REGULATORNI MOLEKULI RNK "SKRIVENI JEZIK RNK"

Transcript

1 REGULATORNI MOLEKULI RNK "SKRIVENI JEZIK RNK" Kod prokariota geni posredstvom molekula irnk kodiraju proteine koji obavljaju katalitičke, strukturne i regulatone funkcije, tako da su proteini jedini izlazni signal njihovog genetičkog sistema. Kod eukariota geni eksprimiraju dva nivoa informacija: irnk, koje kodiraju proteine, i regulatorne RNK. Proteini i regulatorne RNK formiraju složene regulatorne mreže koje paralelno funkcionišu. Različite grupe regulatornih RNK formiraju skriveni nivo internih signala koji kontroliše ekspresiju genoma u normalnim fiziološkim uslovima, tokom razvića ali i u u patološkim stanjima, uključujući i odbranu od virusa. Esencijalne su u regulaciji svih nivoa ekspresije genoma: regulišu epigenetičku memoriju, transkripciju, splajsovanje RNK, editovanje RNK, translaciju, lokalizaciju i stabilnost irnk. Istraživanja regulatornih RNK, može se reći novog RNK sveta, u poslednjih desetak godina su dovela do neverovatnih otkrića, koja su bitno izmenila naše shvatanje o funkcionisanju eukariotskog genoma. Smatra se da bi regulatoran mreža RNK mogla određivati naše složene karakteristike i predstvljati neistraženi svet genetičkih varijacija unutar i između vrsta. Regulatorni molekuli RNK se dele u dve grupe: duge nekodirajuće RNK i male regulatorne RNK. Duge nekodirajuće RNK su dužine od 50 do više od nukleotida (nt), ne sadrže konzervisani okvir čitanja i uglavnom učestvuju u regulaciji strukture hromatina i transkripcije. Male regulatorne RNK su dužine oko 20 do 30 nt koje u interakciju sa proteinima familije Argonaut regulišu ekspresiju genoma na skoro svim nivoima, učestvuju u odbrani od virusa i regulišu transpozone. Familija proteina Argonaut je evoluciono visoko konzervisana i njeni članovi imaju ključnu ulogu u biogenezi i funkciji malih regulatornih RNK. Dve velike subfamilije proteina Argonaut su proteini AGO i proteini PIWI (eng. P-element induced wimpy testis). Male regulatorne RNK svoju funkciju ostvaruju putem RNK interferencije (RNKi), mehanizma represije ili utišavanja ciljnih RNK koje pokazuju homologiju sa malim regulatornim RNK. Utišavanje ekspresije gena RNKi ostvaruje se degradacijom ciljne RNK, translacionom represijom ili destabilizacijom ciljne irnk, ili epigenetičkim utišavanjem. Postoji sve više podataka da male regulatorne RNK putem RNKi mogu, takođe, stimulisati translaciju. Prema široko prihvaćenoj podeli, male regulatone RNK se dele u tri klase, koje se međusobno razlikuju po biogenezi (poreklu, tipu i načinu obrade prekursornog molekula od kojeg nastaju), grupama famillije proteina Argonaut sa kojima stupaju u interakciju i načinima regulacije ciljnih molekula RNK (tabela 1). Male interferirajuće RNK (eng. small interfering RNA, sirna) su dužine 21 nt, nastaju obradom dugog dvolančanog prekursora sa ribonukleazom Dicer, stupaju u interakciju sa proteinima AGO i dovode do degradacije ciljne RNK (slika 1). Dugi dvolančani preursori sirnk su ili egzogeno uneti (virusna RNK ili sintetička RNK) ili endogeno sintetisani (uglavnom sa ponovljenih sekvenci u genomu). sirnk učestvuju u odbrani od virusa i utišavaju hromatina. MikroRNK (mirnk) su dugačke 21 do 23 nt, nastaju obradom jednolančanog prekursora RNK u obliku ukosnice ribonukleazama Drosha i Dicer, 1

2 stupaju u interakciju sa proteinima AGO i najčeše dovode do translacione represije ili destabilizacije irnk (slika 1). MikroRNK imaju ključnu ulogu u posttranskripcionoj regulaciji ekspresije gena. Piwi RNK (eng. PIWI associated RNA, pirnk) su dugačke 24 do 32 nt, nastaju od jako dugačkih jednolančanih prekursora čija obrada ne uključuje enzim Dicer, stupaju u interakciju sa proteinima PIWI i dovode do degradacije ciljnih RNK (slika 1). pirnk su karakteristične samo za metazoe i imaju ključnu ulogu u utišavanju transpozna i razviću i diferancijaciji polnih ćelija. Predstavljaju najmanje izučenu klasu malih regulatornih RNK. Tabela 1. Klase malih regulatornih RNK Vrsta Dužina (nt) Prekursor Obrada prekursora Familija Argonaut Mehanizam delovanja Funkcija sirnk 21 Egzogena ili endogena duga dvolančana RNK Dicer AGO Degradacija ciljne RNK Odbrana od virusa Utišavanje hromatina mirnk Jednolančana RNK koja formira strukturu ukosnice Drosha i Dicer AGO Translaciona represija Destabilizacija irnk Degradacija ciljne irnk Translaciona aktivacija Regulacija ekspresije gena pirnk Duge jednolančane RNK Nepoznati PIWI Degradacija ciljne RNK Transalciona represija Translaciona aktivacija Utišavanje transpozona Regulacija ekspresije gena nt nukleotid 2

3 Slika1. Klase malih regulatornih RNK: biogenza i interkcije sa proteinima familije Argonaut. Objašnjenje u tekstu. 1. MIKRORNK (MIRNK) Mikro RNK utišavaju ekspresiju velike frakcije eukariotskog transkriptoma, čak jedne trećine transkripata koji kodiraju proteine, regulišući široki spektar bioloških procesa: razviće, rast ćelije, deobu i diferencijaciju, apoptozu, odgovor na stres. Funkcija mirnk se vezuje i za razna patološka stanja, na primer, maligne bolsti. Mutacije u putu mirnk dovode do pormećaja razvića, i često su letalne za embrion. Da bi obavile svoju funkciju u posttranskripcionoj regulaciji ekspresiju gena, mirnk stupaju u interakciju sa proteinima AGO. Svaki kompleks mirnk-ago stupa u interakciju sa specifičnom irnk, prepoznajući je preko komplementranog baznog sparivanja između mirnk i 3

4 sekvence irnk u 3'-netranslatirajućem regionu (eng. untranslated region, UTR). Dugački 3'-UTR-ovi eukariotskih gena sadrže brojne regulatorne sekvence koje predstavljaju važna mesta za asembliranje proteinskih kompleksa i kompleksa RNK-proteini koji utiču na lokalizaciju, translaciju i stabilnost irnk. Kompleksi mirnk-ago regulišu ciljne RNK reprimiranjem translacije i/ili promovisanjem degradacije irnk. Iako široko prihvaćeni kao represori translacije, mirnk mogu imati i funkciju aktivatora translacije, i to u zavisnosti od stanja ćelijskog ciklusa, odnosno fizioloških uslova: kada se ćelija normalno deli imaju funkciju represora, a kada je zarobljena u G1 fazi imaju funkciju aktivatora Geni za mikrornk Mikro RNK su kodirane genima koji su nezavisno raspoređeni u genomu ili su delovi introna gena koji kodiraju proteine ili introna gena za nekodirajuće RNK (slika 2a). Opisani su i primeri kada se geni za mirnk nalaze u netranslatirajućim i kodirajućim delovima gena za proteine (slika 2a), a neke mirnk mogu poticati i od obrađenih pseudogena. Poznato je i da se neki geni za mirnk mogu nalaziti u ponovljenim sekvencama genoma, pre svega u različitim transpozonima. Kod biljaka, neki geni za mirnk imaju introne, alternativno se splajsuju, a mogu sadržati i alternativne signale za poliadenilaciju. Slika 2. Geni za mikrornk: a) geni za mirnk se nalaze u različitim regionima gena za proteine i nekodirajuće RNK, i to najčešće u njihovim intronima; b) jedan prkursor mirnk može sadržati sekvence za jednu ili dve različite mirnk (sekvence označene crvenim i plavim slovima). U prepisanom primarnom tanskriptu, deo koji je prekursor za mirnk zauzima karaktrističnu sekundarnu strukturu ukosnice. Jedan prekursor za mirnk može sadržati sekvence za jedan ili dva različita molekula mirnk (slika 2b). Karakteristična struktura ukosnice omogućava da se bioinformatičkim predikacijama identifikuju nove mirnk i njihovi ciljni geni. MikroRNK identifikovane na ovaj način se označvaju sa prefiksom mir i rednim brojem. Potvrda 4

5 da je predviđena sekvenca ćelijska mirnk podrazumeva njeno identifikovanje u ćelijama, kao i utvrđivanje da ekspresija ciljnog gena zavisi od prisustva ispitivane mirnk. U bazi podataka za mirnk, MiRBase ( postoji preko 300 eksperimentalno potvrđenih mirnk u genomu čoveka i njihovih pretpostavljenih ciljnih irnk godine u bazi su postojale sekvence koje odgovarju bioinformatički predviđenim prekursorima mirnk u genomima 142 vrste, za koje se pretpostavlja da bi mogle eksprimirati zrelu mirnk godine u bazi postoji sekvenci koje odgovaraju bioinformatički predviđenim prekursorima mirnk u genomima 168 vrsta i koje bi mogle eksprimirati zrelu mirnk 1.2. Biogeneza mikrornk i formiranje utišavajućeg kompleksa RISC Pregled (slike 1 i 3) Funkcionalne mirnk su obično dugačke 21 do 23 nt i nastaju od prekursornog molekula, primarne mirnk (pri-mirnk) koja ima strukturu ukosnice. Pri-miRNK se transkribuje ili sa nezavisnih gena za mirnk ili je deo introna gena koje transkribuje Pol II. U nukleusu, delovanjem ribonukleaze Drosha od pri-mirnk nastaje prekursor mirnk (pre-mirnk), koji se transportuje u citoplazmu. Pre-miRNK je u citoplazmi supstrat za Dicer, čime nastaje dvolančana mirnk, koja stupa u interkaciju sa proteinima AGO. Kompleks mirnk-ago, sa dodatnim proteinima, formira utišavajući kompleks mirisc, koji reprimira irnk koja ima sekvencu komplementarnu sa mirnk. Neperfektno bazno sparivanje mirnk i ciljne irnk dovodi do translacionog utišavanja i destabilizacije irnk, dok perfektno bazno sparivanje mirnk i ciljne irnk dovodi do endonukleolitičke degradacije irnk. Drosha i Dicer su endonukleaze iz familije RNaza III. Ova familija RNaza je specifična za dvolančane RNK i pomoću dva simetrična RNazna domena seče oba lanca RNK tako da ostavlja jednolančani 3'-kraj dužine 2 nt (eng. 3'-overhang) u nastalom dvolančanom RNK produktu (slike 4 i 5). Oba enzima imaju vezivne domene za dvolančanu RNK (eng. double strand RNA binding domains, dsrbds), duge oko 65 aminokiselina, pomoću kojih prepoznaju strukturu dvolančane RNK i vezuju se za dvolančanu RNK. Mesto sečenja selektuju merenjem, a ne prepoznavanjem specifične sekvence RNK. Drosha sadrži još dva funkcionalna domena za protein-protein interakcije: domen P, bogat Pro, i domen RS, bogat Arg i Ser. Dicer sadrži još tri funkcionalna domena. Domen PAZ specifično prepoznaje jednolančani 3'-kraj dužine 2 nt i vezuje ga. Naziv je dobio po proteinima u kojima se nalazi (Piwi, Argonaute i Zwille). Funkcija druga dva domena, DEAD-boks RNK helikaznog domena i domena DUF (eng. domain of unknown function), nije poznata. Genomi biljka ne sadrže ortolog gena za Drosha, i svi koraci u biogenezi mirnk kod Arabidopsis thaliana se obavljaju pomoću jednog od četri proteina sličnih Diceru (eng. Dicer-like proteins). Kičmenjaci i C. elegans sadrže po jedan gen za Dicer, D. melanogaster sadrži dva, dok biljke sadrže veći broj proteina sličnih Diceru, čiji proteinski produkti obavljaju specijalizovane funkcije u kompleksu sa različitim proteinima koji se vezuju za dvolančane RNK. 5

6 Slika 3. Biogeneza i put mikrornk (mirnk): primarna mirnk (pri-mirnk), prepisana sa nezavisnih gena za mirnk obrađuje se u dva koraka ribonukleazama Drosha i Dicer. U nukleusu, delovanjem kompleksa Drosha-DGCR8 od pri-mirnk nastaje prekursor mirnk (pre-mirnk), koji se transportuje u citoplazmu. Pre-miRNK je supstrat za kompleskdicer-trbp čime nastaje dvolančana mirnk, koja stupa u interkaciju sa proteinima AGO. Kompleks mirnk-ago reprimira irnk koje imaju sekvence komplementarne sa mirnk. Perfektno bazno sparivanje mirnk i ciljne irnk dovodi do endonukleolitičke degradacije irnk, dok neperfektno bazno sparivanje dovodi do translacionog utišavanja i/ili deadenilacije irnk. Alternativni put biogeneze mirnk iz mirtrona - prekursora mirnk kodiranog intronom ne zahteva učešće kompleksa Drosha-DGCR8 jer u potpunosti odgovara pre-mirnk. Drosha i Dicer svoje funkcije obavljaju u kompleksu sa proteinima (kofaktorima). Partneri Drosha su protein pasha kod D. melanogaster i protein DGCR8 (eng. DiGeorge syndrome critical region gene 8) kod sisara, dok je partener Dicera produkt gena loquacious kod Drosophile melanogaster i protein TRBP (eng. TAR RNA binding protein) kod sisara. Ovi proteini, takođe, sadrže vezivne domene za dvolančanu RNK, a DGCR8 sadrži i WW domen za interakcije proten-protein. 6

7 Slika 4. Domenska organizacija proteina koji učestvuju u biogenezi mirnk: svi proteini imaju jedan ili više dmena za prepoznavanje i vezivanje dvolančane RNK (plavi boksovi). Drosha i Dicer imaju simetrične katalitičke RNazne domene odgovorne za RNaza III endonukleolitičku reakciju. Drosha sadrži još dva funkcionalna domena za protein-protein interakcije - domen P, bogat Pro, i domen RS, bogat Arg i Ser. Dicer sadrži još tri funkcionalna domena. Domen PAZ, koji vezuje 3'-kraj pre-mirnk dugačak 2 nt, i domene nepoznate funkcije - DEAD-boks RNK helikazne domene i domen DUF. Protein DGCR8 sadrži i domen WW odgovoran za interakcije protein-protein. Pri-miRNK se savija u dvolančanu strukturu oblika ukosnice koja sadrži dršku i kratku jednolančanu petlju. Dvolančana bazno sparena drška je dugačka 33 bp (tri helijačna okreta u dvolančanoj RNK) i sadrži samo nekoliko pogrešno sparenih baza (slika 5a). Region drške ukosnice sadrži dva funkcionalna dela: donji deo drške, približne dužine 11 bp, i gornji deo drške, približne dužine 22 bp (slike 5a i b). Na vrhu drške je petlja različite veličine (obično oko 10 nukleotida), čija sekvenca nije bitna za obradu. U nukleusu, kompleks Drosha-DGCR8, poznat i kao mikroprocesorni kompleks, uvodi dva prekida u pri-mirnk oslobađajući samu strukturu ukosnice, koja predstavlja pre-mirnk. Za obradu kompleksom Drosha-DGCR8 neophodna je jednolančana RNK koja ograničava 5'- i 3'-krajeve drške i dvolančana drška. Granica jednolančane i dvolančane RNK u pri-mirnk u velikoj meri određuje mesto sečenja, jer Drosha uvodi prekide na mestima koja su po 11 bp udaljena od te granice, odnosno između gornjeg i donjeg funkcionalnog dela drške. Sa dva uvedena prekida formira se pre-mirnk dugačka oko 65 do 70 nukleotida, koja je izgrađena iz drške (dvolančanog regiona dužine 22 bp koji pravi dva helijačna okreta), petlje i jednolančanog 3'-kraja dužine 2 nt, koji je značajan za prepoznavanje pre-mirnk od stane Dicera (slika 5b). Pored kanonskog puta biogeneze mirnk, opisani su i alternativni putevi. Neki introni kod Cenorabditis elegans, D. melanogaster i sisara sadrže gen za mirnk koji u potpunosti odgovara pre-mirnk u pogledu dužine i strukture, tako da obrada ovih gena za mirnk, pozatih pod imenom mirtroni, ne zahteva učešće kompleksa Drosha-DGCR8, već se samim iskrajanjem mirtrona splajsozomom formira pre-mirnk (slike 1 i 3). Takođe, neke klase malih nukleolarnih RNK (snornk) obrađuju se do malih RNK koje deluju slično kao mirnk. 7

8 Slika 5. Biogeneza mikrornk (mirnk): a) primarna mirnk (pri-mirnk) karakteristične strukture ukosnice u kome je dvolančani deo dugačak približno 33 bp, sa označenim mestima sečenja za Drosha i Dicer; b) Drosha se zajedno sa proteinom DGCR8 vezuje za pri-mirnk i uvodi dva jednolnčana prekida u dršci i to 11 nukleotida od granice jednolančane i dvolančane RNK, formirajući prekursora mirnk (pre-mirnk); c) Dicer ima oblik sekire, u kojoj dno drške sekire predstavlja domen PAZ, samu dršku region linker, dok je sečivo predstavljeno sa dva simetrična RNazna domena. Pre-miRNK se transportuje u citoplzmu pomoću eksportina 5 (slike 1 i 3), gde dolazi do druge reakcije sečenja RNK katalizovane Dicerom, koji se nalazi u kompleksu sa proteinom TRBP. Po svojoj trodimenzionalnoj strukturi Dicer liči na sekiricu (slika 5c). Domen PAZ je na kraju drške sekirice, gde formira vezivni džep za jednolančani 3' kraj dvolančanog dela pre-rnk. Region između domena PAZ i RNaznih domena formira dršku sekirice, i sadrži pozitivno naelektrisanu vezivnu površinu za RNK. Region na vrhu, označen kao "sečivo", sastoji se od dva RNazna domena, raspoređenih kao simetričan dimer. Svaki RNazni domen sadrži aktivno mesto i odgovoran je za sečenje jednog od dva lanca iz supstrata RNK. Dicer deluje samo na dvolančanu RNK, bez obzira na njenu sekvencu, i kida je na udaljenosti od 22 nukleotida od njenog kraja. 8

9 Rezultat aktivnosti proteina Drosha i Dicer je dvolančana mirnk dužine od 21 do 23 bp, koja ima jednolančane 3'-krajeve dužine 2 nt (jedan nastao aktivnošću Droshe, a drugi aktivnošću Dicera). Jedan lanac iz dvolančane mirnk se selektuje da bude funkcionalna jednolančana zrela mirnk, i on je označen kao lanac "vodič", dok se drugi lanac degraduje, i označen ja kao lanac "putnik". Po opštem pravilu, lanac čiji se 5'-kraj nalazi u termodinamički manje stabilnom delu dvolančane mirnk se selektuje da bude Lanac "vodič". Sve je veći broj primera da obe "ručice" iz pre-mirnk daju zrele mirnk, od kojih svaka ima svoj set ciljnih irnk. MikroRNK formiraju ribonukleoproteinske čestice označene kao mikro-ribonukleoproteinske čestice (mirnps) ili utišavajući kompleksi miriscs (eng. mirna-induced silencing complexes). Ključne proteinske komponente kompleksa mirisc i puta RNKi su proteini AGO. Formiranje mirisc je dinamičan proces, obično povezan sa obradom pre-mirnk pomoću Dicera, ali svi detalji procesa nisu poznati. Kratka dvolančana mirnk nastala aktivnošću Dicera, se inkorporira u mirisc. Dvolančana RNK denaturiše kako bi nastao lanac "vodič", dok lanac "putnik" ili biva degradovan proteinom AGO ili se kompletan otklanja iz kompleksa RISC i zatim degraduje. Proteini familije Argonaut su visoko-specijalizovani proteini za vezivanje malih regulatornih RNK. Svoje ime su dobili po fenotipu AGO-knockout biljke Arabidopsis thaliana koji podseća na krake hobotnice Argonauta argo. Familija proteina Argonaut je konzervisana u sva tri domena živih organizama. Njihova uloga kod bakterija i arhea, koje nemaju put RNKi, nije poznata. Interesantno je da model organizam Saccharomyces cerevisiae nema proteine Argonaut i puteve RNKi. Na osnovu homologije sekvence članovi familije proteina Argonaut dele se u dve velike subfamilije. Jedna subfamilija se označava AGO po srodnosti sa proteinom AGO1 Arabidopsisa, a druga se naziva subfamilija PIWI po srodnosti sa proteinom PIWI Drosophile (videti kasnije kod pirnk). Subfamilija proteina AGO kod sisara i čoveka sadrži četri člana: AGO1, AGO2, AGO3 i AGO4. Oni se ubikvitno eksprimiraju i asociraju kako sa mirnk, tako i sa sirnk. Argonaut proteini su mali (~100 kd) i karakterišu ih domeni PAZ, PIWI i MID, a N-kraj proteina pokazuje najveću heterogenost među članovima (slika 6). Poznate su kristalografske strukture proetina Argonaut kod bakterija i arhea, ali ne i kod sisara. Domen PAZ, kao i kod proteina Dicer, formira specifični džep koji vezuje 3'-jednolančani kraj dužine 2 nt lanca "vodiča" iz dvolančane male regulatorne RNK. Domen PIWI je odgovoran za endonukleolitičku aktivnost i podseća na bakterijsku RNazu H, koja specifično seče RNK u hibridu DNK-RNK. Dok nisu bile poznate komponente mirisc kompleksa opisivalo se da on ima slicer aktivnost. Nakon otktića domena PIWI proteina Argonaut postalo je jasno da je slicer aktivnost vezana za sam protein Argonaut. Domen PIWI svih proteina Argonaut nije endonukleolitički kompetentan. Među proteinima AGO sisara, samo AGO2 ima očuvanu endonukleaznu aktivnost. Domen MID se nalazi između domena PAZ i PIWI. On formira specifičan džep koji vezuje 5'-fosfatni kraj male regulatorne RNK. 9

10 Slika 6. Domenska organizacija proteina AGO i struktura kompleksa mirnk-ago. Proteini Argonaut se karakterišu domenima PAZ, MID i PIWI, dok N-kraj pokazuje heterogenost između članova familije. Domen PAZ specifično prepoznaje 3'-kraj lanca "vodiča" mirnk i vezuje ga. Domen MID vezuje 5'-fosfatni kraj lanca "vodiča". Domen PIWI je sličan RNazi H i kod nekih članova poseduje endonukleolitičku aktivnost. Kompleks mirnk-ago2 sisara - perfektno komplemntarno sparivanje mirnk i ciljne irnk dovodi do endonukleolitičkog sečenja irnk. AGO2 je jedini član subfamilije AGO sisara koji je endonukleolitički kompetentan. Kompleks mala regulatorna RNK-Argonaut protein ima strukturu koja se sastoji iz dva lobusa (slika 6). Jedan lobus formiraju Domen PAZ i N-terminalni domen, dok drugi lobus fomriraju domeni MID i PIWI. Protein ostvaruje kontakt sa lancem "vodičem" uspostavljenjem intrakcija sa šećrno-fosfatnom okosnicom, ostavljajući tako baze da se spare sa komplemantarnim bazama u ciljnoj irnk. Struktura kompleksa ukazuje da se ciljna irnk sparuje sa lancem "vodičem" barem u regionu semena (videti ksanije), ali da ne dodiruje protein. Pored proteina AGO, mirisc sadrže i dodatne proteine koji imaju funkciju u formiranju mirnp ili imaju funkciju regulatora ili efektora u posredovanju represivne ili aktivirajuće funkcije mirnk. Takvi proteini su, na primer, GW182 i FMRP. GW182 (proteinski marker P tela) stupa u interkaciju sa proteinima AGO u mirnp i neophodan je za indukciju destabilizacije irnk. FMRP (eng. fragile X mental retardation protein) i njegov ortolog kod D. melanogaster, dfxr, koji predstavljaju proteine koji se vezuju za RNK i deluju kao modulatori translacije, posebno u neuronima, dovode se u vezu sa stimulacijom translacije od strane mirisc. Formiran kompleks mirisc sa lancem "vodičem" je spreman da prepozna ciljnu irnk i pokrene njenu endonukleolitičku degradaciju, utišava njenu translaciju, dovede do njene destabilizacije (deadenilacije i dalje egzonukleolitičke degradacije), ili da aktivira translaciju. Sudbina ciljne irnk određene je pre svega njenim stepenom komplemenatrnosti sa mirnk i tipom asociranog proteina AGO. 10

11 1.3. Principi interakcije mirnk-irnk MikroRNK stupa u interakciju sa ciljnom irnk posredstvom baznog sparivanja. Kod biljaka, većina mirnk se skoro perfektno sparuje sa svojim ciljnim irnk. Suprotno, mirnk metazoa se uglavnom neperfektno sparuju sa ciljnom irnk, prateći nekoliko pravila (slika 7). Najznačajnije i najrigoroznije pravilo podrazumeva perfektno i kontinuirao bazno sparivanje regiona mirnk između nukleotida 2 i 8 sa ciljnom irnk. Ovaj region mirnk označen je kao "seme", i preko njega započinje interakcija mirnk i irnk. Adeninski ostatak u irnk naspram pozicije 1 mirnk, ili adeninski ili uracilski ostaci naspram pozicije 9 mirnk, doprinose poboljšanju interakcije, iako nije neophodno da se bazno spare sa mirnk. Sledeće pravilo je da pogrešno sparene baze i izbočine mogu biti prisutne samo u centralnom regionu dupleksa mirnk-irnk. Na ovaj način se sprečava endonukleolitičko kidanje posredovano proteinom AGO. Treće pravilo kaže da mora postojati razumna komplementarnost i u 3' polovini mirnk, kako bi se interakcija sa irnk stabilizovala. Pogrešno sparene baze i izbočine se u ovom regionu uglavnom tolerišu, iako ispravno bazno sparivanje, posedno u regionu od nukleotida 13 do 16 mirnk, postaje značajno kada podudaranje u regionu "semena" nije optimalno. Slika 7. Principi interakcije mirnk-irnk: 1) region "semena" mirnk (od nukleotida 2 do 8) je ključan za interakciju sa ciljnom irnk, 2) pogrešno sparene baze i izbočine mogu biti prisutne samo u centralnom regionu dupleksa mirnk-irnk, 3) 3'kraj mirnk pokazuje razumnu komplementarnost sa ciljnom irnk. Faktori koji doprinose manjem struktuisanju 3'-UTR-ova i čine mesta vezivanja mirnk dostupnijim, na primer regioni bogati parovima AU, mogu poboljšati interakciju mirnk i irnk i doprineti efikasnijoj represiji posredovanoj sa mirnk. Sa nekoliko izuzetaka, mesta vezivanja za mirnk kod metazoa se nalaze u 3'-UTR-ovima i prisutna su većem broju kopija. Značajno je da su višestruka vezivna mesta za istu ili različite mirnk neophodna za efikasnu represiju. Kada se nalaze blizu jedno drugom (na udaljenosti od 10 do 40 nukleotida) ispoljavaju kooperativno delovanje, što znači da njihov zajednički efekat prevazilazi sumu pojedinačnih efekata. 11

12 1.4. Modeli utišavanja irnk posredovan sa mirnk Efekti mirnk na ciljne molekule RNK određen je stepenom komplementarnosti mirnk i ciljne RNK: 1) ukoliko se mirnk perfektno sapri sa irnk indukuje se degradaciju ciljne RNK endonukleolitičkim kidanjem na sredini perfektnog dupleksa mirnk-irnk; 2) ukoliko je sparivanje mirnk i irnk neperfektno dolazi do translacione represije i/ili destabilizacije irnk Model endonukleolitičkog sečenja irnk Kod biljaka i, veoma retko kod životinja, protein AGO iz kompleksa mirisc indukuje degradaciju ciljne irnk endonukleolitičkim sečenjem. Lanac vodič iz kompeksa mirisc se bazno sparuje sa ciljnom irnk, a arhitektura kompleksa je takva da ovo vezivanje pozicionira aktivno mesto domena PIWI na odgovarajući način da može da iseče ciljnu irnk. Ova aktivnost proteina AGO se često u literaturi označava kao slicer activity. Sečenje se dešava približno na sredini dupleksa mirnk-irnk, između nukleotida 10 i 11 mirnk (slika 6). Među proteinima AGO sisara, samo AGO2 ima očuvanu endonukleaznu aktivnost, koji zbog ove osobine jedini učestvuje i u putu RNKi posredovane sa sirnk Modeli utišavanja translacije destabilizacijom i degradacijom irnk posredovani sa GW1 182 Kod životinja, najveći broj mirnk je samo delimično komplementaran svojim ciljnim irnk. U velikom broju slučajeva proteini AGO nisu dovoljni da sami posreduju u reprimiranju irnk. U kompleksu sa proteinima familije GW 182 mogu dovesti do destabilizacije irnk. GW 182 stupa u interakciju sa proteinima AGO i proteinima koji se vezuju za poli(a) rep (PABPC1). Smatra se da interakcija GW 182 sa PABPC1 doprinosi utišavanju na dva načina (slika 9). Prema jednom modelu proteini GW 182 dovode do smanjenja efikasnosti translacije interferirajući sa cirkularizacijom irnk, što vodi destabilizaciji irnk. Prema alternativnom modelu interakcija GW 182-PABPC1 ubrzava deadenilaciju irnk (koja može i ne mora biti posledica narušavanja cirkularizacije irnk). Usled deadenilacije irnk smanjuje se efikasnost translacije, dolazi do otklanjanja 5'-kape i egzonukleolitičke degradacije u smeru 5' 3'. Da bi razumeli ove modele potrebno je upoznati se sa domenskom organizacijom proteina PABPC1 i GW 182. Protein PABPC1 je visoko konzervisani protein eukariota koji se vezuje za poli-a rep irnk i služi kao platforma za vezivanje različitih proteina uključenih u regulaciji translacije i degradacije irnk. Ortolozi proteina PABPC1 se karakterišu sa sledećim domenima: četri visoko-konzervisana motiva za prepoznavanje i vezivanje za jednolančanu RNK (eng. RNA recognition motifs, RRM) na N-kraju, označena kao RRM1-RRM4, nestruktuisanim linkerom bogatim prolinom, i konzervisanim domenom na C-kraju, označenom kao MLLE. Preko motiva RRM, PABPC1 stupa i u interakciju sa eukariotskim inicijacionim faktorom 4G (eif4g), koji uspostavlja interakciju sa 5'-kapom irnk za koju je vezan eif4e. Interakcija PABPC1 i eif4g dovodi do cirkularizacije irnk i stabilizuje vazivanje eif4e za 5'-kapu (slika 8). Struktura zatvorene petlje stimuliše translaciju irnk i štiti krajeve irnk od degradacije. Proteini koji učestvuju u translaciji i degradaciji irnk, a sadrže motive PAM1 i PAM2 (eng. PABP-interacting 12

13 motif 1 and 2) uspostavljau interakcije sa domenima na N- i C-krajevima proteina PABPC1, redom. P-body targeting N-GW M-GW C-GW Slika 8. Domenske organizacije proteina PABPC1 i GW 182: a) Ortolozi proteina PABPC1 se karakterišu sa: četri visoko-konzervisana motiva za prepoznavanje RNK (eng. RNA recognition motifs, RRM) na N-kraju, označena kao RRM1-RRM4, nestruktuisanim linkerom bogatim prolinom, i konzervisanim domenom na C-kraju, označenom kao MLLE. Preko motiva RRM na svom N-kraju, PABPC1 stupa u interakciju sa eukariotskim inicijacionim faktorom 4G (eif4g), koji uspostavlja interakciju sa 5'-kapom irnk za koju je vezan eif4e. Ova interakcija PABPC1 i eif4g dovodi do cirkularizacije irnk i stabilizuje vazivanje eif4e za 5'-kapu. Proteini koji učestvuju u translaciji i degradaciji irnk, a sadrže motive PAM1 i PAM2 uspostavljau interakcije sa domenima na N- i C-krajevima proteina PABPC1, redom. b) Proteini GW 182 imaju karakterističnu strukturu koja se sastoji iz četri nestruktuisana regiona i dva strukturna domena. Nestruktuisani regioni uključuju regione N-GW, M-GW i C-GW, koji redom predstavljaju N-terminalni, središnji i C-terminalni region sa ponovljenim motivima GW (Gly-Trp), kao i region bogat glutaminom (Q). Između ovih regiona nalaze se dva strukturna domena: centralni domen asociran sa ubikvitinom (domen UBA) i motiv za prepoznavanje RNK na C-kraju (domen RRM, eng. RNA recognition motif). U okviru regiona M-GW nalazi se motiv sličan motivu PAM2 (eng. PABP-interacting motif 2, PAM2), dok kraj regiona M-GW i regiona C-GW sadrže sekvencu nalik na motiv PAM1. Motivi PAM1 i PAM2 služe za interkacije sa PABPC1. Proteini GW 182 imaju karakterističnu strukturu koja se sastoji iz četri nestruktuisana regiona i dva strukturna domena (slika 8). Nestruktuisani regioni uključuju regione N-GW, M-GW i C-GW, koji redom predstavljaju N-terminalni, središnji i C-terminalni region sa ponovljenim motivima GW (Gly-Trp), kao i region bogat glutaminom (Q). Između ovih regiona nalaze se dva strukturna domena: centralni domen asociran sa ubikvitinom (domen UBA) i motiv RRM za prepoznavanje i vezivanje jednolančane RNK na C-kraju. 13

14 Dva regiona proteina GW 182 imaju esencijalnu ulogu u utišavanju translacije: 1) N-terminalni region, koji sadrži veći broj ponovaka Gly-Trp (GW) (domen N-GW) direktno vezuje protein AGO, i 2) bipartitni domen za utišavanje, koji obuhvata regione M-GW i C-GW i promoviše translacionu represiju i degradaciju ciljnih molekula RNK. U okviru bipartitnog domena za utišavanje nalaze se dva motiva koja mogu uspostaviti interkciju sa PABPC1. U regionu M-GW nalazi se motiv koji pokazuje sličnost u sa PAM2, i vezuje se za domen MLLE na C-kraju PABPC1. U zadnjem delu regiona M-GW i u regionu C-GW nalazi se manje definisana sekvenca koja funkcionalno imitira motiv PAM1. Motiv sličan PAM1 posreduje u vezivanju proteina GW 182 za motive RRM na N-kraju proteina PABPC1. Dakle, proteini GW 182 sadrže dva različita domena preko kojih se vezuju za protein PABPC1: motiv sličan motivu PAM1 i motiv PAM2. Sa druge strane, protein PABPC1 ima dva mesta vezivanja za proteine GW 182: motive RRM na N-kraju (za PAM1) i domen MLLE na C-kraju (za PAM2) (slika 8). Činjenica da bipartitni domen za utišavanje proteina GW 182 stupa u interakciju i sa N- i sa C-terminalnim domenima PABPC1 ukazuje da GW 182 interferira sa funkcijom PABPC1 u translaciji i/ili stabilizaciji irnk preko barem dva različita modela (slika 9). Slika 9. Translaciona represija i destabilizacija irnk posredovana sa mirnk-ago-gw 182 zasnovana je na interakcijama GW 182 sa proteinima PABPC1. Prema jednom modelu GW 182 uspostavlja interakciju sa domenom PABPC1 za koji se vezuju i eif4g, tako da postoji kompeticija GW 182 i eif4g za vezivanje za PABPC1. Kada se GW 182 veže za PABPC1 dolazi do narušavanja cirkularne strukture irnk i utišavanja translacije. Prema drugom modelu GW 182 uspostavlja interakciju sa drugim domenom PABPC1, tako da se ne narušava cirkularna struktura irnk, ali se formira platforma za vezivanje kompleksa CAF1-CCR4-NOT, koji dovodi do deadenilacije. Deadenilacija je dalje praćena otklanjanjem 5'-kape pomoću DCP2 i egzonukleolitičkom degradacijom u smeru 5' 3' pomoću proteina XRN1. Protein DCP2 zahteva dodatne proteine za potpunu aktivnost i/ili stabilnost, kao što su protein DCP1, pojačivač za otklanjanje 5'-kape 4 (eng. enhancer of decapping 4, EDC4) i RNK helikaza DDX6 (eng. DEAD-box protein 6). Prema jednom modelu, za motive RRM na N-kraju PABPC1 kompetiraju proteini GW 182 i eukariotski inicijacioni faktor 4G (eif4g), koji se vezuje za 5'-kapu irnk preko eif4e. Vezvianje eif4g za PABPC1 dovodi do stvaranja strukture zatvorene petlje irnk, koja stimuliše translaciju. Vezivanje motiva sličnog motivu PAM1 proteina GW 182 za PABPC1 14

15 narušava kružnu strukturu irnk, što smanjuje efikasnost translacije i olakšava njihovu degradaciju (slika 9). Drugi model predviđa da dolazi do interkacije motiva PAM2 utišavajućeg domena GW 182 sa domenom MLLE PABPC1, što ne utiče direktno na ciruklularizaciju irnk, ali izgleda interferira sa funkcijom PABPC1. Smatra se da bi ovakva interakcija GW 182 mogla da redukuje afinitet PABPC1 za poli(a) rep. Ovo bi moglo indirektno interferirati sa cirkularizacijom irnk i učiniti poli(a) rep dostupan deadenilazama. Slično nekim drugim proteinma koji poseduju motiv PAM2, i interakcija PAM2 motiva GW 182 sa PABPC1 bi mogla stvoriti platformu za vezivanje kompleksa CAF1-CCR4-NOT, glavnog kompleksa za deadenilaciju u citoplazmi. Deadenilacija je dalje praćena otklanjanjem 5'-kape pomoću proteina za otklanjanje 5'-kape (DCP2), koji u ciklusima čini irnk osetljivom na egzonukleolitičku degradaciju u smeru 5' 3' pomoću proteina XRN1 (slika 9) Drugi modeli translacionog utišavanja pomoću mirnk Eksperimentalni podaci ukazuju da efekat mirnk na sintezu proteina, pored destabilizacije i degradacije irnk u kojim posreduje protein GW 182, može biti ostvaren i drugim mehanizmima represije translacije. Još uvek nije poznato da li se drugi mehanizmi represije translacije ostvaruju tokom inicijacije translacije i/ili u koracima nakon incijacije. Za sada najviše eksperimentalnih podataka podržava model represije transalcije u koraku inicijacije. Model po kome mirnk dovode do represije translacije u koraku inicijacije potiče iz eksperimenata koji su pokazali da je struktura 5'-kape esencijalna za translaciono utišavanje sa mirnk. Pokazano je da translacionoj represiji sa mirnk mogu podleći samo one one irnk koje sadrže funkcionalnu 5'-kapu. Poznato je da mnogi faktori koji se vezuju za 3'-UTR irnk ispoljavaju svoje inhibtorne efekte na incijaciju transalcije regrutovanjem proteina koji ometaju interakciju eif4e-eif4g (na primer, proteina 4eBPs), ili direktnim vezivanjem za 5'-kapu. Inhibitorni faktori koji se dirketno vezuju za 5'-kapu ne stupaju u interkaciju sa eif4g i ne mogu promovisati formiranje 40S inicijacionog kompleksa, a takve irnk ne formiraju cirkularne strukture. Nedavno je pokazano da centralni domen proteina AGO2 sadrži ograničenu homologiju sa onim regionom proteina eif4e koji se vezuje za 5'-kapu. Najznačajnije je da ova homologija uključuje dva aromatična aminokiselinska ostatka (slika 10), koja su ključna za vezivanje eif4e za 5'-kapu, kao i za vezivanje drugih proteina koji stupaju u interakciju sa 5'-kapom. Slika 10. Domenska organizacija proteina AGO2 čoveka. AGO2 sadrži domen DUF (nepoznate funkcije), domen PAZ (specifično prepoznaje i vezuje 3'-kraj lanca vodiča mirnk) i domen PIWI (domen sličan RNazi H koji je endonukleolitički kompetentan). Region koji razdvaja domene PAZ i PIWI sadrži dve aromatične aminokiseline (fenilalanin na pozicijama 470 i 505) u kojima mutacije sprečavaju translacionu represiju i vezivanje AGO2 za 5'-kapu irnk. 15

16 Zbog ove osobine AGO2 i drugi srodni proteini bi mogli biti u kompeticiji sa eif4e za vezivanje za 5'-kapu, i na taj način reprimirati translaciju u koraku inicijacije (slika 11). Ovakav model donekle objašnjava potrebu za većim brojem mirisc da bi se postigla značajna represija pomoću mirnk. Naime, veći broj kopija mirisc, u okviru kojih se nalazi AGO protein sa manjim afinitetom za 5'-kapu u odnosu na eif4e, bi povećao verovatnoću asocijacije AGO sa 5'-kapom. Ovaj model zahteva dalje ekspreimrntalnu verifikaciju. Smatra se da bi kompleksi mirics mogli reprimirati inicijaciju translaciju i sprečavanjem vezivanja velike subjedinice ribozoma (60S) (slika 11). Suprotno navedenim modelima, su rezultati studija koji pokazuju da i irnk koje nemaju poli-a rep mogu podleći translacionoj represiji. Slika 11. Modeli delovanja mirnk: utišavajući kompleks mirisc vezan za 3'-UTR irnk može pokrenuti deadenilaciju i degradaciju ciljne irnk uz posredovanje proteina GW 182 (gornji levi deo slike). Alternativno, mirisc može reprimirati inicijaciju translacije bilo u koraku preoznavanja 5'-kape ili u koraku pridruživanja 60S subjedinice ribozoma (donji levi deo slike). irnk reprimirana deadenilacijom ili u fazi inicijacije translacije se sklanja u citoplazmatićne RNK granule (na primer, P tela), gde će se degradovati ili dalje čuvati. Represija irnk sa mirisc može da se desi i u fazama nakon inicijacije translacije usled usporene elongacije ili spadanja ribozoma (slika dole desno). mirnk može reprimirati produkciju proteina pokretanjem proteolitičke degradacije rastućeg polipeptida (slika desno gore). Proteaze koja bi učestvovala u ovom procesu je još uvek nepoznata. Kosedimentacija značajne frakcije ćelijskih mirnk ili proteina AGO sa polizomima u mnogim studijama podržava pretpostavku da bi translaciona represija sa mirnk mogla da se ostvaruje i u koracima nakon inicijacije transalcije. Međutim na koji bi način mirnk mogle da modulišu elongaciju ili terminaciju translacije još uvek nije poznato. Predloženi su modeli u 16

17 kojima dolazi ili do usporavanja elongacije transalcije ili do spadanja ribozoma sa irnk (eng. ribosome drop off) (slika 11). Represija ciljne irnk sa jednom mirnk je generalno samo parcijalna, tako da vezivanje jednog kompleksa mirisc za irnk često nema nikakav efekat na represiju. Stoga, kosedimentacija mirisc sa polizomima ne bi morala neophodno da ukazuje na represiju nakon incijacije translacije, već bi mogla jednostavno odražavati asocijaciju mirisc sa irnk koja podeležu produktivnoj translaciji. Dalje, ukoliko se represija translacije dešava i nakon koraka inicijacije, mehanizmi koji dovode do represije translacije u koraku inicjacije i nakon inicijacije ne moraju međusobno da se isključuju. Moguće je da se represija inicijacije transalcije uvek dešava, ali u slučavjevima kada se desi i represija na nivou elongacije, zastoj ribozoma bi mogao maskirati efekat blokiranja inicijacije. Asocijacija reprimiranih irnk sa translaciono kometnentnim ribozomima je dovela do prepostavke da se sa ovakvih irnk polipeptidi kontinuirano sintetišu ali se ne akumuliraju, jer mirisc regrutuju proteazu koja brzo degraduje rastuće polipetide (slika 11). Ovaj model za sada ima najmanje ekperimentalnih dokaza. Pokazano je da inhibitori proteazoma nemaju efekat na represiju posredovanu sa mirnk, tako da bi ovaj model uključivao neku još neidentifikovanu proteazu MikroRNK kao aktivatori transalcije Izgleda da se efekat mirnk na ekspresiju proteina ne ostvaruje samo različitim načinima represije translacije, s obzrom da je pokazano da mirnk mogu stimulisati translaciju. Drugim rečima, mirnk imaju dvostruku funkciju jer služe i kao represori i kao aktivatori translacije ciljnih irnk, i to u zavisnosti od stanja ćelijskog ciklusa, odnosno fizioloških uslova. Kada se ćelija normalno deli imaju funkciju represora, a kada je zarobljena u G1 fazi imaju funkciju aktivatora. U kulturama ćelija sisara pokazano je da 3'-UTR irnk za TNF-α (eng. tumor-nekrosis factor α) stimuliše translaciju u uslovima nedostatka seruma, u kome se nalaze hranljivi sastojci i faktori rasta, što dovodi do zarobljavanja ćelija u G1 fazu. Ova stimulacija translacije je zavisna od mirnk mir369-3 i proteina AGO2. U odsustvu mir369-3 ne dolazi do stimulacije translacije. U ostalim fazama ćelijskog ciklusa mir369-3 reprimira translaciju. Za let7 mirnk je, takođe, pokazano da ima ulogu aktivatora translacije kada dođe do zarobljavanja ćelije u G1 fazi, dok u fazama normalnog ćelijskog ciklusa ima dobro izčenu funkciju represora transalcije. Smatra se da fiziološki uslovi utiču na regrutovanje regulatornih proteina koji mogu promeniti efekat mirnk. Stimulacija translacije uključuje promenu proteina koji se regrutuju na irnk pomoću kompleksa mirnk-ago (slika 12). Kada je ćelija zarobljena u G1 fazi ćelijskog ciklus, kompleks mirnk-ago regrutuje protein FXR1 i stimuliše se translacija. Da li se na kompleks mirnk-ago regrutuju i drugi aktivatori i da li represivni partneri, kao što je GW 182, napuštaju kompleks nije poznato. Različitost proteina koji se regrutuju na irnk pomoću kompleksa mirnk-ago dalje se proširuje velikim brojem članova familija proteina AGO, GW 182 i FXR, kao i njihovim nivoom ekspresije i postranslacionim modifikacijama. Dalje, efekat mirnk-ago kompleksa može biti modulisan proteinima koji se vezuju na drugim mestima u 3'-UTR-u ciljne irnk. Aktivirajuća uloga mirnk kao odgovora ćelije na stres ukazuje da bi i 17

18 druge promene sredine mogle dovesti da neke mirnk ispolje takvu ulogu. S obzirom da se neki proteini koji stupaju u interkaciju sa AGO, kao što je FXR1, takođe vezuju i RNK, može se pretpostaviti da neke irnk sadrže sekvence koje konstituitivno vezuju mirnk-ago komplekse koji dovode do aktivacije translacije. Slika 12. Dvostruka funkcija mirnk: mirnk mogu reprimirati i aktivirati translaciju ciljne irnk. Fiziološki uslovi utiču na regrutovanje regulatornih proteina, koji mogu promeniti efekat mirnk. Male regulatorne RNK koje imaju funkciju i represora i aktivatora ekspresije ciljnih gena mogle bi da obuhvate i druge vrste ovih molekula osim mirnk, kao što su sirnk i pirnk. Pokazano je da specifične pirnk, pored toga što reprimiraju eksprediju gena, kod D. melanogaster mogu i pojačati transkripciju. Takođe, neke dvolančene RNK, koje su komplementarne sekvencama promotra, kada se unusu u ćelije sisara mogu povećati ekspresiju gena Regulacija mirnk i proteina koji asociraju sa njima MikroRNK i komponente kompleksa mirisc, kao i svi ostali regulatori, podležu regulaciji. Pored regulacije koja uključuje prostornu i vremensku ekspresiju ovih molekula, postoji još čitav niz mehanizama za regulisanje specifičnosti i funkcije komponenti kompleksa mirisc. Mali regulatorni molekuli RNK direktno ili indirektno utiču na skoro svaki biološki proces u eukariotskim ćelijama. Da bi obavile takvu funkciju, ne samo da je potrebno da se određena mala RNK eksprimira, već ona mora asocirati sa specifičnim efektornim kompleksom RISC. Proteini AGO, koji su osnovne komponente kompleksa RISC, imaju specifičan obrazac ekspresije, specifične partner proteine i biohemijske osobine. Veoma malo se zna o reguaciji utišavajućeg kompleksa RISC, ali sve je više podataka da posttrasnlacione modifikacije imaju ulogu u regulaciji osnovnih komponenti kompleksa RISC, kao što su AGO, PIWI, TRBP i GW 182 proteini. Proteini AGO i GW 182 su fosfoproteini, ali na koji način bi posttranslacione 18

19 modifikacije mogle uticati na njihovu aktivnost nije poznato. Motiv PAM2 u proteinima GW 182 ukazuje na mogućnost da bi ovi proteini mogli biti ciljni molekuli za ubikvitniaciju preko E3 ubikvitin ligaze EDD (koja poseduje domen MLLE koji stupa u interakciju sa motivima PAM2). Nije poznato da li proteini GW 182 mogu stupiti u interakciju sa EDD i da li ih ta interkacija čini ciljnim molekulima za preteolitičku razgradnju posredovanu proteazomom. Drugi aspekt regulacije malih regulatonih molekula RNK i AGO proteina koji se danas intenzivno istražuje je šta određuje specifičnost interakcije određne regulatorne RNK sa određenim proteinom AGO, odnosno kako se vrši sortiranje malih regulatornih molekula RNK u odnosu na AGO proteine. 2. MALE INTERFERIRAJUĆE RNK (SIRNK) Male interferirajuće RNK (sirnk) nastaju od dugog dvolančanog prekursora koji je ili egzogen unet ili endogeno sintetisan, zbog čega u njihovoj biogenezi ne učestvuje protein Drosha. Egzogene sirnk (egzo-sirnk) mogu nastati od virusnih RNK ili od eksprementalno unetih dugih, perfektno komplementarnih dvolančanih RNK. Eksprimiranje endogenih sirnk (endo-sirnk) je opisano kod biljaka i životinja, kao što su C. elegans, Drosophila i miš. Dvolančani prekursori za endo-sirnk potiču od transkripata sposobnih da formiraju duge dvolančane RNK. Takvi su transkripti prepisani sa ponovljenih sekvenci u genomu (transpozna), antisense lanaca i pseudogena. Navedeno ukazuje da je jedna od mogućih uloga antisense transkripata i transkripata prepisanih sa pseudogena regulacija ekspresije sense transkripata, odnosno roditeljskih gena. Dvolančani prekursor sirnk je supstrat za kompleks Dicer-TRBP. Nastale dvolančane RNK, dugačke 21 nt, asociraju sa proteinma familije AGO i drugim komponentama utišavajućeg kompleksa, kada dolazi do uklanjanja lanca "putnika". Formira se zreli utišavajući kompleks, sirisc, sa lancem "vodičem", koji je vezan sa proteinom AGO. Lanac "vodič" sirnk je uglavnom potpuno komplementaran ciljnoj RNK, tako da protein AGO katalizuje endonukleolitičku degradaciju ciljne RNK. Gubitak funkcionalnog Dicera ili AGO2 dovodi do smanjenja nivoa sirnk i povećanog nivoa ekspresije transpozona ili transkripata koji kodiraju proteine a koji su komplementarni sa sirnk. sirnk su važne za antivirusnu odbranu, jer destabilizuju intermedijere RNK nastale tokom životnog ciklusa virusa. Kod S. pombe je opisano da endo-sirnk vrše transkripciono utišavanje gena, inicirajući stvaranje heterohromatina, funkcija koja do sada nije opisana za mirnk. Egzo-siRNK se eksperimentalno koriste za manipulisanje ekspresijom gena Transkripciono utišavanje gena used modifikacije hromatina pomoću sirnk Mali regulatorni molekuli RNK, pored toga što posttrasnkripciono utišavaju ekspresiju gena na nivou translacije, mogu delovati i na niovu transkripcije, tako što isključuju ekpsresiju targetnih gena modifikacije hromatina. Ovaj mehanizam je najbolje izučen u utišavanju gena u 19

20 centromerama kod kvasca S. pombe. Naime, centromerni regioni S. pombe su organizovani u hetrohromatin, i ovo utišavanje hromatina zahteva mehanizam RNKi. Centromerni ponovci kod S. pombe imaju važnu ulogu u formiranju heterohromatina i u utišavanju gena koji se nalaze u centromernim regionima. Represivni "potpis" modifikacija histona su nizak nivo acetilacije i metilacija Lys 9 histona H3 (H3K9). S. pombe ima po jedan gen za proteine Dicer i AGO. Gubitak funkcionisanja RNKi dovodi do slabog rasta ćelija, ali i do poremećaja u segregaciji hromozoma. Bilo je iznenađenje, kada je ustanovljeno da gubitak RNKi kod ove vrste kvasca dovodi do gubitka metilacije H3K9 i utišavanja gena u centromernim regionima, s obzirom da se ovo utišavanje dešava transkripciono, a ne posttranskripciono kako se do tada mislilo da deluje RNKi. Kako se dešava utišavanje centromernog regiona kod S.pombe (slika 13)? Slika 13. Utišavanje centromera kod S. pombe posredovano sa sirnk. Objašnjenje u tekstu. Centromerni ponovci se bidirekciono transkribuju pomoću Pol II, dajući komplementarne transkripte koji međusobno hibridizuju u dvolančanu RNK. Duga dvolnačana RNK je supstrat za Dicer, koji generiše male dvolančane RNK, koje stupaju u interkciju sa proteinom AGO. Formira se kompleks RITS (eng. RNA induced transcriptional silencing complex), koji se na još nepoznat način usmerava ka centromerama i pokreće njihovo transkripciono utišavanje 20

21 formiranjem heterohromatina. U teoriji, sirnk bi se mogle spariti sa komplementarnim sekvencama u DNK. Međutim, ovaj kompleks se komplemntarno sparuje sa rastućim transkriptima koji se prepisuju sa centomernih ponovaka. Regrutovanje kompleksa RITS na rastuće transkripte centromernih ponovaka pokreće metilaciju heterohromatina, koja se dalje sama širi. Naime, RITS regrutuje proteine Clr4 i SWI6 koji lokalno modifikuju nukleozome uvodeći H3K9 metilaciju. Subjedinica kompleksa RITS, ChpI, poseduje hromodomen pomoću kojeg se vezuje za metilovane histone, što doprnosi stabilizaciji vezivanja RITS. Interesantno je da je sastavni deo kompleksa RITS i RNK zavisna RNK polimeraza (RdRP). Protein AGO u kompleksu RITS ima endonukleolitičku aktivnost, a nastali produkti su supstati za RdRP, čime se generišu novi supstrati za Dicer, i značajno amplifikuje početni represivni signal, po sistemu povratne sprege. Zbog ove osobine, utišavanje centromernog regiona kod ove S. pombe je ekstremno efikasan proces. Interesantno je da homolog za RdRP još nije otkriven u ćelijama sisara. Dakle, transkripcija sama po sebi može dovesti do širenja heterohromatina, kada je sami transkript ciljni molekul za RNKi. Smatra se da sličnim mehanizmom RNKi učestvuje barem delom i u formiranju heterohromatina kod biljaka i vinske mušice. Utišavanje neželjene transkripijce sa transpozona je, takođe, posredovano sa malim molekulima RNK, pirnk, verovatno sličnim mehanizmom. 21