PROBAVA U USTIMA. Ana Shek Vugrovečki, dr. med. vet. doc. dr. sc. Jasna Aladrović, dr. med. vet.

Transcript

1 PROBAVA U USTIMA Ana Shek Vugrovečki, dr. med. vet. doc. dr. sc. Jasna Aladrović, dr. med. vet.

2 Ciljevi: Definirati: slinu, slinsku amilazu i njezino djelovanje Odrediti čimbenike koji utječu na djelovanje slinske amilaze Definirati jedinicu aktivnosti slinske amilaze

3 PROBAVA U USTIMA

4 SLINA mješavina sekreta 3 velikih slinskih žlijezda: zaušne (GLL. PAROTIS) podvilične (GLL. SUBMAXILLARES) podjezične (GLL. SUBLINGUALES) i drugih sitnih žlijezda usne šupljine bezbojna, viskozna, lagano opalescentna tekućina, bez okusa i mirisa

5 2 vrste sekretornih stanica u sl. žlijezdama: SEROZNE bistar, vodenast sekret, bogat bjelančevinama MUKOZNE gust, ljepljiv sekret, bogat mucinima mukozne kanalić serozne

6 ph SLINE Čovjek slabo kisela ili slabo lužnata ph ~ 6,63 Domaće životinje - slabo lužnata SVINJA ph ~ 7,3 PAS, KONJ ph ~ 7,56 Preživači jače lužnata ph ~ 8,10

7 SASTAV SLINE 99% H % organskih + anorganskih tvari ANORGANSKE TVARI - koncentracija Na +, K +, Ca ++ i Mg ++ u slini odgovara približno koncentraciji u krvnoj plazmi Ca-bikarbonat na zraku Ca-karbonat = zubni kamenac

8 ORGANSKE TVARI bjelančevine (albumini, globulini, glikoproteini, mucini) GLIKOPROTEINI KRVNIH GRUPA (3 mg%) u kriminalistici identifikacija osoba tvari s antibakterijskim djelovanjem: leukociti, LIZOZIM (mukolitički enzim), OPSONINI, IgA SVINJA, PERAD SLINSKA AMILAZA!

9 SLINSKA AMILAZA = α-amilaza, PTIJALIN za djelovanje potrebni: temperatura oko 37 C slabo lužnat do slabo kiseo ph aktiviraju je ANORGANSKI IONI prvenstveno Cl - inaktiviraju je tragovi TEŠKIH METALA djelovanje KRATKOTRAJNO - počinje djelovati u ustima - djelovanje se nastavlja u želucu dok ga ne INAKTIVIRA KISELI ph želučanog soka i RAZGRADI PEPSIN postoji i gušteračina amilaza!

10 ŠKROB = biljni POLISAHARID rezervna hrana u biljkama (kukuruz, pšenica, riža, krumpir) osnovna jedinica disaharid MALTOZA u hladnoj vodi, eteru i alhokolu se ne otapa u toploj bubri KOLOIDNO (želatinozna smjesa) - AMILAZA KATALIZIRA HIDROLIZU ŠKROBA DO MALTOZE

11 ŠKROB AMILAZA MALTOZA MALTAZA GLUKOZA može se HIDROLITIČKI RAZGRADITI do glukoze pomoću mineralnih kiselina, uz povišenu temperaturu

12 LUGOLOVA REAKCIJA NA ŠKROB PRINCIP reakcije: zasniva se na ADSORPCIJI molekula JODA na površini ŠKROBNIH MICELA grijanjem molekule joda se otpuštaju plava boja nestaje hlađenjem ponovna adsorpcija molekula joda vraća se plava boja

13 KOLOIDNA OTOPINA ŠKROBA + LUGOLOV REAGENS INTENZIVNO PLAVO OBOJENJE = POZITIVAN LUGOL

14 Zadatak 2. FEHLINGOVA REAKCIJA pozitivnu Fehlingovureakciju daju spojevi sa SLOBODNIM ALDEHIDNIM I KETONSKIM SKUPINAMA svi MONOSAHARIDI od DISAHARIDA: MALTOZA i LAKTOZA

15 POSTUPAK: FEHLING I (plava boja) FEHLINGOV REAGENS (+) REAKCIJA + FEHLING II PROKUHATI I ISPITIVANA OTOPINA ŽUTOSMEĐI - u jednakom omjeru OHLADITI PROKUHATI DO VRENJA TALOG = FEHLINGOV REAGENS

16 LUGOL FEHLING LUGOL FEHLING

17 Pokus 1. UTJECAJ VANJSKIH ČIMBENIKA NA AKTIVNOST AMILAZE 1. epruveta 2. epruveta 3. epruveta 4. epruveta nativna slina prokuhana slina nativna slina nativna slina HCl NaOH K.O.Š. K.O.Š. K.O.Š. K.O.Š.

18 IZVESTI Lugolovu i Fehlingovu reakciju: 1. epruveta 2. epruveta 3. epruveta 4. epruveta LUGOL LUGOL+ LUGOL+ LUGOL + FEHLING + FEHLING- FEHLING- FEHLING-

19

20 Pokus 2. AKTIVNOST AMILAZE PO WOHLGEMUTHU Kvantitativno određivanje JEDINICA AKTIVNOSTI AMILAZE PO WOHLGEMUTHU = količina škroba koja se pod djelovanjem enzima toliko razgradi da s jodom (Lugolovim reagensom) ne daje nikakvo obojenje 1 WOHLGEMUTHOVA JEDINICA = 1 ml koloidne otopine škroba koncentracije 1 g/l koji se hidrolizira do AHRODEKSTRINA u vremenu od 30 minuta, pri T 38 C i u prisustvu NaCl

21 Hidroliza škroba pod djelovanjem slinske amilaze: DEKSTRINI plavo-ljubičasta boja s Lugolovim reagensom ERITRODEKSTRINI crvenkasta boja s Lugolovim reagensom AHRODEKSTRINI nema obojenja s Lugolovim reagensom MALTOZA nema obojenja s Lugolovim reagensom

22 Pribor i kemikalije: 0,9% otopina NaCl (fiziološka otopina; FO) koloidna otopina škroba (KOŠ) masene koncentracije 2 g/l nativna slina radna otopina Lugolovog reagensa stalak s 10 epruveta pipeta od 5 ml i od 2ml kapaljka Postupak: u prvu epruvetu otpipetira se 4 ml FO, a u ostale epruvete po 2 ml. Zatim se u prvu epruvetu otpipetira 1 ml nativne sline, dobro se promućka i otpipetira 2 ml sadržaja u drugu epruvetu. Sadržaj druge epruvete se dobro promućka i iz nje se otpipetira 2 ml sadržaja u treću epruvetu. Postupak se ponavlja do posljednje epruvete iz koje se 2 ml sadržaja baci. Ovim postupkom dobiju se razrjeđenja sline: :5 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560

23 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 1. FO 4 ml 2 ml 2. NATIVNA SLINA 1 ml Promućkati i prenositi po 2 ml sadržaja 3. KOŠ (2 g/l) nakon toga u svaku epruvetu dodati po 1mL K.O.Š. Sadržaj epruveta dobro promućkati i ostaviti u termostatu 30 min. na 38 0 C.

24 nakon inkubacije u svaku epruvetu počevši od zadnje prema prvoj dodati 3 kapi Lugolovog reagensa. LUGOLOV REAGENS :5 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 AKRODEKSTRIN ERITRODEKSTRIN DEKSTRIN ŠKROB npr. nakon dodavanja Lugolovog reagensa u četvrtoj epruveti sadržaj nije promijenio boju aktivnost slinske amilaze = 40 Wohlgemuthovih jedinica

25 aktivnost slinske amilaze = 40 Wohlgemuthovih jedinica