BELANČEVINE Uvod Belančevine ili proteini su visokomolekulski prirodni proizvodi (prirodni makromolekuli) izgrañeni od α-aminokiselina, koje su meñusobno povezane peptidnim vezama u makromolekulske nizove. Naziv PROTEINI potiče od Grčke reči proteios, što znači PRVI čine osnovu života, ulaze u sastav svih živih bića 1
Peptidi Amidna veza, -NHCO-, se ovde zove peptidna veza Peptidi su amidi dobijeni reakcijom amino-grupa i karboksilnih grupa aminokiselina Peptidi se dele na dipeptide, tripeptide... polipeptide Polipeptidi su molekuli sa MM do 10000 Proteini su molekuli sa MM preko 10000 u izgradnji učestvuje svega oko 20 prirodnih α-aminokiselina R 1 R 2 R 3 R 4 R 5 R n H 2 N-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-... -NH-CH-COOH 2
U izgradnji belančevina, sem amino kiselina, mogu da učestvuju i druga jedinjenja, manje ili više složena, gradeći na taj način složene sisteme u kojima su makromolekulski polipeptidni nizovi spregnuti sa neproteinskim delovima, koji se opštim imenom nazivaju prostetske grupe. Prostetske grupe mogu da budu veoma raznolike i složene, kao što su nukleinske kiseline, bojene materije, lipidi, ugljeni hidrati, fosfatna kiselina ili, pak, metali, tako da se sreće niz tipova složenih belančevina ili, kako je to uobičajeno da se kaže konjugovanih proteina. Aminokiselinski sastav belančevina l. Sve aminokiseline koje se pojavljuju u belančevinama, bez izuzetka, su α -aminokiseline. 2. Sa izuzetkom najjednostavnije aminokiseline koja se pojavljuje u belančevinama (glikokol, glicin, α- aminosirćetna kiselina), sve ostale prirodne aminokiseline sadrže najmanje tri C atoma, koji sačinjavaju jedan zasićeni niz. 3. Isto tako, sa izuzetkom glikokola, drugi C atom prirodnih aminokiselina je asimetričan, tako da su sve optički aktivne i sve imaju L-konfiguraciju. u prirodi - manji broj aminokiselina koje imaju D-konfiguraciju 3
H 2 N C HC COOH R H X X = H, CH 3 ili hetero grupa R = H ili organski ostatak N H 2 COOH C H R I II Pregled aminokiselina Alifatske zasićene nesupstituisane monoamino-monokarbonske kiseline 4
Alifatske oksiamino-monokarbonske kiseline 5
Tioaminokiseline Aromatske aminokiseline 6
Heterociklične aminokiseline Diamino-monokarbonske kiseline 7
Iminokiseline Monoamino-dikarbonske kiseline 8
Fizičko-hemijske karakteristike amino kiselina 1. Slobodne aminokiseline sadrže jednu kiselu i jednu baznu grupu, koje se meñusobno neutralizuju, tako da se aminokiseline praktično pojavljuju isključivo u obliku dipoljona. 2. Rastvaranjem slobodnih aminokiselina u vodi, dolazi do uspostavljanja ravnoteže izmeñu slabo kisele NH 3+ grupe, slabo bazne COO - grupe i H + jona iz vode, a ph vrednost na kojoj dolazi do uspostavljanja ove ravnoteže naziva se izoelektrična tačka. + H 3 N COOH C H R + H 3 N COO - COO -.. C H H 2 N C H R R katjon (I) dipol-jon (II) anjon (III) 3. Aminokiseline su amfoterna jedinjenja i mogu da grade soli kako sa kiselinama tako i sa bazama, te im stoga i odgovaraju dve konstante disocijacije, kisela i bazna, koje odgovaraju kiselosti NH 3+ grupe i baznosti COO - grupe (a ne konstantama disocijacije COOH odnosno NH 2 grupe). I= ½ (pka-pkb + 14) 9
4. Stvaranje dipol-jona kod aminokiselina može se sprečiti samo u slučaju da se blokira bilo karboksilna bila amino grupa. 5. α-aminokiseline su sposobne da grade komplekse sa teškim metalima tipa helata način za izdvajanje i prečišćavanje aminokiselina R O NH 2 O Cu + O N H 2 O R Kompleks α-aminokiseline sa jonom bakra 6. Aminokiseline su poznate po brojnim bojenim reakcijama: ninhidrinska reakcija ima opšti značaj ovu reakciju ne pokazuju aminokiseline: prolin i oksiprolin (imino, a ne amino grupa) O O O OH NH 2 H H + R C COOH + R C O + NH 3 + CO 2 OH H OH O ninhidrin redukovani ninhidrin 10
O O OH OH + NH 3 + HO H O O ninhidrin oksidovani oblik O O ninhidrin redukovani oblik N + 3H 2 O OH O plavo-ljubičasti kompleks Peptidna veza i njene karakteristike Stereohemijske karakteristike R1 O R2... N C C N C CO... H H H H Peptidna veza 11
a) trans b) cis (retko) Valentni uglovi i rastojanja peptidne veze C-N veza za 0,015 nm kraća od uobičajene jednostruke C-N veze C O veza za 0,002 nm duža od C=O veze (aldehidi ili ketoni) Cα.. C' N O I H Cα C α + _ C' N O kod kristalnih sistema sa jednom ili više peptidnih veza - hibridna struktura, učešće granične strukture I sa približno 60% i granične strukture II sa oko 40%, Iako ne postoji mogućnost slobodne rotacije oko same peptidne veze, rotacija oko veza C α -C prvog, kao i N-C α drugog ostatka aminokiseline nije ograničena, što znači da planarni fragmenti mogu meñusobno zauzimati različite prostorne rasporede. II H Cα 12
Ravni dveju susednih planarnih peptidnih veza koje se sučeljavaju na istom α-c atomu mogu da zauzmu različite prostorne rasporede, a u zavisnosti od vrednosti azimutalnih uglova ϕ i ψ, koji inače definišu rotaciju oko veza C α -C' odnosno N-C α. C N Cα Prostorni odnos planarnih fragmenata peptidnih veza, koji se sučeljavaju na istom α-c atomu. 13
Mogućnost da planarni fragmenti peptidnih veza zauzimaju različite rasporede u odnosu na α-c atome, i meñusobno, s jedne strane, kao i sposobnost karakterističnog ostatka aminokiseline R sa α C atomom, s druge strane, pruža velike mogućnosti meñusobnog prostornog podešavanja i planarnih fragmenata i karakterističnih ostataka. Prostorni raspored peptidnih veza i aminokiselinskih ostataka R Definisanje peptida Definisanje belančevina složeno 20 aminokiselina aminokiselinski sastav-kvalitativan i kvantitativan - nedovoljno struktura i prostorni oblici makromolekulskih nizova 1. Odreñivanje krajnjih aminokiselina 2. Postupna odgradnja pojedinih aminokiselina 14
Odreñivanje krajnjih aminokiselina DNP derivat aminokiseline je karakteristično žuto obojen, dok dansil derivat intenzivno fluorescira Nedostatak Razlaganje peptida pa se ne može više koristiti Samo podaci o jednoj grupi! 15
Postupna odgradnja pojedinih aminokiselina Reakcija po Edmanu Reakcija sa bromcijanom Ostale specifične reakcije raskidanja peptidne veze Reakcija po Edmanu (Edman) Fenilsenfno ulje 16
Do 100 a.k. ostataka Ograničenje-gubitak supstance Reakcija sa bromcijanom Dobijanje manjih fragmenata Lakša analiza R R'-NH-CH-CO-NH-CH-CO-... R R'-NH-CH-CO-NH-CH-CO-... metionin CH 2 CH 2 S CH 3 N C Br CH 2 + CH 2 S CH 3 C N R'-NH H + N O R CH-CO-... R'-NH O O R + H 2 N-CH-CO-... + CH 3 -S-C N Lakton homoserina slično reaguje i I-CH 2 -CONH 2 17
Ostale specifične reakcije raskidanja peptidne veze Pregled peptidnih veza koje se razlažu pod dejstvom pojedinih enzima Enzim Tripsin Himotripsin Pepsin Papain Optimalna ph vrednost dejstva enzima 7,8 8,0 1-2 7,0 Peptidne veze koje enzim specifično razlaže X-Lys-X; X-Arg-X Phe-X; Tyr-X X-Tyr; X-Phe; X-Leu- X; X-Gly-X G1y-G1n;Cys-SO 3 H- Ser; Gln-Leu; Gly-Asn Uspostavljanje peptidne veze Biosintetski - enzimski Hemijski - acilovanje ili zagrevanje R 1 H 2 N-CH-COOH + R 2 H 2 N-CH-COOH O C R CH 1 NH 2 H N CH R2 COOH O H N R R 1 2 N H O diketopiperazin dipeptid 18
19
Sinteza peptida C 6 H 5 CH 2 OCOCl + + H - 3 NCH 2 COO karbobenzoksi-hlorid C 6 H 5 CH 2 OCO-NHCH 2 COOH karbobenzoksiglicin SOCl 2 C 6 H 5 CH 2 OCO-NHCH 2 COCl hlorid karbobenzoksiglicina Sinteza peptida C 6 H 5 CH 2 OCO -NHCH 2 COCl + + H 3 NCHCOO - CH 3 C 6 H 5 CH 2 OCO-NHCH 2 CO -NHCHCOOH CH 3 karbobenzoksiglicilalanin 20
Sinteza peptida C 6 H 5 CH 2 OCO-NHCH 2 CO -NHCHCOOH H 2,Pd CH 3 + - H 3 NCH 2 CO -NHCHCOO + C 6 H 5 CH 3 + CO 2 CH 3 Gly-Ala Zaštitne grupe pri sintezi peptida neophodno je da se zaštitna grupa lako uspostavlja, pri čemu je poželjno da i odgovarajući reaktivi budu pristupačni. zaštitna grupa mora da bude stabilna za vreme reakcije uspostavljanja peptidne veze. posle obavljenih reakcija poželjno je da se zaštitna grupa otcepi pod blagim uslovima, i to tako da ne doñe do narušavanja tek uspostavljene peptidne veze. 21
Aktivacija COOH grupe pri sintezi peptida Najčešće-prevoñenje u hlorid kiseline nije uvek pogodna, nepoželjne sporedne reakcije Upotreba dicikloheksilkarbodiimida R 1 Z-NH-CH-COOH + H 2 N-CH-CO-Y R dicikloheksilkarbodiimid (DCC) 2 N C N (DCC) R 1 R 2 Z-NH-CH-CO-NH-CH-CO-Y + zaštićeni peptid NH-CO-NH dicikloheksilkarbamid Uspostavljanje peptidne veze na čvrstom nosaču (Merifildov postupak) P kopolimer stirendivinilbenzen + H 3 C-O-CH 2 Cl hlormetil-metiletar SnCl 4 /hlormetilovanje prednost-velika brzina (6 ak u danu) nema problema po pitanju rastvorljivosti operacije su jednostavnije i lako se izvode proces može da se automatizuje P CH 2 Cl R 1 _ + O-CO-CH-NH-t-Boc CH 3 H 3 C O CH 3 O hlormetilovana smola t-boc-aminokiselina t-boc (t-butiloksikarbonil) P R 1 CH 2 -O-CO-CH-NH-t-Boc t-boc-aminoacil polimer HCl/CH 3 COOH ili CF 3 COOH/CH 2 Cl 2 odstranjivanje t-boc grupe 22
P R 1 + CH 2 -O-CO-CH-NH 3 Cl _ Et 3 N/CH 2 Cl 2 neutralizacija P R 1 CH 2 -O-CO-CH-NH 2 P R 2 + t-boc-nh-ch-cooh DCC/CH 2 Cl 2 R R 1 2 CH 2 -O-CO-CH-NH-CO-CH-NH-t-Boc uspostavljanje peptidne veze t-boc-dipeptidil polimer HBr/CF 3 COOH/HF otcepljivanje sintetizovanog peptida sa polimera P CH 2 Br R2 R 1 + H 2 N-CH-CO-NH-CH-COOH brommetilovani polimer dipeptid Nedostaci otežano razdvajanje reakcije ne idu do kraja, ostaju pratioci Efekat faznog prinosa na ukupan prinos u sintezi peptida Broj ostataka a.k. u finalnom polipeptidu Ukupan prinos finalnog peptida (%), kada je prinos svake faze: 96,8% 98% 99,8% 11 21 66 44 80 64 98 96 Za par dana 31 29 51 94 51 13 32 90 100 1,7 11 82 Sinteza u ćeliji belančevina od 100 a.k. za 5 s, uz potpunu tačnost 23
Sinteza polipeptida iz fragmenata sinteza glukagona (proteinski hormon pankreasa), Vinš fragment l: AK 1-6 His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe fragment 2: AK 7-15 Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp fragment 3: AK 16-21 Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp fragment 4: AK 22-26 Phe-Val-Gln-Trp-Leu fragment 5: AK 27-29 Met-Asn-Thr Za uspostavljanje peptidnih veza izmeñu pojedinih fragmenata korišćena je kombinacija dicikloheksilkarbodiimida i N-oksisukcinimida Z 1 -NH-AK 22-26 COOH + H 2 N-AK 27-29 COO-t-Bu fragment 4 fragment 5 Z 1 -NH-AK 22-29 COO-Y Z 1 -NH-AK 16-21 COOH + H 2 N-AK 22-29 COO-t-Bu fragment 3 Z 1 -NH-AK 16-29 COO-Y Z 1 -NH-AK 7-15 COOH + H 2 N-AK 16-29 COO-t-Bu fragment 2 Z 1 -NH-AK 7-29 COO-Y 24
Z 2 -NH-AK 1-6 COOH + H 2 N-AK 7-29 COO-t-Bu fragment 1 Z 2 -NH-AK 1-29 COO-t-Bu zaš. polipeptid otcepljivanje zaš. grupa (CF 3 COOH) H 2 N-AK 1-29 COOH glukagon Z 1 2-nitrobenzensulfonil ostatak, Z 2 N-diadamantiloksikarbonil ostatak, t-bu terc- butil ostatak. Dejstvom trifluorsirćetne kiseline otcepljene su zaštitne grupe i kao krajnji proizvod je dobijen sirovi glukagon, koji odgovara sledećoj strukturi: fragment 1 fragment 2 20 25 29 -Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-COOH 1 5 10 15 H 2 N-His-Ser-G1n-G1y-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Aspfragment 3 fragment 4 fragment 5 izbegnuta otežana rastvorljivost i usporavanje brzine reakcije opasnost od racemizacije povećana 25
Definisanje belančevina Saznanja o aminokiselinskom sastavu su neophodna, ali ne i dovoljna da bi se na osnovu samo ovih podataka mogla definisati bilo koja belančevina. Da bi se došlo do odgovora, neophodno je poznavanje veličine molekula, njihovih struktura i meñusobnih odnosa svih prisutnih aminokiselinskih ostataka, kao i prostornog oblika u celini, ali i u pojedinostima. Odreñivanje molekulske veličine Krioskopska i ebulioskopska metoda, su praktično neprimenljive za utvrñivanje mase zbog slabe rastvorljivosti belančevina Od hemijskih metoda za odreñivanje veličine makromolekulskog sistema često se koristi metoda kvantitativnog odreñivanja krajnjih grupa MALDI/MS (matrix assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry) ESI MS (electron spray ionisation mass spectrometry) 26
Odreñivanje primarne strukture belančevina Senger - metodom obeležavanja slobodnih NH 2 grupa krajnjih aminokiselina dinitrofenil- (DNP-) ostatkom, utvrdio krajnje amino grupe kod insulina Gly i Phe Parcijalnom hidrolizom i identifikacijom a.k. utvrñen sastav insulina S S 5 10 15 20 G-I-V-E-Q-C-C-A-S-V-C-S-L-Y-Q-L-E-N-Y-C-N niz A S S S S 5 10 15 20 25 30 F-V-N-Q-H-L-C-G-S-H-L-V-E-A-L-Y-L-V-C-G-E-R-G-F-F-Y-T-P-K-A niz B Primarna struktura insulina Odreñena kombinacijom hemijskih i enzimskih metoda MM=5733 g/mol Razlike u aminokiselinskom sastavu niza A insulina različitog porekla Poreklo insulina Aminokiseline u položajima 7-10 niza A insulina Goveče Svinja Ovca Konj Kit 7 8 9 10 Cys Ala Ser Val Cys Thr Ser Ile Cys Ala Gly Val Cys Thr Gly Ile Cys Thr Ser Ile 27
Potpuno prostorno definisanje belančevina primarna struktura- regulisana kovalentnim vezama- nedovoljna za definisanje belančevina; prostorno definisanje pravilno izgrañenih fragmenata sekundarna struktura; prostorno definisanje jedinstvenih makromolekulskih nizova, uključujući i pravilno i nepravilno izgrañene fragmente tercijarna struktura; prostorno definisanje makromolekulskih sistema, izgrañenih od više nizova meñusobno povezanih u agregate nekovalentnim vezama kvaternerna struktura. 28
Prostorno definisanje pravilno izgrañenih fragmenata sekundarna struktura primarna struktura - regulisana kovalentnim vezama (dužina i uglovi) sekundarna struktura regulisana diedralnim uglovima ϕ i ψ vrednosti ovih uglova su pozitivne za rotaciju u smeru kretanja kazaljke na satu i negativne ukoliko je rotacija suprotna. Spirala - okarakterisana korakom zavojnice, p, i brojem aminokiselinskih ostataka po jednom koraku zavojnice, n ( visina pojedinog a.k. ostatka, d) Prostorno definisanje pravilno izgrañenih fragmenata sekundarna struktura dve intramolekulske vod. veze kod α-keratina, miozina u zbijenom stanju, hemoglobina. 29
30
Strukturni parametri najvažnijih prostornih oblika spirala belančevina α-spirala 3 10 -spira1a 2 γ-traka spirala poliprolina antiparalelni β-naborani niz ϕ 132 (113 ) 131 (106 ) 105 103 40 ψ 123 (136 ) 154 (176 ) 250 326 315 n 3,61 3,00 2,00 3,00 2,00 d, nm 0,150 0,200 0,280 0,312 0,347 p,nm 0,541 0,600 0,560 0,936 0,695 vrednosti u zagradi su iz drugih izvora 31
Kod fibrilarnih belančevina se najčešće susreću tri tipa struktura: α-spirala, za koju je tipičan predstavnik vlakno vune, (i epidermin, miozin i fibrinogen pojavljuju se u ovom obliku, kao i većina keratina), β-naborani list, ranije poznat i kao β- keratinska struktura, predstavlja sledeći prostorni oblik belančevina, čiji je najtipičniji predstavnik fibroin svile (u ovom obliku susreće i keratin ptičjeg perja kao i neki skeletni delovi životinja koje ne pripadaju sisarima) i kolagen kože i vezivnih tkiva koji pripada trećoj grupi fibrilarnih belančevina za koje je karakteristična trojna spirala (poliprolin). Struktura β-naboranog lista i fibroin Fibroin svile je izgrañen od antiparalelno orijentisanih polipeptidnih nizova, koji uspostavljanjem intermolekulskih vodoničnih veza obrazuju strukturu naboranog lista kako su to definisali Poling i Kori, 1951. g. Gly:Ala:Ser=3:2:1 Način uspostavljanja vodoničnih veza kod β-naboranog niza. Karakteristični aminokiselinski ostaci R su orijentisani upravno na pravac rasprostiranja niza. 32
Šematski prikaz naizmeničnog prostornog uklapanja ostataka glikokola i alanina, antiparalelno orijentisanih slojeva fibroina svile Obezbeñena maksimalna zbijenost reda minimalna elastičnost i izduženje, velika jačina na kidanje Antiparalelna Beta struktura Paralelna 33
α-keratin u vlaknu vune, u kosi stotine mikrofibrila 10 protofibrila makrofibrile (200 nm) desna vlakno 8 nm 2 nm vuneno vlakno može da istegne na gotovo dvostruku dužinu zahvaljujući postojanju spirala, i tom prilikom, umesto strukture α-spirale uspostavlja se izdužena struktura β-naboranog lista elastičnost disulfidni mostovi Trojna spirala kolagena kolagen je čvrst i slabo istegljiv fibrile kolagena - mogu da budu na veoma raznovrsne načine povezane u celine u koži govečeta u rožnjači oka osnovna strukturna jedinica kolagena je tropokolagen MM 285000 g/mol u obliku štapića dužine 300 nm i prečnika 1,5 nm. 34
Primarna struktura fragmenata kolagena (ostaci aminokiselina su označeni usvojenim sistemom sa jednim simbolom) 10 20 G-Y-D-E-K-S-A-G-V-S-V-P-G-P-M-G-P-S-G-P-R-G-L-P-G-P- 30 40 50 -P-G-A-P-G-P-Q-G-F-Q-G-P-P-G-E-P-G-E-P-G-A-S-G-P-M-G- 60 70 -P-R-G-P-P-G-P-P-G-K-N-G-D-D-G-E-A-G-K-P-G-R-P-G-Q-R- 80 90 100 -G-P-P-G--P-Q-A-R-G-L-P-G-T-A-G-L-P-G-M-K-G-H-R-G-F- 110 120 -S-G-L-D-G-A-K-G-N-T-G-P-A-G-P-K Trojna spirala kolagena makromolekul se sastoji iz trojne spirale - tri pojedinačne spirale koje se meñusobno obavijaju i koje su povezane vodoničnim vezama dve meñusobno identične - α 1 -nizovi treća slična - α 2 -niz MM nizova 95000 g/mol uspostavljanja spirale poliprolinskog tipa 35
Šematski prikaz isečka trojne spirale kolagena Pojedinačne poliprolinske spirale se uvijaju ulevo, dok se trojna spirala uvija udesno Trojna spirala kolagena svi ostaci glikokola orijentisani ka unutrašnjosti trojne spirale omogućeno gušće pakovanje pojedinačnih makromolekulskih nizova ostaci prolina okrenuti ka spoljašnjosti trojne spirale dva tipa levih spirala spirala - poliprolin I (10 a.k. na tri zavoja, cis peptidna veza) spirala poliprolin II (3 a.k. po zavoju trans peptidna veza) poliprolinska spirala izduženija od α-spirale 36
Etapno obrazovanje kolagenskih vlakana Prostorno definisanje makromolekulskih nizova tercijarna struktura belančevina Prostorna struktura fibrilarnih belančevina kod vlakana vune, svile i kolagena kože uspostavljanje α-spirale, β- naboranog lista ili poliprolinske spirale ni kod jedne od ovih belančevina nije zapažena potpuna pravilnost prostorne grañe makromolekulskih nizova. na osnovu hemijskih istraživanja - makromolekulski nizovi nisu izgrañeni jedinstvenim načinom smenjivanja pojedinih aminokiselina ili pojedinih fragmenata, već se susreću kraći, pravilno izgrañeni fragmenti čiji ukupni udeo obično ne prelazi 60% od ukupne mase belančevine, dok ostatak makromolekulskih nizova predstavljaju nesreñena područja. 37
Prostorna struktura globulastih belančevina Pravilno izgrañeni fragmenti se pojavljuju, sem kod fibrilarnih, i kod globulastih belančevina. Za razliku od fibrilarnih, kod globulastih belančevina u istom polipeptidnom nizu mogu da se sresti i različiti tipovi sekundarnih struktura (α-spirala, 3 10 - i π-spirala, β-naborani list), pored nesreñenih područja. Dva tipa β-pregiba (I i II) II Prostorni raspored lizozima koji sadrži 6 spiralnih fragmenata (40% mase belančevine) i 2 β-naborana sloja sa 6 antiparalelnih β-nizova i 6 β-pregiba 38
Primarna struktura lizozima belančevine kokošijeg jajeta sa uspostavljenim disulfidnim vezama u položajima 6-127, 30-115, 64-80 i 76-94 Uprošćeni prikaz tercijarne strukture molekula lizozima koji obuhvata samo α-c atome 39
Ponašanje globulastih belančevina u rastvorima Dejstvom rastvarača se narušavaju kontakti izmeñu pojedinačnih makromolekulskih nizova pri čemu se uspostavljaju novi kontakti makromolekula belančevina sa molekulima rastvarača. Zadržavaju svoj karakteristični prostorni aranžman, u neutralnim rastvaračima (dimetilformamid, hloroform, etilendihlorid itd.), ili pak u vodenim rastvorima odreñene ph vrednosti. Delovanjem na belančevine rastvarača sposobnih za interakcije, kao što su npr. dihlor- ili trifluorsirćetna kiselina, zatim promenom ph vrednosti vodenih rastvora ili promenom temperature, pokazalo se da su moguće i takve promene koje se pripisuju promenama prostornog rasporeda. Denaturisanje belančevina narušavanjem sekundarnih veza slučajni raspored - denaturisane belančevine Denaturisanje može da se ostvari različitim uticajima, kao što su organski rastvarači, soli, karbamid, guanidin-hlorhidrat, LiCl, KSCN, CaCl 2, NaClO 4, promena vrednosti ph, detergenti, joni teških metala, kao i pod uticajem toplote; usled oksidacione ili redukcione razgradnje disulfidnih veza, oksidacijom -SH u -SO 3 H grupe ili pak supstitucijom funkcionalnih grupa. 40
Denaturacija Nativni protein Parcijalno denaturisan Nekontrolisano hlañenje Denaturisan Hlañenje pod kontrolisanim uslovima Neaktivan Nativni protein Denaturisanje i regenerisanje ribonukleaze Primarna struktura ribonukleaze (levo) i tercijarna (desno) sa disulfidnim vezama u položajima 26-84, 40-95, 58-110 i 65-72 41
Šematski prikaz denaturisanja i regenerisanja ribonukleaze sati t=10 h Prostorna organizacija belančevina i biološka aktivnost Naziv,,domen" za karakteristične, manje ili više složene funkcionalne fragmente. Funkcionalni domeni se odlikuju svojom biološkom aktivnošću, iako ne moraju da budu strukturno potpuno definisani, dok su strukturni domeni strukturno potpuno definisani (α-spirala, β-struktura), bez obzira na njihovu biološku aktivnost. Kako funkcionalni domeni mogu da premašuju veličinu strukturnih domena, nije isključena mogućnost da jedan funkcionalni domen obuhvata više od jednog strukturnog domena. Čest je slučaj da se,,aktivni centar" funkcionalnog domena nalazi na granici dva strukturna domena. Glutation reduktaza 42
Agregati. Kvaternerna struktura meñusobno povezivanje različitih polipeptidnih nizova disulfidni mostovi (keratin i druge belančevine), estarske ili veze slične estarskim (kolagen), Vodonične veze, Vandervalsove sile jonske veze osnov meñusobnog povezivanja pojedinačnih polipeptidnih nizova u molekulske agregate: dimere, trimere, tetramere, heksamere oligomere, i multimere. makromolekuli belančevina se samo izuzetno pojavljuju kao izolovani nizovi Agregati. Kvaternerna struktura Fibrilarne belančevine makroskopski vidljivi oblici vlakno vune, fibrion svile, kolagen kože definisane dužinom, prečnikom, debljinom vlakna, jačinom na kidanje, izduženjem... Globulaste belančevine sferne ili manje ili više izdužene čestice 43
Kvaternerna struktura Uporedni šematski prikaz oblika i veličina nekih globulastih belančevina Molarne mase nekih belančevina odreñene merenjem brzine sedimentacije u ultracentrifugi A. Molarne mase belančevina koje se pokoravaju Svedbergovom pravilu Belančevina Molarna masa, g/mol M/17500 Mioglobin Mlečni albumin Citohrom c Pepsin Kazein Hemoglobin Edestin Serum-albumin 16900 17400 15600 35500 33600 34300 49500 70000 B. Molarne mase belančevina koje se ne pokoravaju Svedbergovom pravilu ~1 ~1 ~1 ~2 ~2 ~2 ~3 ~4 Belančevina Molarna masa, g/mol M/17500 Gliadin Hordein Zein Lakto-globulin Albumin jajeta Žuti ferment Serum-globulin 27500 27500 40000 41500 44000 82000 167000 ~1,5 ~1,5 ~2,5 ~2,5 ~2,5 ~4,5 ~9,5 Svedbergovo pravilo - prosečne veličine osnovnih jedinki koje izgrañuju složene sisteme belančevina su približno iste i odgovaraju umnošcima molarne mase od oko 17500 g/mol. 44
Hemoglobin Disocijacija molekulskih kompleksa belančevina Belančevina koja se sastoji samo od dva polipeptidna niza može da se razloži (disocira) na pojedinačne polipeptidne nizove. Ukoliko je broj polipeptidnih nizova koji su ugrañeni u kompleksni sistem belančevine veći od dva, disocijacija ovakvih sistema može da se odigra i na različite načine: da se kompleks odmah razloži do pojedinačnih polipeptidnih nizova, da razlaganjem složenog sistema nastaju manji, ali još uvek složeni sistemi-subjedinice, koji se u narednom stupnju razlažu do pojedinačnih polipeptidnih nizova, da razlaganjem složenog sistema nastaju kako subjedinice tako i pojedinačni polipeptidni nizovi, pri čemu subjedinice i dalje mogu da se razlažu. 45
Disocijacija molekulskih kompleksa belančevina kompleks belančevine = x polipeptidnih nizova kompleks belančevine = y subjedinica = y x polipeptidnih nizova kompleks belančevine = y subjedinica + z polipeptidnih nizova y subjedinica = y x polipeptidnih nizova Samo razlaganje je povratna reakcija, što znači da otklanjanjem uzroka razlaganja dolazi do ponovne asocijacije polipeptidnih nizova u subjedinice odnosno kompleksnu belančevinu. Ovaj proces poznat je i pod imenom agregacija, a samo razlaganje bi prema tome bilo dezagregacija. Veze koje održavaju kvaternernu strukturu 46
Kvaternerne strukture značajnih belančevina Za proučavanje i definisanje kvaternerne strukture koriste se sledeće metode: Rentgenostrukturna analiza koja pruža mogućnost čak i pri manjoj moći razlaganja da se u prostornom razmeštaju uoče pojedine subjedinice, čak i polipeptidni nizovi. Elektronska mikroskopija omogućava da se prostorni rasporedi pojedinih subjedinica učine vidljivim. Analiza krajnjih grupa pruža mogućnost da se odrede krajnje grupe svakog polipeptidnog niza. Metoda parcijalne enzimske hidrolize ili selektivne razgradnje metodom sa bromcijanom omogućuje da se utvrdi broj polipeptidnih nizova. Denaturisanje i utvrñivanje broja subjedinica ili peptidnih nizova nastalih posle denaturisanja Svedbergovom metodom odreñivanja brzine sedimentacije u ultracentrifugi, omogućava da se utvrdi broj subjedinica ili polipeptidnih nizova. Ukoliko su polipeptidni nizovi meñusobno različiti, postoji mogućnost da se posle denaturisanja izvrši razdvajanje metodom elektroforeze, protivstrujne raspodele ili hromatografski. Broj subjedinica može se utvrditi i primenom metode izotopa. Razjašnjenju kvaternerne strukture enzima može se doprineti odreñivanjem broja mesta vezivanja supstrata. 47
Transportne. belančevine Najbolje proučene: hemoglobin i mioglobin visoka konc.soli ph>9.0/ph<<4.7 α niz 141 a.k. β niz 146 a.k. osim α 2 β 2 postoje i α 2 δ 2 i α 2 γ 2 48
Kontakti izmeñu subjedinica oksihemoglobina i dezoksihemoglobina Vrsta hemoglobina Kontaktne subjedinice Broj hidrofobnih veza Broj vodoničnih veza Broj jonskih veza Oksihemoglobin α 2 β 2 α 2 β 2 110 80 5 1 - - α 2 β 2 α 2 β 2 - - - - - - Dezoksihemoglobin α 2 β 2 α 2 β 2 98 69 5 1-1 α 2 β 2 - - 2 α 2 β 2 - - 1 Indeksi 1 i 2 predstavljaju redne oznake nizova. vezivanjem kiseonika dolazi do promene kvaternerne strukture oksihemglobina u odnosu na dezoksihemoglobin alosterija 49
Složene belančevine (konjugovane belančevine ili proteidi) Podela prema hemijskoj strukturi neproteinskog dela: Glikoproteidi Lipoproteidi Nukleoproteidi Fosfoproteidi Metaloproteidi Hemoproteidi Flavoproteidi Glikoproteidi sadrže polisaharide ulaze u sastav vezivnog i koštanog tkiva kao i u sastave ćelijskih membrana na primer, fibronektin i proteoglikani su značajne komponente ekstracelularnih prostora koji okružuju ćelije mnogih tkiva životinja. sastavni deo i drugih složenih prirodnih proizvoda kao što su biljne sluzi, lektini, ricin, arabin i sl. 50
Lipoproteidi sadrže lipidne molekule imaju važnu biohemijsku ulogu u organizmu ulaze u sastav krvne plazme mitohondrija, plastida, ribozoma i drugih ćelijskih struktura Nukleoproteidi sadrže nukleinske kiseline imaju veliku ulogu u skladištenju i prenosu genetskih informacija nalaze se uglavnom u jezgru ćelija virusi, pa čak i hromozomi su kompleksne nukleo-proteinske strukture pojedini enzimi su nukleoproteidi 51
Fosfoproteidi proteinska organska jedinjenja pri čemu je fosfatna grupa najčešće esterifikovana hidroksilnim grupama serina, treonina ili tirozina. na primer, kazein, osnovna belančevina mleka, sadrži mnoge fosfatne strukture i služi kao izvor fosfora pri rastu dece. Metaloproteidi kompleksna jedinjenja belančevina i jona metala (gvožñe, cink, bakar) često se nazivaju enzim-proteini ulaze u sastav nekih enzima kao što su katalaza, peroksidaza i sl. katalaza 52
Hemoproteidi sadrže porfirinski prsten i predstavljaju u suštini podklasu metaloproteida prostetska grupa hem se najčešće sreće kod hemoglobina, mioglobina i citohroma. hem se sastoji od protoporfirina i gvožñe(ii)-jona. _ COO _ COO N N Fe 2+ N N mioglobin 153 a.k. Flavoproteidi sadrže flavin imaju značajnu ulogu u oksido-redukcionim procesima u organizmu spadaju u grupu koenzima najvažniji flavinski koenzimi su flavin-mononukleotid i flavin-adenin-dinukleotid najznačajniji flavoproteidi su oni koji sadrže riboflavin. 53