Mikroskop Osnove mikroskopiranja

Transcript

1 Mikroskop Osnove mikroskopiranja Uvod v svetlobni mikroskop B.T. 2001

2 PRVI DEL Osnovna načela v svetlobni mikroskopiji Uvod v svetlobni mikroskop Kaj je mikroskop? Kako deluje? V knjižici bo bralec našel odgovore na taka vprašanja ob najmanjši meri potrebnega tehničnega in matematičnega zapletanja. Poznavanje osnov je nujno za uspešno uporabljanje mikroskopa. Z napotki v tej knjižici se bomo lažje odločili za ustrezno mikroskopsko opremo, potrebno za različne načine mikroskopiranja. Z njeno pomočjo bomo lažje razumeli enostavne in elegantne ideje, ki so vodile do nastanka mikroskopa. V prvem delu so razložena osnovna načela, sledi opis sestavnih delov in na koncu še pomembne podrobnosti. Mikroskopi so naprave, narejene tako, da dajo povečano sliko majhnih objektov, ki jo lahko neposredno vidimo ali fotografiramo. Razumevanje delovanja mikroskopa je lažje, če ga primerjamo z vsem dobro znano napravo, diaprojektorjem. Predstavljajmo si navpično postavljen projektor, z objektivom obrnjenim navzgor. Svetloba iz žarnice potuje skozi lečo kondenzorja, nato skozi diapozitiv ter skozi leče objektiva na zaslon, ki je postavljen pod pravim kotom glede na pot svetlobnih žarkov, na primerni oddaljenosti od leč objektiva. Realna slika diapozitiva na zaslonu je obrnjena (zgoraj-spodaj in levo-desno) in povečana. Če bi zaslon odstranili in s povečevalnim steklom (lupo) opazovali to sliko, bi jo lahko videli še večjo, torej bi jo še enkrat povečali. Opisano dogajanje je bistvo opazovanja z mikroskopom s presevno svetlobo. Svetloba iz žarnice potuje skozi kondenzor pritrjen pod mizico; nato skozi prosojen objekt, ki leži na stekelcu nad odprtino v mizici; nato skozi leče objektiva (podobnega objektivu diaprojektorja) in v notranjosti cevastega tubusa ustvari realno, povečano in obrnjeno sliko objekta. To sliko nato dodatno povečajo leče v okularju (podobno kot lupa na sliki 1) in jo posredujejo v opazovalčevo oko. Opazovalec vidi dvakrat povečano navidezno sliko v oddaljenosti približno 25cm od očesa. Slika 1. Primerjava diaprojektorja in mikroskopa. Slika 2. V sestavljenem mikroskopu vmesno sliko, ki jo ustvari objektiv, poveča še okular 2 Osnove mikroskopiranja; Uvod v svetlobni mikroskop

3 Ti osnovni principi so podlaga za delovanje in izdelavo sestavljenega mikroskopa, katerega ime izvira iz večjega števila leč razporejenih v skupine, za razliko od lupe ali enostavnega mikroskopa, kjer so leče posamič. Izboljševanje preprostih osnov je v teku stoletij pripeljalo do današnjih izjemno zapletenih in izpopolnjenih naprav. Današnji mikroskopi so pogosto narejeni iz posameznih sklopov, ki jih je moč zamenjevati in tako mikroskop prilagajati različnim tehnikam mikroskopiranja, njihova optika pa omogoča velike povečave ob izjemni jasnosti in kontrastnosti slike. Deli mikroskopa in njihov pomen, osvetlitev in svetloba POVEČEVALNE LEČE Enostavni mikroskop ali povečevalno steklo ustvarita sliko objekta. Leča je konveksna, to pomeni, da je v sredini debelejša kot na robu. Slika, ki jo vidi oko, je od njega navidezno oddaljena 25 cm. Ker je slika na isti strani leče kot objekt, je ne moremo projecirati na zaslon. Zato jo imenujemo navidezna slika in je pokončna, ne pa obrnjena. Slika 3. Enostavno povečevalo. Povečevalno steklo je ena sama leča, ki sliko objekta poveča v enem koraku. Slika 4. Odnos med optično in mehansko dolžino tubusa. Osnove mikroskopiranja; Uvod v svetlobni mikroskop 3

4 V sestavljenem mikroskopu sta dve vrsti povečevalnih leč: a. Leča objektiva na spodnji strani tubusa, ki ima majhno goriščno razdaljo in je precej blizu objekta, projecira povečano realno sliko objekta v notranjost tubusa. Ta slika je obrnjena in projecirana na natančno določeno razdaljo v notranjosti tubusa (kar imenujemo optična dolžina tubusa). Če bi v tubus potisnili jedkano steklo ali kak drug prosojen zaslon, bi to realno sliko lahko videli. Objektiv vsebuje najpomembnejše leče v mikroskopu, saj morajo dati jasno sliko visoke ločljivosti. Če je objektiv nekvaliteten in nima odpravljenih napak (aberacij), bo tudi slika slaba. Objektiv ima nekaj pomembnih nalog: 1. objektiv mora zbrati svetlobo, ki prihaja z različnih delov ali točk objekta. 2. objektiv mora biti sposoben posredovati svetlobo, ki prihaja iz različnih točk na objektu, na odgovarjajoče točke na sliki (včasih imenovane antitočke). Slika 5. Slika točke, ki jo ustvari leča, ni nikdar točka, temveč okrogel disk končnega premera, imenovan antitočka. 3. objektiv mora biti narejen tako, da bo njegova goriščna razdalja dovolj blizu objektu, kar mu omogoča projeciranje povečane realne slike v notranjost tubusa. b. Okularna leča v okularju, ki je vstavljen v tubus na njegovi zgornji strani. Okular ima rob s katerim je zataknjen v rob tubusa in mu preprečuje, da bi zdrknil vanj. Položaj okularja je tak, da njegova zgornja leča dodatno poveča realno sliko, ki jo projecira objektiv. Oko opazovalca vidi sekundarno povečano sliko kot bi bila oddaljena 25 cm, torej je slika navidezno nekje pri dnu mikroskopa. Pri tej oddaljenosti je namreč ločljivost povprečnega človeškega očesa najboljša. Razdalja od vrha tubusa do roba objektiva s katerim je ta pritrjen v revolver, je običajno 160 mm. To razdaljo imenujemo mehanska dolžina tubusa. Okular ima nekaj pomembnih nalog: 1. namen okularja je dodatno povečati realno sliko objekta, ki jo projecira objektiv 2. pri opazovanju okular ustvari sekundarno povečano navidezno sliko 3. pri fotomikrografiji ustvari sekundarno povečano realno sliko realne slike, ki jo projecira objektiv. To povečano realno sliko lahko projeciramo na fotografski film v kameri ali na zaslon nameščen v primerni razdalji nad okularjem 4. v okular lahko vstavimo merilca ali druge oznake na tak način, da je njihova slika vidna istočasno s sliko objekta Slika objekta je povečana dvakrat, najprej z objektivom in nato še z okularjem. Taka razporeditev lečja ustvari povečano sliko, katere velikost je zmnožek povečave objektiva in povečave okularja. Objektiv, ki poveča na primer 20x in okular, ki poveča 10x, dajeta sliko, ki je povečana 200x. Večje ali manjše povečave dosežemo z različnimi kombinacijami objektivov in okularjev. 4 Osnove mikroskopiranja; Uvod v svetlobni mikroskop

5 Slika 6. Nastanek slike od objekta do filma. A objekt B objektiv D ravnina slike v notranjosti Huygenovega okularja leži med poljsko lečo C in očesno lečo E v ravnini okularne zaslonke. F kamera G slika A zapisana na G v goriščni ravnini. Slika 7. Optični sistem mikroskopa. Osnove mikroskopiranja; Uvod v svetlobni mikroskop 5

6 STOJALO MIKROSKOPA Stojalo ali okvir mikroskopa nosi objektive na spodnjem koncu tubusa, ki je obrnjen proti objektu. Običajno je na stojalo pritrjen revolver, v katerem je privitih več objektivov. Z obračanjem revolverja lahko v optično os mikroskopa preprosto namestimo poljuben objektiv. Na tisti strani tubusa, ki je obrnjena proč od objekta je vstavljen okular. Pri monokularnem mikroskopu je okular le eden. Pri binokularnem mikroskopu sliko, ki jo projecira objektiv, steklena prizma razcepi v dve smeri in vsaka od slik pade na enega od dveh okularjev. Pri trinokularnem mikroskopu lahko opazovalec s premično prizmo usmeri sliko v okularja ali pa v tubus na katerega lahko pritrdimo fotoaparat ali kamero. Da bi bile motnje zaradi tresljajev čim manjše, je spodnji del stojala mikroskopa tog in težak. Na stojalo mikroskopa je pritjen tubus. Na obeh straneh stojala sta dve kolesci namenjeni ostrenju slike. Večji, makrometrski vijak, je namenjen grobi izostritvi slike in ga uporabljamo le pri najmanjši povečavi. Manjši se imenuje mikrometrski vijak in je namenjen natančnemu ostrenju slike pri vseh povečavah. Z vrtenjem vijakov objekt približujemo ali oddaljujemo od objektiva. Pri večini mikroskopov pri tem dvigamo ali spuščamo mizico, pri nekaterih pa se dviga ali spušča objektiv. Objekt leži na mizici, pravokotni ali okrogli, z odprtino na sredini, skozi katero prehaja svetloba, ki nadaljuje pot skozi objekt in v objektiv. Mizica je pogosto opremljena z vilicami v katere vpnemo preparat in ga nato premikamo z vijakoma pod mizico. Slika 8. Vzdolžni prerez mikroskopa. 6 Osnove mikroskopiranja; Uvod v svetlobni mikroskop

7 Pod mizico je pritjen kondenzor. Leče v kondenzorju zberejo svetlobo žarnice v ravnini objekta. Kondenzor je pritrjen v okvirju, ki ga je pri nekaterih mikroskopih z vijakom kondenzorja mogoče dvigati ali spuščati. Kondenzor ima pogosto še vijake za centriranje, s katerimi leče naravnamo v optično os mikroskopa. Del kondenzorja je tudi lamelna zaslonka, ki se imenuje aperturna zaslonka, in jo lahko odpiramo ali zapiramo z ročico na sprednji strani kondenzorja. Aperturna zaslonka in kondenzor sta bistvena za dobro osvetljenost objekta. Pod kondenzorjem je lahko pritrjeno zrcalce, ki svetlobo iz svetlobnega vira usmerja v kondenzor in naprej skozi objekt. Pogosto ima mikroskop namesto zrcalca v spodnjem delu stojala vgrajeno žarnico, ki poskrbi za osvetlitev. Stojalo mikroskopa ima naslednje naloge: 1. Mikroskopu zagotavlja trdnost in stabilnost, 2. predstavlja ogrodje na katerega sta pritrjena revolver z objektivi na enem koncu ter okular ali okularja na drugem, 3. z vrtenjem makrometrskega in mikrometrskega vijaka omogoča izostritev slike objekta, 4. omogoča namestitev preparata na mizico in njegovo premikanje po njej, 5. na spodnjem delu nosi zrcalce ali ima vgrajeno žarnico, ki sta namenjena osvetlitvi objekta. OSVETLITEV Ker objekti zelo redko proizvajajo lastno svetlobo, za zadostno osvetlitev poskrbi vgrajena žarnica. Svetlobni žarki iz žarnice potujejo skozi kondenzor, nato skozi objekt in naprej v objektiv. Če ima žarnica zelo veliko svetilnost njeno svetlost lahko uravnavamo z vgrajenim ali samostojnim transformatorjem. Pri mikroskopiranju z mikroskopom, ki nima vgrajene žarnice, uporabimo samostojno žarnico in njeno svetlobo v kondenzor usmerimo z ravnim zrcalcem. SVETLOBA Ena od razlag narave svetlobe pravi, da gre za zelo drobno valovanje pravokotno na smer širjenja žarkov. Svetloba potuje po ravnih poteh. Smer ji lahko spremenimo s ploščatimi zrcali ali pravokotnimi prizmami. Svetlobne žarke lahko»ukrivimo«ali lomimo s steklenimi lačami, ki so v sredini debelejše ali tanjše kot na robu. Slika 9. Spremembe valovne dolžine s hitrostjo svetlobe. Svetloba v zraku ali steklu potuje različno hitro (v zraku hitreje; hitrost je privzeta kot enota 1). Svetloba se upočasni in lomi, ko iz zraka vstopi v steklo ali konveksno lečo. Svetloba se torej lomi, ko iz zraka vstopi v konveksno lečo ter ko Osnove mikroskopiranja; Uvod v svetlobni mikroskop 7

8 iz leče izstopi nazaj v zrak; lomi se, ko iz zraka vstopi v olje in iz olja v zrak. Imerzijsko olje ima lomni količnik 1,515, enako kot steklo. Lomni količnik zraka je 1. Slika 10A. Snellov zakon. Lom svetlobe na stekleni površini. Slika 10B. Svetlobni žarek se na stekleni površini lomi, razen, če vstopa v steklo pod pravim kotom. Kadar svetloba pod kotom (drugačnim od 90º) vstopi iz optično redkejše snovi (npr. zraka) v optično gostejšo snov (npr. steklo), se žarki lomijo k pravokotnici. Kadar svetloba pod kotom (drugačnim od 90º) vstopi iz optično gostejše snovi (npr. stekla) v optično redkejšo snov (npr. zrak), se žarki lomijo od pravokotnice. Kadar svetloba zadene mejo med steklom in zrakom pod prevelikim kotom (večjim od t.i. kritičnega kota) iz stekla sploh ne izstopi, temveč se popolnoma odbije nazaj v steklo. Kadar svetloba potuje iz stekla (z lomnim količnikom 1,515) v imerzijsko olje (z lomnim količnikom 1,515) se sploh ne lomi ali odbije, saj sta lomna količnika obeh snovi enaka. Svetlobo sestavlja vidno in nevidno valovanje. Vidni del svetlobnega valovanja predstavljajo dobro znane mavrične barve od vijolične do rdeče. Vijolično modri del spektra predstavljajo kratkovalovni žarki, rdeči del spektra pa dolgovalovni žarki. Za naše oči nevidna dela spektra, ki ju lahko uporabimo v mikroskopiji sta ultravijolični (valovna dolžina krajša, kot pri vijoličnem) in infrardeči (valovna dolžina daljša, kot pri rdečem). Kasneje bomo spoznali, kako pri mikroskopiranju izkoristimo osnovna načela osvetljevanja in svetlobe, da dosežemo čim boljšo sliko opazovanega objekta. Zapomnimo si: mikroskop je naprava, ki poveča vidno ali fotografirano sliko objekta, ne pa objekta samega. 8 Osnove mikroskopiranja; Uvod v svetlobni mikroskop

9 DRUGI DEL Stojalo mikroskopa Pomembne podrobnobnosti Še nekaj dodatnih podrobnosti o stojalu mikroskopa: Občutljivost mikrometrskega vijaka se nanaša na velikost premika mizice, ko mikrometrski vijak zavrtimo v eno ali drugo smer. Pri dobrih mikroskopih je premik običajno mm ali 2 µ, pri vrhunskih raziskovalnih pa ali 1 µ (mikron). Mizica je lahko pravokotna ali okrogla. Uporabno je, da je vrtljiva, saj tako lahko objekt za opazovanje ali fotografiranje primerno zasučemo. Tubus je lahko monokularen, binokularen ali trinokularen. Udobnejše je opazovanje skozi binokularni mikroskop, saj oči pri tem manj trpijo. Za mikrofotografijo uporabljamo trinokularni tubus (tretji tubus je obrnjen navpično navzgor in nanj pritrdimo kamero), pri katerem s premikom vzvoda lahko del svetlobe ali vso svetlobo usmerimo na fotografski film. S trinokularnim tubusom je tako mogoče istočasno opazovati objekt in narediti njegov posnetek. Pri večini mikroskopov lahko menjavamo različne vrste tubusov. Sodobni binokularni tubusi so narejeni pod kotom (običajno 30 ), kar olajša opazovanje. Horizontalno razdaljo med okularjema je mogoče uravnavati glede na razdaljo med opazovalčevima zenicama. Pri tem se ohranja mehanska dolžina tubusa 160 mm. Na enem od okularjev je nameščen zobat obroč, s katerim okular priredimo dioptriji opazovalčevih oči. Sodobni mikroskopi imajo nizko nameščena mikrometrska in makrometrska vijaka, ki ju lahko dosežemo. Vijaka sta običajno koaksialna, zato je uporaba preprosta. Objektivi, okularji, kondenzorji 1. OBJEKTIVI Objektivi so najpomembnejši del mikroskopa. Sodobni objektivi, sestavljeni iz Slika 11. Vrsta apokromatičnih objektivov Osnove mikroskopiranja; Uvod v svetlobni mikroskop 9

10 velikega števila leč, dosegajo visoko kakovost in zmogljivost. Izpopolnjenost korekcije aberacij in ploskosti vidnega polja vpliva na uporabnost in ceno objektiva (aberacije so razložene kasneje). Najcenejši so akromatični objektivi. Ti so kromatično korigirani, kar pomeni, da Slika 12. Kromatična aberacija. Lastnost enostavnih leč, da svetlobo različnih barv lomijo v različna gorišča (a), lahko deloma korigiramo z uporabo akromatičnega lečja (b). se rdeča in modra svetloba združita v istem gorišču. Poleg tega so sferično korigirani za zeleno svetlobo. Zaradi tega dajo akromatični objektivi najboljšo sliko pri svetlobi, ki potuje skozi zelen filter in, kadar jih uporabljamo za mikrofotografijo, s črno-belimi filmi. Naslednjo raven korekcije in višjo ceno imajo fluoritni ali semiapokromatični objektivi. Tudi ti so kromatično korigirani za rdečo in modro svetlobo, poleg tega pa so sferično korigirani za dve barvi svetlobe. Posledica je, da so fluoritni objektivi (steklo leč vsebuje nekaj naravnega ali umetnega fluorita) primernejši od akromatičnih za barvno fotografijo pri beli svetlobi. Največjo stopnjo korekcije (in najvišjo ceno) imajo apokromatični objektivi. Ti so kromatično korigirani za tri barve svetlobe: rdečo, modro in zeleno. Sferično korigirani so za dve barvi. Apokromatični objektivi so najprimernejši za barvno mikrofotografijo v beli svetlobi. Zaradi velike stopnje korigiranosti, imajo taki objektivi pri določeni povečavi večjo numerično aperturo (pomen te lastnosti je razložen kasneje), kot ustrezni akromatični ali fluoritni objektivi. Vse tri vrste objektivov dajejo sliko, ki ni ploska temveč ukrivljena. Da bi se izognili tej neljubi lastnosti, so izdelali objektive s ploskim vidnim poljem, ki dajejo plosko sliko. Taki objektivi se imenujejo plan-akromatični, plan-fluoritni ali plan-apokromatični. Tovrstna korekcija, čeprav zelo draga, je dobrodošla predvsem pri mikrofotografiji. Na vsakem objektivu je vgravirana povečava (npr. 20x ali 10x), dolžina tubusa za katero je bil objektiv izdelan (običajno 160 mm) ter debelina krovnega stekelca, ki 10 Osnove mikroskopiranja; Uvod v svetlobni mikroskop

11 pokriva objekt in so jo upoštevali pri načrtovanju korekcije sferične aberacije (običajno 0,17 mm). Če je objektiv načrtovan za opazovanje s kapljico olja med čelno lečo in krovnim stekelcem ima vgravirano oznako OIL ali OEL ali HI (homogena imerzija). Če takih oznak na objektivu ni, je namenjen "suhemu" opazovanju, to pomeni, da je med njegovo čelno lečo in krovnim stekelcem zrak. Na objektivih je vedno vgravirana oznaka N.A. (numerična apertura). Ta lahko sega od 0.04 pri preprostih objektivih do 1.3 ali 1.4 pri zmogljivih apokromatičnih objektivih. Slika 13. Oznake na objektivu. Slika 14A. 4mm objektiv z N.A. 0,95 in korekcijskim obročem za različne debeline krovnih stekelc. Nekateri objektivi, največkrat zmogljivi "suhi" objektivi s povečavami od 40x do 60x, so opremljeni s korekcijskim obročem. Ker so ti objektivi še posebej občutljivi na nepravilno debelino krovnega stekelca, jih lahko z vrtenjem korekcijskega obroča priredimo za stekelca, ki so debelejša ali tanjša od 0.17 mm. Kadar na objetivu ni zapisana kaka višja stopnja korekcije, lahko sklepamo, da gre za akromatični objektiv. Objektivi z dodatnimi korekcijami nosijo oznake, kot so na primer apochromat ali apo, plan- fl. in podobno. Slika 14B. Delovanje korekcijskega obroča (shematsko). Osnove mikroskopiranja; Uvod v svetlobni mikroskop 11

12 Kadar so v revolver vstavljeni objektivi istega tipa in istega proizvajalca, na primer sami akromatični objektivi različnih povečav, so ti običajno narejeni tako, da projecirajo sliko v približno isto ravnino v notranjosti tubusa. Zaradi tega je pri menjavi objektiva, z vrtenjem revolverja, potrebna le minimalna korekcija ostrine slike z mikrometrskim vijakom. Tako garnituro objektivov imenujemo parfokalna in omogoča preprostejše in varnejše delo. Objektivi so narejeni tudi tako, da so parcentrični. To pomeni, da je objekt, ki smo ga pri katerem od objektivov postavili v sredino vidnega polja v sredini vidnega polja tudi, ko zamenjamo objektiv. 2. OKULARJI Da dosežemo najboljšo sliko, moramo objektive uporabljati v kombinaciji z okularji, ki so prirejeni za tako vrsto objektivov in njihovo korekcijo. Obstajata dve osnovni vrsti okularjev: negativni in pozitivni. Slika 15. Huygenov okular v prečnem prerezu. Slika 16. Ramsdenov okular v prečnem prerezu. Slika 17. Pozitiven okular s korigiranimi lečami. V negativnem okularju sta dve leči: zgornja ali očesna leča in spodnja ali poljska leča. V najpreprostejši izvedbi sta obe leči plankonveksni, s konveksno stranjo obrnjeno proti objektu. Približno na sredini med njima je okrogla odprtina ali zaslonka, ki s svojim premerom določa velikost vidnega polja, ki ga vidimo, ko gledamo v mikroskop. Najpreprostejši negativni okularji, Huygenovi okularji, se uporabljajo v večini rutinskih mikroskopov opremljenih z akromatičnimi objektivi. Čeprav leči v Huygenovem okularju nista posebej korigirani, se njune napake medsebojno bolj ali manj izničijo. Bolje korigirani okularji imajo po dve ali tri leče zlepljene v enotno očesno lečo. Enostaven Huygenov okular ima ob robu vidnega polja modro obrobo. Če je na okularju zapisana le povečava, potem gre najverjetneje za Huygenov okular, ki je najprimernejši za uporabo z akromatičnimi objektivi s povečavami od 5x do 40x. Drug običajen tip okularja je pozitivni ali Ramsdenov okular. V njem sta očesna in poljska leča lahko zlepljeni skupaj in bolje korigirani kot pri enostavnem Huygenovem tipu. Pri pozitivnem okularju je okrogla zaslonka pod poljsko lečo. Mikrometrske ploščice, kazalci, mrežice in podobno položimo na zaslonko enega ali drugega tipa okularja. 12 Osnove mikroskopiranja; Uvod v svetlobni mikroskop

13 Ker objektiv projecira sliko objekta v ravnino okularne zaslonke, vidimo merilce ali mrežico, ki leži na njej, istočasno s sliko objekta. Kompenzacijski okularji so lahko pozitivnega ali negativnega tipa. Uporabljati jih moramo pri vseh povečavah v kombinaciji s fluoritnimi, apokromatičnimi in vsemi vrstami plan objektivov (koristno jih lahko uporabljamo tudi z akromatičnimi objektivi s povečavami 40x ali več). Kompenzacijski objektivi imajo ključno vlogo pri kompenzaciji preostale kromatične aberacije, ki je neizogibna pri optiki visoko korigiranih objektivov. Najboljše rezultate dosežemo, če uporabljamo korekcijske okularje in objektive istega proizvajalca. Kompenzacijske okularje lahko prepoznamo po rumenkastem odsevu svetlobe na robu njihovega vidnega polja. Na njih je oznaka K ali C ali comp. ter oznaka povečave. Okularji, ki so namenjeni uporabi s plan objektivi imajo včasih oznako plan-comp. Okularji, ki so izdelani tako, da imajo izjemno široko vidno polje, nosijo oznako WF ali S.W. Nekateri proizvajalci izdelujejo objektive (CF), ki sami vsebujejo celotno barvno korekcijo in jih zato ne moremo uporabljati s kompenzacijskimi okularji. Izdelajo lahko posebne okularje, ki ob robu vidnega polja ne narede barvnega obroča. 3. KONDENZORJI Kondenzor je pritrjen pod mizico mikroskopa, med vir svetlobe in objekt. Kondenzorje izdelujejo v različnih izvedbah, glede na potrebno stopnjo in vrsto korekcije. Najenostavnejši kondenzor z najmanj korekcije (in najnižjo ceno) je Abbejev kondenzor z numerično aperturo do 1.4. Abbejev kondenzor je sposoben dati močno osvetlitev, vendar ni ne kromatično ne sferično korigiran. Zaradi tega je Abbejev kondenzor primeren predvsem za rutinsko opazovanje z objektivi z manjšo numerično aperturo in povečavo. Naslednjo stopnjo korekcije najdemo pri aplanatičnih kondenzorjih, ki so korigirani za sferično aberacijo, ne pa tudi za kromatično. Uporabljamo jih za mikrofotografijo, zlasti za črno-belo fotografijo ob uporabi zelenega filtra. Največjo stopnjo korekcije imajo aplanatični akromatični kondenzorji. Ti so dobro korigirani tako za sferično kot kromatično aberacijo. Izberemo jih za barvno mikrofotografijo v beli svetlobi. Na kondenzorju sta vgravirani njegova numerična apertura in tip (aplanatični ali Slika 18. Vrste kondenzorjev Osnove mikroskopiranja; Uvod v svetlobni mikroskop 13

14 Slika 19. Akromatični aplanatični kondenzor z N.A. 1,4. Slika 20. Kondenzorji za svetlo polje. Stožci prepuščene svetlobe. aplanatični akromatični). Kondenzorji z numeričnimi aperturami večjimi od 1.0 dajo najboljšo osvetlitev, kadar jih uporabljamo s kapljico olja med zgornjo lečo in spodnjo stranjo objektnega stekelca. Kondenzorjeva apertura in izostrenost sta bistvenega pomena za največji izkoristek zmogljivosti uporabljenega objektiva. Enako je ustrezna uporaba nastavljive aperturne zaslonke, ki je nameščena v kondenzorju ali tik pod njim, bistvena za doseganje primerne osvetljenosti in kontrasta. Odpiranje in zapiranje te zaslonke uravna kot (in s tem aperturo) snopa svetlobnih žarkov, ki gredo skozi kondenzor, skozi objekt in končno v objektiv. Za objektive z majhnimi povečavami (pod 10x) je včasih potrebno odstraniti zgornjo lečo kondenzorja, da bi lahko osvetlil celotno vidno polje. Nekateri kondezorji imajo v ta namen gibljivo nameščeno zgornjo lečo, ki jo enostavno zasučemo iz optične osi. Nekateri proizvajalci izdelujejo kondenzorje, ki jih lahko v celoti zasukamo iz optične osi in nadomestimo z drugimi. Kadar kondenzor uporabljamo brez zgornje leče aperturno zaslonko popolnoma odpremo (primerjaj s Koehlerjevo osvetlitvijo). Višino kondenzorja uravnavamo z vijakom kondenzorja. Z njim izostrimo vir svetlobe v ravnini objekta (podrobnejšo razlago najdete nekoliko kasneje pri Koehlerjevi osvetlitvi). 14 Osnove mikroskopiranja; Uvod v svetlobni mikroskop

15 Svetloba in osvetlitev Slika 21. Kromatična aberacija bele svetlobe A. Nekorigirana leča. Svetloba je razpršena vzdolž osi v mavričnem zaporedju barv. B. Akromatična leča. Zelena ima najkrajšo goriščno razdaljo. Barvna napaka je precej odpravljena. C. Semi apokromatična leča. Barvna napaka je podobna kot pri B, vendar še zmanjšana. D. Apokromatična leča. Za vse običajne namene je kromatična aberacija odpravljena. B: bela svetloba Z: zelena O: oranžna R: rdeča M: modra Š: škrlatna ('brez zelene') Slika 22. Sferična aberacija. To je lastnost leče, da lomi žarke, ki gredo skozi obrobje leče v drugo gorišče kot tiste, ki gredo skozi osrednji del. Optična korekcija je mogoča, vendar je potrebno paziti, da pri sestavljanju mikroskopa sferične aberacije ne bi še povečali. SVETLOBA Poznavanje vedenja svetlobe in pojavov, ki nastanejo pri prehodu svetlobe iz zraka v stekleno konveksno lečo ter iz nje nazaj v zrak, je ključnega pomena za razumevanje nastanka slike. Ko svetloba iz zraka vstopi v konveksno lečo, se njena hitrost zmanjša. Hitrost različnih barv svetlobe, z različnimi valovnimi dolžinami, se zmanjša različno. Zaradi tega je lom (refrakcija) različnih barv svetlobe različen. Žarki, ki pod pravim kotom vstopijo v centralni del leče, iz nje izstopijo nelomljeni. Svetloba, ki vstopa v druge dele leče se lomi. Ko svetloba prehaja skozi konveksne leče objektiva, okularja ali kondenzorja, lahko pride do dveh osnovnih aberacij. Ti aberaciji lahko odpravimo z uporabo ustreznih leč. a) Kromatična aberacija - različne valovne dolžine bele svetlobe potujejo skozi konveksno lečo in se namesto v enotnem gorišču združijo vsaka v svojem gorišču. Optiki se trudijo s kombiniranjem različnih stekel in več povezanih leč doseči enotno gorišče vseh treh osnovnih barv - rdeče, zelene in modre. b) Sferična aberacija - svetloba, ki potuje skozi konveksno lečo pade na različne goriščne točke, odvisno od tega ali gredo žarki bližje robu ali sredini leče. Optiki skušajo vse žarke pripeljati v enotno gorišče. Osnove mikroskopiranja; Uvod v svetlobni mikroskop 15

16 Pri nastajanju slike potujejo svetlobni žarki od osvetjenih točk na objektu skozi objektiv, ki ponazori povečano sliko objekta. Bolj natančna kot je ta ponazoritev, bolj jasna bo slika. V nadaljevanju so na preprost način opisane vpletene geometrijske optične zakonitosti. Za pojasnitev osnovnih načel bomo privzeli, da je objekt svetleča puščica na levi. Slika 23. Odnosi med velikostjo slike in velikostjo objekta. (S:O = SR:OR) Primer A - objekt je zelo daleč od konveksne leče. V tem primeru svetloba iz osvetljene puščice potuje skozi vse dele konveksne leče (ki naj bo dobro korigirana) in se združi v gorišču, katerega oddaljenost je določena z vrsto leče. Razdalja med sredino leče in njenim goriščem se imenuje goriščna razdalja leče. Nastala slika je realna, obrnjena in manjša od puščice. To sliko lahko projeciramo na zaslon postavljen v goriščni razdalji. Primer B - Puščico primaknemo bližje, vendar še vedno dlje od dvakratne goriščne razdalje leče. Tudi sedaj je slika puščice realna in obrnjena. Je večja kot v primeru A vendar še vedno ne tako velika kot puščica. Slika sedaj nastane dlje od leče. Primer C - Puščico (naš objekt) postavimo pred lečo v oddaljenosti, ki je enaka dvakratni goriščni razdalji leče. Realna slika, ki je še vedno obrnjena, je natančno enako velika kot puščica. Slika je za dve goriščni razdalji odmaknjena od leče. Primer D - Puščico primaknemo k leči na razdaljo, ki je med dvojno in enojno goriščno razdaljo leče (med 2F in F kot pravijo optiki). Nastala slika je realna, obrnjena in večja od puščice. Tako delujejo objektivi mikroskopa. Objekt na 16 Osnove mikroskopiranja; Uvod v svetlobni mikroskop

17 objektnem stekelcu objektiv izostri na razdalji med 2F in F. Rezultat je projekcija povečane realne slike objekta, ki nastane v zgornjem delu tubusa mikroskopa. Primer E - Objekt (puščico) ali sliko objekta primaknemo še bližje leči, tako da je oddaljenost manjša od goriščne razdalje leče. Slika je zopet povečana, vendar ni obrnjena. Gre za navidezno sliko objekta, za katero se zdi, da je na isti strani leče kot objekt, na oddaljenost približno 25 cm. Enako velja za okularje, pri vizualnem opazovanju. Slika, ki jo ustvari objektiv, je izostrena v goriščni razdalji očesne leče okularja. Očesna leča okularja skupaj z lečo v človeškem očesu ustvari še dodatno povečano navidezno sliko povečane realne slike, ki jo projecira objektiv (glej sliko 3, str. 3). Različne leče v mikroskopu delujejo v skladu z geometrijskimi optičnimi zakoni opisanimi zgoraj, še zlasti tistimi iz primerov D in E. OSVETLITEV Vse prepogosto zelo kakovostni, dobro opremljeni mikroskopi ne dajo izvrstnih slik, kar je posledica nepravilne uporabe svetlobnega vira. Dobra osvetlitev mora biti svetla, brez odsevov in enakomerna po vsem vidnem polju. Ker večina sodobnih mikroskopov za dosego teh ciljev uporablja Koehlerjevo osvetlitev (imenovano po njenem odkritelju Augustu Koehlerju), bo v nadaljevanju opisan postopek za pripravo Koehlerjeve osvetlitve. Potrebnih je nekaj fizikalno-mehanskih priprav. Kondenzor pod mizico mora biti opremljen z vijakom, s katerim ga primikamo ali odmikamo od objekta. Na kondenzorju mora biti pritrjena aperturna zaslonka, ki jo odpiramo in zapiramo z vzvodom na sprednji strani. Svetilka mora biti opremljena z zbiralno lečo in poljsko zaslonko, ki jo lahko odpiramo in zapiramo. Zaželjeno je še, da lahko žarilno nitko ali žarnico centriramo, oziroma da je že centrirana. Če ponovimo: na mikroskopu sta dve pomembni zaslonki, ki ju moramo naravnati. Aperturna zaslonka je pritrjena pod kondenzorjem, poljska zaslonka pa nad virom svetlobe. Z aperturno zaslonko uravnavamo velikost kota svetlobnega snopa, ki prihaja iz kondenzorja. S poljsko zaslonko uravnavamo velikost osvetljenega dela vidnega polja. Slika 24. Svetilka mikroskopa. Bistveni deli svetilke so žarnica, leča kondenzorja in poljska zaslonka. Zaslonka je nastavljiva. Osnove mikroskopiranja; Uvod v svetlobni mikroskop 17

18 Slika 25. Svetlobni stožec. Kondenzor mora biti izostren in poljska zaslonka nastavljena tako, da svetlobni stožec natančno ustreza aperturi objektiva. KOEHLERJEVA OSVETLITEV 1. korak. Široko odpremo poljsko in aperturno zaslonko. Prižgemo lučko. Nastavimo objektiv z majhno povečavo (10x ali podobno) in okular z 10x povečavo. Previdno izostrimo objekt na objektnem stekelcu, ki leži na mizici mikroskopa. Slika 26. Pot žarkov, ki izvirajo iz dveh točk na žarilni nitki in ustvarijo sliko. Križajo se v ravnini poljske zaslonke, v ravnini sredi objekta, v ravnini realne slike (ravnina zaslonke okularja) in (pri nameščeni kameri) v ravnini fotografskega filma. Glejte besedilo o Koehlerjevi osvetlitvi. 18 Osnove mikroskopiranja; Uvod v svetlobni mikroskop

19 2. korak. Poljsko zaslonko skoraj do konca zapremo. Z vijakom kondenzorja kondenzor dvigamo ali spuščamo toliko časa, da se slika robu zaprte poljske zaslonke izostri in jo vidimo istočasno z že izostreno sliko objekta. Rob zaslonke mora biti čim bolj izostren. Kondenzor je običajno tedaj skoraj v najvišjem položaju. 3. korak. Če odprtina poljske zaslonke ni natančno na sredini vidnega polja, jo centriramo s premikanjem centrirnih vijakov na kondenzorju. Poljsko zaslonko nato počasi odpiramo, da ravno izgine za robom vidnega polja. To moramo ponoviti vsakokrat, ko zamenjamo objektiv. 4. korak. Iz tubusa odstranimo okular in pogledamo v tubus. Vidimo popolnoma osvetljeno zadnjo lečo objektiva (to najlažje naredimo s slepim okularjem - okularjem, ki ima le odprtino, leče pa ne). Ko gledamo v tubus, počasi zapirajmo aperturno zaslonko. Videli bomo, da začne ob robu zadnje leče objektiva nastajati neosvetljen črn obroč. Za najboljšo osvetlitev in kontrast naj bi bilo zasenčene 1/4-1/3 zadnje leče objektiva, pri čemer je 2/3-3/4 leče osvetljene. Nato vrnemo okular nazaj v tubus. Tudi ta korak moramo ponoviti vedno, kadar zamenjamo objektiv. Slika 27. Videz svetlobnega kroga na zadnji leči objektiva. Aperturna zaslonka ima lahko vgravirano skalo (enote na skali lahko neposredno ustrezajo numerični aperturi) s katero lahko zaslonko preprosteje nastavimo. Videli bomo, da je objekt osvetljen enakomerno, brez odsevov in je slika kar se da kontrastna. Intenziteto svetlobe uravnavamo z nastavljanjem transformatorja ali z vstavljanjem nevtralnih sivih filtrov, ne pa z dviganjem ali spuščanjem kondenzorja ali z zapiranjem aperturne zaslonke. Če povečamo napetost na transformatorju se barvna temperatura svetilke zviša. To moramo upoštevati pri mikrofotografiji in svetlobo korigirati z ustreznimi filtri, saj so posamezni filmi prirejeni za določene barvne temperature svetlobe. NUMERIČNA APERTURA IN LOČLJIVOST Če bi bile v nastajanje slike vpletene le zakonitosti optične geometrije, ki so bile opisane doslej, bi lahko dosegli več tisočkratne jasne povečave. Vendar pa so optiki že v 19. stoletju - Abbe, Rayleigh, Airy in drugi - odkrili, da velikost uporabne povečave omejujejo še drugi dejavniki. (Dodatna povečava, ki ne da dodatnih podatkov oziroma ne omogoča videti dodatnih podrobnosti objekta, se imenuje jalova povečava). Tedanji optiki so ugotovili, da svetloba, ki izvira iz različnih točk na objektu, potuje skozi objektiv in ustvari sliko objekta, posameznih točk ne ponazori kot točke temveč kot majhne razmazane kroge, ki jih imenujemo Airyjevi krogi. Vzrok za to je uklon (difrakcija) svetlobe, ki potuje skozi majhne delce in prostore v objektu. Airyjeve kroge sestavljajo majhni koncentrični svetli in temni obroči. Osnove mikroskopiranja; Uvod v svetlobni mikroskop 19

20 Slika 28. Zmanjševanje velikosti antitočke s povečevanjem numerične aperture leče. Manjši kot so Airyjevi krogi, ki jih projecira objektiv, več podrobnosti lahko razpoznamo na sliki objekta. Objektivi, ki so bolje korigirani, ustvarjajo manjše Airyjeve kroge kot slabše korigirani. Objektivi z večjo numerično aperturo (ki bo razložena v nadaljevanju) ustvarjajo manjše Airyjeve kroge. To je razlog, da objektivi z veliko numerično aperturo (N.A.) in boljšo korekcijo lahko razlikujejo Slika 29. Zmanjševanje velikosti Airyjevih krogov s povečevanje numerične aperture. manjše podrobnosti na objektu. Sposobnost jasno razlikovati majhne podrobnosti, ki leže blizu skupaj, imenujemo ločljivost objektiva. Difrakcija svetlobe in omejitve, ki so posledica valovne dolžine svetlobnega valovanja narekujejo, da je uporabna povečava objektiva pomnoženo z numerično aperturo objektiva (na primer 250x za objektiv z N.A. 0,25 ali 1300x za objektiv z N.A. 1,3). Za doseganje željene povečave je v splošnem priporočljivo uporabiti objektiv večje povečave in okular manjše povečave (na primer: za 200x povečavo uporabimo objektiv 20x in okular 10x, ne pa objektiv 10x in okular 20x). 20 Osnove mikroskopiranja; Uvod v svetlobni mikroskop

21 Sledi še razlaga pojma numerična apertura ali okrajšano N.A. Sposobnost objektiva, da ujame različne svetlobne žarke, ki izvirajo iz različnih delov osvetljenega objekta, je neposredno povezana s kotno odprtino objektiva. Objektivi z manjšo kotno odprtino lahko zajamejo le ozek stožec svetlobe v primerjavi z objektivi z velikimi kotnimi odprtinami. Slika 30. Primerjava kotne odprtine objektivov. Ozek kot 15º pri manj zmogljivem objektivu in širok kot 110º pri visoko zmogljivem objektivu z oljno imerzijo. Slika 31. Pomen oljne imerzije. V primeru A je označenih pet žarkov, ki potujejo iz točke P na objektu skozi krovno stekelce v zrak med njim in sprednjo lečo objektiva. Le žarka 1 in 2 lahko vstopita v objektiv. Žarka 4 in 5 se popolnoma odbijeta. V primeru B je med stekelcem in lečo olje, ki ima enak lomni količnik kot steklo. Žarki sedaj potujejo brez loma, zato v objektiv vstopijo žarki 1, 2, 3, in 4. Numerična apertura je torej povečana za faktor n, ki je lomni količnik olja. Osnove mikroskopiranja; Uvod v svetlobni mikroskop 21

22 Enačba za določitev numerične aperture je: N.A. = n sin u V enačbi N.A. pomeni numerična apertura; sin u je sinus 1/2 kotne odprtine objektiva; n je lomni količnik sredstva med objektom in spodnjo lečo objektiva. (Lomni količnik zraka je 1, imerzijskega olja pa 1,515) Slika 32. Primerjava med suhim objektivom in objektivom za oljno imerzijo. Če si zgornjo enačbo ogledamo, lahko zaključimo naslednje: 1. Pri dani kotni odprtini imajo objektivi, ki jih uporabljamo z imerzijskim oljem, večjo N.A, 2. ker u ne more preseči 90, je sin u lahko 1 ali manj. Ker je pri suhih objektivih med objektom in lečo zrak (z lomnim količnikom n = 1) je največja teoretična N.A. suhega objektiva lahko 1 (v praksi ni večja od 0,95), 3. povečanje kotne odprtine objektiva poveča u in s tem sin u, torej poveča tudi numerično aperturo, 4. ker ima olje lomni količnik 1,515 je teoretično mogoče izdelati imerzijske objektive z N.A. 1,515. (V praksi imajo apokromatski imerzijski objektivi N.A. 1,4, še pogosteje pa 1,3.) Oglejmo si še pomembno povezavo med N.A. in ločljivostjo. Ločljivost je definirana kot sposobnost objektiva, da jasno razlikuje dve točki ali podrobnosti, ki ležita blizu skupaj na objektu. Enačba ločljivosti v splošnem velja: 0,61λ R = N. A. (po lordu Rayleighu) 22 Osnove mikroskopiranja; Uvod v svetlobni mikroskop

23 V tej enačbi je R razdalja med dvema majhnima točkama, ki ležita blizu skupaj na objektu; λ je valovna dolžina svetlobe, ki jo uporabimo; N.A. je numerična apertura. Če si enačbo ogledamo, lahko pridemo do naslednjih zaključkov: 1. Ko N.A. narašča se R manjša; razdalja med točkama se zmanjšuje, torej postaja ločljivost boljša, 2. če uporabimo svetlobo s krajšo valovno dolžino (vijolično-moder del spektra) se ločljivost poveča. Svetloba z daljšo valovno dolžino, na primer rdeča, ločljivost zmanjša, 3. ločljivost se spreminja vzporedno z numerično aperturo. Objektivi z veliko numerično aperturo imajo pri opazovanju v vijolično-modri svetlobi največjo možno ločljivost v svetlobni mikroskopiji. Numerična apertura celotnega mikroskopa je odvisna od aperture kondenzorja in aperture objektiva, ki ju skupaj uporabljamo. N. A. mikroskopa = N. A. objektiva + N. A. kondenzorja 2 Enačba pokaže, da moramo za popolen izkoristek N.A. objektiva, uporabiti kondenzor z enako ali večjo N.A. V praksi z zapiranjem aperturne zaslonke na kondenzorju zmanjšamo delovno aperturo celotnega mikroskopa in tako izboljšamo kontrastnost slike. Enačba nam tudi pokaže, da moramo za popolen izkoristek aperture mikroskopa, pri kondenzorjih z numerično aperturo večjo od 1 uporabiti imerzijsko olje, ki ga damo med zgornjo lečo kondenzorja in spodnjo stranjo objektnega stekelca. Močno korigirane imerzijske objektive z N.A. večjo od 1 moramo uporabljati z imerzijskimi kondenzorji z N.A. večjimi od 1. Slika 33. Omejitve delovne N.A. zaradi: A) omejenega premera čelne leče objektiva B) omejene širine svetlobnega stožca C) odsotnosti imerzijskega olja med krovnim stekelcem in objektivom. Mnogokrat pri mikroskopiranju ne potrebujemo objektivov z velikimi N.A. saj preglednost objekta dosežemo z uporabo objektivov z manjšimi N.A. To je še Osnove mikroskopiranja; Uvod v svetlobni mikroskop 23

24 zlasti pomembno zato, ker veliko N.A. in veliko povečavo spremlja zelo majhna globinska ostrina in majhna delovna razdalja. Zaradi tega je pri delu z objekti, pri katerih ločljivost ni bistvenega pomena in je povečava lahko manjša, priporočljivo uporabljati objektive z manjšo povečavo in manjšo N.A., pri čemer je globinska ostrina boljša, delovna razdalja pa večja. (Globinska ostrina pomeni izostreno sliko tistih delov objekta, ki ležijo nad ali pod ravnino izostritve). Slika 34. Zmanjšanje globinske ostrine zaradi povečane N.A. V knjižici so bile opisane osnove mikroskopije. Napisana je zelo na kratko, da bi poudarila le najpomembnejše. Upamo, da se bo bralcu zdela uporabna. 24 Osnove mikroskopiranja; Uvod v svetlobni mikroskop

25 PRILOGE NAVODILA ZA DELO S ŠOLSKIM MIKROSKOPOM NIKON SE 1. Mikroskop odkrij in postavi na sredino delovnega prostora. Naravnaj višino stola, ki ti omogoča udobno opazovanje. 2. Prižgi svetilko. S kolescem za uravnavanje svetlosti naravnaj jakost svetilke malo manj kot na največjo svetilnost. 3. Nastavi objektiv z najmanjšo povečavo (4x). Z makrometrskim vijakom spusti mizico v najnižji položaj. Objekt postavi na objektno mizico. Pazi, da je krovno stekelce zgoraj! Z makrometrskim vijakom dvigni mizico v najvišji položaj. 4. Opazuj skozi mikroskop in počasi spuščaj mizico tako, da vrtiš makrometrski vijak proti sebi, dokler se ne pojavi slika. Z mikrometrskim vijakom sliko lahko natančno izostriš. 5. Z razmikanjem ali primikanjem okularjev nastavi razdaljo, ki ustreza razdalji med tvojima očesoma. 6. Z desnim očesom poglej v desni okular in z mikrometrskim vijakom natančno izosti izbrani detalj na sliki. Z levim očesom poglej v levi okular in z vijakom na okularju natančno izostri isti detalj. Ponovno preveri in po potrebi naravnaj razmik med okularjema. 7. Zapiraj in odpiraj aperturno zaslonko pod kondenzorjem, dokler ne dobiš kontrastne slike z dobro ločjivostjo. Pazi, da zaslonka ni odprta bolj kot je potrebno za pridobitev kontrastov in ne preveč, ker se zmanjša ločljivost. 8. Če želiš uporabljati večjo povečavo, postavi izbran del objekta na sredino vidnega polja. Zavrti revolver na naslednjo povečavo in z mikrometrskim vijakom izostri sliko, tako da opazuješ skozi mikroskop in vijak vrtiš proti sebi ali od sebe. 9. Na enak način kot v točki 7. ponovno prilagodi zaslonko. 10. Pri zamenjavi preparata ponovi točke 3., 4. in Po končanem mikroskopiranju zavrti revolver na najmanjšo povečavo, z makrometrskim vijakom spusti mizico, odstrani objekt, ugasni svetilko in mikroskop pokrij. Osnove mikroskopiranja; Uvod v svetlobni mikroskop 25

26 POIMENOVANJE SESTAVNIH DELOV MIKROSKOPA NIKON SE 26 Osnove mikroskopiranja; Uvod v svetlobni mikroskop

27 Osnove mikroskopiranja; Uvod v svetlobni mikroskop 27