BIOKEEMIA 4: MAKROERGILISED ÜHENDID (ATP) BIOLOOGILINE OKSÜDATSIOON OKSÜDEERIV FOSFORÜLEERIMINE OKSÜDATIIVNE STRESS

Transcript

1 BIOKEEMIA 4: MAKROERGILISED ÜHENDID (ATP) BIOLOOGILINE OKSÜDATSIOON OKSÜDEERIV FOSFORÜLEERIMINE OKSÜDATIIVNE STRESS OLULISEMATE AINEVAHETUSRADADE ÜLDISELOOMUSTUS

2 REAKTSIOONI SUUND JA VÕIMALIKKUS Biokeemilise reaktsiooni suuna ja võimalikkuse määrab vaba energia muut: Negatiivse vaba energia muutusega reaktsioon kulgeb spontaanselt, näit. kataboolsed reaktsioonid) Positiivse vaba energia muutusega reraktsioon ei kulge spontaalselt (anaboolsed reaktsioonid) Vaba energia muut ei sõltu reaktsiooni mehhanismist, vaid lähteainete ja produkti vabaenergia erinevusest Lisaenergia vajadus Produkt +ΔG Vaba energia Substraat ΔG = 0 Tasakaal Spontaanne Produkt Produkt -ΔG Reaktsiooni kulg

3 REAKTSIOONI VABA ENERGIA MUUT (ΔG) Reaktsiooni ΔG sõltub reageeritavate ühendite ja produktide kontsentratsioonist, temperatuurist, ph-st, rõhust: ΔG = ΔGº + RT lnk A + B C + D K = [C][D] [A][B] Vaba energia standardmuut ΔGº : Konstantne ja defineeritav iga reaktsiooni jaoks tingimustel: Reageeritavate ühendite kontsentratsioon 1M ph 7 Temperatuur 25 ºC (298K) ΔGº mõõtühühik on kj/mool või kcal/mool (4.18 J = 1 cal): 1 kalor (cal) on energia, mis kulub 1 grammi vee soojendamiseks 1 ºC võrra (14.5 ºC kraadilet 15.5 ºC kraadile) 1 džaul (J) on energia hulk, mis kulub keha liigutamiseks 1 meetri võrra rakendades sellele jõudu 1 njuuton

4 REAKTSIOONIDE JADA VABA ENERGIA MUUT Reaktsioonide jada puhul on protsessi üldine vaba energia muut võrdne individuaalsete protsesside vaba energia muudu summaga: A B + C ΔGº = +5 kcal/mool B D ΔGº = -8 kcal/mool A C + D ΔGº = -3 kcal/mool Termodünaamiliselt ebasoodsa reaktsiooni kulgemist soodustab temaga seostunud termodünaamiliselt soodne reaktsioon

5 MAKROERGILISED ÜHENDID Makroergiline ühend on madalmolekulaarne orgaaniline ühend, mis osaleb keemilise energia salvestajana ja ülekandjana bioloogilistes süsteemides Makroergiliste ühendite sideme hüdrolüüsi vaba energia stanardmuut on suur: Üle -25 kj/mool Põhiesindajad on makroergilised fosfaadid: ATP GTP UTP CTP ADP Kreatiinfosfaat 1,3-bisfosfoglütseraat Fosfoenoolpüruvaat

6 ADENOSIINTRIFOSFAAT (ATP) ATP on nukleotiid, mis koosneb adeniinist, riboosist ja trifosfaadist ATP aktiivne vorm on tavaliselt seotud kompleksis Mg 2+ või Mn 2+ iooniga O O O N NH 2 γ β α O P O P O P OCH 2 O O O O N N N Mg 2+ HO OH

7 ATP HÜDROLÜÜSI VABA ENERGIA STANDARDMUUT ATP fosfoanüdriidsideme hüdrolüüsil vabaneb suur hulk energiat: ATP + H 2 O ADP + P i + H + ΔGº = -7.3 kcal/mool (-30.5 kj/mool) ATP + H 2 O AMP + PP i + H + ΔGº = kcal/mool (-45.6 kj/mool) ATP hüdrolüüsil vabanenud energia kasutatakse metaboolsetes protsessides termodünaamiliselt ebasoodsa reaktsiooni tasakaalu nihutamiseks: A B ΔGº = +4 kcal/mool A + ATP + H 2 O B + ADP + P i + H + ΔGº = -3.3 kcal/mool

8 ATP UNIVERSAALSUS ENERGIA ÜLEKANDJANA ATP asub bioenergeetilise skaala universaalsel positsioonil: Fosfoenoolpüruvaadi, 1,3-bisfosfoglütseraadi ja kreatiinfosfaadi hüdrolüüsi vaba energia muut on tunduvalt suurem ATP omast: Nende fosfaatide fosforüülgruppi saab üle kanda ADP-le sünteesimaks ATP-d Tekkinud ATP kannab fosforüülgrupi edasi mittemakroergilistele biomolekulidele, mis aktiveeruvad ATP keskne positsioon bioenergeetilisel skaalal teeb ATP universaalseks energia ülekandjaks Katabolismi ja anabolismi energeetiline seostatus realiseerub ATP kaudu: Kataboolsete lõhustumisprotsesside käigus toimuvad suured vaba energia muudud kasutatakse ATP sünteesiks ATP kasutatakse omakorda biomolekulide sünteesiks, lihaskontraktsiooniks, ainete aktiivseks transpordiks, närviimpulsi ülekandeks

9 FOSFOENOOLPÜRUVAAT JA KREATIINFOSFAAT O O P O H 2 C O C C O O O CH 3 H O P N C N CH 2 C + O NH 2 O O Fosfoenoolpüruvaat: ΔGº = kcal/mool Kreatiinfosfaat: ΔGº = kcal/mool

10 ATP TSÜKKEL Biosünteesid Ainete aktiivne transport Lihaskontraktsioon Närviimpulsi teke/levik Signaali amplifitseerumine ATP ADP Biomolekulide oksüdatsioon H 2 O CO 2 Substraadid O 2

11 ATP TSÜKLI EFEKTIIVSUS ATP on organismi kiire energia varu: ATP kulutatakse rakus tavaliselt minutite jooskul tema sünteesi hetkest Inimorganismis on ca 100 g ATP-d, kuid ööpäeva jooksul kulutab inimene ca 40 kg ATP-d: Üks molekul ATP-s retsükleerub üle 1000 korra ööpäevas Füüsilise harjutuse käigus kulub kuni 0.5 kg ATP-d minutis: 2-tunnise jooksu käigus kulub ca 60 kg ATP-d Lihases on kreatiinfosfaat aktiivne fosforüülpuhver: Kreatiinfosfaadi fosforüügrupil on kõrgem ülekande potsentsiaal võrreldes ATP omaga

12 ATP ALLIKAD FÜÜSILISE KOORMUSE KORRAL ATP Aeroobne metabolism Energia Kreatiinfosfaat Anaeroobne metabolism Sekundid Minutid Tunnid

13 KATABOLISMI JA ANABOLISMI ENERGEETILINE SEOSTATUS Anabolism (biosüntees): redutseeriv NADPH NADP ATP ADP Katabolism (lõhustumine): Oksüdatiivne H 2 O CO 2 NH 3 Toitained O 2

14 NADPH ON REDUTSEERIVAS BIOSÜNTEESIS PEAMINE ELEKTRONIDE DOONOR Enamus biosünteesi lähteaineid on rohkem oksüdeeritud vormis võrreldes produktidega, näit.: Rasvhapete sünteesis redutseeritakse lisatud ketorühm lisatud C 2 ühikus metüleenrühmaks, mis vajab nelja elektroni: O R CH 2 C R + 4 H e R CH 2 CH 2 R + H 2 O Peale ATP-d on vaja redutseerivat energiat Redutseerivates biosünteesides on elektronide peamine doonor NADPH

15 REDUTSEERITUD NIKOTIINAMIID ADENIIN DINUKLEOTIIDFOSFAAT (NADPH) H H O O O P OCH 2 O.. N C NH 2 O HO OH NH 2 N N O P OCH 2 O N N O O HO O P O O

16 NADPH KUI ELEKTRONIDE DOONOR H H H CONH 2 CONH 2 + H e.. N + N R NADPH R NADP +

17 BIOLOOGILINE OKSÜDATSIOON Bioloogiline oksüdatsioon on inimese sissehingatud hapniku kasutamine metaboliitide lõhustamiseks, et toota ATP-d ATP sünteesi reaktsioon (ADP + P i + H + ATP + H 2 O) vajab sama koguse energiat, mis vabaneb ATP hüdrolüüsil Inimorganismis moodustub ATP aeroobse oksüdatsiooni käigus, milles suhkrud ja rasvhapped metaboliseeruvad süsihappegaasiks ja veeks ning vabanev energia kasutatakse ATP sünteesiks Näit. glükoosi täielik aeroobne oksüdatsioon tagab 36 ATP molekuli sünteesi: C 6 H 12 O O ADP + 36 P i + 36 H + 6 CO ATP + 42 H 2 O

18 SAHHARIIDIDE OKSÜDATSIOONI ETAPID Sahhariidide oksüdatsiooni esimene etapp on glükolüüs, mis toimub tsütoplasmas: Glükolüüs ei vaja hapnikku Järgnev etapp on tsitraaditsükkel (Krebsi tsükkel), mis toimub mitokondrites Enamik glükoosi oksüdeerumisel glükolüüsis ja tsitraaditsüklis vabanevast energiast säilub NADH ja FADH 2 molekulides, milledel on kõrge elektronide ülekande potentsiaal: Elektronid transporditakse NADH-lt ja FADH 2 -lt hapnikule hingamisahelas, mis toimub mitokondrite sisemembraanis Elektronide transpordiga kaasneb prootonite kontsentratsioonide erinevuse teke kahel pool mitokondrite sisemembraani Prootonite kontsentratsiooni gradient kasutatakse ära ATP sünteesiks mitokondrite sisemembraanis paikneva F o F 1 kompleksi vahendusel

19 SAHHARIIDIDE KATABOLISMI STAADIUMID

20 NAD OKSÜDEERITUD JA REDUTSEERITUD VORMID H H H CONH 2 + H e CONH 2 + N.. N R NAD + R NADH

21 FAD Oksüdeertud flaviin adeniin dinukleotiid (FAD)

22 FAD OKSÜDEERITUD JA REDUTSEERITUD VORMID

23 HINGAMISAHEL JA OKSÜDATIIVNE FOSFORÜLEERIMINE Hingamisahelas toimub elektronide ülekanne NADH-lt ja FADH 2 -lt õhupanikule vee moodustumisega: NADH + H + + ½ O 2 NAD + + H 2 O FADH 2 + ½ O 2 FAD + H 2 O NADH ja FADH 2 on väga head elektronide doonorid ning hingamisahela viimane komponent hapnik on võimas elektronide aktseptor Elektronide ülekande käigus kasutatakse konverteeritud energia prootonite kontsentratsiooni gradiendi näol ATP sünteesiks: Oksüdatiivne fosforüleerimine: Hingamisahelas toimuva oksüdatsiooni arvel fosforüleeritakse ADP ATP-ks

24 OKSÜDATSIOON JA ATP SÜNTEES ON SEOTUD PROOTONITE KONTSENTRATSIOONI GRADIENDIGA

25 MITOKONDRI EHITUS Oksüdatiivne fosforüleerimine toimub mitokondrite sisemembraanis

26 ELEKTRONIDE LIIKUMINE HINGAMISAHELAS Elektronide liikumine hingamisahelas ei toimu mitte otse NADH-lt ja FADH 2 -lt hapnikule, vaid läbi vaheülekandjate: Iga vaheülekandja redutseerub omandades elektroni ja seejärel oksüdeerub, andes elektroni edasi järgmisele vaheülekandjale: Iga vaheülekandja esineb vaheldumisi oksüdeerunud ja redutseerunud vormis, mida nimetatakse redokspaariks: Hingamisahel koosneb redokspaaridest Redokspaaride järjekorra hingamisahelas määrab paari redokspotentsiaal (laeng), mida mõõdetakse voltides (V): Redokspotentsiaal on redokspaari afiinsuse väljendus elektroni suhtes: Väiksema afiinsusega redokspaar annab elektronid suurema afiinsusega redokspaarile Mida negatiivsem on redokspotentsiaal, seda väiksem afiinsus elektroni suhtes ja seda parem elektroni doonor redokspaar on Hingamisahelas toimub elektronide liikumine negatiivsema redokspotentsiaaliga redokspaaridelt positiivsema redokspotentsiaaliga paaridele Redokspaar hapnik/vesi on kõrgeima positiivse redokspotentsiaaliga (+0.82 V), mistõttu elektronid liiguvad hingamisahelat pidi hapniku suunas

27 HINGAMISAHELA EHITUSKOMPONENDID Hingamisahel koosneb neljast valgulisest komponendist: Kompleks I: NADH-CoQ reduktaasne kompleks Kompleks II: suktsinaat-coq reduktaasne kompleks Kompleks III: CoQH2 tsütokroomi c reduktaasne kompleks Kompleks IV: tsütokroomi c oksüdaasne kompleks Kompleksid I, III ja IV on transmembraansed valgulised kompleksid, mida mööda elektronide transpordiga kaasneb prootonite transport mitokondri maatriksist läbi sisemise membraani membraanidevahelisse ruumi Membraanidevaheline ruum I III IV II Maatriks NADH + H + NAD + ½ O H + H 2 O

28 KOMPLEKS I NADH-CoQ reduktaasne kompleks katalüüsib kahe elektroni liikumist NADH-lt flaviin mononukleotiid (FMN) prosteetilisele rühmale FMNH 2 -lt transporditakse elektronid edasi raud-väävel (Fe-S) valgule Fe-S valgult transporditakse elektronid CoQ-le Kahe elektroni ülekandega NADH-lt CoQ-le kaasneb nelja prootoni transport maatriksist membraanidevahelisse ruumi NADH + Q + 5 H + NAD + + QH 2 + 4H +

29 ELEKTRONIDE ÜLEKANNE FMN-LE

30 Fe-S VALGUD 1Fe 2Fe-2S 4Fe-4S

31 CoQ OKSÜDATSIOONIVORMID

32 ELEKTRONIDE TRANSPORT CoQ-LE

33 KOMPLEKS II Suktsinaat-CoQ reduktaasne kompleks katalüüsib kahe elektroni liiumist suktsinaadilt FAD-le FADH 2 -lt liiguvad elektornid Fe-S valgule Fe-S valgult liiguvad elektronid CoQ-le Erinevalt teistest komleksitest ei transpordi kompleks II prootoneid läbi membraani Kompleks II on seotud tsitraaditsükliga suktsinaadi kaudu Suktsinaat + CoQ Fumaraat + CoQH 2

34 KOMPLEKS III CoQH 2 Cyt c reduktaasses kompleksis liiguvad kaks elektroni QH 2 -lt oksüdeeritud tsütokroom c-le, millega kaasneb nelja prootoni transport maatriksist membraanidevahelisse ruumi Q-tsükli osalemisel: QH Cyt c ox + 2 H + Q + 2 Cyt c red + 4 H + Tsütokroom on elektroni ülekandev valk, mis sisaldab heem prosteetilist rühma: Fe-protoporfüriin IX

35 KOMPLEKS IV Tsütokroomi c oksüdaasne kompleks katalüüsib hapniku redutseerimist veeks Reaktsiooni katalüüsiv tsütokroomi c oksüdaas sisaldab kaks heemi (A) ja kolm Cu iooni (A ja B)

36 ELEKTRONIDE LIIKUMINE TSÜTOKROOMI C OKSÜDAASILT HAPNIKULE Tsütokroomi c oksüdaasne kompleks transpordib elektronid ühekaupa redutseeritud Cyt c-lt kahele Cu 2+ aatomile, seejärel tsükroomile a, siis jälle Cu 2+ aatomite kompleksile, siis tsütokroomile a 3 ja lõpuks hapnikule Hapniku molekuli redutseerumisega kaasneb nelja prootoni liikumine maatriksist membraanidevahelisse ruumi 4 Cyt c red + 8 H + + O 2 4 Cyt c ox + 2 H 2 O + 4 H +

37 ATP SÜNTEES Vastavalt Mitchell i hemi-osmootsuse teooriale põhjustab eleltronide transport hingamisahelas prootonite pumpamise mitokondri maatriksist membraanidevahelisse ruumi: Sisemembraani välispind laadub positiivselt, maatriksipoolne pind negatiivselt ph on sisemembraani välisküljel madalam kui maatriksis

38 HINGAMISAHELA ATP SAAGIS Kahe elektroni ülekanne hingamisahela igas prootoneid transportivas kompleksis tekitab piisava elektrokeemilise gradiendi ühe ATP molekuli sünteesiks: Ühe NADH oksüdeeritud molekuli kohta sünteesitakse kolm ATP molekuli: Elektronide ülekanne NADH-lt toimub esimesele prootoneid transportivale kompleksile (kompleks I) Ühe FADH 2 oksüdeeritud molekuli kohta sünteesitakse kaks ATP molekuli: FADH 2 annab elektronid pärast esimest prootoneid transportivat kompleksi H + H + H + Membraanidevaheline ruum I Q III IV II Maatriks NADH + H + NAD + FAD FADH ½ O H + H 2 O 2

39 ATP SÜNTAASI KOMPLEKS F 1 subühik omab katalüütilist aktiivsust: Koosneb viiest polüpeptiidiahelast F o sisaldab prootoni kanalit Vastavalt Boyer i mudelile põhjustab prootonite liikumisel vabanev energia γε ja c subühikute roteerumist, mis omakorda põhjustab katalüütilise ühiku β-subühiku konformatsioonilisi muutusi: Ühe molekuli ATP sünteesiks peab F o F 1 komplekis läbima neli prootonit Prootonite liikumise roll on mitte ATP süntees, vaid sünteesitud ATP vabastamine katalüütilisest tsentrist

40 ATP SÜNTEESI MUDEL O (open) seisund: Seob ATP, ADP ja P i väga nõrgalt L (low) seisund: Seob ADP ja P i tugevamalt T (tight) seisund: Seob ADP ja P i väga tugevalt, moodustunud ATP ei saa väljuda

41 HINGAMISAHEL JA OKSÜDATIIVNE FOSFORÜLEERIMINE: KOKKUVÕTE

42 OKSÜDEERIMISE JA FOSFORÜLEERIMISE LAHUTAMINE Mitmed ühendid toimivad lahutajatena (uncouplers) hajutades prootonite elektrokeemilise gradiendi (s.t. mitokondrite sisemembraani pindade erinevat laadumist), transportides prootoneid või teisi katioone läbi sisemembraani: ATP sünteesiks vajalikud tingimused ei saa kujuneda, s.t. nad lahutavad oksüdatiivse fosforüleerimise elektronide transpordist hingamisahelas Hingamisahel toimib normaalselt, kuid ADP fosforüleerimist ATP-ks ei toimu: Oksüdatsiooni kogu energia vabaneb soojusena Lahutajad (rasvlahustuvad ühendid): 2,4-diklorofenool, 2,4-dinitrofenool, pentaklorofenool, valinomütsiin, j.t. NO 2 O 2 N OH Dissotsieeruv prooton 2,4-dinitrofenool (DNP)

43 OKSÜDATIIVNE STRESS Oksüdatiivne stress on reaktiivsete osakeste produktsiooni ja nende elimineerimise vahelise tasakaalu puudumise tulemusena tekkinud seisund: Oksüdatiivset stressi süvendavad oksüdatiivsed stressorid: Reaktiivsed hapniku osakesed (reactive oxygen species, ROS) Reaktiivsed lämmastiku osakesed (reactive nitrogen species, RNS) Reaktiivsed osakesed võivad olla vabad radikaalid või mitteradikaalsed osakesed, mis on oksüdeerivad agendid või konverteeruvad kergesti vabaks radikaaliks Vaba radikaal on molekul, mille välisel elektronorbitaalil on vähemalt üks paardumata elektron: Vabade radikaalide eluiga on väga lühike, kuid nad on väga reaktiivsed, initsieerides teise vaba radikaali teket, mis viib ahereaktsiooni tekkimisele Vabad radikaalid elimineeritakse antioksüdantsete regulatsioonisüsteemide poolt

44 VABAD RADIKAALID Superoksiidi radikaal (supeoxide anion) O 2 Hüdroksüülradikaal OH Lämmastikoksiidi radikaal (nitric oxide) NO Lämmastikdioksiidi radikaal NO 2 Rasvhappe (lipiidi) peroksüülradikaal LOO Alkoksüülradikaal RO Hüdroksüperoksüülradikaal HO 2 Tiüülradikaal RS

45 ENDOGEENSED OKSÜDATIIVSED STRESSORID Organism produtseerib teatud koguses reaktiivsedi osakesi: Hingamisahel produtseerib superoksiidi radikaale Fagotsüüdid produtseerivad superoksiidi radikaale, hüdroksüülradikaale, vesinikperoksiidi Ksantiini oksüdaas produtseerib superoksoodi radikaale puriinide katabolismi käigus Vaba raud ja vask soodustavad hüdroksüülradikaalide teket Põletikulised protsessid produtseerivad vabu radikaale fagotsüütide üliaktiivsuse tõttu

46 SUPEROKSIIDI ANIOONI TEKE HINGAMISAHELAS Hingamisahela viimases kompleksis toimub elektronide ülekanne hapnikule: Hapniku redutseerimine ühe elektroniga produtseerib superoksiidi aniooni Kuigi tsütokroomi c oksüdaas ei lase osaliselt redutseeritud hapniku osakestel vabaneda, tekib väike kogus superoksiidi aniooni: 2-5 % sissehingatud hapnikust vabaneb superoksiidi anioonina ja vesinikperoksiidina e e O 2 O 2 Superoksiidi anioon O 2 2 Peroksiid

47 HÜDROKSÜÜLRADIKAALI TEKE: FENTONI REAKTSIOON Hüdroksüülradikaali teket vesinikperoksiidist katalüüsivad raud ja vask: Fentoni reaktsioon H 2 O 2 + Fe 2+ OH + OH - + Fe 3+ Hüdroksüülradikaal on üks kõige reaktiivsemaid osakesi bioloogilistes süsteemides

48 SUPEROKSIIDI ANIOONI JA VESINIKPEROKSIIDI ELIMINEERIMINE Superoksiidi anioon elimineeritakse superoksiidi dismutaasi (superoxide dismutase, SOD) poolt: Superoksiidi O H + dismutaas O 2 + H 2 O 2 Vesinikperoksiid elimineeritakse katalaasi või glutatiooni peroksüdaasi poolt: Katalaas 2 H 2 O 2 O 2 + H 2 O

49 SUPEROKSIIDI DISMUTAASI MEHHANISM Ensüümi oksüdeeritud vorm (M ox ) reageerib superoksiidi aniooniga, mille tulemusel tekib hapnik ja ensüümi redutseeritud vorm (M red ) Ensüümi redutseeritud vorm reageerib teise superoksiidi aniooni ja kahe prootoniga, mille tulemusel ensüüm regenereerub oksüdeeritud vormi ning tekib vesinikperoksiid

50 LÄMMASTIKOKSIIDI TEKE Lämmastikoksiid (NO) sünteesitakse lämmastikoksiidi süntetaasi poolt: Substraadiks on arginiin, mis oksüdeeritakse tsitrulliiniks

51 METABOLISMI PÕHIRAJAD Metabolism on katabolismi ja anabolismi integratsioon: Süsivesikute metabolism Lipiidide matabolism Aminohapete metabolism Valkude metabolism Nukleiinhapete metabolism

52 KATABOLISMI STAADIUMID