Analitika bioloških lekova 1 Sadržaj Struktura proteina Biološki lekovi definicija i karakteristike HPLC metode u analitici bioloških lekova Metode masene spektrometrije Primena mikrotalasnog zračenja Elektroforeza 2
1. Struktura proteina Primarna struktura određena je sekvencom amino kiselina (oko 20) Sekundarna struktura trodimenzionalan oblik polipeptidnog lanca Primer α heliksa Tercijarna struktura trodimenzionalna konformacija koja nastaje prostornim organizovanjem delova polipeptidnog lanca sa određenom sekundarnom strukturom Kvaternerna struktura povezivanje proteinskih subjedinica u agregate proteina 3 Primer primarne, sekundarne, tercijalne i kvaternerne strukture proteina 4
2. Biološki lekovi Biološki lekovi ili biofarmaceutici proizvodičije se aktivne komponente proizvode u živim sistemima procesom kultivacije genetski modifikovanih mikroorganizama ili ćelija (bakterija, kvasaca, kao i ćelijskih kultura sisara). 5 Slični biološki medicinski proizvodi ili biosimilari predstavljaju biološke lekove koji su slični sa drugim biološkim lekovima koji su već odobreni za upotrebu sadrže aktivnu supstancu čija je patentna zaštita istekla. proizvođač mora da pokaže da je biosimilarni proizvod identičan sa referentnim proizvodom u pogledu ključnih fizičko-hemijskih osobina i biološke aktivnosti proizvođač mora da pokaže da je biosimilarni proizvod uporediv sa referentnim proizvodom u pogledu kliničke bezbednosti i efikasnosti. Slični a ne isti. 6
Poređenje generičkih lekova i sličnih bioloških medicinskih proizvoda Generički lekovi Biosimilari Molekulska masa Do približno 5 kda Između 5 kda i 500 kda Proizvodnja Hemijska sinteza Jednostavna mikrobiološka fermentacija Genetski modifikovane ćelijske linije Složeni postupci fermentacije Složeni postupci prečišćavanja Analitika leka Standardna analitika leka Složeni analitički postupci Prekliničke studije In vitro i in vivo bioodređivanje Studije toksičnosti Studije lokalne tolerancije Kliničke studije Studije bioekvivalencije o apsorpciji Studije bioekvivalencije o apsorpciji i eliminaciji Studije faze III Studije faze III b - IV Dugotrajne postmarketinške studije Plan o upravljanju rizikom Postupak za odobrenje Decentralizovan ili centralizovan Centralizovan postupak 7 8
Za razliku od tradicionalnih lekova koji su molekule male molekulske mase sa jednostavnom hemijskom strukturom, supstance proizvedene biotehnološkim metodama su složeni molekuli velike molekulske mase. Analitika bioloških lekova predstavlja mnogo zahtevniji i složeniji zadatak. 9 Ranije Analitičke tehnologije nisu bile dovoljno razvijene da omoguće detaljnu fizičko-hemijsku karakterizaciju i poređenje složenih molekula proteina Konzistentnost kvaliteta proizvoda je u velikoj meri zavisila od konzistentnosti i kontrole procesa proizvodnje Sada Napredne tehnike za analitiku omogućile direktno detaljno poređenje kvaliteta i karakteristika biofarmaceutika. 10
3. HPLC metode u analitici bioloških lekova 1. Size-exclusion chromatography hromatografija zasnovana na razlikama u veličini molekula 2. Jonoizmenjivačka hromatografija 3. Reverzno-fazna tečna hromatografija 4. Hromatografija hidrofobnih interakcija 5. Afinitetna hromatografija 11 Size-exclusion chromatography - hromatografija zasnovana na razlikama u veličini molekula Razdvajanje proteina na osnovu njihove razlike u veličinama molekula Najpre se eluiraju proteini velike molekulske mase a zatim proteini manje molekulske mase. 12
Značajni faktori u razvoju metode: dodatak soli do određene koncentracije smanjuje interakcije između proteina i stacionarne faze ph vrednost niža od 7,0 smanjuje mogućnost nastajanja silanolnih anjona (uobičajen je dodatak pufera niskog molariteta i ph blizak fiziološkom 6,8) brzina protoka mobilne faze od 0,5 ml min.-1 do 1,0 ml min -1, pri nižem protoku postiže se bolje razdvajanje pikova Injekciona zapremina do 5% zapremine punjenja kolone Koncentracija uzorka poželjno je injektovati koncentrisane uzorke proteina vodeći računa da ne dođe do precipitacije Prednost: Biološka aktivnost proteina ostaje očuvana tokom analize. 13 Jonoizmenjivačka hromatografija Zasniva se na reverzibilnim, elektrostatičkim (ili jonskim) interakcijama između naelektrisanih proteina/peptida u mobilnoj fazi i naelektrisanih jonoizmenjivačkih grupa stacionarne faze 14
Proteini/peptidi normalno poseduju neto pozitivno ili neto negativno naelektrisanje zavisno od ph vrednosti mobilne faze. Kiseli proteini i peptidi (pi < 6,0 ) razdvajaju se pomoću anjonskih jonoizmenjivačkih kolona jer su negativno naelektrisani. Bazni proteini i peptidi (pi > 8,0) razdvajaju se pomoću katjonskih jonoizmenjivačkih kolona jer su pozitivno naelektrisani. Isoelectric Point pi 15 Značajni faktori u razvoju metode: ph vrednost mobilne faze - obično podešava se na vrednost koja se razlikuje bar za jednu ph jedinicu od pka vrednosti jonoizmenjivačke smole, kako bi 90 % kolone bilo jonizovano jonska jačina - soli koje ulaze u sastav puferskih rastvora daju jone koji mogu da se kompetitivno sa proteinima/peptidima vezuju za jonoizmenjivačke kolone. Ako se protein/peptid jako vezuje za jonoizmenjivačku kolonu, jon većeg afiniteta može se iskoristiti da poboljša proces eluiranja. Neki uobičajeni joni koji se koriste u ove svrhe, predstavljeni u odnosu na njihovu relativnu jačinu, su: Cs + > K + > NH 4+ > Na + i PO 3-4 > CN - > HCOO - > CH 3 COO -. Prednosti: Biološka aktivnost proteina skoro uvek ostaje očuvana. Može se upotrebiti za koncentrisanje razblaženih uzoraka proteina. 16
Reverzno-fazna tečna hromatografija Zasniva se na interakciji nepolarnih regiona proteina/peptida i stacionarne faze 17 Značajni faktori u razvoju metode: odgovarajuća veličina pora - za proteine koji imaju težinu veću od 10 kda kolone sa većim porama (300 A) a za proteine sa težinom manjom od 10 kda kolone sa manjim porama (150 A i manje) izbor kolone - C18 kolona se koristi za hidrofilne proteine/male peptide, a C4 ili C5 kolone se koriste za hidrofobne proteine/velike polipeptide upotreba jon-par reagenasa anjonski grade komplekse sa pozitivno naelektrisanim ostacima proteina dok katjonski grade veze sa negativno naelektrisanim ostacima proteina brzina protoka mobilne faze i uslovi gradijentnog eluiranja temperatura kolone viša temperatura poboljšava efikasnost kolone i oblik pika ali negativno utiče na biološku aktivnost proteina. Prednost: Kompatibilna sa masenom detekcijom 1 Da = 1,66 10 27 kg 18
Hromatografija hidrofobnih interakcija Zasniva se na slabim interakcijama između hidrofobnih zona, prisutnih na površini intaktnog proteina, i nepolarnih grupa stacionarne faze 19 Rastvor soli Vodeni rastvor visoke jonske jačine i neutralne ph vrednosti Hidrofobni ligand Membrana 20
Značajni faktori u razvoju metode: vrsta kolone silika gel modifikovan aril grupama, diolnim derivatima i kratkim alkil nizovima prisustvo i vrsta soli značajna je vrednost površinskog napona koju stvaraju soli (KCl < NaCl < Na 2 HPO 4 < (NH 4 ) 2 SO 4 < Na 3 PO 4 ), obično su koncentracije od 1 M do 3 M. Najbitniji faktor! ph mobilne faze uobičajeno do 5,0 do 8,0 temperatura kolone u cilju očuvanja konformacije proteina izvodi se na što nižim temperaturama Prednosti: Ne dolazi do denaturacije ili gubitka strukture proteina Za detektovanje promena u konformaciji proteina 21 Afinitetna hromatografija Metoda zasnovana na reverzibilnom, specifičnom vezivanju jednog biomolekula za drugi Specifični ligandi enzimski supstrati/inhibitori antigeni/antitela Multifunkcionalni ligandi (npr. konkanavalin A) Za ispitivanje interakcija tipa protein-protein, protein-peptid, i lek-protein 22
4. Masena spektrometrija Zasniva se na određivanju odnosa mase i naelektrisanja jona u gasovitoj fazi Daje informacije i o molekulskoj masi, ali i o strukturi molekula 23 Elektrosprej jonizacija 1) raspršivanje rastvora uzorka i stvaranje naelektrisane čestice 2) oslobađanje jona iz kapi 3) prenos jona iz izvora sa atmosferskim pritiskom u region sa vakuumom i analizator masenog spektrometra 24
MALDI tehnika (Matrix-assisted laser desorption/ionization) 1) Proteini se mešaju sa matriksom koji apsorbuje u ultraljubičastoj ili infracrvenoj oblasti 2) Dobijeni uzorak se odlaže, suši i injektuje u maseni spektrometar 3) Pomoću kratkog pulsa laserske svetlosti proteini se jonizuju i desorbuju iz matriksa u polje visokog vakuuma 25 Identifikacija proteina ili određivanje sekvence 26
top-down pristup Merenje molekulske mase intaktnog molekula 100 % pokrivenosti sekvence post-translacione promene ostaju intaktne Fragmentacija se vrši pomoću MS/MS detektora i omogućava identifikaciju proteina pretraživanjem baze podataka, brzo određivanje N- i C- terimalnog završetka bottom-up pristup Vrši se digestija proteina, dejstvom enzima dobijaju se peptidi mogu biti jedinstveni u pogledu njihove mase, sekvence aminokiselina i separacionih karakteristika pokrivenost sekvence ovim pristupom je od 5 % do 70 % postoji i verovatnoća gubitka post-translacionih promena tokom MS/MS fragmentacije na nivou peptida 27 Određivanje sekvence proteina spregnutom masenom spektrometrijom 28
(a) Nakon proteolitičke hidrolize rastvor polipeptida se injektuje u maseni spektrometar (MS-1). Različiti peptidi se sortiraju a samo jedan tip se selektuje za dalju analizu. Selektovani peptid se dalje fragmentiše u kolizionoj ćeliji, između dva masena spektrometra, sudarima sa kolizionim gasom (malom količinom plemenitog gasa kao što je helijum ili argon). m/z odnos svakog fragmenta se meri u drugom masenom spektrometru (MS-2). Mnogi joni koji se dobijaju tokom druge fragmentacije rezultat su raspada peptidne veze. Oni se redom nazivaju b-joni ili y-joni u zavisnosti od toga da li se naelektrisanje peptida zadržalo na N-terminalnom ili C-terminatnom kraju. (b) Tipičan spektar sa pikovima koji predstavljaju peptidne fragmente dobijene iz uzorka jednog malog peptida (10 rezidua). Obeleženi pikovi predstavljaju jone y-tipa. Veliki pik pored y 5 je dvostruko naelektrisani jon i nije deo y-seta. Susedni pikovi se razlikuju za vrednost mase određene amino kiseline. 29 5. Primena mikrotalasa u analizi proteina/peptida Tipična hemijska reakcija može se ubrzati i do 1000 puta pod dejstvom mikrotalasnog zračenja Primer za analizu peptida pod dejstvom mikrotalasa je Akabori reakcija kojom se vrši identifikacija C terminalnog završetka Ovaj pristup može znatno da poboljša stepen proteolize, efikasnost digestije proteina i posledično, njihovu identifikaciju 30
31 6. Elektroforeza Zasnovana na migraciji naelektrisanih proteina u električnom polju Proteini se mogu razdvojiti i vizuelno detektovati (brza procena broja proteina u smeši ili procena stepena čistoće proteina) Omogućava određivanje važnih osobina proteina kao što su izoelektrična tačka i približna molekulska masa Kretanje proteina u gelu, tokom elektroforeze, je u funkciji njegove veličine i oblika 32
Za procenu čistoće i određivanje molekulske masečesto se koristi površinski aktivna materija natrijum dodecil sulfat (eng. Sodium Dodecyl Sulfate SDS) SDS se vezuje za većinu proteina u količini koja je grubo proporcionalna molekulskoj masi proteina Vezani SDS doprinosi ukupnom negativnom naelektrisanju Nastaje sličan odnos mase i naelektrisanja na svakom proteinu Nativna konformacija proteina se menja kada se veže SDS i većina proteina zauzima sličan oblik Elektroforezom uz prisustvo SDS dolazi do razdvajanja proteina gotovo isključivo na osnovu njihove molekulske mase, pri čemu mali polipeptidi brže migriraju Proteini se mogu vizuelno uočiti dodavanjem boje kao što je Coomassie plavo, koja se vezuje za proteine ali ne i za gel 33 Procena molekulske mase proteina Proteini poznate molekulske mase se elektroforetski razdvoje (traka 1). Oni se mogu upotrebiti za procenu molekulske mase nepoznatog proteina 34
Izoelektrično fokusiranje - za određivanje izoelektrične tačke proteina Uspostavlja se ph gradijent tako što se smeša organskih kiselina i baza male molekulske mase raspodeli u gelu pod uticajem električnog polja. Kada se unese smeša proteina, svaki protein će se kretati sve dok ne dostigne ph vrednost koja odgovara njegovoj pi. 35 Dvodimenzionalna elektroforeza - kombinacija izoelektričnog fokusiranja i elektroforeze Dvodimenzionalnom elektroforezom se mogu razdvojiti proteini identične molekulske mase koji se razlikuju po pi vrednostima, ili proteini koji imaju slične pi vrednosti a različite molekulske mase Proteini se prvo razdvajaju pomoću izoelektričnog fokusiranja. Zatim se taj gel polozi horizontalno na drugi, pa se proteini razdvoje pomoću SDS poliakrilamid gel elektroforeze. Horizontalna separacija oslikava razlike u pi vrednostima, dok vertikalna separacija oslikava razlike u molekulskoj masi. 36
37