STRUKTURNI ELEMENTI KRVI

Transcript

1 3. K R V I H E M A T O P O J E S A STRUKTURNI ELEMENTI KRVI Krv predstavlja jedno od specijalizovanih vezivnih tkiva. Ona je jedino tečno vezivno tkivo a istovremeno i jedino vezivno tkivo u čijoj izgradnji učestvuju ćelije i vanćelijski matriks, ali ne i vlakna. U morfološkom organizovanju krvi učestvuju ćelijski elementi eritrociti koji se tradicionalno označavaju kao crvena krvna zrnca i leukociti koji se tradicionalno nazivaju belim krvnim zrncima, strukturirani elementi koji nisu u pravom smislu ćelije krvne pločice kao i vanćelijski matriks krvna plazma. Krv se smatra lokalizovanim vezivnim tkivom budući da kruži unutar krvnih sudova. Ona, s jedne strane, nosi kiseonik iz pluća i hranljive materije iz crevnog sistema do drugih tkiva dok do pluća nosi ugljen-dioksid a do bubrega materije koje predstavljaju proizvod razlaganja jedinjenja koja sadrže azot. Uloge krvi su, međutim, daleko brojnije. Krv, naime, ima esencijalnu objedinjujuću ulogu jer prenosi hormone od mesta njihove sinteze do mesta na kome se ispoljava njihovo delovanje. U krvnoj plazmi su, pored toga, prisutni i globulini među kojima su i antitela pa na taj način učestvuje u odbrani organizma. Crvena krvna zrnca i krvne pločice su pravi strukturirani elementi krvi. Leukociti, kako oni koji se nazivaju granularnim i podrazumevaju heterofilne, eozinofilne i bazofilne granulocite, tako i agranularni limfociti i monociti prisutni su i u drugim tkivima. U njima oni ispoljavaju svoje delovanje i završavaju svoj kratkoveki život, a krv i krvne sudove koriste da bi dospeli do određenog mesta u organizmu. U organizmu odraslog čoveka ima oko 5.5 l krvi što predstavlja približno 7% njegove telesne težine. Krvna plazma čini oko 54% krvi. Među ćelijskim elementima, koji predstavljaju 46% krvi, najviše ima eritrocita 4.5 do 5 x /l, dok krvnih pločica ima x 10 9 /l. Granulociti, koji zajedno sa agranularnim leukocitima čine tek 1% ukupne zapremine krvi, neujednačeno su zastupljeni u odnosu na ukupan procenat leukocita heterofilnih ima najviše, između 50 i 75%, eozinofilnih tek 2 do 4%, a bazofilnih ima samo do 1%. Prisutnost agranularnih leukocita takođe je neujednačena monocita ima od 2 do 8%, a limfocita može biti između 20 do najviše 40%. O značaju koji krv ima u organizmu govori i jedan stih iz Levitske knjige (17, 11): Telesni život je u krvi. Krvna plazma Krvna plazma predstavlja tečnost koja je po svom sastavu veoma bliska intersticijskoj tečnosti. Najvećim delom je čini voda 91-92%, dok proteina i rastvorenih organskih i neorganskih supstanci ima veoma malo 7-8% i 1-2%, respektivno. Krv i hematopojesa 095

2 Nada M. Šerban fibrinogen (MM Da) imunoglobulini (MM od do više miliona Da) albumini (MM oko Da) Među proteinima najznačajniji su fibrinogeni, globulini i albumin. Fibrinogen, protein koji sintetišu hepatociti, parenhimske ćelije jetre, nužan je za formiranje fibrina tokom procesa koagulacije. Imunoglobulini, funkcionalni molekuli imunog sistema predstavljaju najznačajniji deo globulina. Albumini, koje takođe sintetišu hepatociti, odgovorni su za osnovni osmotski pritisak koji krv vrši na zidove krvnih sudova. U krvnoj plazmi su, u veoma malom procentu, prisutne krajnje raznorodne rastvorene supstance: elektroliti koji, na primer, obuhvataju jone kalcijuma, natrijuma, kalijuma, magnezijuma, hlora, potom hranljivi molekuli glukoza, amino-kiseline, lipidi, zatim supstance koje imaju regulatornu ulogu poput hormona, enzima i vitamina kao i neproteinske supstance koje sadrže azot urea, mokraćna kiselina, kreatin itd., i, najzad, kiseonik i ugljen-dioksid. Mnoge slabo rastvorljive ili nerastvorljive supstance prenose se posredstvom krvne plazme zahvaljujući tome što se vezuju za albumin ili pak za α i β globuline. Tako se, na primer, posredstvom albumina prenose lipidi, neki hormoni ili joni metala koji obrazuju komplekse sa transferinima. eritrocit prema grčkim rečima erythros, crven i kytos, šupljina * Eritrociti malog broja sisara kamile i lame, na primer, kao i svih drugih kičmenjačkih grupa u zreloj formi poseduju relativno krupan nukleus. Oko njega se često zapaža svetao prostor koji odražava proširenu perinukleusnu cisternu. Smisao ovog proširivanja još uvek nije poznat. Slika Oblik eritrocita transmembranski proteini značajni za povezivanje sa citoskeletom: glikoforin protein traka 3 Eritrociti crvena krvna zrnca Eritrociti su ćelije koje omogućavaju prenošenje kiseonika i ugljen-dioksida. Smatraju se jedinim pravim ćelijama krvi premda u funkcijski zreloj, morfološki diferenciranoj formi kod većine sisara nemaju nukleus*. Crvena krvna zrnca su ćelije relativno malih dimenzija. Kod ljudi prečnik im se kreće oko 7.5 µm. Oblikom podsećaju na bikonkavan, dvostrano udubljen disk čiji je periferni region deblji od središnjeg (Sl. 3-01) debljina eritrocita u perifernom delu iznosi 2.6 µm dok je u središnjem regionu samo 0.8 µm. Ovakav oblik obezbeđuje povećanu površinu ćelije čime je olakšana razmena gasova. Eritrociti su veoma gipki sa lakoćom se prilagođavaju nepravilnom obliku kapilara kao i promenama njihovog prečnika. Oni, isto tako, sa lakoćom ponovo stiču svoj prethodni, bikonkavan oblik. Ova osobina eritrocita veoma je značajna budući da je njihov prečnik veći od prečnika najmanjih kapilara (3 µm). Sigurno da ćelijska membrana eritrocita predstavlja onu plazminu membranu čija je struktura najbolje izučena. Kako, bar kada je o većini sisara reč, ne poseduju nukleus i citoplazmine organele, eritrociti su dragocen izvor lako izdvojive ćelijske membrane pa je otuda ona postala model- -sistem za izučavanje strukturno-funkcijskih osobenosti plazmine membrane eukariotske ćelije. U ćelijskoj membrani eritrocita prisutni su glikoproteini koji, poput proteina traka 3, obezbeđuju prenošenje jona kalcijuma i bikarbonata ili, poput glikoforina (Sl. 3-02) koji na svojim spoljašnjim segmentima nose antigene i određuju neke krvne grupe. Za razliku od glikoforina koji kroz lipidni dvosloj prolaze samo jedanput, protein traka 3 prolazi više od deset puta. Premda u membrani mogu biti usamljeni, daleko češće formiraju dimere. Između glikoproteina ćelijske membrane, s jedne strane, i elemenata unutrašnjeg ćelijskog skeleta koji su prisutni u podmembranskom citoplazminom sloju, sa druge, na dva mesta je uspostavljen direktan kontakt (Sl. 3-02). Ujedinjeni, oni ostvaruju zajednicu koja obezbeđuje fleksibilnost eritrocita. 096 Krv i hematopojesa

3 Osnovi histologije radna verzija Osnovu podmembranskog citoskeleta predstavlja višeugaona mreža (Sl. 3-03) koju formiraju molekuli spektrina i kratki aktinski filamenti. Ovim komponentama pridružen je čitav niz proteina koji učestvuju u strukturiranju aktinskog filamenta ili upovezivanju spektrinsko-aktinske mreže sa glikoproteina membrane. Ka svakom aktinskom filamentu, koji se često označava kao protofilament budući da ga formira samo 13 do 15 molekula G-aktina, usmereno je pet do sedam spektrinskih molekula. vezu između glikoforina i spektrina ostvaruju: aktinski protofilament protein 4.1 glikoforin protein traka 3 lipidni dvosloj plazmine membrane drugo mesto vezivanja citoplazma prvo mesto vezivanja paladin protein traka 4.1 ankirin tropomodulin spektrin protein kinaza tropomiosin aducin aktinski protofilament dematin Slika Veze koje podmembranski citoskelet uspostavlja sa ćelijskom membranom eritrocita Aktinskom protofilamentu pridružen je tropomiosin koji učestvuje u njegovom ojačavanju. Procese polimerizovanja i depolimerizovanja aktinskog filamenta sprečavaju proteini tropomodulin, prisutan na minus kraju i aducin, prisutan na plus kraju aktinskog protofilamenta (Sl i 3-03). Međutim, aducin, obrazovan od α i β pod-jedinica, pored uloge završnog proteina pokreće i udruživanje spektrina i F-aktina. Značajnu komponentu spektrinsko-aktinske mreže predstavlja i protein dematin koji je pridružen aktinskom protofilamentu (Sl i 3-03). Istraživanja su pokazala kako je dematin, obrazovan od tri podjedinice, funkcijski nužan za održavanje oblika eritrocita i za mehanička svojstva njegove membrane a njegovo vezivanje za aktin reguliše camp-zavisna kinaza. Spektrin je fibrilni proteinski dimer obrazovan od α i β lanca. Ovi lanci nisu simetrični, drugim rečima na njima se razlikuju regioni glave i regioni repa. U uspostavljanju veze između repova spektrinskih dimera i aktinskog filamenta, s jedne strane, i veze sa citoplazminim domenima glikoforina, sa druge, učestvuje protein 4.1. Na taj način ostvareno je prvo mesto vertikalnog povezivanja citoskeleta sa membranom (Sl. 3-02). Drugo mesto povezivanja spektrinsko-aktinske mreže i membrane ostvareno je približno na sredini spektrinskog dimera. Posredstvom globularnog u strukturiranju aktinskog protofilamenta učestvuju: tropomiosin tropomodulin aducin dematin Krv i hematopojesa 097

4 Nada M. Šerban vezu između proteina traka 3 i spektrina ostvaruju: ankirin paladin protein traka 4.1 proteina ankirina i paladina spektrin je vezan za protein traka 3 (Sl i Sl. 3-03)). Posle izlaganja plazmine membrane eritrocita delovanju deterdženta Triton X-100 spektrinsko-aktinsku mrežu, koja u 90% slučajeva ima šestougaonu dok ostatak može imati petougaonu ili sedmougaonu formu, mo- ankirin tropomiosin tropomodulin protein traka 3 paladin spektrin aducin aktinski protofilament dematin glikoforin citoplazmina površina lipidnog dvosloja Slika Komponente višeugaone mreže podmembranskog citoskeleta eritrocita Konstatovano je da jedan broj naslednih bolesti crvenih krvnih zrnaca potiče od grešaka na nivou komponenti citoskeleta i membranskih proteina sa kojima uspostavljaju vezu. Sferociti, eritrociti loptaste forme, karakteristični za naslednu bolest sferocitozu, predstavljaju rezultat netačnog prepisivanja genskog zapisa za ankirin ali mogu biti posledica i nepostojanja dematina. Eliptocite, eritrocite elipsoidne forme, odlikuje nedostatak jedne od formi glikoforina što sekundarno dovodi do modifikacija i u nivou proteina 4.1. guće je izdvojiti i posmatrati kao samostalnu organelu. Međutim, ukoliko se primene drugačiji postupci za njeno izdvajanje, mreža u daleko većem procentu pokazuje petougaoni i sedmougaoni izgled. Koliko su dosadašnja istraživanja pokazala, u izgradnji podmemranskog citoskeleta ne učestvuju motorni proteini pa se smatra da je njena nesumnjiva fleksibilnost koja omogućava povratnu promenu oblika eritrocita zasnovana na fosforilovanju i defosforilovanju pojedinih komponenti. Ovi procesi podrazumevaju aktivnost protein kinaza lokalizovanih u blizini pojedinih strukturnih komponenti spektrinsko-aktinske mreže (Sl. 3-02) U citoplazmi eritrocita, u kojoj nema citoplazminih organela, prisutno je oko 33% hemoglobina, proteina za koji se vezuju kiseonik i ugljen-dioksid. Kada je za njega vezan kiseonik, hemoglobin biva transformisan u oksihemoglobin, a kada je vezan ugljen-dioksid u karbaminohemoglobin. Ove dve forme hemoglobina mogu se transformisati jedna u drugu. Ukoliko se, međutim, za hemoglobin veže ugljen-monoksid, hemoglobin prelazi u karboksihemoglobin, jedinjenje koje više ne može da se transformiše ni u jednu od prethodne dve forme hemoglobina. Pored hemoglobina, u citoplazmi eritrocita nalaze se i enzimi uključeni u metabolizam glukoze. Kako u ovim ćelijama nema organela, a to podrazumeva da nema ni mitohondrija, glukoza predstavlja jedini izvor energije. 098 Krv i hematopojesa

5 Osnovi histologije radna verzija Eritrociti žive relativno dugo, oko 120 dana. Ostareli eritrociti bivaju uklonjeni u koštanoj srži, tamo gde dolazi i do njihovog formiranja, ili pak u slezini fagocituju ih bilo pravi makrofagi bilo retikularne ćelije koje poseduju fagocitne sposobnosti. Krvne pločice Pored eritrocita, i krvne pločice predstavljaju prave strukturirane elemente krvi. One se, kao što je već istaknuto, kod sisara ne mogu smatrati ćelijama nego, uzimajući u obzir njihov nastanak*, visokoorganizovanim delovima citoplazme. Međutim, druge kičmenjačke grupe poput, na primer, ptica poseduju ćelije koje su funkcijski ekvivalenti krvnim pločicama. Nazivaju se trombociti i to su prave ćelije koje poseduju nukleus a u citoplazmi sve uobičajene citoplazmine organele. U sadejstvu sa endotelskim ćelijama i sa oko 13 proteina krvne plazme krvne pločice formiraju krvne ugruške i učestvuju u procesu obnavljanja oštećenog zida krvnog suda. U tom procesu dolazi do izražaja njihova sposobnost adhezije. Međusobno prijanjanje omogućava okoloćelijski polisaharidni omotač krvnih pločica koji ima znatnu debljinu nm i bogat je glikozaminoglikanima i glikoproteinima. Krvne pločive su obično diskoidno-bikonveksnog oblika (Sl. 3-04), ali mogu imati i izduženu formu. Na osnovu vrste i rasporeda struktura koje ih odlikuju razlikuju se dva regiona koji se označavaju kao hijalomera i granulomera. * videti kasnije megakariopojesu trombocit prema grčkim rečima thrombos, ugrušak i kytos, šupljina glikokaliks hijalomera marginalni snop aktinska mreža granulomera glikogenska granula otvoren kanalikularni sistem tamna granula α-granula λ-granula marginalni snop granulomera hijalomera aktinska mreža otvoren kanalikularni sistem Slika Morfološka organizacija krvne pločice Hijalomera predstavlja perifernu oblast koju karakteriše kružno raspoređen snop mikrotubula nazvan marginalnim snopom (Sl. 3-04). Obrazuje ga deset do 15 mikrotubula koje održavaju diskoidni oblik krvnih pločica. U hijalomeri se zapaža i prisustvo nepravilnih, tamno kontrastiranih cevčica malog prečnika koje čine tamni tubularni sistem. Pretpostavlja se da one Krv i hematopojesa 099

6 Nada M. Šerban predstavljaju ostatak endoplazminog retikuluma u čijem lumenu bi mogli biti magacionirani joni kalcijuma. Pored mikrotubula u hijalomeri, ali i u granulomernom regionu prisutna je mreža aktinskih filamenata koja tokom formiranja krvnog ugruška doprinosi promeni oblika krvnih pločica. U središnjem delu krvnih pločica, granulomeri, uočavaju se granule, po neka mitohondrija, peroksisomi, kao i sistem kanala organizovanih u vidu otvorenog kanalikularnog sistema (Sl. 3-04). Ovi kanali, koji su u kontinuitetu sa plazminom membranom, obezbeđuju povećanje površine krvnih pločica i time olakšavaju oslobađanje aktivnih molekula iz citoplazme. Životni vek krvnih pločica je relativno kratak, do deset dana, pa brojne glikogenske čestice prisutne u granulomernom regionu predstavljaju dragocen izvor glukoze. Krvne pločice odlikuju tri vrste granula α-granule, tamne granule i λ-granule (Sl. 3-04). Alfa granule su najbrojnije i imaju najveće dimenzije od 200 do 500 nm. U njima su magacionirane brojne komponente koje su uključene u proces formiranja krvnog ugruška poput proteina koagulacije, molekula adhezije, citokina, aktivatora i angiogenih molekula. Nesumnjivo da neki od ovih molekula predstavljaju rezultat sintetske aktivnosti ćelija od kojih pločice nastaju. Međutim, istraživanja su pokazala da jedan broj supstanci u α-granule dospeva posredstvom endocitose i da su u ovaj proces uključena i multivezikularna tela. O endocitotskom poreklu određenih molekula u ovim granulama svedoči i sastav njihove membrane. Ona, naime, poseduje i neke transmembranske proteine koji odlikuju plazminu membranu krvnih pločica. Unutrašnjost ovih granula organizovana je na specifičan način (Sl. 3-04). Uz membranu su prisutne vezikule i cevčice malog prečnika od oko 20 nm, potom se uočava elektron-svetla oblast dok je u središtu granule elektron-taman region. Tamne granule, koje se ponekad označavaju i kao δ-granule (Sl. 3-04), sitnije su od α-granula prečnik im se kreće između 250 do 300 nm. U njima se nalaze kalcijum, ADP i ATP, serotonin, histamin, pirofosfataza, kao i faktori koji olakšavaju prikupljanje i prijanjanje krvnih pločica, ali i vazokonstrikciju. Po svemu sudeći da čitav niz supstanci koje odlikuje ove granule u njih dospeva, kao i u slučaju α-granula, posredstvom endocitotskih mehanizama. Treća vrsta granula, λ-granule (Sl. 3-04), predstavljaju lizosome i sadrže najmanje 13 kiselih hidrolaza kao i katepsine D i E ali i još neke proteine. Hidrolitički enzimi koji odlikuju ove granule uključeni su u proces resorbovanja krvnog ugruška. Praćenje formiranja krvnog ugruška u in vivo uslovima pokazalo je da ono predstavlja izuzetno složen proces u koji su uključene brojne komponente koje imaju strukturnu ali i regulatornu ulogu. Pojedine etape koje dovode do obrazovanja ugruška precizno su vremenski i prostorno povezane. Endotelske ćelije neoštećenog krvnog suda sintetišu prostacikline i azot- -monoksid koji sprečavaju prikupljanje krvnih pločica uz površinu krvnog suda (Sl. 3-05). Ovome doprinose i tropomodulin i molekuli slični heparinu koji su prisutni na lumenskoj strani membrane endotelskih ćelija i inaktiviraju specifične faktore koagulacije. 100 Krv i hematopojesa

7 Osnovi histologije radna verzija heterofilni granulocit krvna plazma eritrocit krvna pločica endotel podepitelska lamina kolageno vlakno podepitelsko vezivo fon Vilebrandov faktor tkivni tromboplastin promena oblika krvne pločice oštećena endotelska ćelija oslobađanje sadržaja iz α- i δ-granula fibrinska mreža oslobađanje saržaja iz λ-granula obnovljena endotelska ćelija aktivatori plazminogena Slika Etape u formiranju i uklanjanju krvnog ugruška Krv i hematopojesa 101

8 Nada M. Šerban Erik Adolf fon Vilebrand (Erik Adolf von Willebrand, ) finski lekar internista Međutim, ukoliko do oštećenja dođe, endotelske ćelije prestaju da sintetišu inhibitore koagulacije i počinju da luče tkivni tromboplastin, fon Vilebrandov faktor kao i endotelin. Tkivni tromboplastin i fon Vilebrandov faktor utiču na prikupljanje krvnih pločica koje naležu na kolagena vlakna u ogoljenom podepitelskom vezivu (Sl. 3-05). Endotelin pak predstavlja moćan vazokonstriktor koji smanjuje izlivanje krvi izvan krvnog suda. Paralelno sa tim dolazi do izbacivanja sadržaja iz α- i δ-granula krvnih pločica (Sl. 3-05) a ADP uz još neke komponente prisutne u ovim granulama podstiče njihovo dalje prikupljanje. Krvne pločice priljubljuju se jedna uz drugu velikim delom zahvaljujući polisaharidnoj komponenti plazmine membrane. One menjaju i svoj oblik zahvaljajući aktivnosti aktinskog citoskeleta u perifernom regionu. Ova faza u formiranju krvnog ugruška često se označava kao faza aktivacije krvnih pločica. Prikupljanju krvnih pločica doprinose tkivni tromboplastin i tromboplastin oslobođen iz krvnih pločica. Oni deluju na protrombin prisutan u krvnoj plazmi, pretvaraju ga u trombin, enzim koji olakšava prikupljanje krvnih pločica. Pored toga trombin se ponaša kao hemoatraktant na mesto oštećenja privlači heterofilne granulocite, monocite i limfocite koji doprinose regeneraciji oštećenog mesta. Trombin deluje i na endotelske ćelije krvnog suda povećavajući njihovu propustljivost kao i adhezivnost leukocita. U ovim ćelijama trombin podstiče i proizvodnju brojnih molekula uključenih u proces regeneracije endotela, a izgleda da direktno deluje i na glatke mišićne ćelije prisutne u zidu krvnog suda stimulišući njihovu proliferaciju. Tokom faze prikupljanja faktori prisutni u krvnoj plazmi, u oštećenom krvnom sudu i u krvnim pločicama pokreću sukcesivnu interakciju oko 13 proteina plazme koji omogućavaju da se u prisustvu kalcijuma fibrinogen, takođe prisutan u krvnoj plazmi, pretvori u fibrin koji polimerizuje u kratka vlakna koja formiraju mrežu (Sl. 3-05). Ona doprinosi daljem prikupljanju krvnih pločica. Tako obrazovan krvni ugrušak štiti oštećene endotelske ćelije i omogućava im da se obnavljaju. U približavanju slobodnih krajeva endotelskih ćelija značajnu ulogu imaju aktinski i miosinski molekuli krvnih pločica. Oni, formirajući filamente koji uz utrošak ATP-a dovode do kontrahovanja ugruška, na taj način doprinose međusobnom približavanju endotelskih ćelija. Kada je endotel krvnog suda obnovljen ugrušak biva uklonjen. Endotelske ćelije sintetišu i oslobađaju aktivatore plazminogena (Sl. 3-05) koji pretvaraju plazminogen prisutan u krvnoj plazmi u plazmin koji pokreće odlepljivanje ugruška. Ovom procesu svoj doprinos pružaju i krvne pločice iz kojih se oslobađaju hidrolitički enzimi magacionirani u λ-granulama. Leukociti, bela krvna zrnca U krvi čoveka prisutan je oko 1% leukocita. Kao što je već pomenuto, prema tome da li se u njihovoj citoplazmi nalaze ili ne nalaze granule, razlikuju se granularni i agranularni leukociti. U okviru granularnih leukocita razlikuju se tri tipa ćelija heterofilni (polimorfonuklearni), eozinofilni i bazofilni granulociti. Premda se klasifikuju u agranularne leukocite, limfociti i monociti u svojoj citoplazmi, kao što je ranije rečeno poseduju azurofilne granule. 102 Krv i hematopojesa

9 Osnovi histologije radna verzija Kada se na svetlosnom mikroskopu posmatraju razmazi krvi, granulociti se, između ostalog, međusobno mogu razlikovati i na osnovu načina na koji se boje granule u njihovoj citoplazmi. Boje tipa Romanovski na primer metilensko plavo ili pak azuri (proizvodi oksidacije metilensko plavog) koje se često koriste za bojenje razmaza krvi pokazuju bazofiliju dok eozin, budući da je kisela boja, pokazuje acidofiliju (eozinofiliju). Ukoliko se koristi mešavina ovih boja bivaju obojene granule u heterofilnim granulocitima. Ova kategorija granulocita često se naziva i neutrofilnim, ali ovakvo imenovanje ne ukazuje na postojanje više vrsta granula u njihovoj citoplazmi, već ih lažno predstavlja kao neutralne ćelije, pa se može pomisliti kako se te granule boje bilo nekim neutralnim bojama bilo da na bazofilne i acidofilne boje reaguju neutralno. Kako leukociti nisu pravi ćelijski elementi krvi budući da svoju ulogu u ćelijskoj i humoralnoj odbrani organizma ispoljavaju, kao što je već istaknuto, u drugim vezivnim tkivima, njihove morfološke odlike i neki vidovi njihovih funkcija razmatrani su u okviru pregleda ćelija vezivnih tkiva. U krvnom toku leukociti su nepokretne ćelije, njih krvni tok nosi pasivno a napuštaju ga procesom nazvanim dijapedesa (Sl. 3-06). fibroblast heterofilni granulocit Slika Dijaledesa heterofilnog granulocita vanćelijski matriks kapilar FORMIRANJE ĆELIJA PRISUTNIH U KRVI Proces tokom koga dolazi do formiranja diferenciranih ćelijskih elemenata prisutnih u krvnom toku naziva se hematopojesa. Ona podrazumeva obrazovanje, diferenciranje i sazrevanje pravih ćelija krvi eritrocita, strukturiranih elemenata krvi krvnih pločica, i onih ćelija koje krvni tok koriste ne bi li dospeli do svih regiona u organizmu u kojima se njihovo dejstvo u punoj meri ispoljava granularnih i agranularnih leukocita. Pored ovih ćelija, hematopojetički proces dovodi i do formiranja mastocita, dendritskih ćelija, ali i osteoblasta i osteoklasta. Istraživanja su pokazala da su hematopojetički procesi izuzetno intenzivni budući da se kod ljudi, na primer, svakog dana formira oko 2 x eritrocita i belih krvnih zrnaca. Hematopojetičkim, specijalizovanim vezivnim tkivima nazivaju se ona tkiva u kojima se odigrava proces hematopojese. Hematopojetička tkiva nisu istovetna u embrionu i u odraslom organizmu. Tokom embrionskog razvoja kičmenjaka koje odlikuje formiranje vanembrionskih tvorevina, posebno placentnih sisara, hematopojesa počinje u krvnim ostrvcima koja se uočavaju u oblasti vitelusne kese. U krvnim ostrvcima uglavnom se formiraju eritrociti, makrofagi i megakariociti, ali se ove ćelije razlikuju od onih koje nastaju u hematopojetičkim tkivima odraslog organizma. Eritrociti, naime, poseduju nukleus a formiranju makrofaga ne prethodi stupanj monocita. Hematopojetičku ulogu zatim ima i aorta-gonado-mesonefrosni region u okviru koga se uočavaju hematopojetičke ćelije pridružene endotelu ventralnog dela dorzalne aorte. Hematopojesa u ovom regionu je privremena a podrazumeva formiranje eritrocita, granulocita i limfocita. Potom hematopojetičku ulogu preuzima i jetra kao i slezina. U periodu oko rođenja hematopojetičke ćelije iz jetre migriraju u koštanu srž koja se diferencira paralelno sa formiranjem skeletnih elemenata. hematopojesa prema grčkim rečima haima, haimatos, krv i poiesis, praviti Krv i hematopojesa 103

10 Nada M. Šerban Kod odraslog organizma najvećeg broja sisara jedino hematopojetičko tkivo je koštana srž. Ona je lokalizovana u sunđerastom koštanom tkivu nekih dugih kostiju, u kičmenim pršljenovima i u grudnoj kosti. Treba, međutim, naglasiti da u određenim okolnostima jetra i slezina mogu ispoljiti hematopojetičke funkcije. Zanimljivo je da kod glodara slezina odraslih jedinki čuva svoja hematopojetička svojstva. Koštana srž se javlja u dve forme u formi crvene i žute koštane srži. Crvena koštana srž odlikuje novorođene i mlade organizme dok žuta koštana srž odlikuje odrasli organizam. No, bez obzira da li je reč o jednoj ili o drugoj formi, koštana srž je uvek izgrađena od vezivne strome i hematopojetičke komponente. Vezivnu stromu formiraju ćelije strome i sinusoidni kapilari (Sl. 3-07). Pod ćelijama vezivne strome podrazumevaju se retikularne ćelije i njima veoma slične adventicijske ćelije. Ove dve vrste ćelija mnogi istraživači označavaju kao ćelije slične fibroblastima. Preko svojih nastavaka retikularne i adventicijske ćelije uspostavljaju međusobni kontakt i na taj način formiraju svojevrsnu mrežu. U organizovanju ove mreže učestvuju i neveliki snopovi adventicijska ćelija makrofag vanćelijski matriks ćelija slična adipocitu retikularno vlakno retikularna ćelija endotelska ćelija sinusoida Slika Histološke komponente strome koštane srži retikularnih vlakana. Pločasti nastavci adventicijskih ćelija postavljeni su uz osnovicu endotelskih ćelija i na taj način im pružaju mehaničku potporu budući da ovaj tip kapilara ne odlikuje podepitelska lamina. Komponente vezivne strome su i makrofagi. U žutoj koštanoj srži uočavaju se i ćelije u čijoj citoplazmi postoji lipidno telo (Sl. 3-07). Nazivaju se ćelijama sličnim adipocitima a ne adipocitima belog masnog tkiva budući da prema nekim istraživanjima one nastaju transformacijom retikularnih ćelija. Sa starošću organizma postupno raste broj ćelija sličnih adipocitima, a sma-njuje se količina hematopojetičke komponente. Retikularne i adventicijske ćelije imaju umerenu količinu citoplazminih organela uključenih u sintetske procese i nešto elemenata lizosomskog sis- 104 Krv i hematopojesa

11 Osnovi histologije radna verzija tema. Međutim, ove ćelije pod dejstvom određenih stimulusa mogu da vrše fagocitosu. Glavninu onih hematopojetičkih ćelija koje iz nekog razloga nisu pravilno razvijene ipak uklanjaju makrofagi. Oni fagocituju i ostarele eritrocite. Otuda se u njihovoj citoplazmi uočavaju krupni fagosomi i preostala tela (Sl. 3-07). Unutar okaca mreže koju formiraju retikularne i adventicijske ćelije kao i retikularna vlakna smeštene su slobodne ćelije koje predstavljaju hematopojetičku komponentu koštane srži. One se nalaze u različitim stupnjevima formiranja budućih zrelih ćelija prisutnih u krvnoj plazmi. Pored ćelijskih elemenata, važnu komponentu vezivne strome predstavljaju i komponente vanćelijskog matriksa kolageni tipa I i III, fibronektin, laminin i proteoglikanski molekuli. Laminin, fibronektin i hemonektin, strukturni glikoprotein koji odlikuje ovaj matriks, vezuju se za odgovarajuće receptore na površini ćelija i tako ih povezuju sa matriksom. Koštana srž ima mnogobrojne funkcije. Pored obrazovanja ćelija krvi, ona je, kao što je već pomenuto, prostor u kome se jednim delom odvija uklanjanje ostarelih eritrocita premda ne treba zanemariti doprinos makrofaga u slezini*. U koštanoj srži takođe se čuva i gvožđe. Čuvanje gvožđa je veoma značajno za obnavljanje hemoglobina, ključnog jedinjenja koje odlikuje eritrocite a vezuje kiseonik i ugljen-dioksid. Hemoglobin je obrazovan od globina i porfirinskog jezgra. Po obavljenoj fagocitosi i razlaganju ostarelih eritrocita globin se u makrofagima brzo razlaže. Porfirinsko jezgro pak biva transformisano u bilirubin, pigment žuči. Gvožđe se prenosi posredno, uz pomoć jednog liganda, transferina, proteina krvne plazme, a čuva se u citoplazmi makrofaga i mladih eritrocita u formi feritina, gvožđe-proteinskog kompleksa i hemosiderina. Fagocitne ćelije makrofagi i retikularne ćelije tako uskladišteno gvožđe predaju ćelijama koje su na putu diferenciranja u eritrocite. Na odvijanje hematopojetičkih procesa utiču unutarćelijski regulatori i spoljašnji signali. Aktivnost unutrašnjih regulatora faktora transkripcije, molekula uključenih u prenošenje signala i u odvijanje ćelijskog ciklusa moduliraju spoljašnji signali. Oni pak obuhvataju citokine, koje mnogi označavaju kao hematopojetine, i molekule vanćelijskog matriksa. Neki od hematopojetina u koštanu srž dospevaju, slično hormonskim supstancijama, krvnim tokom. Druge sintetišu ćelije vezivne strome i izlučuju u vanćelijsku sredinu u kojoj oni parakrino deluju na hematopojetičke ćelije. U trećem slučaju molekuli-spoljašnji signali bivaju umetnuti u plazminu membranu ćelija vezivne strome pa je nužno da hematopojetičke ćelije sa njima stupe u direktan kontakt. U hematopojetine svrstavaju se interleukini, faktori koji stimulišu kolonije označeni skraćenicom CSFs*, faktor matičnih ćelija, faktori rasta, kao i eritropojetin i trombopojetin, na primer. Hematopojetine sintetišu ćelije strome ali i monociti, endotelske ćelije, limfociti i fibroblasti. Zajedno sa ćelijama koje ih sintetišu, hematopojetini i molekuli vanćelijskog matriksa formiraju hematopojetičke mikrosredine koje su od ključnog značaja za odvijanje hematopojese. Pitanje porekla ćelija krvi razmatrano je tokom više od jednog veka i u jednom periodu dovelo do formiranja dve u osnovi oprečne teorije. Jedna, Neka istraživanja pokazuju da po obavljenom fagocitovanju eritrocita i spajanju fagosoma sa komponentama lizosomskog sistema dolazi do razdvajanja citoplazme eritrocita i njenog akumuliranja u prostor između membrane fagolizosoma i eritrocitne membrane. Ovako izdvojena citoplazma iz fagolizosoma biva uklonjena posrestvom mehurastih izvrata dok eritrocitna membrana biva fragmentisana. Sa napredovanjem procesa razgradnje, u fagosomu se primećuje postupno smanjenje gustine a prestaju da se zapažaju strukturni elementi eritrocita. * videti poglavlje posvećeno histološkoj organizaciji limfoidnih organa. * prema anglosaksonskom izrazu Colony-Stimulating Factors Krv i hematopojesa 105

12 Nada M. Šerban * PHSC prema anglosaksonskom izrazu Pluripotent Hematopoietic Stem Cell Slika ovog nukleusa na preparatima pripremljenim za posmatranje na svetlosnom mikroskopu podsećala je histologe na površinu blago ustalasane vode ili, pak, na tigrovu kožu. * long-term i short-term stem cells anglosaksonskih autora * u okviru poglavlja Potporno vezivno tkivo videti Koštano tkivo monofiletička, zasnivala se na ideji da sve krvne ćelije potiču od jedne zajedničke predačke ćelije, dok je druga, polifiletička, bila zasnovana na ideji da svaka krvna loza eritrocitna, granulocitna, monocitna, limfocitna i loza krvnih pločica ima svoju sopstvenu predačku ćeliju. Zahvaljujući uvođenju novih metoda i njihovom usavršavanju danas je opšteprihvaćeno gledište da je poreklo svih krvnih loza monofiletičko, drugim rečima da sve ćelije prisutne u krvi potiču od jedne zajedničke predačke ćelije. Ta majka-ćelija svih krvnih ćelija nazvana je pluripotentnom hematopojetičkom matičnom ćelijom (Sl. 3-08). Ona se označava skraćenicom PHSC* i poput svih ćelija vezivnih tkiva potiče od mezenhimske ćelije (Sl. 2-02), a nastaje još u veoma ranom periodu embrionskog razvoja. Pluripotentnu hematopojetičku matičnu ćeliju negdanji histolozi nazivali su hemocitoblastom. Priznavali su da ga nije morfološki jednostavno opisati, a na preparatima posmatranim na svetlosnom mikroskopu prepoznati. Govorili su da je nevelikih dimenzija i da ima relativno malu količinu citoplazme u odnosu na veličinu nukleusa. On je pretežno euhromatski, sa heterohromatskim delom organizovanim u finu mrežu. Najčešće su u njemu istaknuta dva nukleolusa. Citoplazmu hematocitoblasta, koja je na histološkim preparatima bledo plavičasto obojena, smatrali su slabo bazofilnom. Ovakvom opisu PHS ćelije danas se može dodati i podatak da je ona relativno retka procene kažu da ona predstavlja 0.005% ukupnog broja ćelija hematopojetičkog tkiva. Pored toga, pojam pluripotentna hematopojetička matična ćelija obuhvata dve populacije matičnih ćelija nazvanih dugoročno samoobnavljajućim odnosno kratkoročno samoobnavljajućim PHS ćelijama*. Ćelije proistekle iz deoba dugoročno samoobnavljajućih ćelije imaju pluripotentne odlike majke-ćelije i na taj način se održava stalna količina hematopojetičkih matičnih ćelija. Proliferacijom kratkoročno samoobnavljajućih ćelija uglavnom nastaju ćelije koje u pogledu potentnosti nisu istovetne sa majkom-ćelijom i mogu se smatrati opredeljenim ćelijama. Treba istaći da najveći broj hematopojetičkih matičnih ćelija ne odlikuju česte deobe. Smatra se da ovo mirovanje, nedeljenje, predstavlja mehanizam zaštite genetičkog materijala od mogućih grešaka do kojih može doći tokom proliferacije. Malobrojnost ali i nepostojanje preciznih morfoloških odlika onemogućavaju da pluripotentna hematopojetička matična ćelija bude lako uočena na preparatima pripremljenim za posmatranje na svetlosnom mikroskopu. Međutim, ako se primene metodi koji ističu specifične obeleživače njene ćelijske membrane poput, na primer, CD34, hematopojetička matična ćelija može se zapaziti. Obeleživač označen skraćenicom CD34 je integrisani membranski glikoprotein koji reguliše adheziju hematopojetičkih ćelija za ćelije strome. Treba, međutim, pomenuti kako mala podpopulacija hematopojetičkih matičnih ćelija ne eksprimira CD34 a ima pokazatelja koji ukazuju da upravo od ovih ćelija nastaju one koje eksprimiraju ove markere. Ispitivanja su pokazala kako lokalizacija hematopojetičkih matičnih ćelija u koštanoj srži nije slučajna. Njihov najveći broj je, naime, smešten u perifernom regionu koštane srži, uz površinu endosteuma*. Ćelije koje proističu iz njihovog opredeljenjivanja i diferenciranja susreću se u regionima 106 Krv i hematopojesa

13 Osnovi histologije radna verzija pluripotentna hematopojetička matična ćelija multipotentna mijeloidna matična ćelija multipotentna limfoidna matična ćelija CFU-LyB CFU-LyT CFU-EMeg CFU-GM CFU-Meg CFU-E CFU-M CFU-G CFU-Eo CFU-Ba B-limfocit T-limfocit megakarioblast eritroblast monocit heterofilni granulocit T-limfocit pomagač megakariocit plazmocit citotoksični T-limfocit krvne pločice eritrocit makrofag eozinofilni granulocit bazofilni granulocit Slika Hematopojetičko stablo Krv i hematopojesa 107

14 Nada M. Šerban * prema anglosaksonskom izrazu Colony Forming Unit, jedinica koja formira koloniju granulocita, eritrocita, monocita i megakariocita ** S za spleen, slezina. Slezina se pominje da bi ostalo zabeleženo kako su u tom organu prvi put nedvosmisleno pokazane matične ćelije. Naime, kada se u slezinu miševa ozračenih letalnom dozom X-zraka, koja za sobom povlači nestanak hematopojetičkih matičnih ćelija koštane srži, ubrizga suspenzija ćelija koštane srži neozračenog miša-davaoca, dolazi do formiranja malih čvorića koji odgovaraju kolonijama hematopojetičkih ćelija. Ispitivanja su pokazala da je svaki od čvorića obrazovan od mešavine od oko milion hematopojetičkih ćelija svih vrsta, a potiču od jedne jedine matične ćelije i to po svemu sudeći kratkoročno samoobnavljajuće pluripotentne matične ćelije. * prema anglosaksonskom izrazu Burst Forming Unit, jedinica u navaljujućem naletu udaljenim od endosteuma, a što su ćelije više uznapredovale u diferenciranju bliže su krvnim sudovima. Kada stupe u dodir sa faktorom matične ćelije, SCF koji je umetnut u plazminu membranu ćelija vezivne strome, kratkoročno samoobnavljajuće pluripotentne matične ćelije okončavaju interfazni period svog života proliferacijom. Rezultat ove deobe mogu biti dve ćelije koje su istovetne sa majkom-ćelijom ili pak jedna od njih može biti multipotentna mijeloidna matična ćelija ili multipotentna limfoidna matična ćelija (Sl. 3-08). Proliferaciju PHS ćelije podstiču interleukini IL-1, IL-3 i IL-6. Multipotentna mijeloidna matična ćelija često se označava skraćenicom CFU-GEMM* odnosno CFU-S**. Multipotentna limfoidna matična ćelija, označena skraćenicom CFU- -L predstavlja matičnu ćeliju limfoidne loze. Ona može dati rodonačelnu, unipotentnu ćeliju B-limfocitne loze, CFU-LyB ili rodonačelnu ćeliju T- -limfocitne loze, CFU-LyT. Od CFU-LyB linije procesom diferenciranja nastaju B-limfociti koji, kada su aktivirani, dovode do formiranja plazmocita (Sl. 3-08) i memorijskih B- -limfocita. Kako se sazrevanje B-limfocita kod ptica odigrava u divertikulumu crevne cevi označenom kao bursa Fabricii, Fabricijusova kesa ovi limfociti se označavaju B-limfocitima. Smatra se da se proces diferenciranja B-limfocita kod sisara odigrava u koštanoj srži premda ima mišljenja kako bi ovaj proces mogao da se odigrava i u nekom od segmenata limfoidnog tkiva crevne cevi. Od CFU-LyT procesom sazrevanja i diferenciranja pod uticajem određenih hematopojetina nastaju sve klase T-limfocita (Sl. 3-08). Ovaj proces se odigrava u timusu pa se ova klasa limfocita zato naziva T- -limfocitima. Smatra se da od multipotentne limfoidne matične ćelije i to najverovatnije od CFU-LyT rodonačelne ćelije nastaju i NK ćelije. Multipotentna mijeloidna matična ćelija pod uticajem SCF, ali i IL-1, IL-3 i IL-6 proliferiše i daje neku od rodonačelnih ćelija mijeloidne loze (Sl. 3-08). Pri tome treba istaći da neke od rodonačelnih ćelija odlikuje bipotentnost. Bipotentna eritrocitno-megakariocitna ćelija označena skraćenicom CFU- -EMeg ćelija, preko prelaznog oblika označenog skraćenicom BFU-EMeg*, dovodi do formiranja unipotentne rodonačelne CFU-E ćelije i unipotentne rodonačelne CFU-Meg ćelije. Rodonačelne ćelije procesom nazvanim eritropojesa odnosno megakariopojesa omogućavaju formiranje eritrocita i krvnih pločica, respektivno. Prethodničke forme eitrocitne i megakariocitne loze odlikuju zajednički i jedinstveni faktori transkripcije dok u diferenciranoj formi, bar kod sisara, ovi u funkcijskom smislu pravi elementi krvi ne poseduju nukleus. Međutim, biološki smisao ne posedovanja nukleusa još uvek nije do kraja objašnjen. Ima mišljenja da ne posedovanje nukleusa eritrocite i krvne pločice povećava njihovu fleksibilnost kada se nađu u cirkulaciji. Zanimljivo je da su istraživanja vezana za neke obeleživače koji odlikuju rane forme ove krvne loze ukazala na mogućnost da bipotentna eritrocitno-megakariocitna ćelija nastaje, možda direktno, od dugoživeće pluripotentne hematopojetičke matične ćelije (Sl. 3-08). Bipotentna ćelija označena skraćenicom CFU-GM preko unipotentne rodonačelne CFU-G ćelije dovodi do formiranja heterofilnih granulocita 108 Krv i hematopojesa

15 Osnovi histologije radna verzija a preko unipotentne rodonačelne CFU-M ćelije procesom označenim kao monopojesa dovodi do obrazovanja monocita. Od rodonačelne CFU-Eo ćelije formiraju se eozinofilni granulociti dok CFU-Ba ćelija vodi ka formiranja bazofilnih granulocita. Proces formiranja sva tri tipa granulocita, bez obzira na razlike koje postoje između CFU-G, CFU-Eo i CFU-Ba ćelija označava kao granulopojesa ili mijelopojesa. Treba pomenuti kako CFU-EM i CFU-GM ćelije nisu jedine bipotentne rodonačelne ćelije hematopojetičkog stabla. Pored njih postoje i rodonačelne ćelije koje dovode do formiranja B-limfocita, s jedne strane, i do formiranja makrofaga, sa druge. Pokazano je da i rana forma rodonačelne ćelije T-limfocitne loze u timusu poseduje, doduše u maloj meri, mijeloidni potencijal. Smatra se da i ćelije vezivne strome nastaju od mezenhimskih ćelija koje direktno ili indirektno daje CFU-F* ćeliju koja se diferencira u retikularnu ćeliju ili u ćeliju sličnu adipocitu. Retikularna ćelija može da se transformiše u makrofag koštane srži ili u adventicijsku ćeliju ili da ostane nepromenjena retikularna ćelija. Treba pomenuti kako se smatra da i ćelije koje prikazuju antigene i to posebno one koje se označavaju kao dendritske ćelije, kao i mastociti svoje izvorište imaju u koštanoj srži. Pitanje podsticaja koji pokreće i usmerava deljenje i dalju sudbinu kćeri- -ćelija rodonačelne ćelije ka nekoj od ćelijskih loza nalazi odgovore u dvema mogućim hipotezama. Po jednoj, koju zastupaju deterministi, smatra se da su signali koji pokreću proces hematopojese spoljašnji, drugim rečima zasnovani na delovanju hemopojetina, dok se po drugoj, stohastičkoj, procesi smeštaju u ravan slučajnosti. Početne ćelijske forme u koštanoj srži zaista su neprekidno izložene delovanju proizvoda ćelija vezivne strome i brojnih molekula koji su prisutni u međućelijskim prostorima. Izdvojene su relativno brojne supstancije za koje je pokazano da nesumnjivo imaju ulogu stimulusa i pokazano je da u određenim stupnjevima razvoja ćelije na svojoj površini poseduju receptorske molekule koji na te stimuluse mogu pozitivno odgovoriti, znači usmeriti ih u pravcu eritroblastičke, mijeloblastičke ili neke druge loze. Međutim, još uvek se ne zna koji signal pokreće pojavu tih receptora niti koji sve receptori odlikuju najprimitivnije ćelijske forme. A upravo pojava tih receptora je fundamentalna za mehanizam diferenciranja ćelija krvi. Na ovakvim razmišljanjima je i zasnovana hipoteza slučajnosti. S druge strane, pokazano je da ćelije koje su u određenom pravcu diferenciranja uznapredovale utiču na sudbinu prethodničkih formi mehanizmom povratne sprege što ide u prilog determinističkoj hipotezi. Prevaga jedne ili druge hipoteze ili, pak, zasnovanost obeju pokazaće se tek kada budu do kraja poznati svi mehanizmi uključeni u početne faze procesa hematopojese. * prema anglosaksonskom izrazu Colony Forming Unit-Fibroblast Eritropojesa Pod eritropojesom podrazumeva se proces koji dovodi do formiranja i sazrevanja crvenih krvnih zrnaca. Tokom određenih faza eritropojese dolazi do značajnog povećanja broja eritropojetičkih ćelija. Ćelije eritrocitnog genealoškog stabla trpe nekoliko osnovnih promena njihova veličina kao Krv i hematopojesa 109

16 Nada M. Šerban i veličina nukleusa postupno se smanjuju, nukleusi postaju piknotički i na kraju bivaju odstranjeni, a citoplazma, u kojoj ima sve manje citoplazminih organela, biva ispunjena sve većom količinom hemoglobina (Sl. 3-09). Smatra se da eritropojetička serija počinje unipotentnim rodonačelnim CFU-E ćelijama. One su malih dimenzija prečnik im se kreće između 7 i 9 μm i u odnosu na količinu citoplazme imaju krupan nukleus. On je euhromatski, ispunjeni difuznim hromatinom i u njemu se jasno zapažaju jedan do dva nukleolusa. Na preparatima posmatranim na svetlosnom mikroskopu citoplazma je bledo plavičasto obojena, a na transmisionom elektronskom mikroskopu u njoj se uočava prisustvo relativno dobro razvijenih citoplazminih organela. Smatra se da ova ćelija po mnogim svojim morfološkim odlikama podseća na limfocit. proeritroblast bazofilni eritroblast polihromatofilni eritroblast ortohromatofilni eritroblast odstranjivanje nukleusa eritroid eritrocit Slika Shematski prikaz eritropojese Rezultat deobe CFU-E ćelije predstavljaju proeritroblasti, prve ćelije koje se sa sigurnošću mogu identifikovati na preparatima posmatranim na svetlosnom mikroskopu. Proeritroblast je krupna ćelija, prečnika od oko 20 μm (Sl i 3-10). Citoplazma mu je veoma bazofilna odlikuje se prisustvom velike količine slobodnih ribosoma i poliribosoma. Nukleus je krupan, loptast, ali se na njegovoj površini mogu uočiti dva zaravnjena mesta. U nukleusu se zapažaju dva do tri nukleolusa. Proeritroblast prolazi kroz dva 110 Krv i hematopojesa

17 Osnovi histologije radna verzija deobna ciklusa i daje kćeri-ćelije koje su označene kao bazofilni eritroblasti (Sl. 3-09). Bazofilni eritroblast je okruglasta ćelija nešto manjih dimenzija od majke- -ćelije prečnik mu se kreće između 10 i 15 μm. Nukleus je loptast, sa nešto više heterohromatskih oblasti nego što je to slučaj sa nukleusom proeritroblasta (Sl. 3-10), a u njemu se zapažaju fragmenti nukleolusa. Citoplazma je bazofilnija premda se u njoj zapaža sve manje citoplazminih organela i dalje je prisutna velika količina slobodnih ribosoma i poliribosoma. Snopovi mikrotubula na periferiji ćelije formiraju prsten koji održava okruglastu formu ovih ćelija. Bazofilni eritroblast deli se dva puta i daje polihromatofilne eritroblaste (Sl. 3-09). Polihromatofilni eritroblasti su manji od majke-ćelije prečnik im se kreće između 10 i 12 μm, ali su neizmenjenog oblika (Sl. 3-10). Nukleusi, ekscentrično postavljeni, još su tamniji, povećana je količina heterohromatskih regiona. Nukleolusi se više ne uočavaju. I u citoplazmi dolazi do promena na preparatima posmatranim na svetlosnom mikroskopu zapaža se da je obojena delimično bazofilno a delimično acidofilno, pa otuda i potiče njihov naziv. Promena bojenih odlika citoplazme predstavlja rezultat postupnog nagomilavanja novosintetisanog hemoglobina. U citoplazmi se na preparatima posmatranim na transmisionom elektronskom mikroskopu uočavaju retke mitohondrije dok je broj drugih organela značajno smanjen. Mogu se zapaziti i skupine feritina prečnika od 0.1 do 0.3 μm koje se nazivaju siderosomi. I polihromatofilni eritroblast se deli i daje ortohromatofilne eritroblaste (Sl. 3-09). Ortohromatofilni eritroblast, koji se često naziva eozinofilnim eritroblastom ili normoblastom, više ne može da se deli, ali se zato u njemu odigravaju procesi diferenciranja koji postupno vode ka formiranju zrelog eritrocita. Manjih je dimenzija od prethodne ćelijske forme prečnik im iznosi od 7 do 12 μm. Njegova citoplazma je takoreći u potpunosti acidofilna jer je došlo do značajnog nagomilavanja hemoglobina. Nukleus ovih ćelija je u potpunosti heterohromatski i piknotički (Sl. 3-10). U citoplazmi ima još samo retkih mitohondrija kao i sitnih i retkih siderosoma a druge organele se ne zapažaju. Zanimljivo je da u uklanjanju organela nisu angažovani hidrolitički enzimi lizosomskog sistema nego proteasomi. Nukleus biva postupno potiskivan ka periferiji ćelije i na kraju izbačen (Sl. 3-09). Pri tome, dolazi i do gubljenja jednog dela citoplazme. Tokom ove faze dolazi i do redistribucije glikoproteina plazmine membrane. Naime, onaj njen deo koji okružuje nukleus i citoplazmu oko njega odlikuju glikoproteini u čijoj izgradnji ne učestvuje sijalinska kiselina. Glikoproteini u čijoj izgradnji učestvuje sijalinska kiselina karakteristični su za plazminu membranu eritroida i zrelog eritrocita. Smatra se da u procesima redistribucije ovih glikoproteina značajnu ulogu imaju spektrinsko-aktinske komponente citoskeleta i protein 4.1 čija je sinteza na ovom stupnju eritropojesa intenzivna. Intenzivno je i eliminisanje transferina. Na preparatima posmatranim na svetlosnom i na transmisionom elektronskom mikroskopu može se uočiti da su ćelije eritroblastičke loze priljubljene uz retikularnu ćeliju i zajedno obrazuju eritroblastičko ostrvce (Sl. 3-10). Retikularna ćelija svojim relativno debelim citoplazmatskim Krv i hematopojesa 111

18 Nada M. Šerban nastavcima koji se završavaju čupercima mikroresica obuhvata eritrocite u formiranju. Ona pruža mehanički oslonac ovim slobodnim ćelijama i procesom nazvanim rofeocitosa predaje im feritin. Egzocitosom, naime, feritin biva izbačen iz retikularne ćelije i u međućelijskom prostoru priljubljuje se uz bazofilni eritroblast ortohromatofilni eritroblast proeritroblast retikularna ćelija eritroid preostalo telo polihromatofilni eritroblast Slika Eritroblastičko ostrvce * prema anglosaksonskom izrazu Granulocyte/Macrophage Colony-Stimulating Factor polisaharide na površini eritroidnih ćelija i u njih ulazi procesom endocitose. Potom dolazi do fragmentisanja membrane endocitotske vezikule i feritin, koji se tako našao u citoplazmi eritroidne ćelije, ugrađuje se u hemoglobin. Ove ćelije, međutim, gvožđe mogu preuzeti i na drugi način, posredstvom njegovog prenosioca transferina. Mlad eritrocit, eritroid, ima prečnik od 7.2 do 9 μm. U njegovoj citoplazmi zapaža se još po neka retka mitohondrija kao i nešto siderosoma. Ukoliko se svež razmaz krvi boji sa brilijantsko kresil plavom bojom ili sa 9-amino-akridinom, u njegovoj citoplazmi uočava se fina plavičasta mreža. Zbog njenog prisustva ove ćelije se ponekad nazivaju retikulocitima. Dugo se smatralo da ta mreža predstavlja odraz prisustva elemenata granuliranog endoplazminog retikuluma. Međutim, posmatranje tankih preseka koštane srži na transmisionom elektronskom mikroskopu pokazalo je da ih u eritroidu više nema već da pod dejstvom ovih boja dolazi do precipitiranja preostalih poliribosoma. Tokom završnog koraka ka formiranju zrelog eritrocita, uspostavlja se podmembranski citoskelet čije se komponente povezuju sa citoplazmatskim domenima glikoproteina ćelijske membrane. Na odvijanje eritropojese utiču eritropojetin, GM-CSF*, IL-3 i IL-4. Eritropojetin je hormon koji se sintetiše u endotelskim ćelijama kapilarne mreže intersticijuma bubrega i to kada koncentracija kiseonika u krvi opadne. On deluje na diferenciranje CFU-E ćelije i podstiče mitose BFU-E ćelija. Već posle 48 časova po sintetisanju ovog hormona, u krvi se pojavljuju novi eritrociti. 112 Krv i hematopojesa

19 Osnovi histologije radna verzija Megakariopojesa Megakariopojesom označava se proces formiranja krvnih pločica. On podrazumeva (Sl. 3-08) usmeravanje bipotentne CFU-EMeg ćelije ka unipotentnoj rodonačelnoj ćeliji ove krvne loze, CFU-Meg ćeliji. Ona se pak diferencira u megakarioblast (Sl. 3-11), ćeliju prečnika od 15 do 25 μm. Megakarioblast odlikuje bledo bazofilna citoplazma, okruglast nukleus koji na svojoj površini poseduje uvrate a primećeni su i dvorežnjeviti nukleusi. Nukleus je euhromatski sa većim brojem nukleolusa. Megakarioblast je ćelijska forma megakariocitne loze koja je sposobna za proliferaciju koja dovodi do, doduše nevelikog povećanja broja ćelija. Na ovaj proces utiču brojni faktori poput mnogih interleukina ali i GM-CSF kao i eritropojetina. Uz sadejstvo trombopojetina, relativno specifičnog hemopojetina megakariocitne loze, ovi faktori podstiču i netipično smenjivanje mitotskih ćelijskih ciklusa. Naime, u ćeliji se odigrava udvajanje centriola i replikacija DNK, ćelija iz G2 faze ulazi u mitosu ali njen rezultat nisu dve kćeri-ćelije. Ovaj fenomen dovodi do poliploidije a količina DNK biva i 30 puta veća nego u drugim ćelijama. Detaljnija proučavanja ovog fenomena pokazala su kako ćelija u svakom od ciklusa ulazi u profazu praćenu raskidanjem nukleusnog ovoja i formiranjem deobnih vretena i prolazi kroz metafazu i anafazu A, ali anafaze B, telofaze i citokinese nema. Ovaj proces mnogi istraživači označavaju pojmom endomitosa. Međutim, upravo fragmentisanje nukleusnog ovoja tokom profaze ukazuje na razliku između ponašanja megakarioblasta i fenomena endomitose. Smatra se da poliploidiju megakarioblasta omogućava jedinstven regulatorni mehanizam koji se ispoljava u anafazi. Treba, međutim, istaći da nivo na kome ovaj mehanizam deluje još uvek nije do kraja sagledan. Tokom procesa udvajanja DNK povećava se veličina nukleusa ali i količina citoplazme pa se i prečnik ćelije uvećava i iznosi oko 45 μm. U citoplazmi se uočava veliki broj cisterni granuliranog endoplazminog retikuluma, veoma dobro razvijen Goldžijev aparat kao i brojni centriolarni parovi. Od svakog centriolarnog para mikrotubule se zrakasto šire i upravljene su ka periferiji ćelije. Kada nukleus stekne višerežnjevitu formu a u citoplazmi počnu da se uočavaju granule specifične za krvne pločice, govori se o promegakariocitu (Sl. 3-11). Promegakariocit i dalje raste i menja položaj postupno se približava sinusoidnom kapilaru. Povećanje količine citoplazme praćeno je intenzivnim sintetskim procesima. Oni su, s jedne strane, usmereni ka formiranju proteina prisutnih unutar sekretnih granula, a sa druge ka sintezi receptora za fibrinogen i fon Vilebrandov faktor. Ovi receptori bivaju usmereni ka površini ćelije. Treba istaći kako su istraživanja pokazala da sadržaj u granulama krvnih pločica ne predstavlja rezultat isključivo sintetske aktivnosti ćelija megakariocitne loze. Jedan deo supstancija koje odlikuju na prvom mestu α-granule ali i tamne granule u njih dospeva endocitosom posredovanom receptorima kao i onom koja ne zahteva određene receptore. Posrednik između endocitotskih vezikula i granula su multivezikularna tela koja su u početku veoma brojna dok su granule malobrojne. Primećeno je da sa povećanjem veličine ćelija megakariocitne loze dolazi do smanjenja broja multivezikularnih tela a povećanja broja granula. Zanimljivo je da između trombopojetina i eritropojetina postoji visok stepen homologije u nivou N-terminalne polovine što može posredno ukazati na bliskost megakariocitne i eritrocitne loze. Krv i hematopojesa 113

20 Nada M. Šerban centriola demarkacioni membranski sistem pseudopodija megakarioblast granule promegakariocit mikrotubula krvne pločice megakariocit sinusoid pro-pločica Slika Etape u formiranju krvnih pločica 114 Krv i hematopojesa

21 Osnovi histologije radna verzija U perifernim delovima citoplazme promegakariocit uočava se početak formiranja demarkacionog membranskog sistema (Sl. 3-11). On predstavlja razgranatu međusobno povezanu mrežu tubula koja je u kontinuitetu sa plazminom membranom. Poreklo demarkacionog membranskog sistema dugo je bilo nejasno. Mislilo se da njegove komponente mogu poticati od specifične, neobičneformeglatkogendoplazminogretikuluma, odgoldžijevog aparata ili, pak, mogu biti duboki uvrati ćelijske membrane. Eksperimenti sa ubrizganim feritinom razrešili su dilemu pokazujući da plazmina membrana formira ovaj specifični membranski sistem koji predstavlja svojevrsnu membransku rezervu značajnu za diferenciranje krvnih pločica. Nesumnjivo da deo ovog sistema učestvuje u formiranju otvorenog kanalikularnog sistema i tamne tubularne mreže, komponenti koje odlikuju krvne pločice. Megakariocitom se označava diferencirana ćelija megakariocitne loze čiji se prečnik kreće između 50 i 100 μm. Postavljena je uz sam sinusoidni kapilar i svoje citoplazmatske nastavke velikih dimenzija, koji se ponekad nazivaju pseudopodijama, provlači između endotelskih ćelija i kroz otvore unutar endotelske ćelije i tako usmerava u šupljinu krvnog suda (Sl. 3-11). U citoplazmi megakariocita više se ne uočavaju centrosomi a mikrotubule se pomeraju ka periferiji ćelije i postavljaju se paralelno sa njenom površinom (Sl. 3-11). Istraživanja su pokazala kako se u ovoj fazi megakariopojese uspostavlja otvoren kanalikularni sistem kao i tamna tubularna mreža. Dalje etape u formiranju krvnih pločica podrazumevaju promene u nivou pseudopodija. Naime, one se transformišu u citoplazmatske nastavke znatne dužine od 100 d0 500 µm unutar kojih se odvija proces razvoja pojedinačnih krvnih pločica. Ovi nastavci, koji se često označavaju kao prethodnici krvnih pločica ili pro-pločice, mogu biti međusobno povezani i formirati svojevrsnu mrežu (Sl. 3-11). Nesumnjivo da demarkacioni membranski sistem obezbeđuje dovonju rezervu membrana za formiranje prvo pseudopodija a potom i pro-pločica. One podsećaju na perle međusobno povezane tankim citoplazmatskim mostovima budući da se čitavom njihovom dužinom uočavaju lokalna proširenja čiji prečnik odgovara prečniku krvnih pločica. Istraživanja su pokazala kako značajnu ulogu u izduživanju i usmeravanju pro-pločica imaju mikrotubule. Pored toga, one omogućavaju i kretanje strukturnih komponenti krvnih pločica ka slobodnim završecima pro-pločica. Na slobodnom kraju pro-pločice mikrotubule formiraju petlju koja predstavlja začetak marginalnog snopa. Treba istaći kako su ispitivanja u in vitro uslovima pokazala da megakariociti gajeni u prisustvu trombopojetina formiraju dinamičnu mrežu pro-pločica a da se diferencirane krvne pločice odvajaju isključivo od njihovog slobodnog kraja. Međutim, još uvek nije sa preciznošću utvrđeno kako do ovog oslobađanja dolazi. U svakom slučaju takoreći čitava citoplazma megakariocita biva transformisana u masu pro- -pločica koja se odvaja od nukleusa okruženog nevelikom količinom citoplazme (Sl. 3-11). Istraživanja su pokazala kako svaki megakariocit prosečno oslobodi oko 10 4 krvnih pločica. Treba pomenuti kako još uvek nema pouzdanog objašnjenja biološkog značaja poliploidije koja odlikuje megakariocitnu lozu. Jedno od objašnjenja Krv i hematopojesa 115

22 Nada M. Šerban pretpostavlja da višeploidna ćelija koja poseduje veliku količinu citoplazme i veoma aktivan sintetski aparat proizvodi više krvnih pločica od manje ploidne ćelije. mijelopojesa prema grčkim rečima myelos, srž i poiesis, praviti Mijelopojesa (granulopojesa) Mijelopojesom ili, pak, granulopojesom naziva se proces tokom koga dolazi do formiranja i sazrevanja ćelija granulocitne loze heterofilnih, eozinofilnih i bazofilnih leukocita. Tom prilikom dolazi do povećanja broja i smanjenja veličine mijeloblastičkih ćelija, citoplazma biva obogaćena granulama a nukleus postupno menja svoju formu i od loptastog postaje režnjevito-potkovičast (Sl. 3-12). Promene oblika nukleusa praćene su promenom njegovog položaja u citoplazmi on postupno zauzima ekscentričan položaj. Kao što je već istaknuto, granulociti nemaju zajedničku rodonačelnu ćeliju već unipotentne rodonačelne CFU-Eo i CFU-Ba ćelije dovode do formiranja eozinofilnih odnosno bazofilnih granulocita dok bipotentna CFU-GM ćelija preko unipotentne rodonačelne CFU-G ćelije dovodi do formiranja heterofilnih granulocita (Sl. 3-08). Međutim, pojedine ćelijske forme ovih granulocitnih loza imaju neke zajedničke odlike što omogućava da se morfološki vid granulopojese može detaljnije razmatrati na primeru nastanka heterofilnih granulocita. Od promijeloblasta diferenciranjem nastaje mijeloblast (Sl. 3-12), prva ćelija granulocitne loze koja se može identifikovati na preparatima posmatranim na svetlosnom mikroskopu. To je krupna ćelija prečnika između 14 i 20 μm koja ima okrugao, euhromatski nukleus u kome se uočavaju tri do pet nukleolusa. Citoplazma mu je bazofilna a sadrži umerenu količinu citoplazminih organela i dosta slobodnih ribosoma i poliribosoma. Mijeloblast se razvija u promijelocit. Promijelocit je ćelija krupnija od mijeloblasta prečnik joj se kreće između 18 i 24 μm. Nukleus mu je blago bubrežast i unekoliko ekscentrično postavljen, a u njemu se pored nukleolusa zapažaju veoma osmiofilne grupacije hromatina (Sl. 3-12). U citoplazmi se nalaze brojne cisterne granuliranog endoplazminog retikuluma, slobodni ribosomi kao i poliribosomi, a i mitohondrije. Sintetski procesi su aktivirani i sa trans-strane diktiosoma odvajaju se nespecifične, azurofilne granule. U njima se nalaze hidrolitički enzimi. Promijelociti mogu da se dele dajući nove promijelocite. Neki od ovih promijelocita tokom sledećih sedam do osam dana diferenciraju se u mijelocite. To su okruglaste ćelije manjih dimenzija od promijelocita prečnik im se kreće između 10 i 16 μm, a i nukleusi su im manji. Ekscentrično su postavljeni, imaju blago eliptično-ulegnutu formu i veću količinu heterohromatina od ćelijske forme koja im prethodi (Sl. 3-12). Uz ulegnuće na površini nukleusa smešten je Goldžijev aparat. Na stupnju mijelocita u njihovoj citoplazmi dolazi do pojave granula specifičnih za heterofilnu, eozinofilnu odnosno bazofilnu lozu. Specifične granule se odvajaju od cis-strane Goldžijevog aparata (Sl. 3-12) i njihov broj se povećava. Nespecifične, azurofilne granule prisutne su u citoplazmi svih mijelocita. Mijelociti su poslednje ćelijske forme u granulocitnim lozama koje imaju sposobnost proliferacije a dovode do formiranja heterofilnih, eozinofilnih odnosno bazofilnih metamijelocita. 116 Krv i hematopojesa

23 Osnovi histologije radna verzija promijelocit azurofilna granula mijeloblast promijelocit promijelocit specifična granula heterofilni mijelocit tercijerna granula heterofilni metamijelocit heterofilni granulocit sinusoid Slika Granulopojesa formiranje heterofilnih granulocita Krv i hematopojesa 117

24 Nada M. Šerban Metamijelociti su, takođe, okruglaste ćelije, ali nešto manjih dimenzija od mijelocita prečnik im varira između 12 i 15 μm. Bubrežasta forma nukleusa još je izraženija, a povećana količina heterohromatina dovodi do njihove tamnije obojenosti i/ili kontrastiranosti. U citoplazmi se uočava postupno smanjenje broja citoplazminih organela (Sl. 3-12) kao i pojava znatne količine glikogenskih čestica. Metamijelociti nemaju sposobnost deljenja. Diferencirajući se daju zrele granulocitne ćelijske elemente. To diferenciranje podrazumeva dalju pro-mene oblika i veličine nukleusa on postupno postaje ne samo manji nego u većoj ili manjoj meri režnjevit (Sl. 3-12). U početku je dvorežnjevit a u slučaju heterofilnih metamijelocita mogu se uočiti i nukleusi trakastog oblika. Kada je diferenciranje u potpunosti obavljeno, zreli granulociti ulaze u sinusoidne kapilare koštane srži provlačeći se između endotelskih ćelija (Sl. 3-12). Granulociti u krvnom toku provode relativno kratko vreme, između osam i 12 časova. Proces formiranja granulocita podstiče grupa hemopojetina poput, na primer, GM-CSF, faktora koji stimuliše kolonije granulocita i monocita, zatim G-CSF, faktora koji stimuliše kolonije granulocita, kao i nekih interleukina, a sintetišu ih, pošto su aktivirane, brojne ćelije monociti, makrofagi, limfociti, fibroblasti, endotelske ćelije kapilara... Monopojesa Monopojesom se naziva proces tokom koga se u koštanoj srži obrazuju i sazrevaju monociti, ćelije koje svoju funkciju ispoljavaju tek kada se nađu u vezivu i transformišu u jednojedarne makrofagne ćelije, ali predstavljaju i predhodničke ćelije višejedarnih makrofagnih ćelija*. Kao što je već istaknuto, bipotentna CFU-GM ćelija može krenuti bilo ka granulopojesi koja dovodi do formiranja heterofilnog granulocita bilo ka monocitnoj lozi. Njeno usmeravanje ka monocitnoj lozi podstiču GM-CSF, interleukin-3 i M-CSF, faktor koji stimuliše kolonije monocita a prva ćelijska forma se označava kao promonoblast (Sl. 3-13). Po svojim morfološkim odlikama on je veoma azurofilna granula promonoblast monoblast Slika Monopojesa monocit sinusoid blizak promijeloblastu odlikuje ga loptast euhromatski nukleus dok se u slabo bazofilnoj citoplazmi zapaža relativno mala količina citoplazminih 118 Krv i hematopojesa

25 Osnovi histologije radna verzija organela. Promonoblasti se diferenciraju u monoblaste pa u promonocite (Sl. 3-13) a ovaj proces podrazumeva rastenje ćelije, postupnu promenu oblika nukleusa koji postaje bubrežast i zauzima ekscentričan položaj u ćeliji, kao i pojavu azurofilnih granula, lizosoma koji odlikuju zrele monocite. Ove ćelijske forme imaju sposobnost proliferacije a kćeri-ćelije promonocita daju monocite (Sl. 3-13), ćelije koje se posredstvom krvnog toka usmeravaju ka vezivnim tkivima i u njima mogu biti podstaknuti da se diferenciraju u makrofage. Monociti žive znatno duže od granulocita, između 60 i 90 dana. Limfopojesa Limfopoja, proces tokom koga dolazi do formiranja i sazrevanja limfocita, podrazumeva da se od multipotentne limfoidne matične ćelije formiraju dve limfoidne grane. Jedna daje ćelije koje se usmeravaju ka venskom sinusu koji ih odvodi do timusa, primarnog limfoidnog organa u kome dolazi do njihovog umnožavanja i sazrevanja. Rezultat tog procesa su T-limfociti koji se označavaju kao citotoksični T-limfociti ili CD8 ćelije i T-limfociti pomagači ili CD4 ćelije. Druga grana daje ćelije koje ostaje u koštanoj srži u kojoj kod sisara dolazi do formiranja zrelih B-limfocita. Ova grana limfopojese podrazumeva niz ćelijskih formi koje, između ostalog, obuhvataju limfoblast, pro B-ćeliju, pre B-ćeliju, nezrelu B-ćeliju i zreo B-limfocit (Sl. 3-14). Ove stupnjeve definiše ekspresija niza receptora na njihovoj površini, rearanžiranje imunoglobulinskih gena, kao i promene u veličini ćelija. Ćelije endosteuma* zrela B-ćelija krvni sud B-ćelija u apoptosi antigen sopstvenog organizma labavo vezan za receptorski kompleks B-limfocitni receptorski kompleks za antigen antigen sopstvenog organizma čvrsto vezan za receptorski kompleks nezrela B-ćelija receptor za interleukin-7 pro B-ćelija receptor pre B-ćelije pre B-ćelija interleukin-7 Slika Faze sazrevanja B-limfocita ćelija strome koje omeđavaju prostor u kome je smeštena koštana srž, kao i retikularne ćelije koje čine osnovu njene strome, sintetišu različite citokine koji su nužni za umnožavanje i ćelijsko diferenciranje B-limfocita. U procesu sazrevanja Krv i hematopojesa 119