ZADACI. Biohemija I

Transcript

1 ZADACI Biohemija I

2 1. Povezanost između titracione krive i kiselinsko-baznih svojstava glicina. 100 ml 0,1 M otopine glicina (Gly) pri ph 1,72 titrirano je sa 2 M otopinom NaOH. ph je praćen, a rezultati su prikazani grafički: Ključne tačke u titraciji označene su od I do V. Za svaku tvrdnju navedenu od (a) do (o) identificirati odgovarajuću ključnu tačku titracije i obrazložiti. a) Gly je prisutan predominantno kao jon + H 3 N-CH 2 -COOH; b) Prosječni ukupni naboj Gly je +1/2; c) 50% amino grupa je jonizirano; d) ph je jednak pka karboksilne grupe; e) ph je jednak pka protonirane amino grupe; f) Gly ima svoj maksimalni puferski kapacitet; g) Prosječni ukupni naboj Gly jednak je nuli; h) Karboksilna grupa je potpuno istitrirana (prva ekvivalentna tačka); i) Gly je potpuno istitriran (druga ekvivalentna tačka); j) Predominantna vrsta je + H 3 N-CH 2 -COO - ; k) Prosječni ukupni naboj Gly je -1; l) Gly je prisutan predominantno kao smjesa (50:50) vrsta + H 3 N-CH 2 - COOH i + H 3 N-CH 2 -COO - ; m) Ovo je izoelektrična tačka; n) Ovo je završetak titracije; o) Ovo su ph područja najnižeg puferskog kapaciteta.

3 1. a) Gly je prisutan predominantno kao jon + H 3 N-CH 2 -COOH (I) b) Prosječni ukupni naboj Gly je +1/2 (II) c) 50% amino grupa je jonizirano (IV) d) ph je jednak pka karboksilne grupe (II) e) ph je jednak pka protonirane amino grupe (IV) f) Gly ima svoj maksimalni puferski kapacitet (II i IV) g) Prosječni ukupni naboj Gly jednak je nuli (III)

4 1. h) Karboksilna grupa je potpuno istitrirana (prva ekvivalentna tačka) (III) i) Gly je potpuno istitriran (druga ekvivalentna tačka) (V) j) Predominantna vrsta je + H 3 N-CH 2 -COO - (III) k) Prosječni ukupni naboj Gly je -1; (V) l) Gly je prisutan predominantno kao smjesa (50:50) vrsta + H 3 N-CH 2 - COOH i + H 3 N-CH 2 -COO - (II) m) Ovo je izoelektrična tačka (III) n) Ovo je završetak titracije (V) o) Ovo su ph područja najnižeg puferskog kapaciteta (I, III i V)

5 2. Jonizirajuće stanje histidina. Svaka od jonizirajućih grupa aminokiseline može postojati u jednom od dva stanja, nabijenom ili neutralnom. Električni naboj na funkcionalnim grupama je određen vezom između njihove pka i ph vrijednosti rastvora. Ova veza je opisana Henderson-Hasselbalch-ovom jednačinom. a) Histidin ima tri jonizirajuće funkcionalne grupe. Napisati ravnotežnu reakciju za sve tri jonizacije i dodijeliti odgovarajuću pka za svako jonizirajuće stanje. Nacrtati strukture histidina u svakom jonizirajućem stanju. Koji je naboj molekule histidina u svakom od jonizacijskih stanja. b) Nacrtati strukture najdominantnijeg jonizirajućeg stanja histidina na ph 1, 4, 8 i 12. Uzeti u obzir da jonizirajuće stanje može biti procjenjeno tretirajući svaku jonizirajuću grupu nezavisno. c) Koje je naelektrisanje histidina na ph 1, 4, 8 i 12. Za svaki ph odrediti hoće li histidin migrirati prema anodi (+) ili katodi (-) kada se postavi u električno polje.

6 2. a) Histidin ima tri jonizirajuće funkcionalne grupe. Napisati ravnotežnu reakciju za sve tri jonizacije i dodijeliti odgovarajuću pka za svako jonizirajuće stanje. Nacrtati strukture histidina u svakom jonizirajućem stanju. Koji je naboj molekule histidina u svakom od jonizacijskih stanja. b) Nacrtati strukture najdominantnijeg jonizirajućeg stanja histidina na ph 1, 4, 8 i 12. Uzeti u obzir da jonizirajuće stanje može biti procjenjeno tretirajući svaku jonizirajuću grupu nezavisno.

7 2. c) Koje je naelektrisanje histidina na ph 1, 4, 8 i 12. Za svaki ph odrediti hoće li histidin migrirati prema anodi (+) ili katodi (-) kada se postavi u električno polje. ph Stuktura Naboj Kretanje prema Katoda Katoda Nema kretanja Anoda

8 3. Razdvajanje aminokiselina hromatografijom jonske izmjene. Smjesa aminokiselina može se analizirati tako što se prvo razdvoji smjesa na komponente i onda se propusti kroz jono-izmjenjivački hromatograf. Aminokiseline postavljene u kationsku izmjenjivačku smolu koja sadrži sulfonatne grupe (-SO 3- ) putuju kroz kolonu različitim brzinama zbog dva faktora koja utiču na njihovo kretanje: (1) jonsko privlačenje između sulfonatnih ostataka na koloni i pozitivno nabijenih funkcionalnih grupa aminokiselina i (2) hidrofobne interakcije između nepolarnih lanaca aminokiselina i jako hidrofobnih skeleta polistiren-divinilbenzenskih smola. Za svaki par niže navedenih aminokiselina odrediti koja će se prva eluirati u kationskoj izmjenjivačkoj koloni pri ph = 7: a) Asp i Lys b) Arg i Met c) Glu i Val d) Gly i Leu e) Ser i Ala

9 3. a) Asp i Lys Asparaginska kiselina (Asp) je dikarbonska, tako da se pri bilo kojoj ph vrijednosti slabije veže za kationski jonoizmjenjivač, te će se prije eliuirati nego lizin (Lys) koji je diamino kiselina i ima više pozitivnog naboja u odnosu na Asp. b) Arg i Met Arginin ima i gvanidinsku grupu koja pri datom ph još uvijek ima određeni udio pozitivnog naboja koji doprinosi jačem vezanju na sulfonatne grupe kationskog izmjenjivača, tako da će se prije eluirati metionin. c) Glu i Val Slično kao i u prvom slučaju s tom da je valin samo aminokiselina sa nepolarnim bočnim lancem koji doprinosi jačoj interakciji sa česticama smole, tako da će se prvo eluirati glicin. d) Gly i Leu Gly e) Ser i Ala Ser

10 4. Veličina proteina. Odrediti približnu molekulsku masu proteina sa 682 ostatka aminokiselina u jednom polipeptidnom lancu. Kao srednja molekulska masa za aminokiselinske ostatke sadržane u jedostavnim proteinima se uzima 110 g/mol, tako da je približna molekulska masa proteina sa 682-aminokiselinska ostatka Mr= 110 x 682 = 75000

11 5. Broj ostataka triptofana u albuminu goveđeg seruma. Kvantitativna analiza aminokiselina pokazuje da albumin goveđeg seruma (BSA) sadrži 0,58 % triptofana (Mr = 204) po masi. a) Izračunati minimalnu molekulsku masu BSA (pretpostaviti da je samo jedan ostatak triptofana po molekuli proteina); ω = Mr trp /Mr pr Mr pr = Mr trp /ω Mr pr = 204/0,0058= g/mol b) Gel filtracija procjenjuje da je molekulska masa BSA Koliko ostataka triptofana je prisutno u molekuli BSA? dva (2) ostatka triptofana

12 6. Izoelektrična tačka pepsina. Pepsin je zajedničko ime za smjesu nekoliko probavnih enzima (kao veći prekursor proteini) koje luče žlijezde koje su povezane sa želucem. Ove žlijezde također luče HCl koja razlaže hranu omogućavajući pepsinu da cijepa određene molekule proteina. Nastaje smjesa hrane, HCl i probavnih enzima (poznata kao himus), koja ima ph oko 1,5. Koju pi tačku bi predvidjeli za proteine pepsina? Koje funkcionalne grupe moraju biti prisutne da doprinesu ovom pi pepsina? Koje aminokiseline u proteinima će dati takve grupe? phi=1, karboksilne grupe, asparaginska i glutaminska kiselina

13 7. Rastvorljivost polipeptida. Jedna od metoda za razdvajanje polipeptida koristi njihovu različitu rastvorljivost. Rastvorljivost većih polipeptida u vodi zavisi od relativne polarnosti njihovih R grupa, naročito od broja joniziranih grupa: što je veći broj joniziranih grupa, to su polipeptidi bolje rastvorljivi. Koji od slijedećih polipeptida je rastvorljiviji na datoj ph? a) (Gly) 20 ili (Glu) 20 ph = 7 (Glu) 20 glutaminska kiselina polarnija od glicina b) (Lys-Ala) 3 ili (Phe-Met) 3 ph = 7 (Lys-Ala) 3 c) (Ala-Ser-Gly) 5 ili (Asn-Ser-His) 5 ph = 6 (Asn-Ser-His) 5 ph = 6 d) (Ala-Asp-Gly) 5 ili (Asn-Ser-His) 5 ph = 3 (Asn-Ser-His) 5 ph = 3

14 8. Prečišćavanje enzima. U sljedećoj tablici navedeni su podaci dobijeni pri prečišćavanju novog enzima: a) Na temelju navedenih podataka izračunati specifičnu aktivnost enzima nakon svakog postupka prečišćavanja; Postupak prečišćavanja Ukupni protein (mg) Aktivnost (jedinice) Specificna aktivnost enzima Sirovi ekstrakt U/mg Taoženje solima U/mg Taloženje ekstremnim ph U/mg Jonoizmjenjivačka hromatografija U/mg Afinitetna hromatografija U/mg Gel-filtracija U/mg b) Koji od korištenih postupaka je najefikasniji (npr. daje najveći relativni porast u čistoći)? Korak 4 c) Koji od korištenih postupaka je najniže efikasnosti? Korak 3 d) Postoji li naznaka utemeljena na rezultatima u tablici da je enzim nakon koraka 6 čist? Šta bi se još moglo uraditi za određivanje čistoće enzimskog preparata? Da, specifična aktivnost se nije povećala u koraku 6. Mogal si se uraditi i elektroforeza, natrij-dodecilsulfat-poliakrilamidna gel elektroforeza (SDS-PAGE)

15 9. Dijaliza. Prečišćeni protein nalazi se u Hepes puferu (N-(2- hidroksietil)piperazin-n'-(2-etansulfonska kiselina) pri ph 7 sa 500 mm NaCl. 1 ml otopine proteina stavljen je u kivetu izrađenu od dijalizne membrane i dijaliziran prema 1 L istog Hepes pufera koji ne sadrži NaCl. Male molekule i joni (kao što su Na +, Cl - i Hepes) difundiraju kroz dijaliznu membranu, a protein ne. a) Kada se uspostavi ravnoteža, kolika je koncentracija NaCl u uzorku proteina? (pretpostaviti da nema promjena u volumenu uzorka tokom dijalize) c1v1 = c2v2 1 x 500= 1000xc2 0,5 mm NaCl b) Ako je 1 ml originalnog uzorka dijalizirano 2 puta sukcesivno, prema 100 ml Hepes pufera bez NaCl, kolika će biti konačna koncentracija NaCl u uzorku? c1v1=c2v2 1x100=100xc2 5 mm NaCl (prva dijaliza) c1cv1=c2v2 1 1x5=100xc2 0,05 mm NaCl (druga dijaliza)

16 10. Koje aminokiseline u rastvoru imaju kiselu reakciju: a) alanin; b) valin; c) glutaminska kiselina; d) leucin; e) asparaginska kiselina?

17 11. Koje aminokiseline pokazuju bazne osobine: a) leucin; b) treonin; c) histidin; d) lizin; e) metionin; f) arginin?

18 12. Napišite reakciju glicina: a) sa HCl, b) sa NaOH?

19 13. U litar rastvora glicina koncentracije 1,0 mol/l pri izoelektričnoj tački dodano je 0,3 mola NaOH. Odredite ph dobivenog rastvora. ph=pka + log A/HA= 9,60 + log 0,3/0,7=9,23

20 14. Kakvo naelektrisanje ima protein u izoelektričnoj tački: a) pozitivno; b) negativno, c) elektro-neutralno?

21 15. Koji spojevi daju biuretsku reakciju: a) sve aminokiseline; b) glutation; c) dipeptidi; d) tripeptidi i proteini?

22 16. Određivanje sekvence moždanog peptida leucin enkefalina: Grupa peptida koji utiču na nervni prenos u određenim dijelovima mozga je izolirana iz normalnog moždanog tkiva. Ovi peptidi su poznati kao opioidi zato što se vežu za specifične receptore koji također vežu opojne droge, kao što su morfin i nalokson. Opioidi zbog toga oponašaju neka svojstva opijata. Neki istraživači smatraju ove peptide moždanim analgeticima. Predložiti strukturu opioidnog enkefalin leucina koja bi bila u suglasnosti sa niže navedenim informacijama (od a do c): a) Potpuna hidroliza sa 6 M HCl na 110 C koju prati analiza aminokiselina pokazuje prisustvo Gly, Leu, Phe i Tyr u odnosu 2:1:1:1; b) Tretiranje peptida sa 1-fluoro-2,4-dinitrobenzenom koju prati kompletna hidroliza i hromatografija ukazuje na prisustvo 2,4-dinitrofenil derivata tirozina (Tyr). Slobodni Tyr se ne može naći; c) Inkubacija peptida sa kimotripsinom koju prati hromatografija daje slobodni Tyr i Leu, kao i tripeptid koji sadrži Phe i Gly u odnosu 1:2.

23 16. Određivanje sekvence moždanog peptida leucin enkefalina: Grupa peptida koji utiču na nervni prenos u određenim dijelovima mozga je izolirana iz normalnog moždanog tkiva. Ovi peptidi su poznati kao opioidi zato što se vežu za specifične receptore koji također vežu opojne droge, kao što su morfin i nalokson. Opioidi zbog toga oponašaju neka svojstva opijata. Neki istraživači smatraju ove peptide moždanim analgeticima. Predložiti strukturu opioidnog enkefalin leucina koja bi bila u suglasnosti sa niže navedenim informacijama (od a do c): Podatak pod b) govori da je Tyr N-terminalna aminokiselina. Kimotripsin cijepa peptidne veze nastale na karobiksilnim krajevima Phe, Trp i Tyr. Kako nakon inkubacije kimotripsinom nastaju slobdni Tyr i Leu (podatak pod c), a da bi nastao tripeptid Phe i Gly (1:2), Leu mora bit C-terminalna aminokiselina peptida leucin enkefalina. Predložena struktura enkefalina glasi: Tye-Gly-Gly- Phe-Leu.

24 17. Osobine peptidne veze. Prilikom ispitivanja kristalnih peptida x-zračenjem, naučnici Linus Pauling i Robert Corey su našli da C-N veza u peptidima ima dužinu od 1,32 Å, što je između vrijednosti dužina jednostruke C-N veze (1,49 Å) i dvostruke C=N veze (1,27 Å). Oni su pronašli i da je peptidna veza planarna (sva četiri atoma ugljika vezana za C-N grupu su u jednoj ravni) i da su dva α-c atoma vezana za C-N vezu uvijek u trans položaju, u odnosu jedan na drugog (na suprotnim stranama peptidne veze). a) Šta dužina C-N veze u peptidima indicira o jačini ove veze i redu veze (tj. da li je jednostruka, dvostruka ili trostruka) Peptidna veza (C-N) je jača od jednostruke, a po karakteru je između jednostruke i drostruke veze. b) Šta promatranja Paulinga i Coreya govore o lakoći rotacije oko peptidne veze? Rotacija oko peptidne veze je otežana pri fiziološkim temperaturama zbog njenog djelimičnog karaktera dvostruke veze.

25 18. Brzina sinteze α-keratina u kosi. Brzina rasta kose je oko cm/godinu. Sav rast je koncentriran na vlakno kose, gdje su α-keratinske niti smještene unutar živih epidermalnih stanica. Fundamentalni strukturni element α- keratina je α-heliks, koji ima 3,6 ostataka aminokiselina po zavoju i rast od 5,4 Å po zavoju. Uzimajući u obzir da je biosinteza α-keratinskog lanca limitirajući faktor za brzinu rasta kose, izračunajte brzinu po kojoj bi peptidna veza u α- keratinu trebala nastajati (peptidna veza po sekundi) da se dostigne godišnja brzina rasta (dužina) kose. duzina peptidne veze 5,4 /3,6 = 1, 5 Å = 0,15 nm prosječna dužina rasta 17,5 cm/godini broj peptidnih veza ( nm/ s)/0,15nm= 42,28

26 19. Disulfidne veze određuju svojstva više proteina. Neki prirodni proteini bogati su disulfidnim vezama, a njihove mehaničke karakteristike (čvrstoća vlakna, viskoznost, jačina istezanja itd.) povezane su sa stepenom disulfidnog vezivanja. a) Glutenin, pšenični protein bogat disulfidnim vezama, odgovoran je za kohezioni i elastični karakter tijesta napravljenog od pšeničnog brašna. Slično, tvrda i žilava priroda kornjačinog oklopa potiče od brojnih disulfidnih veza u α-keratinu. Koja je molekularna osnova za korelaciju između sadržaja disulfidnih veza i mehaničkih karakteristika proteina? Disulfidne veze su kovalentne veze, koje su mnogo jače od nekovalentnih interakcija koje stabiliziraju većinu proteina. One umrežavaju proteinske lance, povećavajući njihovu čvsrtoću, mehaničku otpornost i tvrdoću b) Većina globularnih proteina se denaturira i gubi svoju aktivnost grijanjem na 65 C. Međutim, globularni proteini koji sadrže više disulfidnih veza moraju se duže ili jače zagrijavati da bi došlo do denaturacije. Npr. inhibitor tripsina goveđeg pankreasa (BPTI) ima 58 aminokiselinskih ostataka u jednom lancu i sadrži tri disulfidne veze. Hlađenjem rastvora denaturiranog proteina vraća se njegova aktivnost. Zašto? Cisteinski ostaci (disulfidne vez) spriječavaju potpuno razmotavanje (denaturaciju) proteina.

27 20. Aminokiselinske sekvence i proteinske strukture. Na osnovu predložene primarne strukture proteina predložiti: a) Gdje može doći do zakretanja ili β-struktura? Na ostacima 7 i 19, prolinski ostaci cis konfiguracije omogućavaju dobro zakretanje b) Gdje se mogu formirati unutarlančane disulfidne veze? Cisteinski ostaci na pozicijama 13 i 24 mogu graditi disulfidne veze.

28 20. c) Pretpostavljajući da je ova sekvenca dio većeg globularnog proteina, ukazati na moguću lokaciju (vanjsku površinu ili unutrašnjost proteina) sljedećih aminokiselinskih ostataka: Asp, Ile, Thr, Ala, Gln, Lys. Obrazložiti. (Uputa: vidjet hidropatski indeks u tabeli 14 u dodatku). Vanjska površina; poralni i nabijeni ostaci (Asp, Gln, i Lys), a unutrašnja površina: nepolarni i alifatski ostaci (Ala, Ile); iako polaran, Thr ima hidroskopski indeks blizak nuli, te se može naći i na spoljnoj ili u unutrašnjosti proteina.

29 21. Struktura peptidnog antibiotika iz Bacillus brevis. Ekstrakti iz bakterije Bacillus brevis sadrže peptid sa antibiotskim svojstvima. Ovaj peptid gradi komplekse sa metalnim jonima i remeti jonski transport kroz stanične membrane drugih bakterijskih vrsta, ubijajući ih tako. Struktura ovog peptida bila je određena na temelju sljedećih promatranja: a) Kompletna kiselinska hidroliza peptida i analiza aminokiselina dala je jednake količine Leu, Orn, Phe, Pro i Val. Orn je ornitin, aminokiselina koja nije prisutna u proteinima, ali je prisutna u nekim peptidima.njegova struktura glasi: b) Molekulska masa peptida iznosila je oko 1200; c) Peptid se razara hidrolizom uz karboksipeptidazu;

30 21. d) Tretman peptida sa FDNB nakon čega je slijedila potpuna hidroliza i hromatografija, dala je slobodne aminokiseline i sljedeći derivat: (napomena: DNP-derivat uključuje amino grupu bočnog lanca, prije nego α-amino grupu) Djelimična hidroliza peptida, hromatografsko razdvajanje i analiza sekvence dali su sljedeće di- i tripeptide: Leu-Phe, Phe-Pro, Orn-Leu, Val-Orn Val-Orn-Leu, Phe-Pro-Val, Pro-Val-Orn Na temelju prethodnih informacija, predložiti aminokiselinsku sekvencu peptidnog antibiotika i obrazložiti. Strelice pokazuju orijentaciju peptidne veze CO NH-.

31 22. Predviđanje sekundarne strukture. Koji od navedenih peptida ima vjerovatniju strukturu α-heliksa i zašto? a) LKAENDEAARAMSEA b) CRAGGFPWDQPGTSN Vjerovatniju strukturu α-heliksa ima peptid a) jer ima više aminokiselinskih ostataka koji teže α-helikoidalnoj strukturi.

32 23. Amiloidna vlakna kod bolesti. Neke male aromatske molekule kao što je fenol crveno pokazale su sposobnost inhibicije prilikom formiranja amiloidnih vlakana u laboratorijskim uslovima (in vitro). Cilj ovakvih izučavanja je pronalaženje lijekova koji mogu biti efikasni kao inhibitori nastanka amiloida u mozgu kod ljudi koji imaju početni stadij Alzheimerove bolesti. a) Objasniti zašto molekule sa aromatskim supstituentima mogu narušiti formiranje amiloidnih vlakana? b) Neki naučnici predlažu da lijekovi koji se koriste kod Alzheimer-ove bolestimogu biti efikasni i za tretman diabetesa tipa 2. Zašto isti lijek može bitikorišten za tretiranje različitih bolesti?

33 23. a) Objasniti zašto molekule sa aromatskim supstituentima mogu narušiti formiranje amiloidnih vlakana? Aromatski ostaci imaju važnu u stabilizaciji amiloidnih vlakana. Tako molekule sa aromatskim supstituentima mogu inhibirati nastanak amiloida interferiranjem sa slaganjem ili udruživanjem aromatskih bočnih lanaca. b) Neki naučnici predlažu da lijekovi koji se koriste kod Alzheimer-ove bolestimogu biti efikasni i za tretman diabetesa tipa 2. Zašto isti lijek može bitikorišten za tretiranje različitih bolesti? Amiloid se formira u pankreasu u vezi sa diabetesom, dok je njegovo prisustvo u mozgu u vezi sa Alzheimerovom bolešću. Iako amiloidna vlakna u ove dvije bolesti uključuju različite proteine, osnovna strukura amiloida je slična i na sličan način se stabilizira, tako da dizajn potencijalnih sličnih lijekova temelji na pometnji ove strukture.

34 24. Koje osobine su karakteristične za proteine: a) amfoternost; b) odsustvo sposobnosti kristalizacije; c) odsustvo sposobnosti zakretanja ravni polarizirane svjetlosti; d) termostabilnost?

35 25. Sa kojim od navedenih spojeva ninhidrinski reagens daje obojenu reakciju: a) polisaharidima; b) monosaharidima; c) nukleinskim kiselinama; d) α-aminokiselinama; e) lipidima?

36 26. Koje veze učestvuju u formiranju konformacione strukture proteina: a) koordinacione; b) vodikove; c) ionske; d) kovalentne?

37 27. Koje od navedenih osobina su karakteristične za denaturirane proteine: a) prisustvo vodikovih veza; b) prisustvo peptidnih veza; c) sekundarna i tercijarna struktura; d) dobra rastvorljivost u vodi?

38 Povežite pojmove po ulogama proteina? Inzulin Mioglobin Rodopsin Hlorofil Prostetička grupa proteina učestvuje u fotosintezi Protein sa hormonskom aktivnošću, učestvuje u regulaciji metabolizma ugljikohidrata Protein mišića sisavaca, prenosi kiseonik u mišićnom tkivu Hromoproteid koji se nalazi u štapićima mrežnjače oka