Vplyv inhibície na priebeh reakcie vo vsádzkovom reaktore

Transcript

1 plyv inhibície na priebeh reakcie vo vádzkovo reaktore TEORETICÝ ÚOD Enzýové inhibítory ú látky, ktoré poaľujú alebo pôobujú zatavenie cheických reakcií. Enzýy katalyzujú prakticky všetky bunkové procey, preto nie je prekvapujúce, že enzýové inhibítory patria k najdôležitejší látka pri výkue, vo výrobe aj aplikácii. Z hľadika echanizu pôobenia rozoznávae štyri typy inhibície. Pri kopetitívnej inhibícii inhibítor úťaží o ubtráto o aktívne ieto enzýu. Ak inhibítor obadí aktívne ieto, zabraňuje tak väzbe ubtrátu do enzýu. opetitívne inhibítory ú štruktúrne čato veľi podobné ubtrátu a interagujú enzýo za vzniku koplexu EI, avšak bez naledujúcej katalytickej reakcie. opetetívnyi inhibítori bývajú čato i produkty enzýovej reakcie. opetitívna inhibícia ôže byť analyzovaná kvantitatívne rovnovážnou kinetikou. prítonoti kopetetívneho inhibítora, vyzerá ichaeli-entenovej rovnica naledovne: r p c (1) + c kde r P rýchloť vzniku produktu, je axiálna rýchloť neinhibovanej reakcie a je zdanlivá ichaeliova konštanta pre kopetetívnu inhibíciu pre ktorú platí: c (1 + ) (2) I 1 kde je ichaeliova konštanta neinhibovanej reakcie, c je koncentrácia ubtrátu a I 1 je ihibičná konštanta.. Pretože a inhibítor viaže reverzibilne do enzýu, ôže byť kopetitívne vytlačený ubtráto zvýšení koncentrácie ubtrátu. eď [S] >> [I], pravdepodobnoť, že olekula inhibítora bude viazaná do enzýu je inializovaná a reakcia vykazuje norálnu hodnotu. Jednoduchý príklado kopetetívnej inhibície je otrava etanolo. ax Alkoholdehydrogenáza ení etanol na foraldehyd, ktorý je škodlivý pre nohé tkanivá Etanol ako alternatívny ubtrát je účinný v kopetícii o aktívne ieto na

2 alkoholdehydrogenáze a terapia počíva v intravenóznej infúzii etanolu, ktorý poalí tvorbu foraldehydu a zníži tak riziko vážneho poškodenia itých tkanív, zatiaľ čo obličky odfiltrujú etanol do oču. Pri nekopetetívnej inhibícii a inhibítor viaže io aktívneho ieta a neovplyvní afinitu ubtrátu k enzýu, avšak zníži a rýchloť enzýovej reakcie. Pri toto type inhibície a teda ení a hodnota a neení... Pre čito nekopetetívneho inhibíciu, vyzerá ichaeli-entenovej rovnica naledovne: r p c + c a zdanlivá axiálna rýchloť inhibovanej reakcie je vyjadrená: 1 c 1+ I I2 (3) (4) kde je zdanlivá axiálna rýchloť inhibovanej reakcie, I2 je inhibičná konštanta. Avšak takýto typ čitej nekopetetívnej inhibície je veľi zriedkavý a zväčša väzba inhibítora ovplyvňuje aj štruktúru aktívneho ieta a teda aj afinitu ubtrátu k enzýu a teda aj hodnotu. Pre takúto ziešanú inhibíciu vyzerá ichaeli-entenovej rovnica naledovne: r p c + c (5) Pri akopetetívnej inhibícii a inhibítory viažu až na koplex enzý-ubtrát a tý zabraňujú rozpadu na produkt. Paraetre a a znižujú rovnakou ierou, takže ich poer je rovnaký ako v prípade neinhibovanej reakcie a je ju ožné ľahko odhaliť pretože platí: (6) Cieľo tejto laboratórnej práce je navrhnúť vhodný ateatický odel opiujúci inhibíciu invertázy CuSO 4 a zitiť jeho kinetické paraetre na základe naeraných údajov, pričo rozhodujúci teto vhodnoti navrhovaného ateatického odelu bude priliehavoť naeraných (experient) a vypočítaných údajov (ateatický odel). Typický experient na eranie enzýovej kinetiky ôže byť vykonaný naledujúci pôobo.

3 čae nula a do zei vodného roztoku ubtrátu inhibítoro pridá enzý a vo vzorkách odoberaných v prených čaových intervaloch a zitia koncentrácie potrebovaného ubtrátu rep. produktu vhodnou analytickou etódou. Pri vyhodnocovaní kinetických paraetrov, a použijú len začiatočné údaje zeny koncentrácie od čau (rýchloť vzniku rep. zániku zložky diferenciálne údaje) keď ú oni ešte tále lineárnou záviloťou. Z naeraných údajov, koncentrácie ubtrátu/produktu ako funkcia čau, a vypočíta ernica priakovej záviloti pre danú začiatočnú koncentráciu ubtrátu: dcp dcs dt dt t 0 t 0 ( ri ) t 0 a vyneie a grafická záviloť rp f(c). Avšak rovnica v toto tvare (7) charakterizujúca yté inhibíciou ( rovnice 1,3,5 ) nie je veľi vhodná na zíkanie kinetických paraetrov, pretože funkcia r P nezávií na paraetroch lineárne (je to nelineárna funkcia). Preto je potrebné rovnice pre inhibície upraviť (zlinearizovať) tak, aby nová závile preenná (y new y) záviela na nových (odifikovaných) paraetroch k 1, k 2 lineárne. Jednou z ožných úprav používaných v enzýovej kinetike je Lineweaver-Burkova linearizácia, kde napríklad pre kopetetívnu inhibíciu je ichaeli-entenovej rovnica upravená do tvaru: 1 r p 1 + I I (8) c c Avšak kinetické paraetre zitené lineárnou regreiou ú neprené a linearizácia a používa iba na prvotný odhad hodnôt kinetickýchparaetrov. Prenejšou etódou na vyhodnotenie paraetrov ateatického odelu je nelineárna regreia. Zitenie kinetických paraetrov je dôležité pre kalkuláciu produktivity reakčného ytéu. Produktivita a niekde definuje aj ako špecifický výkon reaktora. Optiálna produktivita je jedný z najdôležitejších kritérií pri návrhu a prevádzkovaní reaktora. yjadruje koľko žiadaného produktu a vyprodukuje za jednotku čau v dano objee v dano reakčno čae. ypočíta a podľa vzťahu : c p *L Pr (3.33) R ( t + t ) op i kde Pr je produktivita ytéu, R je obje reaktora, L je obje kvapalnej fázy v reaktore, t op je operačný ča, t i je reakčný ča. Operačný ča predtavuje ča na vyprázdnenie,

4 vyčitenie a znovu naplnenie reaktora. Z čaového priebehu produktivity a zití axiálna produktivita pre danú vtupnú koncentráciu ubtrátu. Avšak axiálne produktivita nie je jediný kritério pri návrhu reaktora, do úvahy treba brať aj náklady na doiahnutie ax. produktivity (napr. náklady na iešadlo, náklady na ubtrát, katalyzátor, náklady na doiahnutie reakčnej teploty). Náklady na iešadlo, vyjadrené ako celkový príkon na iešadlo pre doiahnutie ax. produktivity, ú čato dôležitý prevádzkový náklado. Ak je na hriadeli viac ako jedno iešadlo na výpočet príkonu ožno aplikovať naledujúci vzťah: P 3 5 ni N pρ L N d (2.28) kde P je príkon na iešadlo v neaerovano ytée, n I je počet iešadiel, N P je príkonové čílo pre Ruhtonovu turbínu N P 5.2, ρ L je hutota iešanej kvapaliny, N je počet otáčok iešadla, d je prieer iešadla.

5 2. CIEĽ PRÁCE 1. Ukutočniť erania rýchloti enzýovej reakcie etódou začiatočných rýchlotí v ytée invertáza-acharóza inhibítoro. 1. Na základe porovnania experientálnych závilotí r p f(c 0 ) inhibíciou a bez (výledky z práce č.5) určiť o aký typ inhibície ide. 2. etódou lineárnej regreie vypočítať približné hodnoty paraetrov,,i1, I 2 z experientálnych údajov závilotí / r f (1/ c ). 1 p 0 3. Prenoť vypočítaných paraetrov overiť ich výpočto etódou nelineárnej regreie (atlab, Athéna). 4. Overiť platnoť identifikovaného inhibičného odelu grafický porovnaní experientálnych a vypočítaných hodnôt závilotí r p f(c 0 ). 5. Poocou vypočítaných kinetických paraetrov naiulovať čaové priebehy produktu pre rôzne začiatočné koncentrácie ubtrátu Pre jednotlivé vtupné koncentrácie ubtrátu zitiť axiálne produktivity. 6. Určiť koncentráciu ubtrátu pri ktorej a doahuje axiálna produktivita vztiahnutá na celkové nožtvo energie dodané na iešadlo. 7. Ako ovplyvní priebeh reakcie a produktivitu zvýšená koncentrácia katalyzátora -vyvetli na iulácii. 8. Ak by te ako technológ ali k dipozícii 2 katalyzátory katalyzujúce rovnakú reakciu ktoré a líšia iba v hodnote, ktorý katalyzátor by te i te i vybrali a prečo? yvetli na iulácii. 9. Exitujú podienky za akých a dá doiahnuť rovnaká produktivita v inhibovano a neinhibovano ytée? yvetli na iulácii.

6 EXPERIENTÁLNA ČASŤ 3.1 ateriály Použitý enzý Ako experientálny yté používae enzý kvaničnú invertázu (E.C ) ktorá katalyzuje hydrolýzu acharózy za vzniku glukózy a fruktózy podľa naledujúcej reakcie: C 12 Η 22 Ο 11 + Η 2 Ο C 6 Η 12 Ο 6 + C 6 Η 12 Ο 6 (21) Použité roztoky 1. acetátový pufor ph 4,8 koncentráciou 0,1 ol/l 2. záobný roztok enzýu 4 g/l vo vode (kvaničná invertáza, Frakcia, aktivita 44U/g, Siga) l záobný roztok acharózy koncentráciou 0,2 ol/l v 0,1 ol/l acetátovo pufri ph 4, l z roztokov acharózy rôznou koncentráciou (záobný roztok acharózy riediť veľi prene!!! acetátový pufro podľa rozpiu uvedeno v Tabuľke č.1) 3. inhibítor - roztok CuSO 4 koncentráciou 0,16 ol/l (25 l) 3.2 Enzýová reakcia 1. Enzýová reakcia prebieha v uzavretých 1,5 l Ependorfových kúavkách. Do 740 µl acharózového roztoku rôznou koncentráciou ( Tabuľka 2, vzorky č ) pridáe 10µl inhibítora, ependorfky uzavriee a v terotate teperuje 15 inút pri teplote 30 C. 2. Po vyteperovaní naštartujee enzýovú reakciu tak, že pridáe do každej vzorky po 50 µl záobného roztoku enzýu v čaových intervaloch uvedených v Tabuľke 3.

7 Eppfendorovu kúavku tene uzavriee, ze ihneď preiešae na vortexe a vrátie do terotatu. Na topkách ledujee ča reakcie. 3. Prene po 50 inútach reakciu v Ependorfových kúavkách zatavíe prídavko 100µl roztoku NaOH koncentráciou 2 ol/l a ze zhoogenizujee na vortexe (čaový rozpi v Tabuľke č. 2). 4. nožtvo uvoľneného produktu enzýovej reakcie (glukózy) tanovíe glukózový teto pektrofotoetricky. 3.3 Stanovenie glukózy glukózový teto Princíp Na tanovenie produktu enzýovej reakcie glukózy a používa glukózový tet GLU GOD 6 x250. Základo tanovenia glukózy je vytvorenie farebného koplexu ktorého aborbancia a eria pektrofotoetricky. Tento koplex vzniká pri elektívnej oxidácii glukózy na peroxid vodíka a glukonát poocou glukózooxidázy. zniknutý peroxid vodíka a tanovuje oxidačnou reakciou o ubtituovaný fenolo a 4-ainoantipyríno katalyzovano peroxidázou, pričo vzniká červeno farbený produkt. Princíp tanovenia uvoľnenej glukózy: β D glukóza + H (22) glukóza oxidáza 2O2 + O2 D glukonát + H 2O2 peroxidáza H 2 O2 + farbivoredukované farbivooxidáza + H 2O (23) Potup 1. Roztok glukózového tetu predhrejee na 30 C. Do ependorfiek pipetujee po 1 l tohto roztoku. Počet ependorfiek je rovný počtu štandardov glukózy + 3 x počet vzoriek. 2. Do glukózového tetu pridáe kvantitatívne po10 µl dobre zhoogenizovaných vzoriek alebo štandardov glukózy. Ependofove kúavky tene uzavriee, ze dôkladne preiešae na vortexe. 3. Stojan ependorfkai odložíe na tavé ieto a necháe 30 in inkubovať.

8 4. Po ukončení inkubácie vzorky vyberiee, preiešae na vortexe a v každej zeriae aborbanciu pri aborpčno axie produktu tanovenia (500 n) oproti vode. zorka č.1 je lepý pokuo. 5. Na zotrojenie kalibračnej čiary použijee už vopred pripravené štandardné roztoky glukózy koncentráciou: ol/l. 3. YHODNOTENIE NAERANÝCH ÚDAJO 1. Z eraní aborbancie štandardných roztokov glukózy zhotovíe kalibračnú záviloť, vypočítae paraetre kalibračnej rovnice a regrený koeficient. 2. ypočítae koncentráciu uvoľnenej glukózy vo vzorkách poocou kalibračnej čiary. 3. Rýchloť vzniku produktu pre jednotlivé začiatočné koncentrácie acharózy vypočítae podľa vzťahu: c GL Celk r p (24) t RZ kde r p je rýchloť enzýovej reakcie (rýchloť vzniku produktu), c GL koncentrácia produktu - glukózy (ol/l), t reakčný ča, Celk je celkový obje po zatavení reakcie, RZ je obje reakčnej zei (ach+enzýu). 4. Na základe porovnania experientálnych závilotí r p f(c S0 ) inhibíciou a bez (výledky z práce č.5) určíe o aký typ inhibície ide. 5. Zo záviloti etódou lineárnej a nelineárnej regreie vypočítae zdanlivé paraetre,., I 6. Správnoť vypočítaných paraetrov overíe graficky porovnaní experientálnych a vypočítaných hodnôt závilotí.

9 5. ZOZNA POUŽITÝCH SYBOLO Sybol Ab Názov veličiny aborbancia pri 500 n c koncentrácia produktu - glukózy GL c 0 dc dcp D D 1 D 2 začiatočná koncentrácia ubtrátu zena koncentrácie ubtrátu zena koncentrácie produktu deterinant ubdeterinant ubdeterinant k vektor paraetrov k 1, k 2 k 1 odifikovaný paraeter k 2 odifikovaný paraeter konštanta icheali-entenovej zdanlivá konštanta icheali-entenovej pre inhibovanú reakciu r p t rýchloť enzýovej reakcie reakčný ča celkový obje po zatavení reakcie Celk axiálna rýchloť enzýovej reakcie zdanlivá axiálna rýchloť enzýovej reakcie pre inhibovanú reakciu obje reakčnej zei RZ I 1, I2 x inhibičné konštanty vektor nezávile preenných x odifikovaná nezávile preenná x 1/c 0 x i exp y y i cal y i exp experientálne hodnoty nezávile preennej odifikovaná závile preenná y 1/r P vypočítané hodnoty závile preennej experientálne hodnoty závile preennej

10

11 6. PRÍLOHY TABUĽA 2 Príprava roztokov ubtrátu vzorka č záobný. roztok acharózy (l) pufor (l) výledná koncentrácia ubtrátu (ol/l) TABUĽA 3 Čaový rozpi erania priebehu enzýovej reakcie vzorka č štart reakcie ča/in top reakcie ča/in 12