & F. Crick DNA struktura R.W. Holley, F.Sanger Prva sekvencirana RNA P.Berg Prva rekombinantna DNA molekula F.Sanger & A.R. Coulson Sekvenciranje Phage Φ-X174 K.Mullis PCR 1987 L.Hood Prvi automatizirani aparat za sekvenciranje 4
Temelji genomike era sekvenciranja čitavih genoma 90ih 1996 1997 Sekvenciranje čitavih genoma Saccharomyces cerevisiae Escherichia coli 2000 Arabidopsis thaliana 2004 Homo sapiens 5
Što je funkcionalna genomika? Povezuje gen/genom sa prepisanim funkcionalnim produktom protein ili RNA Što je proteomika? Proučava potpuni komplet proteina jednog organizma 6
Proteom Svi proteini jednog genoma 1 genom = nekoliko proteoma Zašto? Razvojni stadiji, različita tkiva, posttranslacijske modifikacije, proteolitičko procesiranje, alternativni splicing,... 1 stanica = 100.000 proteina iz 20.000 gena 7
Proteom! Proteomika je za nekoliko redova veličine složenija od genomike 8
9
Ciljevi projekta proteoma Identificirati sve proteine proučavanog sustava Otkriti komunikacijske mreže proteina Odrediti 3D strukture proteina! dizajn novih ljekova 10
Kako se proučava? Microarray Protein-protein interakcije Analiza genske ekspresije Tehnike gubitka funkcije (RNAi, mutacije) Masena spektrometrija
Bioinformatika Biološki podatci (eksperimentalni) Kompjuterski izračuni 12
1. Što je bioinformatika? 2. Gdje se koristi bioinformatika? 3. Zašto koristimo bioinformatiku?
Što je bioinformatika? Podrška Istraživanje Procesiranje eksperimentalno dobivenih podataka (sekvenciranjem ili drugim instrumentima) Analiza podataka Obrada podataka Održavanje baza podataka Tumačenje podataka KRANJI KORISNIK Biomatematika, biostatistika
Porast informacija
Zašto bioinformatika? 1. Biti u korak s porastom informacija 2. Otkrivati nova znanja 3. Vizualizacija podataka 4. Globalizacija istraživanja i znanja
Objekti u bioinformatici sekvence proširene sekvence (topologije) domene grafikoni i dijagrami 3D animacije
Prikupljanje objekata Prema sličnosti Višestruko sravnjenje Evolucijska stabla Grupiranje po sličnosti Prema kontekstu Metabolički putevi Podjedinice, ligandi genomi
Bioinformatičkim metodama moguće je......sastavljati podatke
...mapirati, predviđati gene
...uspoređivati i sravnjavati (globalno i lokalno)
...uspoređivati kroz evoluciju
...predviđati i određivati različita svojstva
...modelirati
Baze podataka
Baze podataka 1. Primarne - Sadrže eksperimentalno dobivene rezultate direktno od istraživača (GenBank, SwissProt) 2. Sekundarne - napravljene od primarnih - Sadržaj je kontroliran i provjeren (RefSeq, InterPro, Pfam)
ENTREZ NCBI (USA)
ENSEMBL EBI (UK)
UNIPROT
Data mining
RNA geni Funkcionalne nekodirajuće RNA(ncRNA)
Nakon završetka sekvenciranja humanog genoma postalo je očigledno da je humani genom sastavljen od RNA gena, a ne samo gena koji kodiraju proteine.
Postojanje RNA gena Pronađena neočekivana skupina ncrna Barem 85% humanog genoma se prepisuje Veliki dio genoma je prepisan s oba DNA lanca na istim mjestima multigensko prepisivanje
Donedavno poznati RNA geni Ribosomalna RNA - rrna Transfer RNA - trna ~ 1000 gena Male RNA dio ribonukleoproteina RNA splicing, X-kromosom inaktivacija i imprinting, telomeraza
Kompleksnost humanih gena
RNA geni Ribosomalna RNA, rrna Transfer RNA, trna Small nuclear RNA, snrna Small nucleolar RNA, snorna Small Cajal body RNA, scarna RNA ribonukleaze Male citoplazmatske RNA Mikro RNA, mirna Piwi-vezujuće RNA, pirna Endogene male interferirajuće RNA, endosirna Dugačke nekodirajuće regulatorne RNA
Ribosomalni RNA geni 2 mitohondrijske rrna (12S i 16S) 4 citoplazmatskih rrna (28S, 5.8S, 5S, 18S) 5S - grupa od 16 gena na 1 kromosomu; mnogo pseudogena 28S, 5.8S i 18S jedinstvena mulagenska transkripcijska jedinica megabaznih veličina Preko 40 ponavljanja oko 100 rrna gena, na 5 akrocentričnih kromosoma
18S 5.8S 28S 18S 5.8S 28S Ribosom
Transfer RNA geni 22 mitohondrijskih trna = 22 mitohondrijska gena Genomske trna preko 500 gena većina na 6. ili 1. kromosomu Klasificirani u 49 grupa prema specifičnosti antikodona (61) Postoji slaba korelacija broja trna i učestalosti pojedinih ak npr. Cys (2,25%) = 30 gena Pro (6.10%) = 21 gen
mirna Dugačke 20-21 nt Prve opisane u C.elegans i vinskoj mušici Konzervirane tijekom evolucije Reguliraju ekspresiju gena Sintetiziraju se kao RNA prekursori u obliku ukosnice uz pomoć RNA polimeraze III Sudjeluju u procesu RNA interferencije
RNA interferencija
Sve je počelo s cvijetom... Richard Jorgensen Gen za pigment?
Što se dogodilo? 1990. nazvao fenomen kosupresija oba seta gena za pigment su onemogućavala ekspresiju onog drugog Druge biljke i kvasci (Neurospora crasa)
... istovremeno Antisense tehnologija - utišavanje gena korištenjem RNA molekula - ubacivanje RNA komplementarne mrna čije se prevođenje u protein želi zaustaviti
ssrna ili dsrna?? mrna ssrna? dsrna?
dsrna?? sense RNA antisense RNA ds RNA normalni normalni mutirani Craig Mello & Andrew Fire C.elegans
Enzimi koji procesiraju dsrna ds RNA Dicer sirna mrna RISC
Enzimi koji procesiraju dsrna ds RNA Dicer sirna mrna RISC
RNAi proces 1.korak dsrna se procesira i nastaju sense i anasence is processed RNA Duljina: 21-25 nukleoada Imaju 2-3 nt 3 strsece krajeve Za ovaj korak odgovoran je enzim Dicer
2.korak sirna povezuje se s RISC kompleksom (RNA-induced silencing complex) Odmatanje sirna
3.korak Antisense sirna omogućava RISCu povezivanje s komplementarno m jednolančanom mrna.
4.korak RISC reže mrna oprilike po sredini regije na kojoj se spojio s sirna mrna se dodatno razgrađuje drugim enzimima, RNazama
RNA interferencija Craig Mello i Andrew Fire 1998. opisali RNA interferenciju kao mehanizam utišavanja gena (NN 2006) Dicer i RISC (RNA-induced silencing complex) Prirodni oblik regulacije gena Postranskripcijski utišava sintezu proteina dsrna mora biti komplementarna zreloj mrna Preko 1000 gena Prisutna u svim eukariotima
Važnost RNA interferencije 1. Obrana od virusnih infekcija 2. Stabilnost genoma eliminacija transpozonskih transkripata 3. Zaustavljanje sinteze proteina 4. Supresija transkripcije (kromatin ostaje kondenziran) 5. Upotreba RNAi u istraživanju za utišavanje gena 6. Primjena u medicini genska terapija
mirna prirodne sirna Nova skupina gena odgovorna za regulaciju ekspresije, posebno važna u procesima razvoja tkiva, organa, organizma mirna su male jednolančane RNA koje tvore prividno dvolančanu strukturu
mirna procesiranje
Upotreba RNAi Utišavanje gena (gene knockdown) Biotehnologija Funkcionalna genomika Medicina Drug discovery
Antiviralna terapija RNAi i medicina Herpes simplex, virus gripe, hepatitis, HIV Neurodegenerativne bolesti Huntingtonova bolest Tumori Utišavanje gena odgovornih za proliferaciju tumorskih stanica Problem! 1. off-target efekti 2. unos sirna u stanice