Биолошке мембране и транспорт. Милош Мојовић

Transcript

1 Биолошке мембране и транспорт Милош Мојовић

2 Особине ћелије и функција биолошких мембрана Ћелија - основа грађе свих биљака и животиња. Да би се нешто могло назвати "ћелијом" мора да има следеће особине: - да је аутономног састава односу на околну средину - да поседује аутономност хемијских реакција - да остварује везу са околином (отворен систем) Из чега је састављена ћелија? Која је разлика између прокариотске, животињске и биљних ћелија? Састав ћелије Ћелија 1 Ћелија 2 Контролисана повезаност ћелије и околне средине остварује се преко биолошких мембрана.

3 Функција биолошких мембрана Биолошке мембране имају три основне и више допунских функција: Основне функције: - механичка функција (обезбеђује отпорност и аутономност ћелије) - баријерна функција (обезбеђује регулисану размену материја са околином) - матрична функција (обезбеђује положај и орјентацију мембранских протеина у циљу њиховог деловања) Допунске функције: - рецепторска (спољашњих сигнала), енергетска (синтеза "ATP-a" на мембранама митохондрија и хлоропласта), кондуктивна (за провођење биопотенцијала), генераторска (за генерисање биопотенцијала) )...

4 Укупна површина свих биолошких мембрана код човека је око м 2. Мембране чине преко 50% суве материје ћелија. Због своје сложености, мембране су најмање истражени делови организма. Поремећаји у функцијама мембрана су узрок великог броја болести (рак, артериосклероза, вирусна и бактеријска обољења, тровања, оштећења јонизујућим зрачењем...

5 Хемијски састав биолошких мембрана Биолошке мембране у свом основном хемијском саставу садрже: липиде, протеине и угљене хидрате. У мембрана има у мањој количини и: нуклеинских киселина, полиамина, неорганских јона и везане воде. Процентни однос липида и протеина зависи од врсте мембрана: Структура мембране Протеини (%) Липиди (%) Мијелин Еритроцити Митохондрије Једро ћелије Хлоропласти Бактерије

6 Мембрански липиди У састав биолошких мембрана улазе три класе липида: фосфолипиди, гликолипиди и холестерол. Фосфолипиди и гликолипиди се састоје од два хидрофобна угљоводонична ланца (репа) који су везани за хидрофилну главу. Фосфолипидна глава је фосфорилисана и састоји се или од глицерола (група фосфоглицерида) или од сфингозина (сфингомијелин). Гликолипиди у хидрофилној глави имају сфингозин за који је везано један или више шећера. Хидрофибни реп им се састоји или од две масне киселине (као код фосфоглицерида) или од једне масне киселине и једног сфингозинског угљоводоничног ланца.

7 Да поновимо: Фосфолипиди: Фосфолипидна глава је фосфорилисана и састоји се или од глицерола (група фосфоглицерида) или од сфингозина (сфингомијелин). Гликолипиди: Гликолипиди у хидрофилној глави имају сфингозин за који је везано један или више шећера. Хидрофибни реп им се састоји или од две масне киселине (као код фосфоглицерида) или од једне масне киселине и једног сфингозинског угљоводоничног ланца. Масне киселине обично имају између 14 и 24 угљеникових атома. Могу бити засићене или незасићене. Од њихове дужине и степена незасићености зависи спепен флуидности мембране (више двоструких веза = већа флуидност). PtdCho - Phosphatidylcholin; PtdEtn - Phosphatidylethanolamin; PtdIns - Phosphatidylinositol; PtdSer - Phosphatidylserin

8 Фосфолипиди у мембранама У биолошким мембранама, фосфолипиди су распоређени у виду двослоја и то тако да су поларне, хидрофилне главе окренуте ка спољашњој средини а хидрофобни репови ка унутра. ванћелијски простор + цитоплазма _ Mодел помоћу којег се мембране описују назива се флуидно-мозаички мозаички. Биолошке мембране се могу посматрати и као електрични кондензатори при чему су: проводници кондензатора електролит спољашњег (ванћелијског) и унутрашњег раствора (цитоплазма). Проводници тог кондензатора су раздвојени диелектриком (који представља липидни двослој).

9 Моделске мембране Фосфолипиди у воденом раствору могу створити формације мицела и липозома (везикула). Липозоми (фосфолипидне везикуле) се лако добијају убризгавањем раствора липида у воду (овако добијамо стање које одговара минимуму Гибсове енергије). Састоје се из једног или више сферних фосфолипидних двослојева који могу бити раздвојени воденом средином. - пречник липозома ( nm) - дебљина липидног двослоја nm - растојање између слојева nm Мицеле имају само један, сферичан слој фосфолипида који су поларним делом (главом) окренути ка споља (водена средина), док се хидрофобни репови сусрећу у унутрашњости мицеле. Добијамо их из суспензије вишеслојних липозома коју третирамо ултра-звуком звуком. Вишеслојни липозом

10 Моделске мембране Употреба липозома: - у липозоме је могуће инкапсулирати различите типове раствора. - могу се користити за "испоруку" лекова и ензима у терапеутске сврхе. Пример је корићшење липозома за испоруку контрастних агенаса у CT и MRI дијагностици. CT слика абдомена пса коме је дат јод инкапсулиран у липозоме (јодсеовдекористи као контраст јер га упијају Купферове ћелије јетре али не и ћелије тумора). Како то тачно функционише? Липозоми имају могућност да се споје са ћелијом и измешају свој садржај са унутарћелијским медијумом (методе за циљну испоруку до појединих органа су још у развоју). Ово је могуће због амфипатичке природе фосфолипида. Имамо: - јонске интеракције поларне главе и молекула воде - хидрофобне интеракције угљоводоничног ланца у унутрашњости двослоја Неполарни део липозома спречава продор (и излазак) јона и осталих поларних ентитета.

11 Фосфолипидне мембране као модели за испитивање особина мембрана. Спонтано или индуковано формирање фосфолипидног двослоја Планарне мембране (black film) Липозоми (липидне везикуле) спонтано или сонификација SUV (out-in 65-35%) LUV (out-in 50-50%) Small or large unilamellar vesicles Милерова метода: Ове мембране добијамо на малим отворима дијаметра 1mm потопљенима у воду. Капљицу липида раствореног у алкохолу наносимо на отвор. Како алкохол дифундује у воду ствара се липидна опна. MLV Multilamellar vesicles Мултиламеларне Голџијеве структуре

12 Динамика мембранских липида У мембранама постоје три основна типа кретања молекула фофсолипида. Метода за испитивање - ЕПР. Термални покрети хидрофобног дела (уређеност унутрашњости мембране) Латерално кретање липида (дифузија) Трансверзално кретање липида (флип-флоп)

13 Фазни прелази липида у мембранама Липидне двослојне мембране се у физиолошким условима нaлазе у течно-кристалном стању. Ово значи да постоји поредак у узајамној орјентацији и положају молекула али је агрегатно стање течно. Стационарни период живота фосфолипидног молекула износи свега s. Течни кристали се могу образовати само код оних структура које имају "дугачке молекуле" " (попречне( димензије су знатно мање од узджних). Течно-кристалне структуре су веома осетљиве на промене температуре, притиска, хемијског састава и електричног поља. При промени температуре биолошких мембрана долази до фазног прелаза првог реда. Када хладимо мембране, имамо пралазак из течно-кристалног у гел стање.

14 Фазни прелази липида у мембранама Дебљина мембране у гел-фази је већа него у у фази течног кристала где је зато обим већи јер се повећава и површина коју заузимају молекули мембране. За нормално функционисање, мембрана мора бити у течно- кристалном стању. Температура фазног прелаза гел-течни кристал зависи од састава мембране (варира од -20 C за мембране од незасићених липида до +60 C за мембране од засићених липида). Организми се адаптирају на температурске промене (дистални део ноге јелена има више незасићених липида од дела ка трупу).

15 Фазни прелази липида у мембранама Мембранске липидне фазне транформације се најчешће мере калориметријски и рендгеноструктурном анализом. При течни кристал-гел фазним прелазима, у липидном двослоју долази до формирања транспроводних канала пречника 1-3nm кроз које се кроз мембрану могу транспортовати јони и мали молекули. Због тога се на температури фазног прелаза нагло повећава јонска проводљивост мембране. Ово може спасти ћелију од криогених повреда јер долази до повећаног испуштања воде и соли из ћелије (онемогућава се кристализација унутар ћелије на ниским температурама). Промена јонске проводљивости изазива стварање биопотенцијала (нервни импулс) који носи информацију о промени температуре. Промена хемијског састава мембране такође изазива фазни прелез течни кристал-гел (нпр. додатак јона Ca +2 доводи до његове интеракције са негативно наелектрисаним структурама на површини мембране, фазне сепарације и прелаза).

16 Протеини на једном слајду (подсећање) Састојесеод20 различитих аминокиселина, од којих је 8 есенцијалних (тело их не може произвести, препоручено је свакодневно узимање различитих намирница које садрже беланчевине). АК су у протеинима повезане пептидним везама (између карбоксилине и амино-групе) а њихова секвенца је одређена генетским кодом (тј. распоредом трплета никлеотида који носе те АК тј. кодона). формирање пептидне везе енкодирање протеина Протеини поседују примарну, секундарну, терцијерну и квартенарну структуру. Редослед аминокиселина у појединим протеинима називамо примарном структуром. Просторна грађа протеинског ланца зове се секундарна структура протеина. Структура ланца може бити α-узвојница, β-набрана плоча, или неправилно клупко. Она је најчешће условљена водоничним везама. Најтипичнији протеин са конформацијом α-узвојницејеα-кератин, од којег је изграђена коса, нокти, рогови... Просторни распоред свих атома у молекулу неког протеина зове се терцијарна структура протеина. То обухвата огранке алифатских и ароматских остатака. Квартерна структура протеина описује повезивање више пептидних ланаца у одређени молекул. Протеине можемо поделити и на скеропротеине, глобуларне протеине и протеинске комплексе. Скеропротеини су нерастворни у води, служе као потпорни елементи коштаног ткива, правилни су кончасти молекули, а карактеристични пример су колаген (везивно ткиво), и кератин (коса, нокти, перје). Глобуларни протеини растворни су у води, кугласти су молекули, а овде спадају протеини крвне плазме, протеини беланца јајета и ензими. Протеински комплекси су грађени од протеинског дела и непротеинских или простетских група. У ову групу спадају гликопротеини, липопротеини, фосфопротеини и металопротеини.

17 Мембрански протеини Као што је липидни двослој фундаментална структурна јединица у мембранама, тако мембрански протеини имају скоро целокупну активну функцију мембране (транспорт, рецептори...). Мембранске протеине делимо на периферне и интегралне. Периферни протеини су глобуларни протеини који не пролазе кроз мембрану и са њом најчешће интереагују преко електростатичких интеракција и водоничних веза. Одвајамо их од мембране променом ph или третманом помоћу раствора соли. Интегрални протеини су интегрисани у липидни двослој. Поседују и хидрофобне и хидрофилне делове те могу бити једним делом у мембрани или пролазити кроз њу (трансмембрански). Уклањају се помоћу детерџената или органских растварача (раскидањем хидрофобних веза). Интегрални протеини поседују латералну покретљивост

18 Сепарација и детекција протеина - Електрофореза - Изоелектрично фокусирање Принцип електрофорезе Заснива се на миграцији наелектрисаних честица кроз раствор под дејством електричног поља. На честицу наелектрисања z која се налази у електричном пољу E делује сила: F p = z E Кретању честице се супротстаља сила трења F t која је за сферне честице пропорционлна коефицијенту вискознасти раствора η, радијусу честице r и брзини којом се она креће v. F t = 6 πηr v Повећавањем брзине честице се повећава и сила трења, тако да се после неког времена успоставља равнотежа тако да је: z E = 6 πηr v Одавде се види да покретљивост наелектрисаних честица (однос v/e) зависи од њихове величине и наелектрисања.

19 Електрофореза Типови електрофорезе: - градијентна гел електрофореза - нативна диск гел електофореза - (SDS PAGE) полиакриламид гел електрофореза Избор пуфера: - боратни, цитратни, EDTA се не могу користити (праве комплексе или се везују за металне јоне). - користе се пуферски раствори ниске проводљивости са великим јонима и ниском електрофоретском покретљивoшћу нпр.h-tris). Јачина спољашњег електричног поља: - потребан је стабилан извор једносмерне струје (5-8 V/cm) ВЕЖБА (ВИРТУЕЛНА) 1 ВЕЖБА (ВИРТУЕЛНА) 2 Изоел. фокусирање 2D електрофореза Детекција протеина

20 Асиметричност мембране Мембрански липиди и протеини показују латералну и трансверзалну асиметрију па су оне - асиметричне структуре. Латерална асиметрија представља формирање липидних и протеинских кластера у равни мембране. Липиди често формирају асиметричне кластере као последица латералне фазне сепарације (пример са Ca +2 ). Протеини такође показују латералну мембранску асиметрију. Они имају потребу за груписањем у кластере ради бржег међуделовања. Протеински кластери бактерије Halobacterium halobium Трансверзална асиметрија мембрана представља појаву да њене особине нису исте са спољашње и унутрашње стране (битно за транспорт, деловање хормона, имунолошке реакције између ћелија... ) Протеинска и липидна трансверзална асиметрија узрокује различит распоред наелектрисаности спољашњости и унутрашњости мембране што има утицај на мембрански потенцијал (мења се пропустљивост јонских канала и активност протеина).

21 Како се постиже липидна трансверзална асиметрија? Протеини - није тешко схватити њихову асиметричност али како остварити и одржати асиметричност за липиде... треба ли енергије за то? У ћелијама еукариота фосфолипиди, гликолипиди и холестерол се синтетишу помоћу ензима који су лоцирани у (или на површини) ендоплазматичног ретикулума (ЕР) или Голџијевог система. Транспортом произведених фосфолипида, гликолипида и холестерола од ЕР и Голџија (до мембрана у ћелији и плазма мембрана), управљају тзв. липид-транспортни протеини. Сада на сцену ступају флипазе. То су протеини који могу да "пребаце" фосфолипид са једне стране двослоја на други. Ово скраћивање флип-флоп флоп времена ради одржавања трансверзалне липидне асиметричности захтева Е (која се добија из "АТP-а").

22 Ф И З И К А Л И С А Њ Е Одвајање плазма мембрана корена кукуруза 50 g исечених коренова хомогенизовано је у охлађеном авану помоћу тучка уз присуство 120 ml охлађеног пуфера. Пуфер коришћен у овом поступку састојао се из 250 mм сахарозе, 3 mм етилендиаминтетрасирћетне киселине, 50 mм Тris-HCl (ph 7.5), 1 mм дитиотреитола и 10% (v/v) глицерола. Хомогенат је затим филтриран кроз четири слоја газе и центрифугиран на g 10 минута. Супернатант је затим центрифугиран на г 30 минута. Микрозомална фракција у натанту се затим испира пуфером за прање (2 mм Трис-HCl, ph 7.5; 250 mм сахароза, 10% v/v глицерол) и затим центрифугира на g 30 минута. Испрани микрозоми се затим суспендују у 3 мл фазног пуфера (5 мм К-фосфатни пуфер, ph 7.8; 330 mм сахароза; 3 mм KCl) за одвајање плазма мембрана у двофазном систему по Ларсону. За фазно одвајање, 3 g микрозома се суспендује да би се направило 12 g двофазног система који садржи 6.5% (v/v) декстрана Т 500, 6.5% (v/v) полиетиленгликола 335, 330 mм сахарозе, 3 mм KCl, 5 mм К2HPO4, ph 7.8. Кивете се мешају инверзијом пута и центрифугирају 5 минута на 1500 g. Приближно 90% горње фазе се сакупља и наноси на свежу доњу фазу. Ова процедура се понавља три пута и коначна горња фаза (U3 фракција) се разблажује са 10 запреминапуферазапрањеицентрифугирана g 30 минута. Резултујући натант који садржи пречишћене плазма мембране ресуспендује се у одговарајућем пуферу за прање да би се добила коначна концентрација од 2-3 mg протеина по милилитру. Овако добијене мембране се одмах користе или се чувају на -60 C. Одвајање ћелијских органела (нпр.митохондрија) Изолација митохондрија се заснива на њиховој величини (једино је једро веће од њих). Иовдејеосновни принцип диференцијално центрифугирање хомогенизованог ткива. Веома је тешко издвојити баш чисте митохондрије тако да се издваја митохондријална фракција што значи да је у систему највише митохондрија (али има и других органела као што су лизозими, делови ћелије, језгра, пероксизоми... ). Процедура: самељу се нпр. јетра, срце, мишићи, мозак... спанаћ, авокадо... (измрве се у авану, наравно, претходно се узорак прелије течним азотом). Стави се то у пуфер (обично сахарозни). Хомогенизовати све у блендеру да се ћелије растуре и испусте свој садржај у пуфер. Центрифугирати на малим брзинама (1200 г) при чему се спуштају тежи делови (ћелијски фрагменти, једра...). Супернатант затим центифуфирамо на већим брзинама (26000 g.. овде се таложе мало лакше ствари као што су митохондрије). Одвојимо талог, и ставимо га у пуфер, опет се центруфугира на великим брзинама (25000 g), одвоји се талог у коме су сада релативно чисте митохондрије. Иначе, све се ради на 2-4 C Вежба - одвајање митохондрија и плазма мембрана корена кукуруза:)

23 Транспорт кроз мембрану Може се класификовати према величини честица које се транспортују: - макротранспорт (велике количине раствора, комплекси, мале ћелије) - микротранспорт (јони, мали молекули, макромолекули) Макротранспорт Обухвата три типа процеса: ендоцитозу (ћелије увлаче честице), егзоцитозу (ћелије избацују честице), транзицитозу (када се на једну честицу прво примени ендо- па егзоцитоза). - Фагоцитоза је посебан облик ендоцитозе код кога имунокомпетентне ћелије (нпр. макрофаге) једу и уништавају вирусе, мртве ћелије... ендоцитоза конститутивна (нерегулисана) секреција егзоцитоза два типа егзоцитозе регулисана секреција ("окидач" је неки сигнал)

24 Микротранспорт Може се класификовати према енергији која је потребна да би се он остварио. Према томе постоји: 1) Пасивни транспорт: увек иде у смеру концентрационг градијента (од више ка нижим концентрацијама), последица је дифузије, не троши Е јер је увек ΔG<0 i ΔS>0. Пасивни транспорт се може реализовати као: - проста дуфузија - олакшана дифузија 2) Активни транспорт: увек иде насупрот концентрационом градијенту, тражи утрошак енергије па је то процес код кога је ΔG>0 i ΔS<0.

25 Проста дифузија у биолошким системима Проста дифузија у биолошким системима и није толико "проста" с обзиром на њихову нехомогеност и анизотропност. Микротранспорт се у ћелијским мембранама обавља кроз липидни матрикс тј.: липидни двослој, порама и јонским каналима (одређени типови протеина). Пошто се сматра да је димензија ћелије знатно већа од димензија честица које дифундују, дифузију можемо описати 1 Фиковим законом: J x =-D (dс/dx) J x = дифузиони флукс (1/m 2 s), број молекула који пролазе кроз јединицу површине у јединици времена (у правцуx-осе) D= коефицијент дифузије (m 2 /s) dc = промена концентрације честица (mol/m 3 ) dx = промена дужине (m) Негативан знак се јавља пошто се транспорт врши у смеру опадајуће концентрације. D зависи од P, T и састава средине. Промену концентрације услед дифузије са растојањем и временом дефинише 2 Фиков закон: ( C/ t) x = D ( 2 C/ x 2 ) t

26 Проста дифузија кроз мембране Уколико су молекули из цитосола или спољашњег медијума липосолубилни они могу дифундовати са једне на другу страну мембране (масне киселине, алкохоли...). Молекули који нису липосолубилни или су наелектрисани (нпр. амино киселине) тешко дифундију кроз мембрану. Мембране различитих ћелија имају различите вредности дифузионих коефицијената D. Проста дифузија - Oсмоза Осмоза је специјалан случај просте дифузије која се одиграва у случајевима када су два раствора различитих концентрација одвојени селективном мембраном (полупропустљива мембрана). Селективна мембрана је она која има особину да допушта дифузију молекула растварача али не и молекула растворка. Уколико је концентрација растворка већа у једном него у дугом делу тада растварач кроз мембрану прелази у део са већом концентрацијом тако да: ΔG<0 и ΔS>0 Овај процес се зове директна осмоза

27 Осмоцки притисак Уколико са две стране полупропустљиве мембране имамо два расвора различитих концентрација догодиће се осмоза (прелазак воде из једног у други компартмент). Хидростатички притисак који врши вода на мембрану у раствору концентације С на температури Т зове се осмоцки притисак. Осмоцки притисак описује Вант-Хофов закон који гласи: - осмоцки притисак C M - моларна концентрација раствора R - универзална гасна константа T - температура раствора =C M RT Еритроцити потопљени у растворе различитог осмоцког притиска Осмоцки притисак биолошких раствора једнак је осмоцком притиску стандардног раствора (зове се и физиолошки раствор) који се састоји од: : М NaCl, на ph=7, на собној температури. Раствори са истим осмоцким притиском су изотонични, нижим притиском (и нижом концентрацијом) хипотонични или хипертонични (са вишом концентрацијом).

28 Како се ћелија штити од осмозе? Ћелијска мембрана је пропусна за молекуле воде, јоне и мале молекуле а непропусна је за макромолекуле. Али, ћелијска мембрана је више пропусна за воду него за јоне који су чак мањи од њених колекула. Како то? У мембрани постоје посебни "водени" канали који се користе искључиво за транспорт воде. Они се зову аквапорини. Веома су специфични за молекуле воде и не пропуштају чак ни протоне! Да би се заштитила од пуцања због осмозе, у ћелији постоји још један вид транспорта. Он је задужен да "избацује" јоне из ћелије и обављају га јонске пумпе. Овај процес захтева утрошак енергије јер се одвија насупрот концентрационог градијанта (биће речи касније). Следећи тип пасивног транспорта је олакшана дифузија. Аквапорин

29 Олакшана дифузија Јони као што су (Na +, K +, Cl - ) и мали молекули (нпр. глукоза) се тешко растварју у липидном двослоју. Aли они ипак веома успешно пролазе кроз мембрану. Како то? Ово им омогућава посебан вид транспорта који се назива олакшан транспорт (тј. олакшана дифузија). Овакав вид транспорта се одвија у смеру концентрационог градијента. Слично простој дифузији, олакшана дифузија је егзоенергијски процес јер је ΔG<0, ΔS>0. Насупрот простој дифузији, олакшана дифузија се одвија путем специфичних канала и протеина носача који су уграђени у мембрану. У зависности од врсте коју треба пренети кроз мембрану постоје два основна типа олакшаног транспорта: каналима и носачима транспорт каналима транспорт носачима

30 Транспорт каналима Канали су трансмембрански протеини који се користе за транспорт малих јона и молекула као што су: Na +, K +, Cl -, Ca +2, H 2 O. Ове протеинске структуре поседују две конформације (отварање и затварање) које се активирају хемијским, електричним, механичким или светлосним путем. Постоје ендогени јонски канали (транспортују сопствене јоне и молекуле) и егзогени јонски канали (који убацују молекулe и јоне у друге мембране). Пример егзогеног к.: Секреција грамицидинског A - јонског канала од стране бактерије Bacillus brevis - Грамицидински канал је димер, трансмембрански протеин који се састоји из два β-хеликса. - Дозвољава несметан проток јона Na + и К + (наравно, низ концентрациони градијент), али не и Ca Уколико се грамицидински канал убаци у мембрану циљне ћелије, брише јој се електрохемијски градијент и ћелија умире. - Грамицидин се на овај начин понаша као антибиотик, хемијско оружје против других компетитивних ћелија. - На сличан начин (формирањем пора у другим ћелијама) функционишу и Nistatin и amfotericin B (лекови против гљивица). 3Д модел грамицидинског канала

31 Транспорт носачима Мали молекули као што су неки шећери (глукоза, фруктоза, маноза) као и амино киселине не могу проћи кроз мембрану јер нису липосолубилни. Ипак, они (као и неки јони) се кроз плазма мембрану могу транспортовати помоћу специфичних носача који се зову унипортери. И овај транспорт се врши низ концентрациони градијент тако да и даље важи да је: ΔG<0 и ΔS>0. Унипортери - полипептиди или протеински молекули носачи, веома су специфични за одеђену врсту молекула или јона које треба да пренесу. Унипортери подлежу конформационим променама, вежу молекул са једне и ослободе га на другу страну. Као у случају канала и овде постоје: ендогени и егзогени носачи. Пример егзогеног носача: Секреција antibiotika ваниломицина из бактерије Streptomyces fulvissimus. - Овај носач је хидрофобан те се лако убацује у мембране циљних ћелија и ту се користи за транспорт јона К + ван ћелије (за кога је знатно специфичнији него за јоне Na + ). Ваниломицин принцип рада С обзиром на конформационе промене молекула носача, очигледно је да је процес преношења носачима знатно спорији од каналског ( у односу на јона/s)

32 Транспорт носачима Пример ендогеног нoсача: GLUT1 - носач глукозе у мембранама еритроцита. Има две конформације. Једна када веже молекул глукозе са спољне стране мембране и дуга када га ослободе у ћелију. Иако се глукоза кроз мембрану константно уноси у ћелију еритроцита она се унутра не акумулира јер се брзо трансформише у глукозу 6 фосфат. Због овог GLUT1 константно функционише. Треба рећи да су D- галактоза и D- маноза шећери који се такође (али са мањим афинитетом) могу везати за активна места GLUT1 и представљају компетенте глукози. Принцип рада GLUT1 носача GLUT1 дефицијентни синдром је узрочник многих обољења као што су: микроцефалиа (мала глава), абнормални мишићни спазми, атаксија (отежана координација покрета), дисартрија (отежан говор), летаргија (безвољност), главобоље, тикови, неконтролисани покрети очима нарочито пре јела.

33 Основне карактеристике олакшане дифузије Шта смо до сада научили: - Оба типа олакшаног транспорта (каналима и носачима) се одигравају пасивно (без утрошка енергије) и вођени су концентрационим или електричним градијентом. - Брзина олакшане дифузије знатно је већа него просте дифузије. - Оба типа олакшане дифузије су веома специфични за врсте које се преносе кроз мембрану. - Брзина олакшаног транспорта лимитирана је бројем канала или носача који су специфични за дату врсту. - Постојање компетиције између жељене и сличних врста додатно смањује брзину транспорта циљних молекула или јона. - Оба типа транспорта могу бити блокирани инхибиторима.

34 Активни транспорт Живе ћелије, да би нормалино могле да функционишу, морају да одржавају оптималне концетрације јона у свом цитосолу (које се често разликују у односу на спољашњу средину). Оваква прерасподела концентација јона често није у складу са електричним или хемијским градијентом. Због тога постоје специфични биолошки механизми које транспортују јоне насупрот електрохемијског градијента. Овакав тип транспорта назива се активни транспорт. За активни транспорт важи да је ΔG>0 и ΔS<0. Да би овакав вид транспорта могао да се одриграва потребан је утрошак енергије. Ову енергију обезбеђује ћелија у виду АТP-а. Постоји примарни и секундарни активни транспорт (вођен концентрационим градијентима насталих као последица примарног транспорта). АТP 3Д структура Примарни и секундарни активни транспорт Већина ћелија користи чак 1/3 својих резерви АТP-а да би одржале активни транспорт. Неурони користе чак 3/4 својих резерви ATP-а за активни транспорт.

35 Да се подсетимо: синтеза АТP-а Како и где се дешава синтеза АТP-а? АТP се може правити у различитим процесима: - ћелијске респирације (из шећера у процесу гликолизе и циклусу лимунске киселине тј. оксидатвне фосфорилације). - бета оксидацији (из масти, масних киселина). - анаеробној респирацији (код прокариота без присуства кисеоника). - у процесу фотосинтезе... АТP се код еукариота који не врше фотосинтезу прави у митохондријама у процесу ћелијске респирације (оксидативне фосфорилације). Код биљака АТP се прави у тилакоидним мембранама хлоропласта у процесу фотосинтезе (процес фосфорилације). У процесу синтезе АТP-а ћелија користи просте и комплексне шећере и масти као извор енергије, разноврсне ензиме, носаче, пумпе... Процес синтезе АТP-а Хемиосмоза Митохондрије код еукариота заузимају око 1/4 запремине ћелије. Један молекул глукозе може произвести 36 молекула АТP-а.

36 Примарни активни транспорт Основна својства примарног активног транспорта су: - ендоенергијски је процес (ΔG>0) - не постоји код мртвих ћелија - температурски је зависан (знатно више од пасивне дифузије) - може бити смањен помоћу метаболичких инхибитора (цијанидима, азидима...) или хипоксијом (смањеним присуством кисеоника). - може бити инхибиран специфичним инхибиторима као што су кардиотонични стериоди (великог су афинитета према јонским пумпама). Јонске пумпе, као специфични биолошки процеси који су одговорни за пумпање јона (нпр. Na + и K + ), заснивају свој рад на активном транспорту (пример: Nа + /K + АТP-азна пумпа). Пасивни транспорт Активни транспорт Већ дуже времена је познато да кардиотонични стероиди ouabain и digitoxigenin повећавају снагу срчаног мишића. Кардиотонични стероиди се клинички користе за третман престанка рада срца.

37 Nа + /K + пумпа Постоји неколико типова јонских пумпи од којих је Nа + /K + најважнијих за ћелију. Nа + /K + АТP-аза је интегрални мембрански протеин транспорт Nа + и K + јона уз хидролизу АТP-а: ATP+H 2 O ADP+P+H + који АТP-азна једна од обавља активни Овај ензим (Nа + /K + АТP-аза аза) је у ствари једна мала молекулска машина која пумпа три јона Nа + ван и два јона K + у ћелију по једном циклусу. Један циклкус Nа + /K + пумпа обави само за 10 ms. Укупна реакција која описује Nа + /K + АТP-азну пумпу је: 3Na + унутра+2k + споља+atp унутра 3Na + споља+2k + унутра+adp унутра +P унутра + G унутра G -Гибсова слободна енергија реакције која износи 50 кј/mol Због концентрационог односа транспортованих јона од [Nа + ]/[K + ] = 3/2 ова пумпа има електрогенички карактер, тј. доприноси електричној поларизацији мембране (укупно се више позитивних јона избацује ван). Пошто у сваком циклусу пумпа истовремено транспортује јоне Nа + ван а јоне K + у цитосол, овај систем преноса се зове антипортни систем или антипортер. Уколико се два различита јона транспортују у истом правцу то је симпортни систем или симпортер док ако се само један тип јона транспортује у једном смеру то је унипортни систем или унипортер, носач.

38 Nа + /K + пумпа Постоји неколико типова Nа + /K + АТP-аза али им је заједничко да су све састављене од два типа протеина: α и β подјединица. α подјединице су састављене од 10 трансмембранских хеликса који делимично штрче у цитоплазмичну област (цитосол). За тај (каталитички активни) део се везује P из АТP дајући АDP (тј. АТP га фосфорилише а сам се хидролизује). β подјединица је једна трансмембранска структура која делимично штрчи ван мембране. Сврха јој је да помаже кретању α подјединица. Неке Nа + /K + АТP-азе имају и малу γ подјединицу која учествује у ензимској регулацији пумпе. Na/K пумпа видео Na/K пумпа

39 Пинг-понг (Nа + /K + пумпа) Функционисање Nа + /K + АТP-азе базирана је на њеној могућности да доживи цикличне конформационе промене захваљујући енергији из АТP-а. Ову серију сукцесивних конформационих промена можемо описати преко два стања: стањa високог афинитета за Nа + или ПИНГ, и стањa високог афинитета за К + или ПОНГ. Функционисање Nа + /K + АТP- азе ствара мембрански потенцијал од mv. Jens Skou je године добио Нобелову награду за хемију због открића како функционишу јонске пумпе.

40 Друге јонске пумпе (АТP-азе P-типа) У плазма мембранама и мембранама ћелијских органела можемо наћи још пуно различитих јонских пумпи: H +,K + ATP-aзе, Ca 2+ ATP-aзe, K + ATP-aзe, H + ATP-aзe,... као и протонске пумпе које активира светлост. H +,K + ATP-aзе се могу наћи у мембранама ткива која облажу унутрашњост желуца и служе да одржавају веома ниску ph желудачног сока. Једначина која описује кинетику деловања овог антипортера је: nh + унутра +nk+ споља +ATP унутра nh+ споља +nk+ унутра +ADP унутра +P унутра + G унутра Ca 2+ ATP-aза одржава ниску концентрацију Ca +2 у ћелији (0.1µМ) која је потребна за пренос спољашњих сигнала у ћелију путем пасивне дифузије Ca +2 (која прати специфичне хемијске и физичке окидаче). 2Ca 2+ унутра +ATP унутра 2Ca2+ споља +ADP унутра +P унутра + G унутра Ca 2+ ATP-aза структура Ca ATP-aза Ca ATP-aза

41 Друге јонске пумпе (АТP-азе F-типа) Посебно је занимљива H + ATP-aза која се може наћи код бактерија (Halobacterium halobium, Escherichia coli), митохондријама, хлорпластима. Она користи или енергију фотона (Halobacterium halobium) или ATP-a (Escherichia coli) да би транспортовала H + -јоне ван ћелије (насупрот концентрационом градијенту). Као резултат насталог протонског градијента добија се извор енергије који се може искористити за синтезу ATP-a у митохондријама (Halobacterium halobium) или за вршење механичког рада (Escherichia coli). Занимљиво је да ова пумпа, која прво служи за избацивање H + -јона, може радити и у обрнутом смеру (као АТP синтаза). Постоје и ATP-aзе V- типа (вакуоларне) које исто преносе протоне и снижавају ph код многих организама (подврста су ATP-aза P-типа али још није познато тачно до детаља како раде). H + ATP-aза H + ATP-aза као ATP синтаза

42 "ABC" транспортери Представљају читаву фамилију АТР - зависних траспортера који служе за транспорт: амино-киселина киселина, пептида, протеина, металних јона, липида и других хидрофобних супстанција ван ћелије (насупрот конц. градијенту). Познат је MDR1 транспортер који је одговоран за резистентност неких тумора на антитуморске лекове (зато што пумпа лек ван мембране тумора). Већна "АВС" транспортера се налази у мембрани али има их и у ендо. ретикулуму, мембранама митохондрија и лизозома. "АВС" транспортери у главном функционишу као пумпе али има и оних који се понашају као јонски канали (који се активирају хидролизом АТР-а). Пример АВС транспортера Флипазе, група мембранских протеина чија је улога да пребацују мембранске липиде са једне на другу страну мембране, су такође из групе "АВС" транспортера. Ћелијски механизми који уклањају вишак холестерола из ћелије заснивају се на раду "АВС" транспортера. Мутације у генима који су одговорни за синтезу ових транспортера воде болестима као што су: цистична фиброза и анемија.

43 Транспорт глукозе Где год да је у ћелији потребна енергија, мора постојати систем за довод глукозе. Глукоза се нпр. у еритроците уводи помоћу специфичног транспортера GluT1 (већ је било речи о њему). Овај процес се одвија олакшаном дифузијом. Транспортер GluT1 GluT2 GluT3 GluT4 GluT5 GluT6 Локација транспорта Већина ћелија Јетра, бета ћелије панкреаса, хипоталамус Неурони, плацента Скелетни и срчани мишићи, сало Мукозна ткива у тестисима, сперма, бубрези Слезина, леукоцити, мозак Транспортер GluT7 GluT8 GluT9 Локација транспорта Микрозоми (у јетри) Тестиси, бластоцити, мозак Јетра, бубрези GluT10 Јетра, панкреас GluT11 GluT12 Срце, скелетни мишићи Скелетни мишићи, адипозно ткиво Тачна структура GluT1 транспортера ни данас није прецизно одређена. Процес транспорта глукозе може се описати механизмом који је аналоган ензимским реакцијама (Михаелис-МентеновогМентеновог типа).

44 Транспорт глукозе (кинетика) Уколико је супстрат глукоза ван ћелије (S out ), продукт глукоза у ћелији (S in ), а "ензим" је транспортер "Т"... тада можемо представити брзину "узимања" глукозе као функцију концентрације глукозе са спољашње стране мембране као: Зависност брзине узимања глукозе од њене спољашње концентрације Схематски опис транспорта глукозе Транспорт глукозе се одвија у четири корака: Брзина акумулације глукозе у ћелији (Михаелис Ментенова једначина) Процес преноса иде овако: Глукоза се везује за носач, смањује се активациона енергија за конформациону промену S out T 1 S in T 2, глукоза пролази кроз мембрану, глукоза се ослобађа у цитоплазму, транспортер се враћа у основну Т 1 конформацију. Схематски опис транспорта глукозе Носач поседује два конформациона облика Т1 и Т2. Графички приказ Михаелис Ментенове једначине

45 Лош транспорт глукозе (дијабетис) Када поједемо оброк који је веома богат угљеним хидратима, долази до повећања концентрације глукозе у крви (између оброка 5 mм). За уклањање тог вишка глукозе, задужени су миоцити срчаног и скелетних мишића (који је складиште као гликоген) или адипоцити (који је конвертују у триглицериде). За уклањање глукозе је овде задужен транспортер GluT4 чија је концентрација у мембрани иначе веома мала (наиме, GluT4 је у великој мери смештен у везикулама унутар ћелије). Како сад то све ради? Када се детектује повећана количина глукозе у крви долази до испуштања инсулина (хормон панкреаса). Овај процес индукује померање везикула богатих GluT4 до плазма мембране у коју га "убацују". На овај начин процес "узимања" глукозе се повећа 15 пута. По смањењу концентрације глукозе, смањује се секреција инсулина па се GluT4 враћају у своје везикуле. Код дијабетиса Типа 1 (diabetes mellitus) инсулин се не излучује, те не постоји процес узимања глукозе (храњење) мишића, већ она остаје у крви (па је детектујемо оним апаратима за мерење шећера). А шта се догађа код дијабетиса типа 2? Како се призводи вештачки инсулин? (људски ген који садржи инф. о производњи инсулина се убаци у ДНК бактерије која се затим користи као "фабрика" за производњу инсулина ($$$$$$$$$$).

46 Секундарни активни транспорт (јонски градијенти као енергија за активни транспорт) Јонски градијенти који се добијају као последица транспорта Na + и H + могу бити искоришћени за котранспорт различитих молекула насупрот њиховом концентрационом градијенту (лактозе, глукозе, амино киселина...). Примарни транспорт H + ван ћелије код E. coli: стандардно долази до успостављања протонског градијента и електричног потенцијала кроз мембрану док лактозни транспортер омогућава сада секундарни активни транспорт лактозе у ћелију уз симпорт H + низ конц. градинет (у ћелију). Коранспорт глукозе са Na + кроз плазма мембране епителијалних ћелија. Na + /K + ATP-азна пумпа одржава јонски концентрациони градијент, пумпајући Na + јоне напоље и на тај начин омогућава и котранспорт глукозе.

47 Хидрофилни трансмембрански канали - аквапорини- Фамилија интегралних мембранских протеина који су задужени искљичиво за брз транспорт воде кроз мембрану називају се аквапорини. До сада је код људи познато око 10 типова аквапорина. Сваки од њих задужени су за транспорт воде у одређеним типовима ћелија. Еритроцити имају пуно аквапорина у својим мебранама који им омогућавају да се брзо скупљају и шире (у зависности од осмоларности околне средине). Нефронске ћелије (у бубрезима) такође поседују пуно аквапорина с обзиром на потребу ових ћелија да реабсорбују воду током формирања урина. Молекули воде могу се кретати кроз аквапорине брзином чак од /s, што је малтене континуални ток воде кроз њих (вођен је осмоцким градијетом). Најбржи ензимски транспорт који је до сада забележен је 4x10 7 1/s (за ензим каталазу). Ипак, аквапорини су изузетно специфични за воду (нпр. веома је битно да кроз ове канале на пролази и хидронијум јон Н 3 О + ). Па како функционишу ти аквапорини?

48 Аквапорини - структура Као пример узећемо аквапорин АQP-1. Он је тетрамер, састоји се од четири мономерна протеина од којих сваки представља трансмембранску пору која по димензијама омогућава да кроз њу истовремено прође само 1 молекул воде (d= d=2-3а). Сваки мономер се састоји од 6 трансмембранских хеликоидалних сегмената и 2 краћа хеликса (који су постављени ка унутра и представљају филтер искључив само за воду). Остали остаци у мономерима су у главном неполарни али је омогућено формирање водоничних веза са молекулима воде који пролазе. Ипак, онемогућен је пролаз повезаних молекула воде (Н-везама) који могу представљати мостове за брзи транспорт протона дуж воденог ланца. Аргинински и хистидински остаци она 2 хеликса формирају благо позитивно наелектрисање које додатно осигурава немогућност пролаза протонима кроз пору.

49 Јон-селективни канали (мало детаљније) Представљају посебну врсту канала који су специфично селективни само за одређени тип јона. Поред јонских пумпи (већ било речи о њима), јонски канали додатно омогућавају брз проток специфичних јона када се за то постоји потреба. Првобитно су препознати код неурона али постоје у свим плазма и унутарћелијским мембранама еукариота. Веома су важни за регулисање трансмембранског потенцијала. Код неурона, брза промена активности јонских канала је од суштинске важности за промену мембранског потенцијала (акционог потенцијала) који носи сигнал од једног на други крај неурона. Код миоцита, брзо отварање Ca +2 канала у саркоплазмичном ретикиулуму доводи до ослобађања Ca +2 јона што индукује контракцију мишића. Као што смо већ напоменули, флукс проласка јона кроз јонске канале може бити за неколико редова величине бити већи него што је то случај код транспорта јона путем јонских транспортера ( јон/s) што је близу теоријског максимума за слободну дифузију. Пролазак јона кроз јон-селективне канале није концентрационо сатурисан (брзина проласка јона не достиже максимум при високој спољашњој концентрацији јона).

50 Јон-селективни канали (мало детаљније) Јон селективни канали поседују "врата" са обе своје стране (спољашње и унутрашње стране мембране). Ова "врата" се отварају и затварају као одговор на спољашње агенсе. Постоје лигандно и напонско контролисани јонски канали. Код лигандно-контролисаних јонских канала везивање малих молекула на спољашња или унутрашња "врата" канала доводи до алостеричке модификације канала (протеина) што отвара или затвара канал. Код напонски-контролисаних контролисаних јонских канала, промена трансмембранског електричног потецијала узрокује померање наелектрисаних делова протеина и на тај начин се канал отвара и затвара. Да би се јонски канал отворио потребан је свега део милисекунде, и такође, он може остати отворен свега неколико милисекунди (ово омогућава да ове молекулске машине буду веома ефикасне за транспорт сигнала нервног система). Па како можемо измерити овако кратку активност јонских канала? За ту сврху користимо електрична мерења patch-calmp calmp техником (као промена напона који се јавља између две стране мембране - који је реда mv, или као ток електичне струје - који је реда pa или µa).

51 Структура К + јонског канала Структуру К + јонског канала објаснићемо на примеру који се може наћи у бактерији Streptomyces lividans. Овакву структуру генерално имају и сви до сада познати К + јонски канали укључујући оне који су напонски регулисани (који су одговорни за пренос нервног сигнала кроз неуроне). Радијус јона К + је 1.33 А и он кроз овај канал пролази пута брже од јона Na + чији је радијус 0.95 А, и то брзином од 10 8 јон/s. Како то? K + јонски канал се састоји из 4 идентичне подјединице које пролазе кроз мембрану и формирају двоструки конус ко је проширен са спољње стране мембране. Структура К + јонског канала Свака подјединица има 2 дужа, трансмембранска α-хеликса као и један краћи. Спољашњи конус формира по један дужи α-хеликс од сваке подјединице док унутрашњи конус праве остали α-хеликси окружујући канал, правећи јонски филтер.

52 Структура и принцип рада К + јонског канала Са обе стране канала, на "вратима", налазе се негативно наелектрисани остаци амино-киселина који повећавају локалну концентрацију катјона као што су К + и Na +. На самом улазу, сви јони слободно улазе из раствора задржавајући своју хидратациону сферу. Краће α-подјединице усмерене су ка каналу (које су такође негативно наелектрисане те додатно стабилишу јоне). Ови мали хеликси до 2/3 пута полако сужавају канал одвајајући хидратациону сферу јонима (тј. узму им воду). Е сад оно право... кисеоникови атоми из карбонилне групе (од АК из хеликса) замењују молекуле H 2 O из сфере и затварају јон у "кавез"" (али( у који се могу уфитовати само јони К+). Јони Na + су исувише мали да направе контакт са кисеоничним лигандима. Јони К + овако кроз канал пролазе један по један, међусобно се одбијајући и тиме одржавају свој константан ток. Структура К + јонског канала

53 Структура и принцип рада К + јонског канала Постоје 4 потецијална места за која се могу везати К + јони (црвене карбонилне групе су обележене на слици). Ипак, истовремено су за везивање искоришћена само 2 места. Како сада то функционише? Јони калијума прво заузимају места 1 и 3 па затим "скоче" на места 2 и 4. Ствар је у томе што је канал тако направљен да је енергијска разлика између положаја 1-3 и 2-4 изузетно мала. 1 Овај размак између К + јона се дешава 2 сам по себи због њиховог међусобног одбијања. 3 Такође, ово одбијање спречава да 4 неки од јона буде дуже време везан за карбонилну групу (максимално Места везивања на ns), већ да постоји њихов константан К + јонском каналу ток кроз канал путем везивања и одбијања.

54 Структура Na + јонског канала Na + јонски канали у плазма-мембранама мембранама неурона и миоцита срчаних и скелетних мишића су по својој природи напонско регулисани канали. Они осећају електричне градијенте кроз мембрану на основу којих се отварају или затварају. Флукс који ови канали постижу за Na + јоне је већи од 10 7 јон/s. Када су у затвореном стању (затворена конформација) ови канали се могу брзо активирати (отворити) под утицајем трансмембранског електричног потенцијала. У отвореном стању Na + јонски канали остају свега део милисекунде када се брзо затварају и остају затворени чак неколико милисекунди. Овај процес је кључан за успешан транспорт нервног сигнала кроз аксон (сигнализација). Суштинска компонента Na + јонског канала је дугачак полипептид од 1840 АК који су организовани у 4 домена увијених око централног канала. Сваки од домена се састоји из 6 трансмембранских хеликса.

55 Структура неуронског Na + јонског канала Област сегмената између трансмембранских хеликса 5 и 6 назива се пором која је специфична по искључивом транспорту јона Na + јер у себи садржи филтер (према величини и налектрисању). Хеликс 4 садржи моноштво АК са позитивно наелектрисаним остацима и помера се у оквиру мембране као одговор на промену трансмембранског потенцијала. Потенцијал је "нормалан" када је унутрашњост мембране негативна (око -60 mv) и креће се до око +40 mv када се преноси сигнал. Померање хеликса 4 (услед( промене потенцијала) условљава отварање канала. Затворен канал (поларизована мембрана) Отворен канал (деполаризована мембрана) Отворен канал се затвара помоћу специфичног механизма (лопта+ланац). Како то ради? Да дну канала (део ка цитосолу) налази се један лоптасти протеин који је повезан кратким полипептидним сегментом (ланац) за канал. Лопта се слободно креће када је канал затворен. Међутим, када се канал отвори (помери се 4 хеликс) то условљава ослобађање места где се лоптасти протеин веже за дно канала (повучен оним кратким сегментом) и тако га затвора. Од дужине полипептидног ланца зависи колико ће канал дуго бити отворен.

56 Да сумирамо шта смо научили што се тиче јонских канала До сада смо видели да се пасивни транспорт јона и малих молекула најефикасније обавља порама, каналима и носачима. За разлику од њих јонске пумпе транспортују јоне активно насупрот концентрацоном градијенту трошећи енергију коју производи ћелија. Брзина олакшане дифузије каналима је више од 1000 пута већа од брзине транспорта јонским пумпама (приближна дифузији у воденим растворима). Видели смо да је структура јонских канала веома комплексна и да они не представљају обичне "цеви" који пролазе кроз мембрану. Структура јонских канала битно зависи од њихове околине. У зависности од околине, канали могу заузети једно од два конформациона стања: отворено или затворено. Окидач за постојање једног од два стања може бити: - хемијска активација (везивањем специфичних лиганада за канал као код аквапорина, Г-протеина или неуротрансмитера ацетилхолина) - електрична активација (деполаризација елетричног поља) - механичка активација (торзија, спољашњи притисак... ) - индукована светлошћу (апсорпција фотона).

57 Акциони потенцијал -транспорт електричног сигнала дуж аксона- Како померамо стопало? Како долази до преноса електричног сигнала од мозга-преко неурона-до мишића? Свака нервна ћелија (неурон) има дугачак део (аксон) који се користи за пренос сигнала. Аксони су направљени да би преносили електричне сигнале што се назива акциони потенцијал. Аксони су обложени Швановим ћелијама које изолују аксон и помажу да се електирчни сигнал транспортује брже и ефикасније. Нерв Аксон Акциони потенцијал АКЦИОНИ ПОТЕНЦИЈАЛ

58 Неуронске синапсе На који начин сада долази до преноса неуро-сигнала на следећи неурон? Тај прелазак се дешава преко неуронских синапси. Синапса Шта су то неуротрансмитери? Која је улога Ca у овом процесу? Неуротрансмитери су посебни молекули који су смештени у везикулама на крају аксона. То су: амино-киселине (глицин, глутамат, аспартат, серин,, GABA), моноамини (допамин, норадреналин, епинефрин, серотонин, мелатонин) и остали (ацетилхолин, аденозин, хистамин, NO, CO, Zn (не( пакују се у везикуле већ се само ослобађају у синаптички расцеп...) Када неуро-сигнал дође до краја аксона, то изазива отварање Ca канала и Ca улеће у неурон и везује се за везикуле. То индукује процес интегрисања везикула (који су пуне неуротрансмитера) у мембрану и испуштања неуротрансмитера из ћелије у синаптички расцеп (простор између две нервне ћелије). Неуротрансмитери се затим везују за рецепторе пост-синаптичког синаптичког неурона. То изазива деполаризацију аксона уласком Na кроз мембрану путем олакшане дифузије, појаву акционог потенција... и сигнал путује даље. После обавњеног посла, неуротрансмитери се паковањем у везикуле и проласком кроз мембрану. Синапса 1 Синапса 2 враћају у пре-синаптички неурон

59 Ометање нормалног преноса неуро-сигнала Који све проблеми могу настати у процесу преноса неуро-сигнала сигнала? Демијенализација - МС (мултиплекс склероза) МС Лајмска болест - уз оштећења нервног система Лајмска болест Неуротоксини - принцип деловања. Неуротоксини Конзумирање опојних дрога - активација хиперпродукције допамина. Метафемини Прозак (антидепресив) - инхибира поновно преузимања употребљеног серотонина. Прозак Глутамат

60 Кончно да сумирамо транспорт...

61 Испитивање јонских канала patch-calmp calmp техника Електричне методе за испитивање јонских канала су коришћене давно пре него што је била позната њихова структура. Patch-calmp calmp техника користи појачавач трансмембранског напона и стаклене пипете са врхом микрометарских димензија (за мерење струје). Принцип је следећи: - округли врх пипете (пречника око 1µm) се притисне уз ћелијску мембрану - примени се мали вакум да би се осигурао контакт са ћелијом. - унутрашњост пипете је испуњена електролитом да би се контролисало понашање јонских канала присутних у "ухваћеном" делу мембране. Да би се могле мерити мале струје створене проласком јона кроз канале, отпор између пипете и мембране мора бити велики тзв. gigaseal. Зато је вакум веома важан јер не дозвољава да медијум око ћелије продре у електролит. Patch-clamp clamp техника интерактивни приказ

62 Patch-calmp calmp методе снимања У зависности од типа контакта између пипете и ћелије постоји четири типа снимања: - cell attached (за мерење сигнала појединих канала који су унутар "закрпе" - велики отпор. - whole cell (вакумски пулс остварује електрични контакт са унутрашњошћу ћелије) мембрана пуца - снимају се сви јонски канали у мембрани + могућност убацивања хем. реагенса у ћелију. - inside out (као whole cell уз одвајање пипете од ћелије приком чега се откида канал уз затварање у односу на околни медијум. За ипитивање једног канала у цитоплазмичном медијуму. - outside out (као whole cell уз одвајање пипете од ћелије када се ствара везикула на њеном врху. За испитивање понашања једног канала под утицајем спољашњих рецептора. Интерактивни приказ типова снимања

63 Patch-calmp calmp метода Три од описаних метода снимања служе за мерење појединачних јонских канала под утицајем различитих агенаса. Какве информације добијамо из patch-clamp clamp мерења? - на слици је типичан patch-clamp clamp сигнал једног канала - присуство или одсуство струје говори нам о томе да ли је канал отворен или затворен Вежба: Примена Patch Clamp технике за снимање јонских канала код Xenopus Oocytes (јајна ћелија жабе) Електрофизиолошка испитивања јонских канала доказала су хипотезу о постојању мембранских структура која се понашају као врата за јоне. Neher & Sakmann су године добили Нобелову награду за физиологију и медицину за развој patch-clamp clamp технике

64 Фотосинтеза Како биљке долазе до хране? Стварају је саме. Како? Из СО 2 путем фотосинтезе. Процес фотосинтезе се састоји из светле и тамне фазе. У светлој фази (догађа се дању), биљке користе енергију Сунца (светлост) да би створиле енергијске молекуле NADPH и ATP (e - транспортни ланац у тилакоидним мембранама хлоропласта). У овој фази се ослобађа О 2 (добијен из воде). Овде једну од кључних улога има хлорофил (молекул, пигмент, који веома ефикасно апсобује светлосну Е и усмерава је на реакционе центре. У тамној фази (Калвинов циклус, догађа се и дању и ноћу), биљке стварају глукозу и друге угљене-хидрате из СО 2 користећи енергију добијену у светлој фази. Овај процес се одиграва у стромама хлоропласта. Добијена глукоза се може трошити у процесу респирације (добијање АТР уз утрошак О 2 и ослобађање СО 2 ) или складиштити и виду скроба (амилоза, амилопектин... молекули глукозе повезани α(1,4) и α(1,6) гликозидним везама...). Light Фотосинтеза 1 Фотосинтеза 2 Добијање глукозе Хлорофил а и б Фотосинтеза

65 АФМ као метода за испитивање мембрана Једна од метода која се може искористити за испитивање мембранских протеина је АФМ (Atomic Force Microscopy). Принцип је у томе што се веома зашиљен врх микроскопске пробе, који се налази на носачу "клацкалици", превлачи преко неравне површине мембране. Електростатичке и Ван-Дер Дер-Валсове силе, које се јављају између тог врха и површине узорка, померају пробу горе-доле те се тако могу детектовати "брда" и "долине" на узорку. AФМ слика аквапорина Е. Colli Ласерски зрак који је усмерен на "клацкалицу" детектује њено померања реда 0.1nm nm. Скенирањем дуж X и Y осе добијамо тродимензиону слику површине мембране са резолуцијом од 0.1 nm. AФМ видео АФМ принцип рада

66 EPR -primene u biološkim sistemima-

67 Spinske probe i spinski obeleživači Spinske probe stabilni (dugoživeći) slobodni radikali (nitroksidi) koji se ubacuju u sistem da bi se ispitala neka osobina Modifikacija osobina ručka Sterno zaklanjanje reaktivne grupe Spinski obeleživači (spin labels) nitroksidi vezani za druge molekule praćenje ponašanja obeleženih molekula

68 Spinske probe i obeleživači (EPR spektri) TEMPONE Paramagnetni elektron spin-labela se nalazi u sp 3 orbitali između N i O. I N =1, a I O =0. Jezgro sa spinom 1 ima 3 moguće vrednosti magnetnog momenta (+1,0,-1) pa dolazi do cepanja oba energetska nivoa elektrona (m S =1/2 i m S =- 1/2) na po tri. Iz jednačine E = gβeb, vidimo da razlike u energiji vode ka različitim rezonantnim uslovima. Na osnovu izbornog pravila Δm S =±1 (spinski nivoi) i Δm I =0 (Zemanovi nivoi) moguća su 3 prelaza, pa postoje i 3 linije. +½ M I EPR spektar a M S =±½ ΔE 1 ΔE 2 ΔE 3 -½ M I triplet B * Svaka linija je i dodatno proširena usled interakcije sa protonima (I=1/2) iz susednih CH 3 grupa (super hiper fina interakcija), vide se i 13 C (I=1/2) sateliti... ali, polako

69 Kretanje lipida u membrani Termalni pokreti hidrofobnog dela Uređenost unutrašnjosti membrane Lateralno kretanje lipida difuzija Transverzalno kretanje flip-flop

70 Fosfolipidne membrane kao modeli za ispitivanje osobina membrana. Spontano ili indukovano formiranje fosfolipidnog dvosloja Planarne membrane (black film) Liposomi (lipidne vezikule) spontano ili sonifikacija SUV (out-in 65-35%) Problem je šta sa krajevima, pa se krajevi zakače za nešto LUV (out-in 50-50%) Small or large unilamellar vesicles MLV Multilamellar vesicles EM multilamelarne Goldžijeve strukture

71 Lipozomi - uređenost i fazni prelazi EPR spinske probe Selektivno obeležavanje pozicije duž lanca Fazni prelaz = gel (uređeno) neuređeno (tečni kristal) DS u vodi DS u membrani Uticaj pokretljivosti spinske probe na izgled EPR spektra Određivanje faktora uređenosti S fosfolipidnog dvosloja metodom EPR spinskih proba

72 Šta se dešava sa EPR spektrima spin-labela kada se ugrade u membranu??? C O OH + H 2 O O N O U vodenom rastvoru + Integrisan u membranu 7-DS Ukupan spektar 7DS-a ugradjenog u membranu potpuno odudara od onog iz rastvora. Do toga dolazi zbog anizotropije.

73 5,7,12-DS u membrani Što je fluidnost veća, molekuli se slobodnije kreću pa dolazi do postepenog gubitka anizotropije i spektar je sve sličniji onom iz rastvora. Spektri za dve ekstremne situacije postaju identični, a ukupni spektar uži zašto??? Širina spektralnih linija = (2τ 1 ) -1 + (1 + γ e 2 B 1 2 τ 1 τ 2 ) 1/2 τ 2-1 gde su: τ 1 i τ 2 longitudinalno i transverzalno relaksaciono vreme, B 1 je magnetna komponenta ulaznog zračenja); γ e je žiromagnetni odnos. τ 1 opisuje gubitak magnetizacije, relaksaciju koja nastaje kroz proces gde apsorbovana energija prelazi u toplotu (spin-rešetka relaksacija). τ 2 opisuje gubitak magnetizacije kroz gubitak faze, energija se prenosi sa elektrona na elektron (spin-spin relaksacija) Širina linije je u principu obrnuto proporcionalna brzini relaksacije. Kada je membrana rigidnija, spinovi su bliži jedan drugome tako da lakše dolazi do spinske difuzije, a veći broj sudara doprinosi spin-rešetka relaksaciji. Relaksacija je tada brža, a linije šire. Kada se poveća mobilnost molekula (spin-label-a) u membrani relaksacija ide sporije, pa su i linije uže. Ovo je još jedan faktor, osim anizotropije, koji daje direktnu vezu izmedju fluidnosti membrane i širine spektralnih linija. Fluidnost membrane se povećava od površine prema unutra. Polarne glave su relativno gusto spakovane na površini, međusobno se privlače ili odbijaju i interaguju sa vodom u okolini. Od njih se prema sredini membrane pruža(ju) masnokiselinski lanac koji nepolaran. U blizini glave on je slabo pokretan. Međutim što se ide dalje od polarnog dela, hidrofobni rep je sve slobodniji i tu se može uočiti veća fluidnost.