PRAKTIKUM IZ FIZIOLOGIJE 2

Transcript

1 1954 PRAKTIKUM IZ FIZIOLOGIJE 2 Doc. dr Zdenko Kanački 2

2 Doc. dr Zdenko Kanački PRAKTIKUM IZ FIZIOLOGIJE 2 UNIVERZITET U NOVOM SADU POLJOPRIVREDNI FAKULTET Novi Sad, 2015.

3

4 EDICIJA POMOĆNI UDŽBENIK Osnivač i izdavač edicije Poljoprivredni fakultet, Novi Sad, Trg Dositeja Obradovića 8, 2100 Novi Sad Godina osnivanja 1954 Glavni i odgovorni urednik edicije Dr Milan Popović, redovni profesor. Dekan poljoprivrednog fakulteta. Članovi komisije za izdavačku delatnost Dr Ljiljana Nešić, vanredni profesor, - predsednik. Dr Branislav Vlahović, redovni profesor, - član. Dr Milica Rajić, redovni profesor, - član. Dr Nada Plavša, vanredni profesor, - član.

5 CIP - Каталогизација у публикацији Библиотека Матице српске, Нови Сад 591.1(075.8) КАНАЧКИ, Зденко Praktikum iz fiziologije 2 / Zdenko Kanački. - Novi Sad : Poljoprivredni fakultet, 2015 (Novi Sad : Feljton) str. : ilustr. ; 30 cm. - (Edicija Pomoćni udžbenik) Tiraž Bibliografija. ISBN a) Ветеринарска физиологија COBISS.SR-ID ii

6 Autor Dr Zdenko Kanački, docent Glavni i odgovorni urednik Dr Milan Popović, redovni profesor, Dekan poljoprivrednog fakulteta u Novom Sadu. Urednik Dr Milenko Stevančević, redovni profesor, Direktor Departmana za veterinarsku medicinu Fotografija Dr Zdenko Kanački, docent Recenzenti Dr Josip Krnić, redovni profesor. Univerzitet u Sarajevu, Veterinarski fakultet Dr Slobodan Stojanović, docent. Univerzitet u Novom Sadu, Poljoprivredni fakultet. Izdavač Univerzitet u Novom Sadu, Poljoprivredni fakultet, Novi Sad. Zabranjeno preštampavanje i fotokopiranje. Sva prava zadržava izdavač. Štampa: Štamparija "Feljton", Novi Sad Štampanje odobrio: Komisija za izdavačku delatnost, Poljoprivredni fakultet, Novi Sad. Tiraž: 20 Mesto i godina štampanja: Novi Sad, iii

7 PREDGOVOR Praktikum iz Fiziologije 2 predstavlja logički nastavak i jedinstvenu celinu sa praktikumom iz Fiziologije 1, pa se napomene koje su date u predgovoru tog praktikuma odnose u celosti i na ovaj praktikum. Nastava iz Fiziologije, za studente veterinarske medicine je iz didaktičkih razloga podeljena u dva predmeta Fiziologija 1 i Fiziologija 2, a podela je izvršena po organskim sistemima. Međutim, važno je napomenuti da se svi procesi u organizmu međusobno integrišu u jednu, jedinstvenu celinu i samo se kao takvi mogu u potpunosti sagledati i razumeti. Razumevanje nastavne materije obrađene u okviru ovog praktikuma je uslovljeno dobrim poznavanjem i razumevanjem činjenica, metoda i tehnika koje su detaljno opisane u Praktikumu iz Fiziologije 1. U okviru Praktikuma iz Fiziologije 2 opisani su ogledi koji se izvode na laboratorijskim životinjama, pa je i na ovome mestu potrebno ponovo naglasiti neophodnost poštovanja etičkih i zakonskih normi. Iz ovog razloga je izvođenje praktičnih vežbi, opisanih u okviru ovog praktikuma, predviđeno uz korišćenje alternativnih metoda (modela). Na ovaj način je studentima omogućeno upoznavanje sa metodama i tehnikama koje se primenjuju u radu sa laboratorijskim nživotinjama, a ujedno i lakše razumevanje činjenica koje su utvrđene opisanim ogledima. Ovaj praktikum je, pre svega, namenjen studentima studijskog programa Veterinarske medicine, ali ga mogu koristiti i studenti srodnih studijskih programa. Pored njih, njega mogu koristiti i stručnjaci iz ovih oblasti, kao podsetnik u svakodnevnom radu. Novi Sad, godine. A u t o r iv

8 SADRŽAJ 1.0 Fiziologija varenja i metabolizam Ispitivanje pljuvačke Određivanje elektrohemijske reakcije pljuvačke Ispitivanje enzimske aktivnosti ptijalina Ispitivanje sadržaja buraga Ispitivanje fizičko-hemijskih svojstava sadržaja buraga Mikroskopski pregled sadržaja buraga Proba vrenja glukoze (stvaranja gasova) Dokaz sposobnosti stvaranja amonijaka iz uree Proba vezivanja nitrita 1.3 Varenje u jednokomornom želucu Ukupna kiselost želudačnog soka Enzimi želudačnog soka 1.4 Varenje u tankom crevu Crevni sok Pankreasni sok Žuč 1.5 Fiziologija jetre Određivanje sadržaja proteina u krvnoj plazmi / serumu Određivanje aktivnosti transaminaza u krvnoj plazmi / serumu Određivanje koncentracije glukoze u krvnoj plazmi / serumu Određivanje koncentracije uree u krvnoj plazmi / serumu Određivanje koncentracije ukupnog bilirubina u krvnoj plazmi / serumu Određivanje koncentracije kalcijuma u krvnoj plazmi 2.0 Fiziologija ekskrecije i bilans vode i elektrolita Opšti podaci o uzorku mokraće Fizičke osobine mokraće Fizičko-hemijske osobine mokraće Hemijski sastojci mokraće Mikroskopski pregled mokraće Ispitivanje diureze pacova nakon opterećenja vodom efekti 47 adiuretina 2.7 Klirens plazme Energetski bilans i termoregulacija Termogenetski napor Fiziologija endokrinog sistema Fiziologija endokrinog pankreasa Endokrina regulacija kalcemije 62 v

9 5.0 Fiziologija centralnog nervnog sistema (CNS) Ispitivanje nekih klinički važnijih refleksa kod sisara Patelarni reflex (reflex kvadricepsa) Refleks Ahilove tetive Refleksi oka Kornealni refleks Pupilarni refleks Refleksi spinalne žabe Narkoza žabe Spinalni šok Širenje (radijacija) refleksa Refleks brisanja (zaštitni reflex) Refleksno vreme Sinapsa pruža otpor provođenju nadražaja Arefleksija izazvana uklanjanjem delova refleksnog luka 5.3 Uticaj acetilholina, adrenalina i atropine na pupilarni otvor žabe 6.0 Fiziologija čula 6.1 Prag za dve tačke 6.2 Osetljivost na različite structure 6.3 Memorija i osećaj dodira vi

10 1.0 Fiziologija varenja i metabolizam Jedna od osnovnih karakteristika života jeste stalna razmena materija između organizma i okolne spoljašnje sredine. Biljni i životinjski organizmi čine s okolnom prirodom nerazdvojnu celinu a vezu između njih predstavljaju razne organske i neorganske materije koje neprekidno kruže u svim ćelijama organizma. Te, za život neophodne, hranjive materije unose se u životinjski organizam hranjenjem, izuzev kiseonika koji se unosi disanjem. Uneta hrana služi kao: izvor energije za organizam i materijal za izgradnju telesnih struktura. Oslobađanje energije i sinteza nove žive materije odigravaju se u toku složenih biohemijskih procesa koji se označavaju kao metabolizam ili promet materija. Promet materija podrazumijeva tri grupe fizioloških procesa: primanje (unošenje), razlaganje i resorpcija hranjivih materija i unošenje kiseonika (varenje i spoljašnje disanje), proces hemijskih transformacija hranjivih materija u ćelijama organizma (intermedijarni promet) i proces izlučivanja krajnjih produkata prometa materija (ekskrecija i deponovanje). Organizam može da iskoristi u prirodnom, nepromenjenom obliku samo neke materije kao što su voda, razni joni (mineralne materije) i vitamini. Zadatak procesa varenja sastoji se u tome da hranu, unetu u digestivni trakt, izmeni tako da je organizam može iskoristiti. Procesom varenja u digestivnom traktu dolazi do postepenog razlaganja hranljivih materija u njihove proste sastojke: belančevine na amino kiseline, ugljenih hidrata na glukozu i druge monosaharide, masti na glicerol i masne kiseline. Sastojci nastali procesom varenja lako se rastvaraju i difunduju kroz površinske slojeve ćelija, brzo se resorbuju iz creva (i buraga), a sem toga oni nisu tuđi organizmu i posle resorpcije organizam je u stanju da ih iskoristi bilo kao energetski izvor, bilo za izgradnju ćelija. U radu organa za varenje za sve životinje zajednička su četiri osnovna procesa: mehanički i fizički procesi varenja hrane, odnosno motorna funkcija probavnog sistema, digestivne sekrecije, tj. lučenje sekreta iz žlezda koje učestvuju u varenju hrane, hemijski procesi varenja, pod kojim se podrazumeva enzimsko razlaganje hranljivih materija i resorpcija produkata varenja iz digestivnog trakta u krv i/ili limfu.

11 Ove aktivnosti organa za varenje odigravaju se povezano i skoro uvek istovremeno u svim delovima digestivnog trakta; pri tome jedna aktivnost uslovljava mogućnost odigravanje druge. Karakteristična i specifična funkcija koju, u okviru zajedničkog procesa varenja, obavljaju pojedini organi digestivnog trakta, u vezi je sa postupnim promenama hrane tokom procesa varenja. Hrana, dospela u bilo koji deo probavnog trakta, u mnogome se razlikuje od takve iste hrane koja je proboravila izvesno vreme u drugom delu digestinog trakta. Tako, u usnu duplju biva uneta prirodna i neizmenjena hrana, ali ona u želudac dospeva već znatno izmenjena (sažvakana je, mnoge materije u njoj prešle su iz čvrstog stanja u oblik rastvora, a neke su se hemijski izmenile, itd.). Iz želuca hrana prelazi u creva još više promenjena, sa izrazito kiselom reakcijom od izlučene HCl, sa znatno razloženim belančevinama pod dejstvom pepsina, a kod preživara i sa razgrađenom celulozom pod dejstvom mikroflore i mikrofaune. Dalje menjanje hrane u crevima odigrava se uz istovremenu stalnu resorpciju svarenih sastojaka, dok se, najzad, u debelim crevima ne formira izmet, koji nema nikakve sličnosti sa hranom koja je uneta u digestivni trakt. Klasifikacija životinja na mesojede, biljojede i svaštojede izvršena je na osnovu načina njihove ishrane dok su bile slobodne u prirodi. One su osnovne sastojke hrane (proteine, masti i ugljene hidrate) dobijale hraneći se biljkama ili drugim životinjskim vrstama. Otuda se evolucija građe i funkcije njihovog digestivnog trakta odigravala najvećim delom u uslovima ishrane na koju su bili upućeni u slobodnoj prirodi. Domestifikacijom životinja umnogome je izmenjen način njihove ishrane, što se mora imati u vidu, kako sa stanovišta fiziologije ishrane, tako i sa stanovišta patologije današnjih visokoproduktivnih životinjskih vrsta. Uopšteno se može reći da se kod mesojeda hrana vari dejstvom enzima digestivnog trakta, a mikrobijalna digestija je minimalna. Nasuprot njima, kod biljojeda hrana podleže obimnim procesima mikrobijalne fermentacije u posebnim delovima digestivnog trakta (burag, odnosno debelo crevo). Omnivore se hrane biljnom i životinjskom hranom, ali se njihovi procesi varenja odigravaju prvensteno pod dejstvom enzima digestivnih sokova, slično kao kod mesojeda. Procesom domestifikacije svinja je u velikoj meri postala biljojed, a s tim u vezi došlo je do značajnog udela bakterijskog razlaganja hrane u debelom crevu. U današnjim uslovima procesi varenja hrane u svinje u velikoj su meri uplivisani načinom ishrane i proizvodnom namenom. 1.1 Ispitivanje pljuvačke Pljuvačka predstavlja mešavinu sekreta svih pljuvačnih žlezda čiji se izvodni kanali ulivaju u usnu duplju. Najvažnije su tri velike parne pljuvačne žlezde: zaušne (gl. parotis), podvilične (gl. submaxillares s. mandibulares) i podjezične (gl. sublinguales), premda u sluzokoži usne duplje i jezika postoje i brojne sitne pljuvačne žlezde koje pretežno luče sluz. Sitne pljuvačne žlezde kod svih domaćih životinja luče pluvačku kontinualno, zbog čega je sluzokoža usne duplje stalno vlažna. Mešovita pljuvačka iz usta je sluzava, prozračna tečnost, malo opalescentna i lako penušava, bez mirisa i ukusa. 2

12 Količina dnevno izlučene pljuvačke (tabela 1.1) zavisi od životinjske vrste, od volumena uzete hrane, njenih fizičko-hemijskih svojstava, sadržaja vode, trajanja žvakanja, preživanja, itd. Tabela 1.1: Prisustvo ptijalina, elektrohemijska reakcija i količina dnevno izlučene pljuvačke Vrsta Prisustvo ptijalina ph Količina za 24 sata (L) Ovca - 8,0 8, Goveče - 8, Konj - 7, Svinja + 7,2 7, Pas - 7,56 0,6 1,2 Čovek + 6,63 0,5-1 Uloga pljuvačke je: mehanička (natapanje i razmekšavanje hrane, pomaganje da se formira zalogaj i učini klizavim, podesnim za gutanje), fizička (rastvaranje sastojaka hrane čime se potstiču miris i ukus, kao i stimulacija digestivnih sekrecija) i hemijska (razlaganje skroba kod vrsta koje poseduju ptijalin-čovek i svinja). Kod preživara pljuvačka je od posebnog značajajer svojim velikim količinama i bogatim prisustvom bikarbonata reguliše količinu tečnosti u buragu i elektrohemijsku reakciju sadržaja. Uzorci pljuvačke za ispitivanje mogu se iz usne duplje dobiti dirktno iz usne duplje ili pomoću ezofagealne fistule. Pljuvačkom natopljena i progutana hrana izlazi iz jednjaka kroz fistulu, sakuplja se i meri težina a razlika u težini date hrane i prikupljene iz fistule odgovara količini izlučene pljuvačke. Pravljenjem privremene ili trajne fistule izvodnog kanala jedne od pljuvačnih žljezda može se dobiti čista pljuvačka, a moguće je pratiti faze lučenja u zavisnosti od regulatornih faktora i može se pljuvačka analizirati. 3

13 ZADATAK: Uzeti uzorak pljuvačke preživara direktno iz usne duplje. Opisati fizičke osobine. MATERIJAL: Hvataljka po Peanu, vata, levkovi sa filter papirom, laboratorijska čaša. IZVOĐENJE: Ovcu ili goveče fiksirati i zamotuljak vate pričvršćen hvataljkom uvući u usnu duplju sa strane uz prostor između sekutića i kutnjaka. Povlačeći vatu nekoliko puta po površini sluzokože usne duplje da bi se što bolje natopila pljuvačkom, zatim je iscediti u levak obložen sa filter papirom. Postupak ponoviti nekoliko puta. Opisati fizičke osobine dobijenog uzorka pljuvačke (boja, prozračnost, konzistencija, miris). PROSTOR ZA RAD Boja: Prozračnost: Konzistencija: Miris: Određivanje elektrohemijske reakcije pljuvačke Kod većine domaćih životinja elektrohemijska reakcija pljuvačke je manje ili više bazna (tabela 7.1). Kod preživara je elektrohemijska reakcija izrazito bazna (8 8,4) zato što preovlađuje pljuvačka gl.parotis koja je izuzetno bogata bikarbonatima i proteinima koji zajedno sa fosfatima neutrališu niže masne kiseline koje se stvaraju u predželucima. Kod mesojeda je elektrohemijska reakcija blago kisela kad nema varenja, dok je u toku obroka oko 7,5. Kod čoveka je elektrohemijska reakcija pljuvačke, takođe, blago kisela. ZADATAK: Odrediti elektrohemijsku reakciju u uzorku mešovite pljuvačke kod preživara i/ili čoveka. MATERIJAL: Hvataljka po Peanu, vata, levkovi sa filter papirom, čaša, lakmus papir. IZVOĐENJE: Uzorak pljuvačke uzeti na način kao što je opisano u prethodnoj vežbi. Elektrohemijsku reakciju pljuvačke utvrditi pomoću lakmus papira. Uranjanjem vrha crvenog lakmus papira konstatovati promenu boje u plavu - alkalna elektrohemijska reakcija. Pljuvačka kod preživara je bazne elektrohemijske reakcije usled prisustva velike količine Na-bikarbonata što predstavlja značajan pufer koji doprinosi održavanju elektrohemijske reakcije sadržaja buraga u fiziološkim granicama. Ispitivanje 4

14 elektrohemijske reakcije ponoviti i na sakupljenom, proceđenom uzorku mešovite pljuvačke čoveka. PROSTOR ZA RAD: Ispitivanje enzimske aktivnosti ptijalina U sastavu pljuvačke svinje, kunića, živine i čoveka nalazi se enzim ptijalin (dijastaza, alfa-amilaza) koji deluje na alfa-glukozidne veze skroba i glikogena razlažući ih do maltoze, glukoze i maltotrioze, kao krajnjih proizvoda. Preživari ne sadrže ptijalin što je značajno jer bi, u suprotnom, ostala nesvarena celuloza. Luči se u neaktivnom obliku (proenzim), a aktiviraju ga joni hlora iz NaCl, takođe prisutnog u pljuvački. Pod dejstvom ptijalina razloži se svega 3-5% skroba u usnoj duplji. Optimalna elektrohemijska reakcija za njegovo delovanje je od 6,2 do 6,6 pa je njegovo dejstvo moguće i u želucu, sve dok HCl ne razloži mucine koji oblažu bolus i tako ga štite. Ptijalin je termolabilan i pri višim temperaturama se denaturiše (gubi svoju enzimsku aktivnost). ZADATAK: Ispitati enzimsku aktivnost ptijalina pljuvačke čoveka. MATERIJAL: Stalak sa 5 epruveta (1-5), proceđena sakupljena pljuvačka, skrob, vodeno kupatilo (37 C), Lugolov rastvor, pipete, Fehling I (7g kristalnog CuSO 4 i destilovane vode do 100ml) i Fehlig II (35g kalijum-natrijum tartarata, 10g NAOH, destilovana voda do 100ml). IZVOĐENJE: Pripremiti koloidni rastvor skroba: u staklenu čašu uneti 1g skroba, dodati 100ml destilovane vode, zagrevati do ključanja, a zatim ohladiti. U svaku od 5 epruveta sipati po 4ml rastvora skroba, potom ispitivanje izvoditi u 3 faze: I U epruvete 1, 2 i 3 usuti po jednu kap Lugolovog rastvora i konstatovati pojavu intenzivne plave boje (koloidne micele skroba za svoju površinu vezuju molekule joda iz Lugolovog rastvora); II Epruvetama 2 i 4 dodati po 1 ml nativne pljuvačke, a u epruvete 3 i 5 po 1 ml prokuvane pluvačke; III Sve epruvete staviti u vodeno kupatilo 20 minuta na 37 C. Izvaditi epruvete iz vodenog kupatila i sa sadržajem iz epruveta 4 i 5 izvesti Fehlingovu probu (u dve epruvete usuti po 1ml reagensa Fehlig I i Fehling II i tome dodati oko 2ml sadržaja epruvete 4 odnosno 5). 5

15 TUMAČENJE REZULTATA: Intenzivna plava boja u epruvetama sa Lugolovim rastvorom ukazuje da skrob nije razložen dok gubitak te boje ukazuje na razlaganje skroba pod dejstvom ptijalina. Skrob koji je razložen do maltoze daje pozitivne redukcione probe Fehlingova reakcija je pozitivna (rastvor se boji crveno). Fehlingova reakcija je negativna kada nije došlo do razlaganja skroba do maltoze jer je ptijalin denaturisan. PROSTOR ZA RAD: 1. epruveta: 2. epruveta: 3. epruveta: 4. epruveta: 5. epruveta: ZAKLJUČAK: 1.2 Ispitivanje sadržaja buraga Predželuci preživara, pored toga što imaju važnu motornu ulogu, predstavljaju i poprište obimne hemijske i mikrobiološke aktivnosti. Ova funkcija predželudaca zasniva se na simbiotskom odnosu između organizma preživara (domaćina) i brojne mikropopulacije (bakterije, protozoe i gljivice) koja svojim delovanjem obezbeđuju glavninu energetskih potreba preživara. Obzirom da aktivnost mikroflore i mikrofaune čini jedan od bitnih faktora koji određuju produktivne sposobnosti preživara, lako je razumeti zašto se čine stalni napori u pravcu što boljeg upoznavanja puteva kojima mikroorganizmi vrše razgradnju hranljivih materija, kao i optimalnih uslova koji obezbeđuju njihovu maksimalnu delatnost. U istom smislu su razumljiva i nastojanja da se ustanove neki specifični testovi u cilju kontrole životne aktivnosti mikroflore i mikrofaune predželudaca. Kao rezultat takvih nastojanja danas je na raspolaganju veliki broj metoda i testova od kojih će se neki izvesti i na našim vežbama. U ove metode spadaju i utvrđivanje fizičko-hrmijskih svojstva sadržaja buraga (boja, izgled, miris, elektrohemijska reakcija), mikroskopsko posmatranje infuzorija i dokazivanje nekih 6

16 važnih hemijskih procesa koji su izraz aktivnosti mikroorganizma predželudaca. Sadržaj buraga se može dobiti na dva načina: želudačnom sondom i preko fistule buraga. Nakon vađenja sadržaja potrebno ga je procediti kroz gazu da bi se otklonile najkrupnije partikule hrane i potom proceđeni sadržaj držati na temperaturi od 38 C do 40 C kako bi se predviđena ispitivanja mogla izvesti korektno Ispitivanje fizičko-hemijskih svojstava sadržaja buraga Ispitivanje fizičko-hemijskih svojstava sadržaja buraga se vrši neposredno nakon vađenja sadržaja i podrazumeva ispitivanje: boje, konzistencije, mirisa i elektrohemijske reakcije. ZADATAK: Ispitati fizičko-hemijska svojstava sadržaja buraga. MATERIJAL: Proceđen buragov sadržaj, lakmus papir i/ili ph-metar. IZVOĐENJE I TUMAČENJE REZULTATA: Neposredno nakon dobijanja procediti buragov sadržaj i ispitati fizičko-hemijska svojstva. Boja buragovog sadržaja je normalno bledo zelena boje, kada se životinja drži i hrani u stajskim uslovima, dok je pri pašnoj ishrani boja izraženo zelena. Sivi ton boje se zapaža pri hrani sa džibrom. Žućkasto-smeđa boja je prisutna kada u ishrani dominiraju seno i silaža. Smeđa boja je indikator slabe mikrobne aktivnosti buragovog sadržaja (mikroflore i mikrofaune). Siva boja se javlja kod akutnog prežderavanja koncentratom. Konzistencija buragovog sadržaja je normalno viskozna usled prisustva mnoštva mikroorganizama i siznih partikula hrane. Pretežno vodenasta konzistencija ukazuje na ketozu (acetonemiju) i slabu aktivnost sadržaja. Mehuričasta (penušava) konzistencija nastaje kod pojave naduna (timpanije). Miris buragovog sadržaja je normalno karakteristično aromatičan i uglavnom dolazi od svojstva hrane. Miris na trulež i fekalije se javlja kada dominiraju truležni procesi u buragu. Kiseo miris nastaje kod akutnog prežderavanja žitaricama ili koncentratima. Kiseo miris vodi poreklo, uglavnom, od prisustva mlečne kiseline u većim količinama. 7

17 Normalna (fiziološka) elektrohemijska reakcija (ph vrednost) buragovog sadržaja se kreće od 6 do 7,4. Međutim, ph vrednost se najčešće kreće od 6,8 do 7, a najniža je 2 sata nakon hranjenja. Redovna su dnevna kolebanja vrednosti ph u zavisnosti od uzimanja hrane. Za približno određivanje ph vrednosti koristi se lakmus papir, a za preciznija određivanja merenje se izvodi pomoću ph-metra. Vrlo kiseo sadržaj nastaje pri ishrani velikim količinama veoma kisele silaže (ph je nizak). Ukoliko u buragovom sadržaju preovlađuju truležni procesi ili dolazi do oslobađanja velike količine amonijaka elektrohemijska reakcija postaje alkalna. PROSTOR ZA RAD: Boja: Konzistencija: Miris: Elektrohemijska reakcija: ZAKLJUČAK: 8

18 1.2.2 Mikroskopski pregled sadržaja buraga Povoljni uslovi u predželucima (temperatura, vlažnost, stalni ph, anaerobna sredina, redukovan priliv hrane-supstrata za fermentaciju, neprestana resorpcija) omogućava naseljavanje brojnih vrsta mikroflore (bakterije i gljivice) i mikrofaune (protozoa). Mikroflora i mikrofauna u predželucima imaju dvostruki značaj: svojim enzimima potpomažu varenje teško svarljivih sastojaka biljne hrane (celuloza, hemiceluloza, pektin i dr.), a kada sa sadržajem pređu iz predželudaca u pravi želudac i creva domaćina, i same postaju izvor hranljivih materija za preživara. Proizvodi mikrobne fermentacije mogu biti korisni (niže masne kiseline, mikrobni proteini, vitamini i amonijak) ili neupotrebljivi (metan), a neki od njih su čak i štetni po životinju (amonijak u višku i nitrati). U jednom gramu sadržaja buraga ima bakterija i oko 10 6 infuzorija. Veličina bakterija obično iznosi 1-2µm, maksimalno do 6µm, a infuzorija µm. Pošto je enzimatska aktivnost buragovog sadržaja direktno zavisna od mikroflore i mikrofaune u njemu, jer promene u flori i fauni dovode do promena u načinu i intenzitetu razlaganja hrane, to je veoma važno poznavanje brojčane zastupljenosti i aktivnosti pojedinih vrsta mikroorganizama u buragu. ZADATAK: Mikroskopski posmatrati i proceniti gustinu (broj), veličinu i vitalnost infuzorija. MATERIJAL: Mikroskop, sadržaj buraga, predmetno i pokrovno staklo, kapaljka. IZVOĐENJE: Staviti kap buragovog sadržaja na predmetno staklo i pokriti pokrovnim staklom. Zagrejati preparat na oko 30 C držeći ga par sekundi iznad plamena šibice. Ukoliko je uzorak bogat infuzorijama, može se golim okom zapaziti njihovo živahno kretanje, bilo po njima samima, bilo po sitnim česticama hrane i mehurićima gasa koje oni pomiču svojim kretanjem. Preparat posmatrati pod mikroskopom (uveličanje 100X) i proceniti broj (gustoću), veličinu i vitalnost infuzorija. Procena vitalnosti se vrši na osnovu odnosa živih (pokretnih), prema mrtvima (nepokretnim) infuzorijama. Gustina i vitalnost infuzorija važni su pokazatelji aktivnosti buragovog sadržaja, pa mogu biti od značaja za kliničku dijagnozu i prognozu pojedinih oboljenja. Smanjen broj (gustoća) infuzorija prati gladovanje i neke digestivne poremećaje (indigestije) uzrokovane greškama u ishrani. Slaba pokretljivost infuzorija zapaža se kada ph sadržaja padne ispod 6, a kod izrazite acidoze buraga u kapi sadržaja uopšte nema infuzorija. 9

19 Skicirati vidno polje sa mikroskopa i zabeležiti zapažanja. PROSTOR ZA RAD: ZAPAŽANJA I ZAKLJUČAK: Proba vrenja glukoze (stvaranja gasova) Prilikom fermentacije hrane u buragu nastaju velike količine gasova (najviše u vremenu od 30 minuta do 4 sata posle obroka, u količini i do 40L/sat). Najviše ima CO 2 (20-65%) i metana (27-40%), zatim azota (oko 7%) i veoma malo kiseonika, vodonika i drugih. CO 2 nastaje fermentacijom ugljenih hidrata, dekarboksilacijom raznih aminokiselina, hidrolizom uree itd. Najizdašniji izvor metana je mravlja kiselina, a nastaje redukcijom CO 2 u metanogenim bakterijama. Što su procesi vrenja u buragu intenzivniji, to nastaje više gasova. Prema tome, mereći nivo proizvodnje gasova u jedinici vremena možemo dobiti uvid u digestivnu aktivnost sadržaja buraga, odnosno mikrobiološku aktivnost. ZADATAK: Odrediti količinu stvorenog gasa u saharometru. MATERIJAL: Sadržaj buraga, saharometar po Einhornu (slika 1.1), epruvete i pipete, 16% rastvor glukoze, termostat. 10

20 Slika 1.1: Saharometar po Einhornu IZVOĐENJE: U epruvetu usuti 10ml proceđenog buragovog sadržaja, dodati 0,5ml 16% rastvora glukoze (to je količina od 80mg), izmešati, napuniti saharometar i staviti ga u termostat na 39 C. Količinu stvorenog gasa (izdvaja se u uskom produženom i graduisanom delu saharometra) očitavati nakon 30, 60 i 90 minuta. Obično (fiziološki) se u toku jednog sata izdvoji 1-2ml gasa. Stvaranje gasova je manje ako hrana obiluje celulozom, a siromašna je lako svarljivim šećerima i belančevinama. Pri gladovanju čak i nema stvaranja gasova. Velike vrednosti produkcije gasova nalaze se u slučaju akutnog naduna kada je sadržaj penušavog izgleda. PROSTOR ZA RAD: Količina stvorenog gasa nakon 30 minuta: Količina stvorenog gasa nakon 60 minuta: Količina stvorenog gasa nakon 90 minuta: ml ml ml ZAKLJUČAK: 11

21 1.2.4 Dokaz sposobnosti stvaranja amonijaka iz uree U buragu se pod uticajem mikrobnih proteaza i peptidaza 40-50% proteina hrane razgradi do kratkih peptida i slobodnih aminokiselina. Jedan manji deo nastalih aminokiselina direktno se ugrađuje u bakterijske proteine. Veći deo aminokiselina se pod dejstvom bakterijskih dezaminaza razlaže do amonijaka i odgovarajućih ketokiselina. Amonijak koriste mikroorganizmi za sintezu svojih aminokiselina. Pored toga, znatan deo amonijaka vodi poreklo iz uree koja u burag pristiže ne samo kao dodatak hrani, nego i u sastavu pljuvačke ili difuzijom kroz zid buraga u njegov lumen (rumeno-hepatično kruženje azota ili ciklus regeneracije reutilizacije uree). ZADATAK: Dokazati u sadržaju buraga nastanak amonijaka iz uree. MATERIJAL: Buragov sadržaj, epruvete, pipete, urea u supstanciji, Nesslerov reagens (za dokazivanje amonijaka). IZVOĐENJE: U dve epruvete sipati po 5ml proceđenog buragovog sadržaja, u jednu od njih dodati vrhom apotekarske kašičice (ili na vrhu nožića) uree u supstanciji, promešati i obe epruvete staviti u vodeno kupatilo na 30 C i držati minuta. U međuvremenu u dve čiste epruvete staviti po 5ml Nesslerovog reagensa. Nakon završenog inkubiranja izvaditi epruvete iz vodenog kupatila i izvesti probu dokazivanja prisustva amonijaka dodavanjem sadržaja buraga u epruvete sa Nesslerovim reagensom po sledećem protokolu 1. epruveta: Nesslerov reagens kapi sadržaja buraga kojem je dodata urea 2. epruveta: Nesslerov reagens kapi sadržaja buraga kojem nije dodata urea TUMAČENJE REZULTATA: Pojava crvenkasto-žute boje dokaz je da postoji amonijak nastao hidrolizom uree pomoću enzima ureaze poreklom iz mikroflore. PROSTOR ZA RAD: 1. epruveta: 2. epruveta: ZAKLJUČAK: 12

22 1.2.5 Proba vezivanja nitrita Bakterije iz prostijih i složenijih azotnih jedinjenja mogu sintetisati druga organska jedinjenja azota. Tako se povećava biološka vrednost proteina. Na primer, biološka vrednost proteina sena iznosi 60, a proteina koji se sintetišu u buragu, zahvaljujući mikrobnoj aktivnosti, 80. Mikroorganizmi buraga isto tako vrše pretvaranje neorganskog azota u organski. Hemijski tok reakcije je sledeći: ZADATAK: Dokazati u sadržaju buraga razlaganje nitrita. MATERIJAL: Buragov sadržaj, epruvete, pipete, kapaljke, 0,025% KNO 2, termostat, porcelanska pločica, reagensi I i II. IZVOĐENJE: U tri epruvete staviti po 10ml buragovog sadržaja i prebaciti ih u termostat na 39 C. Dodati u sve tri epruvete 0,025% KNO 2 i to: 1. epruveta: 0,2ml 2. epruveta: 0,5ml 3. epruveta: 0,7ml U razmacima od 5 minuta uzeti uzorak se stavlja na porculansku pločicu i dodaju se po kap reagensi I i II. Pozitivna reakcija (prisustvo nitrita) je pojava crvene boje. Brzina iščezavanja nitrita je proporcionalna njihovoj koncentraciji (u prvoj epruveti nitriti iščezavaju već za 5-10 minuta). PROSTOR ZA RAD: 1. epruveta: 2. epruveta: 3. epruveta: ZAKLJUČAK: 13

23 1.3 Varenje u jednokomornom želucu Želudac (grč. gaster, lat. ventriculus) je prošireni deo kanala za varenje koji se pruža od jednjaka (oesophagus) do dvanaestopalačnog creva (duodenum). Svojim gornjim delom želudac komunicira sa jednjakom preko kardijačnog otvora (ostium cardiacum) a svojim donjim krajem komunicira sa dvanaestopalačnim crevom preko piloričnog otvora (ostium pyloricum). Kod životinja sa prostim želucem, procesi varenja se značajno razlikuju od varenja u višekomornom želucu (preživari). Opšte uloge jednokomornog želuca su: rezervoarska, uloga u varenju (razgradnja proteina i skroba), zaštitna (antibaktericidna zahvaljujući prisustvu HCl), regulacija elektrohemijske reakcije, učešće u eritropoezi (značaj za resorpcija Fe i vitamina B12) i endokrina uloga (tkivni hormon gastrin). Hrana dospela u želudac podleže razlaganju koje vrše ptijalin iz pljuvačke, kod vrsta koje ga poseduju i enzimi želudačnog soka (amilolitička i proteolitička faza). Kod monogastričnih životinja želudačni sok je sekret kardijalnih, fundusnih i pilorusnih žlezda. Želudačni sok je bistra do lako opalescentna bezbojna izotona tečnost, specifične mase od 1,002 do 1,006. Količina i konzistencija želudačnog soka variraju zavisno od vrste i kvaliteta hrane. Elektrohemijska reakcija želudačnog soka iznosi od 1 do 2,5. Može biti vodenast i jako kiseo (ph oko 1) u periodu izražene sekrecije, ili više sluzav i manje kiseo za vreme gladovanja. Kiselost želudačnog soka potiče uglavnom od HCl, a manje od organskih kiselina i drugih kiselih jedinjenja. HCl izaziva denaturaciju proteina i prevodi ih u acidoalbuminate. U želudačnom soku nalaze se sledeći enzimi: pepsin, lipaza, a kod mladih preživara i lab-ferment. Na acidoalbuminate (nastalih od proteina pod dejstvom HCl) deluje pepsin i razlaže ih polipeptida. Na emulgovane masti (mlečna mast, mast žumanceta) deluje enzim lipaza. Treba napomenuti da za razlaganje masti ne postoje optimalni uslovi u želucu. Kod mladih preživara, koji se hrane mlekom, je prisutan enzim himozin (lab-ferment). Himozin razlaže kazein na parakazein i surutkinu albumozu i nastaje Ca-parakazeinat (gruš) na koga djeluje pepsin. Pored ovih enzima u želudačnom soku se nalaze i želatinaze u tragovima i polinukleaze (DNA-ze i RNA-ze) koje hidrolizuju DNA i RNA iz biljnih i životinjskih ćelija hrane i deskvamiranog epitela do mononukleotida. 14

24 Želudačni sok sadrži i Kastlov (Castlov) unutrašnji (intrinsic) faktor koga proizvode ivične ćelije želudačnih žlezda. On štiti vitamin B 12 od varenja, a značajan je za njegovu resorpciju u završnom delu tankog creva. Želudačni sok svinja je naročito bogat ovim faktorom. Želudačni sok se za potrebe ispitivanja može dobiti pomoću: želudačne sonde i želudačne fistule Ukupna kiselost želudačnog soka Ukupna kiselost želudačnog soka potiče od sastojaka koji se nalaze u želudačnom soku ali i od pojedinih sastojaka iz hrane. HCl se u želudačnom soku nalazi u vidu slobodne HCl i vezane HCl (uglavnom za proteine). Uloga HCl u želudačnom soku je višestruka: aktivator je pepsinogena (prevodi ga u pepsin), obezbeđuje optimalan ph (1 2) za enzimske aktivnosti u želudcu, rastvara nerastvorljive soli Fe 3+ i Ca 2+ što je bitno za njihovu redukciju i apsorpciju u tankom crevu, izaziva bubrenje potpornih belančevina vezivnih opni u hrani (elastin, kolageni i dr.), izaziva bubrenje i denaturaciju proteina, nastaju acidalbumini (dostupniji delovanju enzima), poseduje baktericidno delovanje. Pored HCl, na ukupnu kiselost želudačnog soka utiču i mucini, organske i neorganske kiseline i kiseli sastojci poreklom iz hrane. ZADATAK: Odrediti ukupnu kiselost želudačnog soka metodom titracije. MATERIJAL: Želudačni sok, rastvor 0,1M NaOH, fenoftalein, bireta, laboratorijska čaša, stakleni štapić, pipete. Na praktičnoj nastavi se kao zamena za želudačni sok može se koristiti rastvor HCl (54 90mmol/L) u koji je dodata manja količina peptona. IZVOĐENJE: Ukupna kiselost želudačnog soka se određuje metodom titracije pomoću NaOH i indikatora fenoftaleina. U laboratorijsku čašu sipati 10ml želudačnog soka, dodati 2 3 kapi indikatora fenoftaleina i titrisati sa 0,1M NaOH sve do pojave ružičaste boje. 15

25 Titracijom sa bazom neutrališu se sve kiseline u želudačnom soku. Pojava ružičaste boje fenoftaleina označava kraj titracije. Izračunavanje totalne kiselosti (TK) vrši se pomoću sledeće formule: TK = količina 0,1M NaOH (ml) X 10 (količina želudačnog soka u ml) PROSTOR ZA RAD: Količina utrošenog 0,1M NaOH = ml TK = ZAKLJUČAK: Enzimi želudačnog soka Izbor enzima u želudačnom soku nije jako veliki. Želudačni sok sadrži proenzime pepsinogen i lab-ferment (u sirištu mladih preživara), manju količinu lipaza, želatinaze, DNA-ze i RNA-ze. Pepsin je proteolitički enzim koji pripada grupi endopeptidaza koje kidaju peptidne veze među aminokiselinama unutar peptidnih lanaca. Luče ga glavne ćelije želudačnih žlezda u obliku proenzima pepsinogena koji se oslobađa procesom egzocitoze. Pepsinogen se pod uticajem HCl, odnosno vodonikovih jona, pretvara u aktivni pepsin. Autokatalitička aktivacija pepsinogena se dešava pod uticajem malih količina pepsina. Aktivacija podrazumeva odvajanje inhibitornog peptida, odnosno pepsin-inhibitora. Pepsin razlaže proteine dospele u želudac do peptona (smeša polipeptida, sa još uvek velikom molekulskom masom). Optimalni ph za dejstvo pepsina je jako kisela sredina (ph od 1,5 do 3). Deluje na potporne proteine vezivnog tkiva (elastine) i time oslobađa proteine mišića i omogućava njihovo razlaganje. Bolje deluje na denaturisane 16

26 proteine, a ne razlaže protamine, keratine i mucin. Pod dejstvom pepsina se u želucu razloži svega 10-20% proteina poreklom iz hrane. ZADATAK: Dokazati dejstvo pepsina na proteine. MATERIJAL: Ekstrakt želudačne sluzokože, 0,3% HCl, 1% Na 2 CO 3, koagulisano belance (isitnjeno u kockice), 5% NaOH, 0,25% CuSO 4, epruvete, vodeno kupatilo. Koagulisano belance se koristi kao supstrat jer su u njemu proteini nerastvorljivi. Delovanjem pepsina na koagulisano belance dolazi do oslobađanja peptida, usled enzimskog razlaganja belančevina. IZVOĐENJE: Pripremiti ekstrakt želudačne sluzokože. Proseći, očisti od sadržaja i oprati svež svinjski želudac ili želudac neke druge monogastrične životinje. Ispreparisati sluzokožu, a zatim je isitniti i macerirati u 0,2 0,3% rastvoru HCl. Macerat ostaviti na 37 C kratko vreme (nekoliko minuta), a zatim ga čuvati rashlađenog (na ledu) do upotrebe. Reakcije izvesti u četiri epruvete prema proceduri datoj u tabeli 1.2. Tabela 1.2: Izvođenje vežbe dokaza dejstva pepsina na proteine Epruveta Reagens i količina Ekstrakt sluzokože Koagulisano belance Temperatura i vreme inkubiranja 1. 0,3% HCl 5ml 3 kapi 3 4 kockice 38 C ½ sata 2. 0,3% HCl 5ml kockice 38 C ½ sata 3. 0,3% HCl 5ml 3 kapi prokuvanog 3 4 kockice 38 C ½ sata 4. 1% Na 2 CO 3 5ml 3 kapi 3 4 kockice 38 C ½ sata Pripremljene epruvete lagano izmešati, obeležiti ih i staviti u vodeno kupatilo na određenu temperaturu i naznačeno vreme (tabela 1.2). Po isteku vremena, epruvete izvaditi iz vodenog kupatila i uraditi biuretsku reakciju (opisano u vežbi određivanja sadržaja proteina u krvnoj plazmi i serumu). TUMAČENJE REZULTATA: U epruveti u kojoj su proteini razloženi do peptona biuretska reakcija je pozitivna. Negativna biuretska reakcija ukazuje na odsustvo pepsina, njegovu denaturaciju ili neadekvatne uslove sredine za njegovo dejstvo (alkalna sredina). Pri radu treba voditi računa o količini dodatog ekstrakta želudačne sluzokože jer on sadrži proteine. Ako se doda u većoj količini reakcija može biti pozitivna, iako se očekuje negativna (reakcija je lažno pozitivna). 17

27 PROSTOR ZA RAD: 1. epruveta: 2. epruveta: 3. epruveta: 4. epruveta: ZAKLJUČAK: Lab-ferment (Himozin, Renin) je endopeptidaza koju proizvode glavne ćelije želudačnih žlezda. Nalazi se u većim količinama u sirištu mladih preživara, dok kod ostalih životinja nije dokazan. Za dejstvo lab-fermenta optimalni ph je između 5 i 6, za razliku od pepsina koji deluje u izrazito kiseloj sredini. Svoju aktivnost renin zadržava i u slabo alkalnim uslovima. Renin deluje na kazein mleka i razlaže ga na parakazein i surutkinu albumozu. Parakazein u zajednici sa kalcijumovim jonima gradi kalcijum-parakazeinat (sir). Kod monogastričnih životinja kazein se razlaže i pod dejstvom pepsina i nekih drugih proteinaza. ZADATAK: Dokazati dejstvo lab-fermenta na kazein. MATERIJAL: Lab-ferment, mleko, epruvete, vodeno kupatilo. Himozin se može dobiti ekstrakcijom iz osušenih želudaca mladih preživara ili se može nabaviti i kao gotov enzim. IZVOĐENJE: Uzeti dve epruvete i u svaku sipati po 10ml mleka. U prvu dodati 1 2 kapi lab-fermenta, a u drugu isto toliko denaturisanog (prokuvanog enzima). Obe epruvete staviti u vodeno kupatilo i nakon minuta konstatovati u koj epruveti se mleko usirilo, a u kojoj ostalo tečno. Objasniti dobijen rezultat. PROSTOR ZA RAD: 1. epruveta: 2. epruveta: 18

28 ZAKLJUČAK: 1.4 Varenje u tankom crevu Himus kiselog i tečnog, polutečnog ili kašastog karaktera u malim porcijama dospeva u početni deo tankog creva gde se temeljno mehanički i hemijski obrađuje zahvaljujući: veoma dobroj motornoj aktivnosti tankih creva i intenzivnoj hidrolitičkoj aktivnosti enzima crevnog i pankreasnog soka i žuči. Hranljive materije se u tankom crevu razlažu do najjednostavnijih jedinjenja koja se potom resorbuju. U ovom delu digestivnog trakta se vrši najveći deo resorpcije (oko 90% hranljivih materija) Crevni sok Crevni sok predstavlja mešavinu sekreta Liberkinijevih, Brunerovih (duodenalnih) žlezda, kao i sluzi koju luče brojne peharaste ćelije koje su rasute po sluznici tankog creva. Crevni sok je vodenasta, sluzava, bledo žuta tečnost, specifične mase oko 1,008, alkalne elektrohemijske reakcije. On poseduje sledeće enzime: peptidaze, crevna amilaza, crevna lipaza, fosfolipaze, polinukleaze, crevne oligaze maltaza, saharaza, laktaza (razlažu najveći deo disaharida hrane do monosaharida). Peptidaze crevnog soka se jednim imenom nazivaju crevni erepsin. Aminopeptidaze razlažu polipeptide, koji na kraju imaju bar jednu aminokiselinu sa slobodnom aminogrupom, dajući oligopeptide. Dipeptidaze hidrolizuju dipeptide do pojedinačnih aminokiselina. Količina i delovanje crevne amilaze i crevne lipaze su bezbačajne u poređenju sa amilazom i lipazom poreklom iz pankreasnog soka. Fosfolipaze razlažu fosfolipide na glicerol, fosfornu kiselinu i azotnu bazu. Polinukleaze razgrađuju DNK i RNK iz biljnih i životinjskih ćelija poreklom iz hrane, kao i deskvamiranog epitela do mononukleotida. 19

29 1.4.2 Pankreasni sok Egzokrini deo pankreasa predstavlja daleko veći deo od njegovog endokrinog dela i izgrađen je iz acinusa i kanalića. Egzokrini deo pankreasa luči pankreasni sok koji predstavlja najvažniji, najkompletniji i najefikasniji digestivni sok svih domaćih životinja. Pankreasni sok je bistra, bezbojna tečnost, slabo alkalne reakcije. Najvažniji sastojci pankreasnog soka su enzimi (proteinaze, amilaza, maltaza, lipaza i polinukleaze). Glavni proteolitički enzimi pankreasnog soka su tripsin, himotripsin i više peptidaza koje se označavaju zajedničkim nazivom kao pankreasni erepsin. Enzimi tripsin i himotripsin su endopeptidaze koje se u pankreasu luče u obliku profermenta tripsinogena i himotripsinogena. Tripsinogen se aktivira u tankom crevu pod dejstvom enzima crevne enterokinaze u aktivni oblik tripsin. Razlog zašto ga acinusne ćelije ne sintetišu u ovom aktivnom obliku jeste njegova osobina da deluje stimulatorno na enzim fosfolipazu-a koja je prisutna u membranama različitih ćelija, pa i acinusnih. Tripsin vrši proteolizu delujući na peptidne veze između karbonilnih grupa arginina i lizina i aminogrupa drugih aminokiselina. Himotripsinogen se u tankom crevu aktivira u himotripsin pod uticajem tripsina. Tripsin aktivira i sve ostale proteaze pankreasnog soka (proelastazu, prokarboksipeptidaze). Himotripsin prekida peptidne veze između karboksilnih grupa fenil-alanina i tirozina. Optimalni ph za delovanje tripsina i himotripsina se kreće u granicama od 7,5 do 9. U pankreasnom erepsinu (smeša egzopeptidaza) najvažnije su karboksipeptidaza A i B koje deluju na peptide sa slobodnom karboksilnom grupom, razlažući ih do aminokiselina i oligopeptida. Pankreasna lipaza je najvažniji lipolitički enzim digestivnog trakta i luči se uglavnom u aktivnom obliku. Da bi ovaj enzim delovao, neophodno je da su masti emulgovane i da je lipaza vezana za kolipazu u odnosu 1:1. Kolipaze su neaktivne sve dok na njih ne deluje tripsin. Optimalna elektrohemijska reakcija za njeno dejstvo je oko 8. Od lipolitičkih enzima u pankreasnom soku postoje i holesterol-esteraza i fosfolipaza A i B. Pankreasna amilaza je glavni amilolitički enzim digestivnog trakta i luči se u neaktivnom obliku. Nju aktiviraju hloridni joni (iz NaCl-a). Deluje samo na 1-4α glikozidne veze polisaharida. Ne deluje na 1-4β glikozidne veze (celuloza i hemiceluloza), niti na 1-6 veze u amilopektinima. Maltaza raskida glikozidne veze u maltozi i na taj način daje dva molekula glukoze. Polinukleaze pankreasnog soka razgrađuju DNK i RNK iz biljnih i životinjskih ćelija poreklom iz hrane, kao i deskvamiranog epitela do mononukleotida. Pankreasni sok sadrži dosta Na 2 CO 3 koji je važan za neutralisanje kiselog sadržaja himusa. ZADATAK: Dokazati dejstvo tripsina na proteine. MATERIJAL: Ekstrakt pankreasa, ekstrakt crevne sluzokože, koagulisano belance, 1% Na 2 CO 3, 0,3% HCl, reagensi za izvođenje biuretske reakcije (5% NaOH i 0,25% CuSO 4 ), epruvete, vodeno kupatilo. 20

30 IZVOĐENJE: Pripremiti ekstrakte pankreasa i crevne sluzokože. Očistiti potpuno od masti i vezivnog tkiva svež svinjski pankreas. Zatm ga iseći na sitne komadiće i izmešati sa Ringerovim rastvorom u odnosu 5g pankreasa na 100ml rastvora. Ovako pripremljenu smešu kratkotrajno zagrejati na 38 C a potom čuvati rashlađenu (na ledu) do upotrebe. Za pripremu ekstrakta crevne sluzokože uzeti 1 metar duodenuma, izvrnuti ga, isprati od sadržaja i sluzi, iseckati ga i izmešati sa Ringerovim rastvorom u odnosu 5g tkiva na 100ml rastvora. Ovako pripremljenu smešu kratkotrajno zagrejati na 38 C a potom čuvati rashlađenu (na ledu) do upotrebe. U pet epruveta izvesti reakciju prema protokolu u tabeli 1.3. Pripremljene epruvete lagano izmešati, obeležiti ih i staviti u vodeno kupatilo na određenu temperaturu i vreme (tabela 1.3). Posle naznačenog vremena epruvete izvaditi iz vodenog kupatila i uraditi biuretsku reakciju (opisano u vežbi određivanja sadržaja proteina u krvnoj plazmi i serumu). Tabela 1.3: Izvođenje vežbe dokaza dejstva tripsina na proteine Epruveta Reagens i količina Ekstrakt (4 kapi) Koagulisano belance Temperatura i vreme inkubiranja 1. 1% Na 2 CO 3 5ml Pankreasa i crevne sluzokože 3 4 kockice 38 C ½ sata 2. 1% Na 2 CO 3 5ml Pankreasa 3 4 kockice 38 C ½ sata 3. 1% Na 2 CO 3 5ml Crevne sluzokože 3 4 kockice 38 C ½ sata 4. 1% Na 2 CO 3 5ml Pankreasa (prokuvan) i crevne sluzokože 3 4 kockice 38 C ½ sata 5. 0,3% HCl 5ml Pankreasa i crevne sluzokože 3 4 kockice 38 C ½ sata TUMAČENJE REZULTATA: Biuretska reakcija je pozitivna u slučaju kada su se proteini razložili pod dejstvom tripsina na male peptidne molekule (tripsinogen iz ekstrakta pankreasa aktivirao se pod uticajem crevne enterokinaze iz ekstrakta crevne sluzokože). 21

31 Biuretska reakcija je negativna kada nema tripsinogena, kada nije došlo do njegove aktivacije ili je tripsinogen denaturisan. Biuretska reakcija je negativna, takođe, kada je neadekvatna sredina za dejstvo tripsina (kisela sredina). PROSTOR ZA RAD: 1. epruveta: 2. epruveta: 3. epruveta: 4. epruveta: 5. epruveta: ZAKLJUČAK: Pankreasni i crevni sok sadrže enzim amilazu koji razlaže skrob i glikogen do maltoze. Po svom dejstvu slična je ptijalinu, ali je efikasnija. Pankreasna amilaza je aktivnija od crevne amilaze. Deluje samo na 1-4α glikozidne veze polisaharida, a ne deluje na 1-4β i 1-6 glikozidne veze. Ovaj enzim se aktivira pod dejstvom jona hlora iz NaCl, a optimalan ph se kreće u granici od 5,5 do 6,9. ZADATAK: Dokazati dejstvo amilaze iz ekstrakta pankreasa i crevne sluzokože na skrob. MATERIJAL: Ekstrakt pankreasa, ekstrakt crevne sluzokože, 5% rastvor skroba, Feling I i II, epruvete i vodeno kupatilo. IZVOĐENJE: Pripremiti ekstrakte pankreasa i crevnog soka kao što je opisano prethodnim vežbama. U četiri epruvete sipati po 8ml 5% rastvora skroba, prethodno pripremljenog i ohlađenog. U 1. epruvetu dodati 5 6 kapi ekstrakta pankreasa, a u 2. epruvetu isto toliko ali prethodno prokuvanog ekstrakta pankreasa. U 3. epruvetu dodati 5 6 kapi ekstrakta crevne sluzokože, a u 4. epruvetu isto toliko prokuvanog ekstrakta crevne sluzokože. Obeležiti sve četiri epruvete i staviti u vodeno kupatilo 30 minuta na 38 C. Nakon vađenja iz vodenog kupatila sa sve četiri epruvete uraditi Fehlingovu probu. TUMAČENJE REZULTATA. Fehlingova proba je pozitivna u epruvetama gde je amilaza razložila skrob do disaharida maltoze, koja ima redukcionu sposobnost. Kada je enzim amilaza denaturisan kuvanjem Fehlingova proba je negativna. 22

32 PROSTOR ZA RAD: 1. epruveta: 2. epruveta: 3. epruveta: 4. epruveta: ZAKLJUČAK: Oligaze crevnog soka deluju u završnoj fazi razlaganja ugljenih hidrata, odnosno razlaganja disaharida do monosaharida. U ove enzime spadaju maltaza, saharaza i laktaza. Saharaza katalizuje razgradnju saharoze do glukoze i fruktoze. ZADATAK: Dokazati dejstvo saharaze na disaharid saharozu. MATERIJAL: Ekstrakt crevne sluzokože, 1% saharoza, Fehling I i II, epruvete i vodeno kupatilo. IZVOĐENJE: Pripremiti ekstrakt crevne sluzokože. U dve epruvete sipati po 5ml 1% saharoze. U 1. epruvetu dodati 20 kapi ekstrakta crevne sluzokože, a u 2. epruvetu istu količinu prethodno inaktivisanog (prokuvanog) ekstrakta crevne sluzokože. Obe epruvete staviti u vodeno kupatilo 30 minuta na 38 C. Nakon vađenja iz vodenog kupatila izvesti Fehlingovu probu u obe epruvete. TUMAČENJE REZULTATA: Disaharidi laktoza i maltoza imaju redukcione sposobnosti jer imaju maltozni tip veze, dok saharoza nema redukcionu sposobnost jer poseduje trehalozni tip veze (nema slobodnih poluacetatnih grupa). Fehlingova probu je pozitivna (sadržaj je crvene boje) u epruvetama gde je saharaza razložila disaharid saharozu na glukozu i fruktozu. Negativna Fehlingova proba je u epruvetama u kojima je enzim saharaza denaturisan kuvanjem (saharoza nema redukcione sposobnosti). 23

33 PROSTOR ZA RAD: 1. epruveta: 2. epruveta: ZAKLJUČAK: Žuč Ćelije jetre (hepatociti) neprekidno stvaraju i izlučuju žuč u žučne kanaliće koji se udružuju u veći žučni kanal, a na kraju u jedinstven žučni kanal ductus hepaticus. Ductus hepaticus se kod životinja koji imaju žučnu kesu spaja sa ductus cysticus u zajednički žučni kanal - d. choledochus koji se uliva u lumen duodenuma, na čijem kraju se nalazi Oddijev sfinkter (reguliše uticanje žuči u duodenum). Žuč je gusta, sluzava tečnost. Kod životinja koje imaju žučnu kesu, žuč je koncentrovanija puta, u odnosu na životinje kod kojih se ona uliva direktno preko u dvanaestopalačno crevo. U žučnoj kesi se resorbuju elektroliti (Na i Cl) i voda. Žučnu kesu nemaju: konj, jelen, žirafa, slon, kamila, pacov, golub i hrčak. Boja žuči zavisi od odnosa žučnih boja: mrkožutog (crvenog) bilirubina i zelenog biliverdina. Žuč je sekret i ekskret jer sadrži materije neophodne za varenje i materije koje su krajnnji produkti metabolizma. Žuč ima više uloga: žučne kiseline smanjuju površinski napon i omogućavaju stvaranje fine emulzije masti u crevima; tako lipolitički enzimi ispoljavaju veću aktivnost jer deluju na mnoštvo sitnih kapljica, aktivira pankreasnu lipazu koja razlaže masti, utiče na motoriku creva, neutrališe kiseo sadržaj koji je dospeo iz želuca i obezbeđuje optimalan ph, žučne kiseline obezbeđuju resorpciju masti i liposolubilnih vitamina. Žučne kiseline nastaju od holesterola, derivati su holanske kiseline. Primarne žučne kiseline su: holna, dezoksiholna, litoholna i henodezoksiholna kiselina i izlučuju se 24

34 puferizovane u obliku natrijumovih i kalijumovih soli. Soli žučnih kiselina se konjuguju sa glikokolom i taurinom, gradeći glikoholnu i tauroholnu kiselinu. Značaj i uloga soli žučnih kiselina se ogleda,pre svega, u emulzifikaciji masti (snižavanjem površinskog napona tečnosti u sadržaju tankog creva omogućavaju nastanak fine stabilne emulzije masti) i aktivaciji pankreasne lipaze. Pored toga soli žučnih kiselina pojačavaju motoriku tankog creva, zajedno sa fosfolipidima (lecitinom) održavaju holesterol žuči u rastvorljivom obliku, imaju baktericidno delovanje i oštećuju viruse sa lipoproteinskim omotačem ZADATAK: Dokazati prisustvo žučnih kiselina u žuči. MATERIJAL: Žuč, 10% rastvor saharoze, koncentrovana H 2 SO 4, destilovana voda, epruvete. IZVOĐENJE: U prvu epruvetu sipati 5ml razblažene žuči, a zatim dodati 3-4 kapi rastvora saharoze. U drugu epruvetu sipati oko 3ml H 2 SO 4, a zatim u nju pažljivo niz zid sipati sadržaj iz prve epruvete. Na dodirnom sloju javlja se prsten intenzivno crvene boje. Reakcija se zasniva na pretvaranju saharoze u furfurol pod uticajem sumporne kiseline, koji se sa raspadnim proizvodima žučnih kiselina boji crveno. Zabeležiti zapažanja. PROSTOR ZA RAD: Žučne boje (bilirubin i biliverdin) nemaju fiziološku ulogu. Nastaju razgradnjom hemoglobina (hema) u ćelijama monocitno-makrofagnog sistema jetre, slezine i koštane srži. Preko niza međuproizvoda nastaje žuti pigment bilirubin koji se vezuje za albumine krvne plazme (slobodni ili indirektni bilirubin) i dospeva u jetru. Potom se oslobađa od albumina i u ćelijama jetre dolazi do konjugacije bilirubina sa glukuronskom kiselinom (konjugovani, vezani ili direktni bilirubin). ZADATAK: Dokazati prisustvo žučnih boja u žuči (Gmelinova proba). MATERIJAL: Žuč, koncentrovana azotna kiselina, epruvete. IZVOĐENJE: U prvu epruvetu uliti 4 5ml žuči, a u drugu istu količinu azotne kiseline. Drugu epruvetu iskositi pa u nju oprezno niz zid sipati sadržaj iz prve epruvete. Na 25

35 dodirnom sloju obrazovaće se prstenovi različite boje žut crven plav zelen (posmatrano odozdo). Žuti potiče od holetelina, crveni od bilirubina, plavi od bilifuscina i zeleni od biliverdina. Ista proba se može izvesti i na filtracionoj hartiji. Na sredinu hartije kanuti kap žuči, a potom na tu kap dodati kap azotne kiseline. Uočiti koncentrične krugove različitih boja i zabeležiti zapažanja. PROSTOR ZA RAD: 1.5 Fiziologija jetre Jetra je najveća žlezda u organizmu na koju otpada oko 5% ukupne telesne mase kod novorođenčadi i oko 2% kod odraslih jedinki. Jetra poseduje dvostruko snabdevanje krvlju: arterijska krv-oko 300ml/min ili 20% ukupnog protoka, a preostalih 1200ml/min dolazi iz portalnog venskog sistema. Portalna krv je bogata resorbovanim supstancama, sadrži veće koncentracije hormona pankreasa i creva u odnosu na sistemsku cirkulaciju, ali je relativno siromašna kiseonikom. Arterijska i venska krv se mešaju idući kroz sinusoide sa jako permeabilnim zidovima ka centru svakog režnjića i ulivajući se u v. centralis koje odvode krv do velikih hepatičnih vena, a ove do v. cave inferior. Sinusoidi jetre čine bogatu intralobularnu mrežu i razlikuju se od konvencionalnih kapilara-veći su i varijabilnog prečnika, te sadže dosta fagocita. Sinusoidi poseduju endotelne ćelije i velike fiksne makrofage (Kupfferove ćelije). Smatra se da zid kapilara ne predstavlja značajnu barijeru za slobodno kretanje velikih molekula između hepatocita i lumena sinusoida. Prema tome, ćelije endotela sadrže fenestre koji nemaju dijafragmu vidljivu elektronskim mikroskopom (izuzev kod preživara), endotel sinusoida nema kontinuiranu bazalnu laminu (izuzev kod preživara), a ćelije i retikularna vlakna u perisinusoidalnom prostoru ne čine kontinualnu granicu. Jetra je inervirana autonomnim nervnim vlaknima parasimpatikusa koji dolaze iz n. vagusa i simpatikusnim postganglijskim vlaknima celiačnog gangliona. 26

36 Jetra ima mnogobojne, veoma raznovrsne uloge: depo je glikogena, masti, proteina,vitamina i mineralnih materija, izlučuje žuč u duodenum, sintetiše mnoge supstancije za potrebe organizma, metabolizira, detoksikuje i inaktivira egzogene materije, prevodi supstancije u aktivnije forme (na primer T 4 u T 3 ), preuzima dimerne IgA i izlučuje ih u lumen creva putem žuči, obzirom na veliki vaskulsrni kapacitet, služi i kao depo krvi, mesto je hematopoeze kod fetusa a pod određenim uslovima i kod odraslih, zbog prisustva fagocita deluje kao važan filter stranih materija, naročito bakterija poreklom iz creva, endokrina uloga (somatomedini ili insulinski faktori rasta), učestvuje u metabolizmu ugljenih hidrata, masti, holesterola, proteina, vode i mineralnih materija. Na osnovu ovoga može se zaključiti da jetra pretstavlja centralni organ za intermedijarni metabolizam i zato ispitivanja funkcionalnog stanja jetre imaju osnovni značaj. Laboratorijske probe za funkcionalno ispitivanje jetre se mogu podeliti u tri grupe: 1. grupa: Određivanje koncentracije serumskih proteina (ukupni proteini, albumini, A/G odnos, protrombinsko vreme); 2. grupa: Određivanje aktivnosti enzima u krvnom serumu (alaninaminotransferaza ALT, aspartat-aminotransferaza AST, alkalna fosfataza ALP, dehidrogenaza mlečne kiseline LDH ili laktodehidrogenaza, karbaminotransferaza ornitina OCT, gama-glutamiltranspeptidaza GGT, dehidrogenaza glutaminske kiseline GLDH, dehidrogenaza sorbitola SDH); 3. grupa: Određivanje koncentracije specifičnih jetrinih produkata u krvnom serumu (glukoza, urea, bilirubin, žučne kiseline, lipidi holesterol, trigliceridi, fosfolipidi, masne kiseline, lipoproteidi). Niz proba za ispitivanje funkcionalnog stanja jetre se zasnivaju na kvantitativnim, kolorimetrijskim reakcijama koje se očitavaju metodom spektrofotometrije. Princip ove metode se zasniva na reakcijama koje kao rezultat imaju proizvode određene boje, odnosno koji absorbuju svetlost određene talasne dužine. Količina absorbovane svetlosti (ekstinkcija - E) je proporcionalna koncentraciji pa se na osnovu poznavanja ekstinkcije ispitivane materije poznate koncentracije (standarda) 27

37 i ekstinkcije iste materije nepoznate koncentracije (uzorka) može izračunati njena koncentracija, a po sledećoj formuli: E uzorka C uzorka = X C standarda E standarda Uređaj kojim se može očitati ekstinkcija ispitivanih materija, na određenoj talasnoj dužini svetlosti (u nm) naziva se spektrofotometar. Princip rada spektrofotometra je prikazan na slici 1.2. Slika 1.2: Princip rada spektrofotometra Svetlost koja se dobija iz svetlosnog izvora (A) prolazi kroz sabirno sočivo (B), a zatim se razlaže na spektar različitih talasnih dužina pomoću prizme (C). Uz pomoć selektora talasnih dužina (D) svetlost određene talasne dužine se propušta kroz uzorak koji se nalazi u kiveti (E). Deo svetlosti se apsorbuje u uzorku, a deo koji prolazi registruje detektor fotoćelija (F), što se registruje na analognom ili digitalnom displeju (G). Da bi se izvršila kalibracija uređaja, pored uzorka i standarda, potrebno je očitati ekstinkciju i slepe probe (u kojoj nema ispitivane materije) Određivanje sadržaja proteina u krvnoj plazmi / serumu Proteini krvne plazme i seruma su heterogena grupa molekula različite molekulske mase, fizičko-hemijskih i imunohemijskih osobina. Od ukupne količine organskih sastojaka, koja iznosi oko 85g u jednom litru krvne plazme, na proteine otpada 60-80g/L. Poznato je oko 200 raznih vrsta proteina krvne plazme, a prema sastavu i obliku njihovih molekula, fizičko-hemijskim svojstvima i fiziološkoj ulozi svrstavaju se u nekoliko grupa. Osnovna podela je na proste proteine (albumini, globulini i fibrinogen) i složene proteine, u koje spadaju lipoproteidi i glikoproteidi (tabela 1.4). 28

38 Tabela 1.4: Koncentracija proteina krvne plazme i seruma (g/l) Vrsta Proteini plazme Fibrinogen Proteini seruma Albumini Globulini Konj 68,4 3, ,5 32,5 Goveče 83,2 7, ,3 39,7 Ovca 57,4 3,6 53,8 30,7 23,1 Koza 72,7 6,0 66,7 39,6 27,1 Svinja 69,0 5, ,3 32,7 Pas 67,2 5, ,7 26,3 Mačka ,8 40,1 25,7 Određivanjem koncentracije ukupnih proteina u krvnoj plazmi i krvnom serumu moguće je ustanoviti: normoproteinemiju (proteinemija varira unutar fizioloških granica), hipoproteinemiju (smanjena koncentracija proteina) i hiperproteinemiju (povećana koncentracija proteina). Proteinski sastav krvne plazme predstavlja odraz zdravstvenog stanja jednog organizma, koji se menja pri nekim fiziološkim stanjima, ali do znatnih promena kvalitativnog i kvantitativnog odnosa dolazi kod niza bolesti i zbog toga se stalno usavršavaju postojeće i uvode nove metode za njihovo izdvajanje i proučavanje. Za određivanje koncentracije proteina u krvnoj plazmi i serumu na raspolaganju je veliki broj metoda sa različitom tačnošću. Principi reakcija na kojima se zasnivaju pojedine metode su dosta različiti, pa otuda razlike i u dobijenim podacima kada se analizira jedan isti uzorak. Međutim, prisutne razlike se kreću u dozvoljenim granicama i u kliničkoj praksi treba koristiti onu metodu koja je jednostavna za izvođenje, kratko traje, a daje upotrebljive podatke. U praksi se za određivanje koncentracije ukupnih proteina u krvnoj plazmi i serumu najčešće koristi Biuret metoda. Biuretski reagens se priprema na sledeći način: U normalni sud od 1L uzeti 0,5L destilovane vode, dodati 1,5g Cu-sulfata i 6g K-Na-tartarata, dodati 300ml 10% rastvora NaOH i dopuniti sud do 1L destilovanom vodom. Gotov biuretski reagens se može nabaviti i u trgovini. 29

39 Biuret metoda spada u grupu kolorimetrijskih metoda, gde se na osnovu intenziteta ljubičaste boje, koja nestaje delovanjem Cu-sulfata u alkalnoj sedini na peptidne veze proteina u plazmi ili serumu i intenziteta boje standarda (poznata koncentracija proteina), izračunava koncentracija u uzorku plazme (seruma). Intenzitet nastale ljubičaste boje proporcionaalan je koncentraciji proteina i meri se fotometrijski na talasnoj dužini 546nm (540nm). Merenje se vrši prema slepoj probi (u toj probi nema ispitivane materije, a u ovom slučaju nema proteina). Znači, u svakom ispitivanju priprema se jedna slepa proba, standard i serija uzoraka. ZADATAK: Odrediti koncentraciju proteina u krvnoj plazmi/serumu neke životinje Biuretskom metodom. MATERIJAL: Gotovi test (Biuret metoda) za proteine sa standardom, spektofotometar, stalak sa epruvetama, pipete, krvna plazma ili krvni serum. IZVOĐENJE: Prema uputstvu proizvođača test kompleta. PROSTOR ZA RAD: Određivanje aktivnosti transaminaza u krvnoj plazmi / serumu Određivanje aktivnosti serumskih enzima danas spada u najčešća, a prema mnogobrojnim opažanjima i najpouzdanija biohemijska ispitivanja kojima se utvrđuje oštećenje jetre. Ipak, treba naglasiti da kod svih domaćih životinja ta ispitivanja nisu ni podjednako istražena niti je njihov relativni značaj za dijagnostiku funkcionalnog stanja jetre podjednak za svaku životinjsku vrstu (AST kod biljojeda i svinja, ALT i alkalna fosfataza kod pasa i mačaka). Osim toga, veoma često nije reč o ospitivanjima kojima se ispituju funkcije jetre, već o postupcima kojima se utvrđuje da li je i u kojem stepenu narušen integritet hepatocita. Naime, povećavanje aktivnosti nekog serumskog enzima upućuje u prvom redu na izlazak enzima iz hepatocita (ili drugih parenhimatoznih ćelija) zbog oštećenje ćelijske opne ili ćelijskih mikrostruktura. S druge strane, količina (aktivnost) nekih enzima u ekstracelularnoj tečnosti i krvi može se povećati a da i ne nastane oštećenje ćeliske membrane i to se dešava u sličajevima povećane sinteze enzima u tim ćelijama (alkalna fosfataza, npr.) 30

40 Enzimi aspartat-aminotransferaza (AST) i alanin-aminotransferaza (ALT) katalizuju sledeće reakcije: ZADATAK: Odrediti aktivitet ALT i AST u plazmi/serumu neke živtinje. MATERIJAL: Gotovi testovi za ALT i AST, vodeno kupatilo, epruvete, pipete, spektrofotometar, krvna plazma ili krvni serum. IZVOĐENJE: Prema uputstvu proizvođača test kompleta. PROSTOR ZA RAD: Određivanje koncentracije glukoze u krvnoj plazmi / serumu Glukoza je jedini oblik glukosaharida koji se nalazi u krvi, odnosno u krvnoj plazmi.znamo da se svi monosaharidi oslobođeni varenjem ugljenih hidrata iz hrane resorbuju u digestivnom traktu, a u jetri se prevode (izomerizacija monosaharida) u glukozu. Koncentracija glukoze (glikemija) je parameter izostrukture organizma, uporno se održava u fiziološkim granicama. Glikemija kod većine vrsta domaćih životinja iznosi 4-6mmol/L, sa odstupanjem u dozvoljenim granicama. Kod preživara, zbog specifičnosti varenja ugljenih hidrata u predželucima, upola je manja, a kod živine dvostruko veća. Koncentracija glikoze u krvi može prolazno da se poveća posle unošenja obroka sa visokim sadržajem šećera (alimentarna hiperglikemija) i ako tada glikemija pređe prag reapsorpcije glukoze u tubulima bubrega, pojaviće se glukoza u mokrći i to obično kratko traje (alimentarna glukozurija). Kod dugotrajnog gladovanja i posle teškog mišićnog rada,glikemija može da padne ispod fiziološke granice, što se manifestuje gubitkom svesti i grčevima (hipoglikemična koma ili šok). Jetra je veoma značajan organ za održavanje glikemije, zahvaljujući svojoj sposobnosti da višak resorbovanih monosaharida privremeno deponuje u glikogen koji se određenim mehanizmima vrlo brzo mobiliše između obroka i u toku gladovanja. Kada se 31

41 potroše rezerve glikogena, jetra obezbeđuje potrebnu količinu glukoze glukoneogenezom, sposobnošću da sintetiše glukozu iz neugljenohidratnih jedinjenja (međuproizvodi glikolize, glicerol, propionat, međuproizvodi ciklusa limunske kiseline i glukogenih aminokiselina). Za vreme gladovanja jetra koristi Coriev i alaninski ciklus za stvaranje potebne glikoze. U regulaciji glikemije učestvuje nekoliko hormona: insulin, hormon rasta, ACTH, glukokortikosteroidi, adrenalin, glukagon i tiroksin. ZADATAK: Odrediti koncentraciju glukoze u plazmi/serumu neke životinje. MATERIJAL: Gotovi test za glukozu (GOD-PAP metoda), epruvete, pipete, spektrofotometar, krvna plazma ili krvni serum. IZVOĐENJE: Prema uputstvu proizvođača test kompleta. PROSTOR ZA RAD: Određivanje koncentracije uree u krvnoj plazmi / serumu Azotne materije krvnog seruma (ukupni serumski azot) obuhvataju azot belančevina i neproteinski azot koji ostaje u serumu posle deproteinizacije. Neproteinski azot čine azot uree i rezidualni azot (azot aminokiselina, mokraćne kiseline, amonijaka, kreatina, kreatinina,...). Višak amonijaka se iz organizma izlučuje u obliku samog amonijaka-amonotelični organizmi (životinje koje žive u vodi), uree-ureotelični organizmi (suvozemni kičmenjaci) ili mokraćne kiseline-urikotelični organizmi (ptice i gmizavci). Ureotelične životinje sintetišu ureu u jetri u Krebs-Henseleitovom ciklusu. Prti spontanim bolestima jetre, lakšim ili težim, sinteza uree nije bitno narušena, pa je i koncentracija uree u serumu u fiziološkim granicama sve dok bureg funkcioniše normalno. Kod pasa sa akutnom atrofijom jetre i pri hroničnim oboljenjima jetre javlja se u pojedinačnim slučajevima snižena koncentracija uree u serumu. Naprotiv, prema brojnim novijim podacima koncentracija uree u krvnom serumu kod životinja sa obolelom jetrom je manje ili više povećana (pas-upalne i degenerativne promene u parenhimu jetre, akutne i hronične bolesti jetre kod konja). Referentne vrednosti: 3-9mmol/L za većinu domaćih životinja. ZADTAK: Odrediti koncentraciju uree u plazmi/serumu neke životinje. 32

42 MATERIJAL: Gotovi test za ureu (metoda sa diacetilmonoksinom), epruvete, pipete, spektrofotometar, centrifuga, krvna plazma ili krvni serum. IZVOĐENJE: Prema uputstvu proizvođača test kompleta. PROSTOR ZA RAD: Određivanje koncentracije ukupnog bilirubina u krvnoj plazmi / serumu Žučne boje su crveni bilirubin i zeleni biliverdin. Uglavnom nastaju razlaganjem hemoglobina,odnosno njegove prostetične grupe (hema), u ćelijama monocitnomakrofagnog sistema (MMS) slezine,jetre i koštane srži. Samo 10% do 20% žučnih boja nastaje raspadom ostalih protoporfirina u organizmu. Po nastaloj hemolizi haptoglobin prihvata hemoglobin i prenosi ga do monocitno-makrofagnog sistema slezine,jetre i koštane srži, gde se on preko niza međuproizvoda pretvara u bilirubin. Preostali biliverdin redukcijom prelazi u bilirubin. On postepeno napušta ćelije monocitno-makrofagnog sistema i pošto je teško rastvorljiv, vezuje se za albumine krvne plazme koji ga donose do hepatocita (slobodan,nekonjugovan, indirektni bilirubin). Hepatociti ga preuzimaju i konjuguju ga u glatkom endoplazmatskom retikulumu sa glukoronskom i sumpornom kiselinom i pri tome uglavnom nastaje bilirubin-diglukuronid (vezani, konjugovani, direktni bilirubin) koji je netoksičan i rastvorljiv u vodi. On ne može da pređe iz hepatocita u krv, nego aktivnim transportom biva prebačen u žuč. U crevu se dejstvom mikroflore od njega odvaja glukuronid, a oslobođeni bilirubin se redukuje u urobilinogen i dalje,u sterkobilinigen. Pri određivanju koncentracije bilirubina u krvnom serumu,ređe u krvnoj plazmi, određuje se ukupan serumski bilirubin, konjugovani i nekonjugovani bilirubinn. Ovo je neophodno da bi se tumačio oblik i porekljo nastanka ikterusa, tj. da li je poremećaj u vidu povećanog stvaranja bilirubina (hemoliza), smanjene konjugacije (insufijencija jetre) ili otežanog oticanja žuči (holestaza). Referentne vrednosti za većinu životinja se kreću od 1 do 10 mol/l, a za konja 5 do 50 mol/l. ZADATAK: Odrediti koncentraciju bilirubina u plazmi/serumu govečeta. 33

43 MATERIJAL: Gotovi test, epruvete, pipete, spektofotometar, krvna plazma ili krvni serum. IZVOĐENJE: Prema uputstvu proizvođača test kompleta. PROSTOR ZA RAD: Određivanje koncentracije kalcijuma u krvnoj plazmi Kalcijum se u krvnoj plazmi nalazi u dva oblika: slobodni ili jonski i vezani kalcijum (za proteine krvne plazme, najviše za albumine). Od ukupne količine Ca u krvi više ima jonskog Ca (oko 55%), a koncentracija ukupnog kalcijuma u krvi (kalcemija) varira između 2 i 2,7mmol/L; kod kokoši nosilja iznosi 3-8mmol/l. Koncentracija Ca krvi se pažljivo održava u fiziološkim granicama jer pad koncentracije (hipokalcemija) može imati letalan ishod. Kalcijum ima višestruku ulogu: regulator je nervno-mišićne razdražljivosti (usled hipokalcemije dolazi do povećane razdražljivosti), učestvuje u koagulaciji krvi (faktor IV), aktivator je nekih enzima, važan je činilac u procesu okoštavanja. Graviditet i laktacija su fiziološka stanja koja predstavljaju kritičan period u održavanju kalcemije. Koncentracija Ca u krvnoj plazmi se određuje kolorimetrijskim metodama; jedna od njih je sa krezoftalein kompleksonom sa kojim joni Ca u alkalnom puferu reaguju gradeći jedinjenje ljubičasto-plave boje čiji je intenzitet proporcionalan koncentraciji Ca. U trgovini se nabavlja pripremljen test-komplet sa standardnim rastvorom Ca (2,5mmol/L) i kompletnim uputstvom za izvođenje analize. ZADATAK: Odrediti koncentraciju kalcijuma u krvnoj plazmi govečeta. MATERIJAL: Test komplet sa standardom Ca, pipeta (mikropipeta), spektrofotometar, epruvete, destilovana voda, krvna plazma. 34

44 IZVOĐENJE: Prema uputstvu proizvođača test kompleta. PROSTOR ZA RAD: 35

45 2.0 Fiziologija ekskrecije i bilans vode i elektrolita Procesi ekskrecije (izlučivanja u spoljašnju sredinu) imaju suštinski značaj za održavanje konstanktne zapremine telesnih tečnosti i relativno stalnog sastava telesnih tečnosti. Odnosno, procesi ekskrecije učestvuju u održavanje homeostaze, a odvijaju se preko više organa i organskih sistema. Ekskrecija se vrši putem: respiratornog sistema (sistem koji najbrže reaguje), uropoetskog sistema (kvantitativno najvažniji ekskretorni sistem), digestivnog sistema i kože. Bubrezi su parni organi parenhomatozne građe, imaju veliki protok krvi (oko 20% minutnog volumena srca) i veliku potrošnju kiseonika. Procesom stvaranja mokraće i njenom eliminacijom putem uretera, mokraćne bešike i urtre u spoljnu sredinu, bubrezi obavljaju najveći deo posla u održavanju konstantnosti sastava unutrašnje sredine (homeostaza organizma) i to izotonije, izohidrije i izojonije. Prema tome, bubrezi vrše oslobađanje (prečišćavanje) krvi od materija koje su štetne za organizam, koje se nalaze u višku i od onih koje nisu potrebne organizmu. Pored toga, bubrezi ispoljavaju značajnu endokrinu ulogu. Eksperimentalno odstranjivanje oba bubrega za kratko vreme (2-7 dana) dovodi do smrtnog ishoda životinje usled ireverzibilnih poremećaja homeostaze (posledica trovanja organizma nagomilanim proizvodima metabolizma). Osnovnu funkciju jedinice bubrega čini nefron čiji se broj u oba bubrega kreće od oko 1 milion (ovca) do oko 5,5 miliona (konj). Nefron se sastoji od Malpigijevog telašca kojeg čini pedesetak paralelno postavljenih kapilara (glomerul) obavijenih Bowmanovom kapsulom i sistema kanalića (tubuli) koji se nastavljaju na parijentalni list Bowmanove kapsule. Sistem kanalića se sastoji od 3 osnovna dela: proksimalni deo, Henleova petlja i distalni deo. Bubreg se snabdeva krvlju preko bubrežne arterije (a. renalis) koja se u njemu grana na sitnije ogranke. Glomerularni kapilari nastaju grananjem aferentne arteriole (vas afferens) koja je kratka i relativno velikog prečnika. Glomerularni kapilari se skupljaju ponovo u arteriolu koja izlazi iz Malpigijevog telašca-izvodna arteriola (vas efferens). Eferentna arteriola nakon izlaska iz Malpigijevog telašca ponovo se rasipa u arterijske kapilare, pa tektad prelazi u venske kapilare, gradeći tako peritubularnu kapilarnu mrežu u oblasti oko proksimlnih i distalnih tubula. Nastali venski kapilari se skupljaju u venule, intertubularne vene, itd., a izlazni krvni sud iz bubrega je bubrežna vena (v. renalis). Eferentna arteriola je duža i uža od aferentne, te takopruža znatan otpor proticanju krvi zbog čega je u mreži glomerularnih kapilara pritisak visok (znatno viši nego u kapilarama sistemske cirkulacije-iznosi oko 10kPa). S druge strane,pritisak u mreži peritubularnih kapilara je veoma nizak. Prema tome, visok pritisak u peritubulatnoj kapilarnoj mreži omogućije da se tečnost neprekidno iz okolnih tubula i peritubularnog tkiva resorbuje u ove kapilare. 36

46 U kapilarama glomerula se odvija proces ultrafiltracije: iz krvi kroz glomerularnu membranu u lumen Bowmanove kapsule se filtrira tečnost - glomerularni filtrat ili primarna mokraća. To je ultrafiltrat krvne plazme i sadrži sve sastojke plazme osim proteina. Ultrafiltracijom krvi kroz glomerularnu membranu u toku 24 sata kod čoveka se stvori oko 170L primarne mokraće, a kod govečeta i konja preko 1000L. Međutim, svega 1-1,5% od ove količine se izlučuje dnevno u spoljašnju sredinu kao konačna mokraća, što znači da se u tubulima tokom proticanja nastalog ultrafiltrata voda i materije potrebne organizmu ponovo vraćaju u krv procesom koji se naziva tubularna reasorpcija. Prema tome, sastojci potrebni organizmu reapsorbuju se u potpunosti iz primarne mokraće, neke se reapsorbuju delimično, a ima sastojaka koji ne samo da se ne reapsorbuju, već se i aktivno izlučuju iz krvi preko tubulocita u lumen tubula (tubularna sekrecija). Pritisak koji obezbeđuje filtraciju kroz glomerularnu membranu naziva se filtracioni pritisak (Fp) i on je jednak razlici između hidrostatskog (krvnog) pritiska u glomerularnim kapilarama i zbira koloido-onkotskog pritiska belančevina krvne plazme i pritiska tečnosti u Bowmanovoj kapsuli: Fp=Hp (KOp + ICp) Fp = filtracioni pritisak Hp = hidrostatski (krvni) pritisak (usmerava tečnost kroz glomerularnu membranu) Kop = koloido-onkotski pritisak belančevina krvne plazme (suprotstavlja se filtraciji) Icp = interkapsularni pritisak (hidrostatski pritisak tečnosti u Bowmanovoj kapsulisuprotstavlja se filtraciji) 37

47 Prosečne vrednosti navedenih pritisaka u fiziološkim okolnostima kod čoveka, a i kod drugih sisara, iznose: Fp = 9,3 kpa (4 kpa + 1,9 kpa) Fp = 9,3 kpa 5,9 kpa Fp = 3,4 kpa Pojmovi koji se koriste pri opisivanju količine izlučene mokraće su: poliurija = izlučivanje veće količine razređene mokraće, oligurija = izlučivanje manje količine koncentovane mokraće i anurija = prestanak izlučivanja mokraće. U kliničkoj praksi humane i veterinarske medicine postoji veliki broj metoda za ispitivanje bubrežne funkcije i za procenu stepena oštećenja pojedinih funkcionlnih delova nefrona. Mokraća je ekskret i predstavlja ekskretorne funkcije bubrega. Opšte osobine i fizičkohemijske karakteristike mokraće su karakteristične za vrstu domaće životinje, dok se hemijski sastav bitno ne razlikuje među životinjskim vrstama. Analiza karakteristika i sastava mokraće se vrši sa opravdanom pretpostavkom da svaka eventualna odstupanja od normalnog mogu da ukažu na oštećenje funkcije bubrega, a nekada se na osnovu rezultata kliničkih pregleda mokraće može odrediti lokalizacija patološkog procesa na nefronu, pa čak proceniti i stepen oštećenja određenog funkcionalnog dela nefrona. Jasno je da ovo zalazi u zadatke patološke fiziologije i klinike. Na ovom mestu ćemo opisati i na vežbama izvesti samo neke metode koje se primenjuju pri pregledu mokraće, a sve u cilju potvrđivanja postavki iz fiziologije bubrega. Plan postupka pregleda mokraće prikazan je u tabeli 2.1. U ovom poglavlju će biti govora o prvih pet navedenih faza pregleda mokraće, dok se o mikrobiološkom pregledu mokraće govori u okviru drugih predkliničkih i kliničkih predmeta. 38

48 Tabela 2.1: Plan pregleda mokraće Opšti podaci Podaci o životinji (vrsta, rasa, pol, starost, ime / oznaka) Podaci o vlasniku Podaci o dnevnoj količini urina Podaci o načinju uzimanja uzorka Značajne napomene o eventualnom kliničkom nalazu Fizičke osobine Boja Konzistencija Prozirnost Miris Fizičko-hemijske osobine Gustina (specifična težina) Elektrohemijska reakcija (ph) Hemijske osobine Utvrđivanje prisustva određenih organskih i neorganskih sastojaka mokraće Mikroskopski pregled Utvrđivanje karakteristika mokraćnog sedimenta (organizovanog i neorganizovanog) Mikrobiološki pregled Urinokultura 2.1 Opšti podaci o uzorku mokraće Opšti podaci o uzorku urina se dobijaju se od veterinara kliničara, nadležne institucije i/ili vlasnika životinje. U ove podatke spadaju: podaci o životinji (vrsta, rasa, pol, starost, ime / oznaka), podaci o vlasniku, podaci o dnevnoj količini urina, podaci o načinju uzimanja uzorka, značajne napomene o eventualnom kliničkom nalazu. Ovi podaci su neophodni u cilju pravilne analize i tumačenja dobijenih rezultata pregleda mokraće. Uzorak mokraće koji veterinar kliničar šalje u laboratoriju na pregled mora pratiti propratni akt u kome su ovi podaci naznačeni. 39

49 ZADATAK: Za uzorak mokraće, koji će biti ispitivan na vežbama, navesti opšte podatke. PROSTOR ZA RAD: Podaci o životinji (vrsta, rasa, pol, starost, ime / oznaka): Podaci o vlasniku: Podaci o dnevnoj količini urina: Podaci o načinju uzimanja uzorka: Značajne napomene o eventualnom kliničkom nalazu: 2.2 Fizičke osobine mokraće Boja: Boja mokraće zavisi od vrste životinje. Ona može biti bledožute (svinja) do mrke boje (kod konja). Boja potiče od pigmenata urohroma, uroporfirina i urobilinogena. Pravilo je da ako životinja lući više mokraće onda je ona svetlije boje zbog razređenosti pigmenata i obrnuto. Promena boje može da ukaže na prisustvo nekog patogenog procesa u organizmu. Oboljenje konja (praznična bolest) praćeno je izlučivanjem mioglobina mokraćom i ona je tada skoro crne boje. Crvena boja mokraće ukazuje na prisustvo hemoglobina - hemoglobinurija ili eritrocita - hematurija. Boja mokraće može biti promenjena i kod uzimanja nekih lekova, a i neka hrana može uticati na boju. 40

50 Konzistencija: Kod većine domaćih životinja i čoveka mokraća je bistra i tečna. Kod konja mokraća ima dosta sluzi i stajanjem se brzo zamuti jer dolazi do bakterijskog razlaganja sastojaka u njoj, a talože se i neke soli. Prozirnost: Normalno je prozirna ali prisustvo gnoja, detritusa ćelija i drugih sastojaka koji se pod normalnim uslovima na nalaze u njoj utiče na smanjenje prozirnosti. Miris: Miris mokraće je specifičan za vrstu životinje. Kod konja on je aromatičan, kod goveda sladunjav, a kod mesojeda i svinje oštar i neprijatan. Otkrivanje mirisa na aceton pri pregledu mokraće ukazuje na prisustvo dijabetes melitusa kod ljudi, a kod krava i malih preživara na ketozu. ZADATAK: Ispitati fizičke osobine uzorka mokraće. PROSTOR ZA RAD: Boja: Konzistencija: Prozirnost: Miris: ZAKLJUČAK: 2.3 Fizičko-hemijske osobine mokraće Specifična težina: U zavisnosti od vrste životinje specifična težina mokraće se kreće u rasponu od Određuje se urometrom (slika 2.1). Normalno je da specifična težina bude obrnuto srazmerna količini izlučene mokraće. Međutim, kod šećerne bolesti se luči velika količina mokraće (poliurija), jer glukoza povlači vodu iz cirkulacije koja je praćena i glukozurijom, a istovremeno prisustvo glukoze utiče da je specifična težina mokraće velika. 41

51 Slika 2.1: Urometar Elektrohemijska reakcija: Odredjuje se lakmus papirom ili ph-metrom. Mokraća mesojeda je kisela a preživara bazna (ph oko 8,5). Kod čoveka i omnivora ph mokraće zavisi od vrste unete hrane (ako se konzumira pretežno biljna hrana, onda je ph bazan, a ako se uzima meso, onda je kiseo). Kod gladovanja mokraća je kod svih vrsta kisela jer se tada troše depoi hranljivih materija iz sopstvenog organizma. ZADATAK: Ispitati fizičko-hemijske osobine mokraće. MATERIJAL: Urometar, menzura, lakmus-papir i/ili ph-metar, uzorak mokraće. IZVOĐENJE: Presuti uzorak mokraće u menzuru i uroniti u njega urometar. Očitati podeok do kojega je urometar uronjen u uzorak. U zavisnosti od vrste (očekivane elektrohemijske reakcije) za približno određivanje ph vrednosti koristiti crveni ili plavi lakmus papir, a za precizno ph-metar. PROSTOR ZA RAD: Specifična težina = Elektrohemijska reakcija = ZAKLJUČAK: 42

52 2.4 Hemijski sastojci mokraće Hemijski sastojci mokraće mogu biti organske i neorganske prirode. Većina organskih sastojaka koji se mogu naći u mokraći su patološki sastojci, što znači da se u mokraći zdravih životinja oni ne nalaze ili se nalaze u onim koncentracijama da se uobičajenim kliničko-hemijskim metodama ne mogu otkriti. Postoje ipak slučajevi kada mokraća zdravih jedinki sadrži sastojke koji se normalno ne nalaze i onda se govori o fiziološkoj glukozuriji (usled alimentarne hiperglikemije), fiziološkoj proteinuriji, itd. Pojava proteina u konačnoj mokraći se označava kao proteinurija. U primarnoj mokraći proteini se nalaze u vrlo maloj količini, svega oko 0,3g/l, što je oko 200 puta menje od koncentracije proteina u krvnoj plazmi. Ako bi se ta količina isfiltrovanih belančevina, s obzirom na količinu primarne mokraće, našla u konačnoj mokraći, onda bi se zntne količine proteina gubile iz organizma. Budući da se odmah u proksimalnim tubulima procesom pinocitoze reapsorbuje, u konačnoj mokraći se oni ne mogu detektovati uobičajenim kliničko-hemijskim metodama. Međutim, primenom veoma osetljivih metoda i u normalnoj mokraći može da se dokaže prisustvo proteina (fiziološka proteinurija) u tragovima. Glukoza krvi ima visok bubrežni prag reapsorpcije kao i drugi sastojci primarne mokraće, za koje se može reći da su iz prinude filtrirani iz krvi samo zato da bi se krv, tj. organizam, oslobodio štetnih produkata metabolizma. Prag reapsorpcije za glukozu iznosi oko 8,5mmol/l, a to znači da sve dok je glikemija ispod 8,5mmol/l, glukoza će se potpuno reapsorbovati iz primarnog urina u krv i neće je biti u konačnoj mokraći. Pojava glukoze u konačnoj mokraći - glukozurija je znak da je koncentracija glukoze u krvi veća od 8,5mmol/l i da se višak glukoze iznad ove koncentracije ne reapsorbuje, pošto je kapacitet tubula za reapsorpciju glukoze u potpunosti zasićen. Kod čoveka i nekih životinja glukoza se može pojaviti u mokraći nakon konzumiranja veće količine hrane bogate ugljenim hidratima-alimentarna glukozurija. Patološka glukozurija nastaje kod šećerne bolesti (diabetes melitus), renalnog dijabeta, poremećaja funkcije hipofize, nadbubrega,tireoideje i dr. Ketonska tela (aceton, acetosirćetna i betaoksibuterna kiselina) su jedinjenja koja se stvaraju u organizmu u slučajevima kada ćelije nemaju dovoljno glukoze na raspolaganju. Pojava ovih jedinjenja u krvi naziva se ketonemija. Pojava ketonskih tela u mokraći - ketonurija je patološki nalaz u mokraći i javlja se kod ketoze preživara, kod ljudi je pratilac šećerne bolesti, dugotrajnih gladovanja itd. Prisustvo hemoglobina u mokraći (hemoglobinurija) je patološka pojava, u normalnoj mokraći ga nema. Kod pojačane intravitalne hemolize eritrocita (hemolitičke anemije) dolazi do pojave većih količina slobodnog hemoglobina u krvi i kada se popuni kapacitet nekih belančevina krvne plazme da vezuje Hb (haptoglobin i dr.), slobodni Hb se filtrira kroz glomerule bubrega, reapsorbuje, a višak se izlučuje mokraćom u spoljnu sredinu. Mokraća koja sadrži Hb je crvene boje, ali i kod hematurije ima istu boju,što je važno kod postavljanja diferencijalne dijagnoze. ZADATAK: Ispitati hemijske osobine uzorka urina. 43

53 MATERIJAL: Sulfosalicilna kiselina, azotna kiselina, Fehlingov reagens, Benedictov reagens, natrijum-nitroprusid, sirćetna kiselina, benzidin, vodonikperoksid, epruvete, laboratorijski plamenik, uzorak mokraće. IZVOĐENJE: Proteini: Kvalitativno dokazivanje proteina u mokraći je moguće izvesti sledećim probama: Sulfosalicilnom kiselinom: U epruvetu usuti 3ml mokraće i dodati 3 kapi sulfosalicilne kiseline. Pojava zamućenja i belih pahuljica taloga ukazuje na prisustvo proteina. Ako mokraća ostane bistra, reakcija je negativna. Reakcija je pozitivna ako se u mokraći proteini nalaze u koncentraciji većoj od 100mg/l. Azotnom kiselinom (Helerova proba): Uzeti dve epruvete; u prvu usuti 3ml azotne kiseline a u drugu 3ml mokraće. Sadržaj druge epruvete polako niz zid sipati u prvu epruvetu. U slučaju pozitivne reakcije (ako u mokraći ima proteina) na dodirnom sloju se pojavi beli prsten koji je masivniji ako u mokraći ima više proteina. Probom kuvanja: Zasniva se na osobini proteina da se denaturiše kuvanjem kada denaturisani proteini postaju nerastvorljivi i pojavljuju se u vidu grudvice taloga. Glukoza: Prisustvo glukoze u mokraći može se odrediti pomoću nekoliko reakcija: Fehlingova proba: u jednu epruvetu usuti po 1ml rastvora Fehling I i Fehling II i prokuvati. U drugu epruvetu sipati 2ml mokraće i dodati sadržaj prve epruvete. Zagrejati na plamenu do ključanja. Pojava crvene boje ukazuje na prisustvo šećera u uzorku mokraće, a ako rastvor ne promeni boju, reakija je negativna. Benedictova proba: Usuti u epruvetu 2ml mokraće i dodati istu količinu Benedictovog rastvora, pa zagrejati do klučanja. Pojava crvene boje znači da je reakcija pozitivna - u mokraći je prisutna glukoza. Ketonska tela: U mokraći se ketonska tela mogu dokazati pomoću sledeće probe: Proba natrijum-nitroprusidom se izvodi u dve epruvete po sledećem planu: 1. epruveta: 3ml mokraće + 2 kapi 50% NaOH. 2. epruveta: Natrijum-nitroprusid (na vrh kašičice) + destilovana voda (da se prah rastvori) Sadržaj druge epruvete uliti u prvu i pojaviće se crvena boja. Mešavini dodati 1-2ml koncentrovane sirćetne kiseline i ako se crvena boja intenzivira to ukazuje da mokraća sadrži aceton a ako se crvena boja izgubi i nastane prljavo žuta to znači da u mokraći nema acetona. Hemoglobin: Prisustvo hemoglobina u mokraći se može dokazati pomoću benzidinske probe: U epruvetu usuti 2-3ml koncentrovane sirćetne kiseline, a onda dodavati benzidin i mešati dok se ne pojavi talog benzidina na dnu epruvete (zasićeni 44

54 rastvor), a zatim dodati oko 3ml vodonikperoksida (H 2 O 2 ). U drugu epruvetu uliti 4ml mokraće i dodati nekoliko mililitara rastvora iz prve epruvete. Pozitivna reakcija je pojava zelenoplave ili plave boje. Ova proba će biti pozitivna i u slučaju hematurije, pa se tačna dijagnoza postavlja pregledom sedimenta, kada se u slučaju hematurije otkriva prisustvo velikog broja eritrocita. Na kraju, treba naglasiti da se za rutinska klinička ispitivanja fizičko-hemijskih i hemijskih karakteristika urina danas sve više u upotrebi test trake za određivanje ph urina, kao i prisustva i količine krvi, leukocita, bilirubina, urobilinogena, proteina, glukoze, ketona i nitrita. Prvenstvena prednost korišćenja ovih test traka je dobijanje rezultata u roku od samo nekoliko minuta. PROSTOR ZA RAD: Proteini: Glukoza: Ketonska tela: Hemoglobin: ZAKLJUČAK: 45

55 2.5 Mikroskopski pregled mokraće Mikroskopski pregled mokraće podrazumeva pregled mokraćnih sedimenata. U talogu (sedimentu) mokraće, koji se dobiva centrifugiranjem uzorka mokraće i odvajanjem tečnog dela, mikroskopski se traže tzv. bubrežni cilindri, kristali i ćelije. Utvrđivanje prisustva mokraćnih sedimenta deo je rutinskog kvalitativnog pregleda mokraće, a nalazi se opisuju i brojčanim vrednostima - polukvantitativno (npr. 3-5 leukocita po vidnom polju i sl.). Mokraćni sedimenti se mogu podeliti na: neorganizovani sediment (neorganske i organske prirode) i organizovani sediment (ćelijske elemente i bubrežne cilindre). ZADATAK: Izvršiti mikroskopski pregled mokraćnih sedimenata. MATERIJAL: Centrifuga, epruvete za centrifugiranje, pipete, predmetna stakla, pokrovna stakalca, uzorak mokraće. IZVOĐENJE: Uzorak mokraće presuti u epruvetu za centrifugiranje i centrifugirati. Nakon centrifugiranja odliti supernatant. Talog resuspendovati sa 0,5 ml supernatanta, preneti kap na predmetno staklo i pokriti sa pokrovnim stakalcetom (vodeći računa da uzorak ne dospe na njegovu gornju površinu). Ovakvo pripremanje uzorka se naziva vlažna priprema. Uzorak posmatrati na mikroskopu pod uvećanjem objektiva od 10 i 40 puta. Pošto je u pitanju nativni preparat (koji nije obojen) potrebno je koristiti slabije osvetljenje, spušteni kondenzor i zatvorenu blendu na mikroskopu. Na malom uvećanju mikroskopa mogu se posmatrati i kvantifikovati veći kristali i čestice, bubrežni cilindri, jaja parazita. Na velikom uvećanju mikroskopa mogu se posmatrati i kvantifikovati ćelije (leukociti, eritrociti, epitelne ćelije, spermatozoidi i sl.), masne kapljice, manji kristali i čestice, bakterije i gljivice. U cilju efikasne identifikacije bubrežnih sedimenata stvoreni su atlasi sa njihovim slikama i opisima. Nakon pregleda nekoliko vidnih polja zabeležiti sva zapažanja i kvantifikovati neki od pronađenih bubrežnih sedimenata. PROSTOR ZA RAD: 46

56 2.6 Ispitivanje diureze pacova nakon opterećenja vodom efekti adiuretina U toku procesa stvaranja definitivne mokraće, prolaskom velike količine stvorenog glomerularnog filtrata (primarne mokraće) kroz tubularni sistem nefrona odigrava se proces reapsorpcije, tj. vraćanje iz lumena tubula u peritubularnu kapilarnu mrežu vode i svih, za organizam korisnih i neophodnih materija. Na taj način dolazi i do reduciranja volumena definitivne mokraće koja se svodi na oko 1% od ukupno stvorene primarne mokraće. Zadržavanje vode u organizmu ili njeno povećano izlučivanje u spoljnu sredinu putem bubrega regulisano je povećanom ili smanjenom sekrecijom vazopresina, tj. antidiuretičkog hormona (ADH) iz zadnjeg režnja hipofize. Oko 80% vode iz primarne mokraće se reapsorbuje u proksimalnim tubulima (obavezna ili obligatorna reapsorpcija). U distalnim tabulima i sabirnim kanalićima iz primarne mokraće može da se reapsorbuje znatan deo vode i da se mokraća koncentruje, ali je uslov za to prisustvo u krvi ADH koji utiče da zid tabula ovog dela nefrona bude propustljiv za vodu (neobavezna ili fakultativna reapsorpcija). Obim ove reapsorpcije zavisi od volumena i osmolariteta ekstracelularne tečnosti. Unošenjem veće količine vode u organizam dolazi do povećanja volumena ekstracelularne tečnosti i smanjenja njene osmotske koncentracije. Ovo stanje ne podražuje osmoreceptore, nema oslobađanja ADH, zid distalnih tibula i sabirnih kanalića nije propustljiv za vodu i lučiće se velika količina razređene mokraće (poliuruja), čime će se organizam osloboditi viška tečnosti. Suprotno ovome, nedostatak vode u organizmu (gubitak vode znojenjem, povraćanjem, prolivom i dr,), unošenje viška soli, uskraćivanje vode (žeđ), dovešće do izlučivanja male količine koncentrovane mokraće (oligurija), a to znači da bubrezi vodu u maksimalnoj količini vraćaju i zadržavaju u organizmu. Prema tome, u ovom slučaju je pretila opasnost od smanjenja volumena ekstracelularne tečnosti (manjak vode) i povećanje njenog osmolariteta i osmotske koncentracije krvi. Na ovo reaguju osmoreceptori u hipotalamusu, dolazi do podsticanja sekrecije i oslobađanja ADH iz neurohipofize, koji se putem krvi doprema do distalnih tubula i sabirnih kanalića gde značajno povećava obim reasorpcije vode. Izlučivanjem viška vode i rastvorenih soli, ili zadržavanjem vode, bubrezi obavljaju glavni deo posla u održavanju osmolariteta, izojonije i izohidrije ekstracelularne tečnosti, te održavanje volumena telesnih tečnosti. ZADATAK: Pratiti obim lučenja mokraće kod pacova u uslovima opterećenja vodom i tretmana antidiuretičkim hormonom (ADH). MATERIJAL: Tri pacova, tri metabolička kaveza (komore) za pacove (slika 2.2), špricevi i igle, destilovana voda, graduirane posude (epruvete), ADH (ekstrakt zadnjeg režnja hipofize). 47

57 Slika 2.2: Metabolički kavez IZVOĐENJE: Pripremiti 3 metabolička kaveza tako da se ispod levkastog produžetka postavi graduisana epruveta u kojoj će se, u toku trosatnog posmatranja, prikupljati i meriti količina mokraće. Svakog od 3 pacova postaviti u poseban kavez i to uz sledeću pripremu: pacov 1. - bez ikakvog tretmana, pacov 2. - intraperitonealno aplicirati 15-20ml destilovane vode i pacov 3. - intraperitonealno aplicirati 15-20ml destilovane vode, a subkutano 5 i.j. ADH. Svakih 30 minuta kontrolisati i evidentirati količinu mokraće u epruveti i vrednosti uneti u tabelu 2.2. Prokomentarisati dobijene rezultate. 48

58 Skicirati postupak sa modela: TUMAČENJE REZULTATA: Pod pretpostavkom da su sva tri pacova zdrava i u eksperiment postavljeni sa normalnom funkcijom bubrega i faktorima koji učestvuju u stvaranju mokraće (krvni, glomerularni, koloidoonkotski, intratubularni pritisak i dr,) onda će količina izlučene mokraće u toku od 3 sata isključivo zavisiti od tretmana koji smo izvršili. Prvi pacov će ispoljiti normalnu, za svoj organizam uobičajenu diurezu; drugi pacov će u opserviranom periodu izlučiti znatno više mokraće nego prvi (nakon resopcije vode putem peritoneuma dolazi do povećanja količine vode u unutrašnjoj sredini, hipoosmolariteta, smanjenja sekrecije ADH, smanjenja reapsorpcije u tubulima, nastaje poliurija sa smanjenjem specifične težine mokraće); treći pacov će imati zakasnelu diurezu zbog toga što je u njegovoj krvi prisutan ADH u višku, unesen injekcionim putem. PROSTOR ZA RAD: Tabela 2.2: Ispitivanje diureze pacova Pacov Diureza 30 min 60 min 90 min 120 min 150 min 180 min

59 ZAPAŽANJA I ZAKLJUČAK: 2.7 Klirens plazme Za procenu veličine protoka krvi kroz bubrege, kao i za procenu osnovnih ekskretornih procesa bubrega (glomerularna ultrafiltracija, tubularna reapsorpcija i tubularna sekrecija) koristi se određivanje klirensa plazme. Veličina čišćenja različitih supstanci iz plazme pruža koristan način za procenu delotvornosti kojom bubrezi izlučuju raznovrsne materije. Po definiciji bubrežni klirens neke supstance je zapremina plazme (u ml) koja se potpuno očisti od neke supstance bubrezima u jedinici vremena. Ako plazma koja prolazi kroz bubrege sadrži 1mg neke supstance u 1 ml, a 1 mg te supstance se izlučuje svakog minuta mokraćom, onda se 1 ml/min. plazme očisti od te supstance. Ako se neki sastojak krvi filtrira kroz glomerularnu membranu, a nema ga u konačnoj mokraći, onda je klirens za taj sastojak jednak nuli. Klirens plazme 0 imaju svi sastojci krvi koji se filtriraju i u potpunosti reapsorbuju u tubulima (amino kiseline, glukoza, proteini, vitamini, niže masne kiseline imaju visok prag). Sastojci primarne mokraće koji se u tubulima delimično reapsorbuju, a većim delom izlučuju (urea, kreat.) imaju klirens veći od nule. Sastojak plazme koji se filtrira, a u tubulima ne reapsorbuje, nego u potpunosti izlučuje mokraćom, ima klirens jednak obimu glomerularne filtracije. Da bi klirens plazme za neku supstancu mogao biti iskorišten za merenje obima glomerularne filtracije, ta supstanca mora da zadovolji nekoliko kriterijuma: mokraću, da ima malu molekulsku masu i da se lako filtrira, da se ne veže za proteine krvne plazme, da se u tubulocitima ne reapsorbuje niti ne secernira iz krvi u primarnu da se ne metaboliše niti deponuje u bubrezima, da nije toksična i da se koncentracija lako određuje u krvi i mokraći. 50

60 U krvi nema takvih sastojaka (eventualno kreatinin kao nuzproizvod metabolizma skel. mišića), ali ih ima u prirodi i koriste se za merenje obima glomerularne filtracije. Takva materija je inulin - polimer fruktoze, molekulske mase 5.200, filtrira se slobodno kao i voda, ne reapsorbuje se niti secernira. Iz tog razloga veličina njegovog izlučivanja mokraćom predstavlja veličinu glomerularne filtracije. ZADATAK: Na osnovu klirensa plazme za inulin izračunati obim glomerularne filtracije. IZVOĐENJE: Izračunavanje klirensa plazme za sve materije koje se filtriraju kroz glomerul vrši se po obrascu: Klirens plazme (ml/min) = Cu = koncentracija supstance u urinu (mg/ml) Vu = volumen urina (ml/min) Cp = koncentracija supstance u plazmi (mg/ml) Cu X Vu Na osnovu zadatih vrednosti izračunati klirens plazme za inulin. PROSTOR ZA RAD: Cp Cu = Vu = Cp = Klirens plazme = mg/ml ml/min mg/ml ml/min ZAKLJUČAK: 51

61 3.0 Energetski bilans i termoregulacija Odvijanje životnih funkcija zasniva se na procesima i reakcijama kojima se hemijska energija transformiše u toplotu. Obim tih reakcija zavisi od temperature sredine na kojoj se odvijaju tako da podizanje temperature za 10 C dovodi do povećanja proizvodnje toplote od strane živih ćelija za približno 2-3 puta. Toplota se u organizmu stalno stvara kao sporedni proizvod oksidacionih procesa u ćelijama (naročito u jetri i mišićima koji rade). Smatra se da u toku sagorevanja hranljivih materija u organizmu oko 30% od ukupne energije hrane odlazi funkcionalnim sistemima ćelija u obliku ATP-a, a preostali deo se oslobađa u obliku toplote. Međutim, promena temperature, takođe, menja i karakter mnogih komplikovanih bioloških i biohemijskih procesa. To znači da održavanje relativno konstantne temperature organizma postoji kao potreba za efikasno i delotvorno funkcionisanje složenih životnih procesa. Tokom evolucije viša živa bića (sisari i ptice) su razvila precizne termoregulacione mehanizme koji im omogućavaju održavanje (čuvanje) telesne temperature u konstantnim i prilično visokim granicama, bez obzira na visinu temperature sredine koja ih okružuje. To su homeotermne (toplokrvne) životinje koje su u stanju ne samo da održavaju svoju telesnu temperaturu, nego obavljaju i svoje uobičajene životne aktivnosti pri velikim promenama temperature okoline. Održavanje stalne telesne temperature homeoterma na relativno visokom nivou znači da proizvodnja toplote u organizmu mora biti kontinualna i visoka u hladnoj sredini, a to zahteva i stalno unošenje u organizam dovoljne količine hrane i odvijanje oksidativnih reakcija. Takođe, homeotermi moraju posedovati mehanizme koji će u uslovima veoma visoke spoljašnje temperature sprečiti pregrevanje organizma. Sve ovo ukazuje na to da je održavanje stalne telesne temperature energetski vrlo skup proces. Druga grupa životinja, pojkilotermne (hladnokrvne) životinje nemaju stalnu telesnu temperaturu, već ona direktno zavisi od temperature okoline (gmizavci, vodozemci); u skladu s time je i njihova aktivnost. Posebnu grupu čine sisari prezimari (medved, jazavac, hrčak, jež i dr,) koji su u principu homeotermi, ali za vreme zimskog sna (hibernacija) kod njih dolazi do sniženja telesne temperature tako da se ona može samo za nekoliko stepeni razlikovati od temperature okoline. Za vreme hibernacije intenzitet metabolizma je dosta nizak i tek kad temperatura okoline padne ispod 0 C, onda se metabolitički procesi intenziviraju u cilju sprečavanja daljeg opadanja telesne temperature. Ovo je od izuzetnog značaja jer sprečava pojavu stvaranja kristala leda koji mogu dovesti do ireverzibilnog oštećenja ćelija. Novorođene životinje u prvim danima života ponašaju se kao nesavršeni homeotermi pošto im termoregulacioni mehanizmi nisu u potpunosti razvijeni. U veterinarskoj praksi, temperatura tela kod skoro svih životinja meri se uvlaćenjem termometra u rektum (rektalna temperatura se uzima kao prosečna telesna temperatura). Merenje se vrši medicinskim (maksimalnim) termometrom (opsega od 35 do 45 o C). 52

62 Prilikom merenja rektalne temperature mora se uzeti u obzir i temperaturni gradijent u rektumu (termometar uvek stavljati do iste dubine). Osim rektalne, može se meriti i potpazušna, vaginalna, oralna i dr. Telesna temperatura predstavlja obavezan parametar trijasa. Prosečna telesna temperatura kod domaćih životinja i čoveka je data u tabeli 3.1. Različiti delovi tela imaju različitu temperaturu zbog različitog stvaranja i odavanja toplote. Temperatura kože je najniža zbog velikog odavanja toplote. Koža istaknutih delova tela (uši, nos, čelo, udovi) ima nižu temperaturu od kože trupa. Fiziološka variranja temperature kože su znatna. Temperatura tjelesnih šupljina odgovara temperaturi rektuma i vagine. U ustima, nosu i plućima je nešto niža (oko 0,5 o C u odnosu na rektalnu) zbog dolaska svežeg vazduha. Tabela 3.1: Telesna temperatura kod domaćih životinja i čoveka Vrsta / uzrast C Vrsta C Konj 37,5 38 Pas 37,5 38,5 Ždrebe 37,5 39 Mačka 38,0 39,5 Goveče 37,5 39,5 Ovca 38,5 39,8 Tele 38,5 39,5 Koza 38,5 40,5 Svinja 38,5 39,5 Kokoš 40,0 41,5 Prase 39,0 40,5 Čovek 36,5 37 Proizvodnja, stvaranje toplote u organizmu naziva se termogeneza, a oslobađanje, odnosno odavanje toplote u spoljnu sredinu termoliza. Odavanje toplote se vrši po zakonima fizike i to na sledeće načine: zračenjem (radijacija), provođenjem (kondukcija i konvekcija) i isparavanjem. Pod normalnim okolnostima, kod svakog homeoterma, relativno konstantna telesna temperatura (eutermija) je rezultat ravnoteže između termogeneze i termolize, odnosno važi sledeća jednakost: TERMOGENEZA / TERMOLIZA= 1 53

63 Ukoliko je taj odnos manji od 1 (smanjen obim termogeneze ili povećana termoliza), telesna temperatura se smanjuje hipotermija. Ako je odnos veći od 1 (povećana termogeneza ili smanjena termoliza), telesna temperatura se povećava hipertermija. Proizvodnja toplote u organizmu je ključni činilac održavanja konstantne temperature tela jer se prilagođava količini toplote koja se gubi iz organizma. Sledeći faktori određuju koliko će se toplote proizvesti u organizmu: kontrakcija skeletne muskulature (uključujući i drhtanje), funkcionalna aktivnost tireoideje i srži nadbubrega, tonus simpatikusa, bazalni metabolizam,itd. Mehanizmi koji se aktiviraju kada je homeoterm izložen opasnosti od pregrevanja ili rashlađivanja su refleksne prirode, a pokreće ih i kontroliše centar za termoregulaciju u hipotalamusu. Centar se sastoji iz dva dela: jednog koji kontroliše odavanje toplote iz orgnizma i drugog koji reguliše proces proizvodnje u organizmu. Informacija centra o promeni temperature omogućena je posredstvom perifernih i centralnih termoceptora. Periferni termoceptori su smešteni na površini tela (u koži), a centralni se nalaze u hipotalamusu, a o stanju telesne temperature obaveštavaju se preko krvi. U zavisnosti od toplotnog balansa u organizmu dolazi do aktiviranja mehanizama za očuvanja temperature tela konstantnom. Aktiviranje jedne grupe mehanizama i reakcija dovodi do povećanog odavanja toplote i smanjivanja njenog stvaranja, dok uključenje druge grupe mehanizama smanjuje obim odavanja toplote, a povećava njeno stvaranje. Mehanizmi koji učestvuju u regulaciji telesne temperature su prikazani u tabeli 3.2. Tabela 3.2: Mehanizmi za regulaciju telesne temperature Mehanizmi koje aktivira hladnoća Mehanizmi koje aktivira toplota Povećavaju stvaranje toplote Smanjuju gubitak toplote Povećavaju gubitak toplote Smanjuju stvaranje toplote Drhtanje Vazokonstrikcija u koži Vazodilatacija u koži Anoreksija Glad Stiskanje Znojenje Apatija Povećan apetit Ježenje Pojačano disanje i dahtanje Povećana voljna mišićna aktivnost Pojačano lučenje kateholamina Grupisanje Nakostrešenje dlake i perja Kaljužanje Navlaživanje tela 54

64 3.1 Termogenetski napor Kada se homeoterm nađe u sredini u kojoj je temperatura ekstremno niža od telesne i kada postoji opasnost od rashlađivanja usled znatnog odavanja (gubitka) toplote u okolinu, organizam snažno podstiče termogenezu u cilju uspostavljanja ravnoteže sa termolizom. Dakle, on ispoljava termogenetski napor da bi održao konstantnu telesnu temperaturu. Uspešnost odbrane od rashlađivanja (hipotermije) zavisi od: stanja energetskih rezervi organizma, stanja i efikasnosti rada i reagovanja centra za termoregulaciju i efikasnosti snabdevanja kiseonikom i eliminacije ugljendioksida. ZADATAK: Pratiti napor organizma za održavanje telesne temperature u uslovima ektremno niske temperature okoline i to menjajući faktore od kojih zavisi termogenetski napor. MATERIJAL: Tri pacova, 3 tegle (2-3L), termometar, led, veća plastična posuda sa vodom i ledom, etar. IZVOĐENJE: Pre početka rashlađivanja pacovima izmeriti početnu (kontrolnu) rektalnu temperaturu. U sve 3 tegle usuti usitnjenog leda i preliti malom količinom vode. Pacove postaviti u tegle po sledećem planu: 1. pacov: Osim postavljanja u teglu ne poduzimati nikakav drugi tretman, teglu poklopiti poklopcem sa dovoljnim brojem rupa da bi ovaj pacov imao na raspolaganju dovoljnu količinu vazduha; temperaturu meriti svakih 15 minuta. 2. pacov: Izvršiti laganu narkozu eterom, staviti ga u teglu; temperaturu meriti svakih 15 minuta. 3. pacov: Teglu sa pacovom dobro zatvoriri šlifovanim poklopcem kako bi se tokom vremena u toj tegli stvorili hipoksični uslovi (smanjuje se količina kiseonika, a povećava CO 2 ); rektalnu temperaturu prvi put meriti tek nakon 45 minuta (da se ne naruše hipoksični uslovi). Nakon minuta, trećeg pacova (koji je bio u hipoksičnim uslovima) rashladiti do oko C i uvesti ga u stanje kliničke smrti (prestanak disnja i rada srca). Kada se konstatuje klinička smrt, odmah treba započeti proces reanimacije i to prvo postepenim zagrevanjem regije srca (smotuljci vate natopljeni toplom vodom) i veštačkim disanjem (može poslužiti obična pumpica sa merila pritiska), a tek kada se povrate funkcija srca i disnja osušiti životinju i postepeno je zagrejavati. Pojava drhtanja tokom reanimacije predstavlja povoljan prognostički znak. 55

65 Skicirati postupak sa modela: Zabeležiti dobijene rezultate (u tabelu 3.3) i zapažanja. PROSTOR ZA RAD: Tabela 3.3: Termogenetski napor pacova Pacov Telesna temperatura ( C) 15 min 30 min 45 min 60 min 75 min 90 min ZAPAŽANJA I ZAKLJUČAK: 56

66 4.0 Fiziologija endokrinog sistema Regulacije koje se ostvaruju posredstvom tkivnih tečnosti (krvi) se nazivaju humoralne regulacije. U kategoriju humoralnih faktora regulacije spadaju sve supstancije, bez obzira da li su egzogenog ili endogenog porekla, pod sledećim uslovima: deluju na ćelijskom nivou, do ćelija dospevaju nošene krvlju, ćelijama donose "poruku" da prekinu, otpočnu ili promene intenzitet životnih procesa. Hormoni predstavljaju faktor humoralne regulacije. Sam momenat pojavljivanja hormona, u procesu evolucije, je nejasan. Javljaju se pre endokrinih žlezda. Hormoni su specifične supstance koje izlučuju manje ili više specijalizovane ćelije, a dospevši do određenih ciljnih ćelija ili tkiva, na manjoj ili većoj udaljenosti od mesta njihovog stvaranja, menjaju intenzitet već postojećih metaboličkih procesa. Pojam hormon ima mnogo šire značenje od pojma endokrini hormone. Uloga hormona je da regulišu brzinu specifičnih procesa - već postojećih reakcija posredovanih enzimima. Doprinos hormona ukupnoj homeostazi organizma veoma je značajan zato što deluju na: metaboličke reakcije, diferencijaciju ćelija, procese rasta i razvoja, procese sazrevanja i starenja. Hormoni svoje dejstvo ostvaruju preko unutarćelijskog posredničkog sistema regulacija i sa njim čine funkcionalno jedinstvo. Hormoni se mogu klasifikovati na više načina. Podela hormona prema hemijskoj strukturi: Proteinski hormoni različite strukture (proteini, glikoproteini, peptidi): hormoni adenohipofize, hormoni neurohipofize, hormoni paratireoidee, hormoni endokrinog pankreasa, neurohormoni i hormoni digestivnog trakta. Svi proteinski hormone su hidrofilni, imaju veliku molekulsku masu pa ne mogu prolaziti kroz ćeljsku membranu već se vezuju za receptore u ćelijskoj membrani. 57

67 Derivati aminokiselina: kateholamini (proizvode ih ćelije srži nadbubrega i paraganglija) i hormoni tireoidee. Steroidni hormoni: hormoni polnih žlezda i hormoni kore nadbubrega. Tireoidni i steroidni hormoni su liposolubilni i mogu prolaziti kroz ćelijsku membranu. Eikosanoidi: prostaglandini, prostaciklin, tromboksan i leukotrijeni. Derivati više nezasićenih masnih kiselina (arahidonska kiselina) imaju hormonske osobine - deluju lokalno. Podela hormona prema poreklu: endokrini hormoni, tkivni hormoni, hormoni digestivnog trakta i neurohormoni. Podela hormona prema mestu delovanja: endokrini (deluju na većoj udaljenosti od mesta izlučivanja), parakrini (deluju na manjoj udaljenosti na susedne ćelije) i autokrini (deluju na same ćelije koje ih izlučuju). U principu, hormoni se deponuju u malim količinama u odnosu na ukupnu dnevnu proizvodnju. Izuzetak od ovog pravila čini tireoidna žlijezda. Proteinski hormoni se privremeno deponuju u ćelijama u vidu sekretornih granula. U transportu hormona često posreduju proteinski nosači. Nakon što izvedu svoje dejstvo, hormoni se najčešće inaktiviraju u ciljnom tkivu, ali i u drugim organima (jetra, bubrezi, pluća). Izlučivanje hormona po pravilu nije stalno već se po vremenu i intenzitetu usklađuje se s potrebama organizma. Osnovni princip regulacije je mehanizam negativne povratne sprege koji se 58

68 može ostvarivati na više nivoa. Hormoni ostvaruju svoje delovanje uglavnom tako što se vezuju za visokoafinitetne specifične receptore (molekule proteina) koji mogu biti locirani bilo na plazmatskoj membrani ili u unutrašnjosti ćelije. Svoje regulacijsko dejstvo hormoni ostvaruju na različite načine: promenom intenziteta transporta neke supstancije kroz ćelijsku membranu, produkcijom nekog medijatora ("drugog glasnika") ili aktivacijom gena. Opšte funkcije hormona su: regulacija metabolizma, regulacija rasta i razvoja (morfogeneza), razvoj reproduktivnih organa i regulacija reprodukcije, kontrola ponašanja životinja, reagovanje i adaptacija organizma na promene i različita delovanja iz spoljašnje i unutrašnje sredine, endokrini (hormonski) sistem je osnovni regulator proizvodnih sposobnosti domaćih životinja. Moderno shvatanje endokrinog sistema podrazumeva izučavanje endokrinih funkcija u okviru integrisanog neuroendokrinog sistema kojeg kod sisara čine: nervne ćelije u centralnom i perifernom nervnom sistemu, endokrine ćelije klasičnih endokrinih žlezda i pojedinačne neuroendokrine ćelije u sluznici digestivnog trakta. Pojedinačne endokrine žlezde ili pojedinačne endokrine ćelije funkcionišu uz veoma prisno sadejstvo delova centralnog, perifernog i vegetativnog nervnog sistema. Posebna uloga u integrisanju regulatornih procesa pripada hipotalamusu. Hipotalamus kod kičmenjaka fizički i funkcionalno povezuje endokrini i nervni sistem i služi kao glavni regulator aktivnosti pojedinih endokrinih žlezda. 4.1 Fiziologija endokrinog pankreasa Endokrina funkcija pankreasa ogleda se u radu endokrinih ćelija grupisanih u tzv. Langerhansova ostrvca. Ova ostrvca su razbacana po egzokrinom pankreasu, a najviše ih ima u repu pankreasa. Ova ostrvca se satoje iz tri tipa ćelija: alfa, beta i delta. Beta ćelije 59

69 izlučuju hormon insulin (lat. insula - ostrvo), dok alfa izlučuju glukagon. Insulin i glukagon su sa antagonističkim dejstvom: dok insulin smanjuje koncentraciju glukoze u krvi, glukagon je povećava. Delta ćelije luče hormon somatostatin koji ihibira sekreciju ostalih hormona. Povećana koncentracija glukoze (šećera) u krvi dovodi do pojačanog lučenja insulina pa on smanjuje nivo šećera u krvi. Kada se nivo glukoze smanji na normalu, smanjuje se i lučenje insulina. Međutim, kada se insulin nedovoljno izlučuje ili postoji rezistencija na njega dolazi do nagomilavanja glukoze u krvi, tj. hiperglikemije što dovodi do nastanka šećerne bolesti (diabetes mellitus). Insulin su izolovali 1921./1922. godine Frederik Banting i Čarls Best. Hormon insulin obezbeđuje rast i obnavljanje ćelija i usmerava energiju metaboličkim putevima celog organizma. Nastaje u naročitim ćelijama (beta ćelije), u ostrvcima hormonski aktivnih ćelija pankreasa (Langerhansova ostrvca). Izlučivanje insulina podstiče glukoza, a insulin smanjuje sadržaj glukoze u krvi (glikemiju), ukoliko je to potrebno. Glikoza pomoću insulina prelazi u ćelije raznih tkiva i tamo se metaboliše ili se skladišti za kasnije potrebe. Kada je šećer u krvi nizak (za vreme obroka, a naročito pri gladovanju), insulin se gotovo ne izlučuje. Insulin naročito podstiče gomilanje energetskih zaliha i sprečava njihovu razgradnju. Kako visok šećer u krvi podstiče izlučivanje insulina, u krvi ga ima više nakon svakog obroka mešovite hrane sa ugljenim hidratima. Insulin deluje ne samo na glukozu, već i na druge hranljive materije (belančevine, masti) koje hrana sadrži. Šećer u krvi precizno ukazuje na potrebu organizma za energijom. Kada hrane ima dovoljno, dovoljno ima i glukoze u krvi i izlučivanje insulina je neprestano povećano. Uz njegovu pomoć, višak energije, koji stiže sa hranom, taloži se u tkivima (depoi glikogena, masno tkivo). Ako hrane nema dovoljno, šećer u krvi opadne. Preterani pad šećera može da poremeti rad mozga (tada glukoza mora stalno da stiže iz energetskih zaliha), zato je održavanje minimalnog nivoa šećera u krvi od životnog značaja. Između obroka, glikoza se obnavlja iz glikogena iz jetre. Nizak šećer u krvi ne podstiče izlučivanje insulina, a mala količina insulina, zatim, omogućava razgrađivanje zaliha. Međutim, u fiziološkim uslovima, nikada ne nastupa preterano razgrađivanje, čiji bi metaboliti mogli da škode organizmu. Održavanje ravnoteže između insulina i glukoze je veoma precizno. Samo nesmetano funkcionisanje te povratne veze obezbeđuje održavanje energetske ravnoteže i pravilnu ishranjenost organizma. Insulin se koristi i kao lek za regulisanje nivoa šećera u krvi. Glukagon je polipeptidni hormon koga luče alfa ćelije endokrinog dela pankreasa. Osnovno dejstvo ovog hormona je povećanje koncentracije glukoze u krvi (hiperglikemisjsko dejstvo). Glukagon je po tome hormon suprotnog dejstva (antagonista) insulinu. On izizaziva još i razgradnju masti (lipoltički efekat) i povećanje koncentracije slobodnih masnih kiselina u krvi. Povećanje lučenja glukagona je praćeno padom lučenja insulina i obrnuto. Jedan od najjačih stimulusa za oslobađanje glukagona je pad koncentracije glukoze u krvi (hipoglikemija). Kad se koncentracije glukoze poveća slabi lučenje glukagona, a poveća se insulina. Na taj način se uzajamnim dejstom glukagona i insulina održava stalna koncentacija glukoze u krvi. 60

70 Hormoni stresa: adrenalin, kortizol i hormon rasta povećavaju lučenje glukagona. Takođe, hormoni vazopresin i endorfini stimulišu oslobađanje ovog hormona. Adrenalin zajedno sa noradrenalinom kao deo simpatičkog sistema takođe može izazvati povećano lučenje kortizola. Hormoni insulin i somatostatin smanjuju oslobađanje glukagona. Osnovni efekat glukagona je povećanje koncentracije glukoze u krvi tj. hiperglikemijki efekat. Najveći deo dejstva glukagon ostvaruje u jetri. Ćelije pankreasa luče glikagon direktno u krv, koja portalnim krvotokom prvo dospeva u jetru. Jetra sadrži velike koncentracije razervnog šećera, glikogena, koji predstavlja depo glukoze koja se oslobađa njegovom razgradnjom. Glukagon ostvaruje dejstvo vezivanjem za receptore na ćelijama jetre, hepatocitima. Razlaganjem glikogena prvo nastaje glukozo-1-fosfat, koji se zatim prevodi u glukozo-6-fosfat. Aktiviranjem enzima glukozo-6-fosfataza (specifičan enzim za ćelije jetre), pod čijim dejstvom nastaje običan molekul glukoze, koji može napustiti ćelije jetre i otići u krvotok. Pored procesa razgradnje glikogena, glukoza može nastati i procesima stvaranja glukoze iz drugih supstanci - glukoneogeneza. Glukoneogeneza se takođe povećava pod uticajem hormona glukagona. U ćelijama masnog tkiva, povećava se razgradnja masti i oslobađanje slobodnih masnih kiselina u cirkulaciju. Transport masnih kiselina u mitohondrije ćelija, gde se vrši sagorevanje masti putem β oksidacije, je takođe povećano. Takođe, stimuliše se i stvaranje acetonskih tela iz masnih kiselina preko acetil koenzima A. Somatostatin je polipeptidni hormon koga luče delta ćelije endokrinog pankreasa, hipotalamus kao i neke neuroendokrine ćelije gastrointestinalnog trakta. Somatostatin inhibiše lučenje drugih hormona: insulina, glukagona, hormona rasta, gastrina, sekretina i tireotropnog hormona itd. Takođe inhibiše kontrakciju žučne kese i lučenje žuči. Deluje kao lokalni hormon, sa parakrinim dejstovom (deluje na okolne ćelije). Ispitivanje funkcionalnog stanja endokrinog pankreasa je vrlo bitno, kako u humanoj tako i u veterinarskoj medicini, u cilju dijagnostikovanja šećerne bolesti (diabetes mellitus). Apsolutni ili relativni manjak insulina rezultira hiperglikemijom, a kada nivo glukoze u krvi pređe bubrežni prag reapsorpcije glukoze dolazi do pojave glukozurije. Glukozurija uzrokuje osmotsku diurezu što dovodi do dehidracije i polidipsije (povećan unos vode). Gubitak glukoze u urinu dovodi do gubitka energije i zbog toga i do gubitka telesne mase, pa se javlja polifagija (povećan unos hrane). Dijabetes je stanje potpunog izgladnjivanja organizma zbog nemogućnosti korištenja glukoze, pa se počinju koristiti drugi dostupni izvori energije. Ispitivanje funkcionalnog stanja pankreasa se može vršiti kontinuiranim praćenjem nivoa glukoze u krvi i mokraći. Međutim, bitno je napomenuti da prisutstvo hiperglikemije, takođe, prati mnoga druga stanja osim šećerne bolesti. Potrebno je istaknuti i pojavu tzv. stresne hiperglikemije kod mačaka (koncentracija glukoze u krvi do 24 mmol/l). Takav oblik hiperglikemije se javlja kod velikog broja mačaka u stresu, a intervencija veterinara i uzimanje uzorka krvi predstavlja izraziti stres za mačke. 61

71 Međutim, stresna hiperglikemija kod mačaka je kratkotrajna i ne rezultira glukozurijom. Glukozurija, takođe, prati i neke druge bolesti. Postoji mogućnost i pojave granične hiperglikemije koja se obično otkrije rutinskim laboratorijskim testiranjem. Psi kod kojih se koncentracija glukoze u krvi stalno kreće između 6,66 i 11,1 mmol/l predstavljaju primer ovog stanja, jer pri tim koncentracijama glukoza ne prelazi bubrežni prag, pa se ne može naći u mokraći. U ovakvim slučajevima je potrebno izvršiti i test opterećenja glukozom (praćenje koncentracije glukoze nakon opterećenja organizma većom količinom glukoze). ZADATAK: Objasniti kako je na rezultate dobijene u vežbama ispitivanja koncentracije glukoze u krvnoj plazmi i utvrđivanja prisustva glukoze u mokraći moglo uticati funkcionalno stanje endokrinog pankreasa. PROSTOR ZA RAD: 4.2 Endokrina regulacija kalcemije Evolucija živog sveta i premeštanje iz vodenog na kopneni način života zahtevala je adaptaciju organizama na okruženje siromašno kalcijumom. Zbog toga se kod viših sisara i razvijaju brojni homeostatski mehanizmi koji održavaju plazma nivoe kalcijuma u vrlo uskim granicama. Istovremeno, nije slučajno da je ovaj katjon ostao osnovni gradivni mineral i mineral neophodan za odvijanje mnogih fizioloških procesa (strukturna i metabolička uloga). U plazmi se kalcijum nalazi u tri osnovna oblika: jonizovanom (oko 45%), vezanom za proteine plazme (oko 45%) i u kompleksu sa malim difuzibilnim ligandima: citrat, laktat, fosfat, bikarbonat i drugi (oko 10%), pri cemu jonizovana frakcija predstavlja fiziološki aktivan oblik koji se nalazi u dinamičkoj ravnoteži sa ostalim frakcijama. Koncentracija kalcijuma u ćelijama je izuzetno niska ali ova frakcija igra vitalnu ulogu u kontroli funkcija svih celija. Održavanje bilansa kalcijuma je vrlo kompleksan proces u koji su uključene kosti, digestivni sistem i bubrezi. Parathormon (PTH), kalcitriol, i u manjoj meri kalcitonin i neki steroidni hormoni (polni hormoni i glukokortikoidi) igraju direktnu ili indirektnu ulogu u održavanju plazma nivoa kalcijuma odnosno ukupnog bilansa ovog minerala u organizmu. 62

72 Paratiroidni hormon (PTH, parathormon, paratirin) luče paratiroidne ćelije paraštitaste žlezde kao polipeptid. PTH deluje tako što povišava koncentraciju kalcijuma u krvi. Na lučenje PTH stimulativno deluju sniženi nivo serumskog kalcijuma, blago povišenje novoa serumskog magnezijuma i povišenje nivoa serumskog fosfata (povećanje koncentracije fosfata uzrokuje formiranje kalcijum fosfata). Na lučenje PTH inhibitorno deluju povišeni nivo serumskog kalcijuma i jako sniženje serumskog magnezijuma. Kalcitriol (1,25-dihidroksiholekalciferol, 1,25-dihidroksivitamin D 3 ) je hormonski aktivna forma vitamina D sa tri hidroksilne grupe. On povišava nivo kalcijuma u krvi putem povećanja unosa kalcijuma iz creva u krv i mogućeg povećanja otpuštanja kalcijuma u krv iz kostiju. Kalcitonin je peptidni hormon, koji se proizvodi u perafolikularnim ćelijama (Cćelijama) štitaste žlezde i ima ulogu u regulaciji koncentracije kalcijuma u krvi. To je polipeptid koji se najpre se sintetiše kao znatno veći molukul, prethodnik ovom hormonu ili prohormon iz koga se daljom modifikacijom dobija kalcitonin. On sprečava resorpciju kalcijuma iz kostiju tako što inhibiše ćelije, osteoklaste, koje razgrađuju kosti i na taj način se smanjuje koncentracija kalcijuma u krvi. Ima suprotno dejstvo parathormonu. Kosti su mahom sastavljene iz soli kalcijuma, u manjoj meri magnezujuma i fosfata, tako da se njihovom razgradnjom u krv oslobađaju pomenute supstance. Kalcitonin takođe u manjoj meri smanjuje respsorciju kalcijuma u bubrežnim tubulima i crevu. Hiperkalcemija (povećana koncentracija kalcijuma u krvi) stimuliše, a hipokalcemija (smanjena koncentracija kalcijuma u krvi) inhibiše sekreciju ovog hormona. ZADATAK: Objasniti kako je na rezultat dobijen u vežbi ispitivanja koncentracije kalcijuma u krvnoj plazmi mogao uticati endokrini sistem. PROSTOR ZA RAD: 63

73 5.0 Fiziologija centralnog nervnog sistema (CNS) Osnovni zadaci regulatornih procesa u organizmu su: međusobno usklađivanje pojedinih faza fizioloških procesa (po redosledu i po intenzitetu) u cilju obezbeđenja skladnog funkcionisanja celine složenog procesa koji se jednim imenom zove život, usklađivanje složenih životnih funkcija s karakteristikama sredine u kojoj se odvijaju, odnosno održavanje homeostaze (intracelularne i ekstracelularne), usklađivanje razmene materija i energije sa okolinom prema aktualnim potrebama i reprodukcija i održavanje vrste. Pošto se život i životni procesi odvijaju u veoma promenjivoj sredini, životinje i čovek moraju posedovati adaptivne mehanizme pomoću kojih će na promene okoline reagovati dosta brzo, efikasno i svrsishodno. Integracija i koordinacija funkcija i adaptivnih reakcija je zadatak za to posebno usavršenih sistema organizma: nervnog, endokrinog i imunog sistema. Funkcije ova tri sistema su međusobno isprepletane, svaki od njih utiče i moduliše aktivnost drugoga, a svi zajedno obezbeđuju harmoničan rad čitavog organizma. Prvenstveni zadatak nervnog sistema je u regulaciji brzih promena u organizmu (pojačanje rada srca, povišenje krvnog pritiska, mišićne kontrakcije i dr.). Suprotno tome, endokrini i imuni sistem su sporiji sistemi. Odgovori i efekti nervnog sistema se vremenski mere u sekundama, a reagovanje endokrinog i imunog sistema nastaje tek posle više minuta, sati ili dana, jer oni regulišu metaboličke i homeostatske procese, odnosno zaštitu organizma Sa funkcionalnog stanovištva, nervni sistem se sastoji iz tri dela: senzitivni, motorni i analizatorski (asocijacijski ili kompijuterski). Prva dva mogu da se podele na periferni (nervi) i centralni (kičmena moždina, moždano stablo, mali i veliki mozak), mada su sve podele didaktičkog karaktera radi jasnijeg izlaganja, jer nervni sistem funkcioniše kao jedna jedinstvena celina. Refleks predstavlja odgovor (reakciju) efektora na specifično draženje određenih receptora. U suštini, refleks je automatsko reagovanje efektora (npr. reakcija na gubitak ravnoteže). Refleksi imaju prostorni odnos između mesta nadražaja i odgovarajućih mišića (efektora) koji se tada kontrahuju. Ta anatomsko-funkcionalna jedinica (celina) refleksa se označava kao refleksni luk koji se sastoji iz najmanje pet delova: 1. senzitivni receptor (nalaze se u koži, mišićima ili čulnim organima), koji je specijaliziran za primanje specifičnih nadražaja i transformiše ih u energiju nervnog impulsa, 2. senzitivni ili aferentni neuron provodi impuls od receptora do CNS u koji pretežno ulazi putem dorzalnih korenova kičmene moždine, 64

74 3. nervni centar (centralna sinapsa) se nalazi u sivoj masi CNS i predstavlja mesto funkcionalnog kontakta aferentnog i eferentnog neurona, 4. eferentni (efektorni, motorni) neuroni polaze iz nervnih centara, a telo neurona je smešteno u sivoj masi CNS (ventralni rogovi kičmene moždine) i provode impulse do efektora i 5. efektor (izvršni organ) može biti mišićna ili žlezdana ćelija i njegova aktivacija predstavlja, ustvari, refleksni odgovor. Refleksni luk, koji se sastoji samo iz ovih pet elemenata, tj. ima samo dva neurona i samo jednu sinapsu, naziva se monosinaptički refleksni luk (zastupljen je u organizmu sisara samo kod miotaktičkog refleksa refleks na istezanje, koji je značajan u regulaciji tonusa mišića, održavanju položaja tela i dr.). Međutim, u većini slučajeva između aferentnog (senzitivnog) i eferentnog (motornog) neurona u CNS umetnut je veći broj interneurona polisinaptički refleksni luk. Poznavanje i ispitivanje refleksa ima veliki klinički značaj jer refleksi ukazuju na eventualne promene u građi i funkcionisanju elemenata refleksnog luka. Podela refleksa: Obzirom na broj sinapsi refleksi se mogu podeliti na proste (monosinaptičke) i složene (polisinaptičke) reflekse. Obzirom na lokalizaciju centralne sinapse refleksi mogu biti spinalni (sinapsa u kičmenoj moždini), bulbarni (sinapsa u produženoj moždini), mezencefalički (sinapsa u mezencefalonu), hipotalamusni (sinapsa u hipotalamusu), kortikalni (sinapsa u korteksu, itd. Na osnovu položaja receptora refleksi mogu biti eksteroreceptivni (receptor je na površini tela u koži ili sluzokoži) ili interoreceptivni (receptor je u dubljim tkivima ili organu). Na osnovu tipa receptora: Mehanoreceptorni refleksi ovde spadaju receptori kože, slobodni nervni završeci oko korenova dlake i receptori dubokih unutrašnjih organa, refleksna regulacija krvnog pritiska baroreceptori u aorti i sinusu caroticusu, kinestetički receptori mišićno vreteno, Golgijevi tetivni receptori i nervni završeci u zglobnim kapsulama, receptori na istezanje u plućima, receptori specijalizovanih čula: ćelije Kortijevog organa u pužu, vestibularni receptori za ravnotežu, itd.. Hemoreceptorni refleksi ovde spadaju receptori čula: ćelije gustativnih telašaca i ćelije olfaktivne sluzokože, receptori krvnih sudova koji reaguju na promene koncentracije CO 2 receptorne ćelije u glomusu aorticumu i glomusu caroticumu, inspiratornom centru, receptori u hipotalamusu koji reaguju na promene koncentracije glukoze, aminokiselina i masnih kiselina. Termoreceptorni refleksi receptori su u koži i sluzokoži jezika: za toplo i hladno. 65

75 Elektromagnetski refleksi to su receptori mrežnjače oka čepići i štapići. Nocioceptorni refleksi receptori za bol. To su nervni završeci tankih senzitivnih nervnih vlakana koji se nalaze u koži i unutrašnjim organima. Po brzini refleksnog odgovora: brzi refleksi sa debelim mijelinskim neuronima i spori refleksi sa tankim amijelinskim nervnim vlaknima. Na osnovu tipa efektora refleksi mogu biti motorni (efektor je mišić), sekretorni (efektor je žlezda), vazomotorni (efektor je krvni sud, odnosno glatka mišićna vlakna u njegovom zidu). Prema načinu nastanka: bezuslovni i uslovni refleksi. Prema karakteru eferentnih puteva: vegetativni i somatski refleksi. 5.1 Ispitivanje nekih klinički važnijih refleksa kod sisara Refleksi se ispituju kao obavezan deo neurološkog pregleda i to posebno u humanoj medicini, mada je ispitivanje refleksa zastupljeno i u veterinarskoj praksi. Polazeći od toga da su refleksi odgovori efektora na nadražaje koji dolaze iz spoljašnje ili unutrašnje sredine putem refleksnog luka i da su ovi odgovori uvek isti na isti nadražaj koji je primenjen na iste receptore, onda se može shvatiti značaj ispitivanja refleksa i sticanja određenog iskustva u praktičnom radu pri proceni gore navedenih promena. Ovo ispitivanje daje dragocene podatke o stanju nervnog sistema, a termini kojima se opisuje refleksni odgovor organizma su sledeći: normorefleksija odgovor orgfanizma u fiziološkim granicama, niperrefleksija pojačani refleksi, niporefleksija oslabljeni refleksi i arefleksija ugašeni refleksi. 66

76 5.1.1 Patelarni refleks (refleks kvadricepsa) Ovaj refleks je refleks duboke senzitivnosti i nije promenjiv. Adekvatan odgovor na nadražaj je kratkotrajna kontrakcija m quadricepsa. Refleksni luk se sastoji od sledećih komponenti: receptora (mišićno vreteno u m. quadricepsu), aferentno vlakno (n. femoralis), centra (sinapsa je speštena u drugom do četvrtog segmenta lumbalnog dela kičmene moždine), eferentnog vlakna (n. femoralisa) i efektora (m. quadricepsa). ZADATAK: Ispitati patelarni refleks kod čoveka i psa. MATERIJAL: Neurološki (perkusioni) čekić (slika 5.1). Slika 5.1: Neurološki (perkusioni) čekić IZVOĐENJE: Čoveka postaviti da sedi na uzdignutu površinu (noge vise) ili sa prekrštenim nogama. Psa postaviti da leži na bok. Mišići treba da budu opušteni. Neurološkim čekićem naglo kucnuti po tetivi kvadricepsa ispod čašice kolena pri čemu dolazi do opružanja noge, tj. ekstenzije potkolenice. Zabeležiti zapažanja. PROSTOR ZA RAD: 67

77 5.1.2 Refleks Ahilove tetive Adekvatan odgovor na nadražaj je plantarna fleksija (pomeranje unazad stopala). Refleksni luk se sastoji od sledećih komponenti: receptora (mišićno vreteno u m. gastrocnemiusu), aferentno vlakno (n. tibialis), centra (sinapsa je speštena u L5, S1 i S2 segmenta kičmene moždine), eferentnog vlakna (n. tibialis) i efektora (m. quadricepsa). ZADATAK: Ispitati refleks Ahilove tetive kod čoveka i psa. MATERIJAL: Neurološki (perkusioni) čekić. IZVOĐENJE: Čovek kleči na mekoj podlozi na stolici ili sedi na uzdignutoj površini. Pas leži na boku. Ispitivač perkusionim čekićem lagano udara po Ahilovoj tetivi, dok drugom rukom može držati stopalo kako bi bolje registrovao jačinu refleksne reakcije. Zabeležiti zapažanja. PROSTOR ZA RAD: Refleksi oka Na ovom mestu će biti opisana dva refleksa koji spadaju u različite grupe. Jedan je kornealni refleks koji spada u grupu površinskih refleksa, a drugi je refleks pupile (zenice) koji spada u grupu vegetativnih refleksa Kornealni refleks Fiziološka uloga ovog refleksa je u zaštiti oka od upada stranih čestica, insekata i sl. ili u zaštiti od mehaničkih oštećenja. Ispoljava se u zatvaranju očnih kapaka ili treptanju do otklanjanja stranih čestica. Isto tako, koristi se u klinici za procenu dubine narkoze kod životinja i ljudi. Predoziranje narkoticima dovodi do slabljenja ili potpunog gubitka ovog refleksa, što signalizira opasnost, obzirom na to da se centar nalazi u produženoj moždini gde se nalaze i centri za regulisanje vitalnih funkcija (disanje, rad srca). 68

78 Refleksni luk se sastoji od sledećih komponenti: receptora (mehanoreceptori u rožnjači), aferentno vlakno (n. ophtalmicus, grana n. trigeminusa), centra (produžena moždina), eferentnog vlakna (n. facialis) i efektora (m. orbicularis oculi i m. levator palpebrae). ZADATAK: Ispitati kornealni refleks kod čoveka. MATERIJAL: Zamotuljak vate ili štapić sa vatom na krajevima. IZVOĐENJE: Zamotuljkom vate lagano dodirnuti rožnjaču oka sa strane, pri čemu nastaje odbrambena reakcija zatvarannje očnih kapaka, odnosno zatvaranje oka. Zabeležiti zapažanja. PROSTOR ZA RAD: Pupilarni refleks U zavisnosti od količine svetlosti koja ulazi u oko ovaj refleks će reagovati sužavanjem (mioza) ili širenjem midrijaza) zenice. Refleks predstavlja»automatsku blendu«oka. Jača svetlost izaziva miozu, a slabiji intenzitet svetlosti izaziva midrijazu. Na taj način se kontroliše količina svetlosti koja pada na fotoreceptore mrežnjače. Receptori pupilarnog refleksa su fotoreceptori (čepići i štapići) mrežnjače (retine), a impulsi odlaze u centar vlaknima n. opticusa. Centar je smešten u subkortikalnom centru čula vida (corpora quadrigemina i corpora genucilata lateralia u talamusu). Eferentni put i efektor zavise od toga kolika je jačina svetlosti stigla do fotoreceptora. Jači intenzitet svetla dovodi do mioze, što je posledica kontrakcije m. sphinctera pupilae, a impuls je stigao preko n. oculomotoriusa (parasimpatikus). Midrijaza je rezultat kontrakcije m. dilatatora pupilae, a inervisan je simpatikusnim nervnim vlaknima. Atropin, koji blokira acetilholinske muskarinske receptore, izaziva midrijazu zbog preovladavanja tonusa m. dilatatora pupilae. Vlakna n. opticusa se ukrštaju u hijazmi i zbog toga se pri osvetljenju jednog oka sužava zenica, ne samo tog oka (direktna reakcija), već i drugog oka (indirektna, konsenzualna reakcija) jer se impulsi prenose na oba jedra n. oculomotoriusa. 69

79 ZADATAK: Ispitati pupilarni refleks kod čoveka. MATERIJAL: Baterijska lampa. IZVOĐENJE: U delimično zamračenoj prostoriji dlanom prekriti jedno oko ispitanika, a drugo oko osvetliti baterijskom lampom zapaža se mioza. Konsenzualnu reakcija se ispituje tako što ispitivač postavlja dlan okomito između oba oka ispitanika, a zatim naglo osvetli jedno oko i posmatra reakciju drugog oka dolazi do mioze, iako to oko nije direktno osvetljeno. Suprotno tome, ako se u osvetljenoj prostoriji dlanom ruke zatvori jedno oko, na drugom oku će doći do širenja zenice midrijaza. Zabeležiti zapažanja. PROSTOR ZA RAD: 5.2 Refleksi spinalne žabe Kičmena moždina je sedište nervnih centara (sinapsi) refleksa čiji se receptori nalaze u koži, skeletnoj muskulaturi trupa i ekstremiteta i u unutrašnjim organima. Centri se nalaze u sivoj masi kičmene moždine koja je smeštena centralno i na poprečnom preseku ima oblik leptira raširenih krila. Sastoji se iz tela i dendrita motornih neurona, nervnih završetaka senzornih neurona, brojnih interneurona i glija ćelija. Pored somatskih spinalnih centara, u kičmenoj moždini se nalaze i neki vegetativni centri, kao što su centri za kontrolu refleksa mikcije i defekacije. Spinalni centri su pod kontrolom viših struktura CNS, odakle do njih dolaze facilitacijski (olakšavajući, stimulacijski) i inhibitorni impulsi Narkoza žabe Narkoza omogućava lakši rad i manipulaciju sa laboratorijskim životinjama. Takođe, humani rad sa laboratorijskim životinjama je jedan od osnovnih postulata u radu sa njima, a ujedno predstavlja i moralnu i zakonsku obavezu. Ova procedura je neophodna u cilju sprečavanja izlaganja laboratorijskih životinja nepotrebnoj patnji, bolu i stresu. ZADATAK: Izvršiti narkozu žabe. 70

80 MATERIJAL: Žaba, etar, vata, tegla, 10% rastvor uretana, špric sa iglom, laboratorijski sat. IZVOĐENJE: Staviti žabu u običnu staklenu teglu, ubaciti vatu dobro natopljenu etrom, a zatim poklopiti. Kada je žaba postala nepokretna (adinamija ekstremiteta) znači da je narkotisana. Narkoza se može izvesti i ubrizgavanjem 1ml 10% rastvora uretana u dorzalnu limfnu kesu. Zabeležiti zapažanja i konstatovati razlike u vremenu potrebnom da se postigne narkoza pomoću etra i pomoću uretana. Skicirati postupak sa modela: PROSTOR ZA RAD: Spinalni šok Ispitivanje funkcije kičmene moždine vrši se na životinjama kod kojih je presecanjem nervnog stabla kičmena moždina odvojena od ostalih (viših) delova CNS. To je najjednostavnije izvesti na preparatu spinalne odnosno dekapitovane žabe. ZADATAK: Utvrditi spinalni šok žabe MATERIJAL: Žaba, pribor za narkozu, stativ sa držačem za donju vilicu žabe, makaze, pinceta, laboratorijski sat. 71

81 IZVOĐENJE: Žabu uvesti u narkozu. Izvršiti dekapitaciju žabe odsecanjem makazama gornje vilice nekoliko milimetara iza očiju. Na ovaj način su odstranjeni mozak i produžena moždina i odvojeni od kičmene moždine. Uključiti laboratorijski sat u cilju određivanja dužine trajanja spinalnog šoka. Skicirati postupak sa modela: Posebnim držačem obuhvatiti donju vilicu i fiksirati u stativ tako da žaba visi. Pincetom štipkati prste stopala i pratiti reaktivnost. Zapaziti da je žaba mlitava i ne reaguje na mehaničke nadražaje ona se nalazi u spinalnom šoku koji traje od 5 do 10 minuta. U toku trajanja spinalnog šoka postoji potpuna paraliza, gubitak tonusa muskulature, kao i gašenje refleksa što je posledica isključenja facilitacijskih (ekscitatornih) dejstava iz viših delova CNS. Posle 5 do 10 minuta reaktivnost se potpuno uspostavlja. Žaba na štipkanje odgovara podizanjem ekstremiteta. Zabeležiti koliko je trajao spinalni šok i ostala zapažanja. Skicirati postupak sa modela: 72

82 PROSTOR ZA RAD: Širenje (radijacija) refleksa Širenje refleksa se odvija na nivou kičmene moždine, a omogućeno je postojanjem interneurona koji u centru vrše prenos nadražaja sa jednog receptivnog polja na više udaljenih motornih neurona, pri čemu se u odgovoru na draženje uključuje veći broj mišićnih vlakana, iako oni i njihovi refleksni centri nemaju direktne veze sa nadraženim receptorima. U kičmenoj moždini se impulsi prenose iz centra refleksnog luka (sinapsa) pomoću interneurona i kranijalno i kaudalno (»vertikalno«širenje refleksa kod čoveka), a i ipsilateralno u istoj ravni poprečnog preseka kičmene moždine (»horizontalno«širenje refleksa kod čoveka). ZADATAK: Dokazati širenje refleksa postepenim povećavanjem intenziteta nadražaja. MATERIJAL: Spinalna žaba iz prethodnog ogleda. IZVOĐENJE: Žaba koja se oporavila od spinalnog šoka postavlja se na stativ fiksirana za donju vilicu. Pincetom štipkati jedan zadnji ekstremitet u određenim vremenskim razmacima i sve jačim intenzitetom i pratiti reakcije (odgovore na štipkanje). Lagano štipkanje dovodi samo do fleksije mišića stopala, malo jače štipkanje izaziva intenzivnije povlačenje ekstremiteta, veoma jako štipkanje izaziva fleksiju ne samo nadraženog ekstremiteta, već i suprotnog kontralateralna iradijacija refleksa. Mogu reagovati čak i prednji ekstremiteti. Zabeležiti zapažanja. Skicirati postupak sa modela: 73

83 PROSTOR ZA RAD: Refleks brisanja (zaštitni refleks) Ovaj refleks spada u složene reflekse, a omogućen je širenjem i sumacijom jakih nadražaja koji traju duže vreme. Manifestuje se naizmeničnom fleksijom i ekstenzijom, a isto tako abdukcijom i addukcijom odgovarajućih grupa mišića ekstremiteta. Reflks brisanja dokazuje komunikaciju između velikog broja centara u kičmenoj moždini koja se ostvaruje pomoću aktivacije brojnih interneurona. Prisutno je i horizontalno i vertikalno širenje refleksa, kao i vremenska sumacija. ZADATAK: Izvesti ogled refleksa brisanja na spinalnoj žabi. MATERIJAL: Isto kao u prethodnim vežbama na spinalnoj žabi, filter papir, 0,5% H 2 SO 4. IZVOĐENJE: Spinalnoj žabi obešenoj na stativ, na leđa sa jedne strane kičmenog stuba staviti komad filter papira natopljenog u 0,5% sumpornoj kiselini. Posle nekoliko sekundi, žaba nakon nekoliko pokušaja ponavljanom abdukcijom i fleksijom zadnjeg ekstremiteta iste strane na kojoj je i natopljeni filter papir, uspeva da ga»brisanjem«ukloni. Nakon što operemo žabu potapanjem u vodu, ogled se ponavlja, ali sada sa držanjem ekstremiteta na strani na kojoj je filter papir, sprečavajući refleks. Zapaža se da će žaba»pokušati«da ukloni papirić ekstremitetom iste strane, ali pošto je to sprečeno, ona će papir ukloniti drugim ekstremitetom. Zabeležiti zapažanja. Skicirati postupak sa modela: 74

84 PROSTOR ZA RAD: Refleksno vreme Refleksno vreme je vreme koje protekne od momenta aplikacije nadražaja na receptorno područje pa do odgovora odgovarajućih efektora. To je tzv. celokupno refleksno vreme za koje nadražaj prođe čitav refleksni luk. Centralno refleksno vreme se odnosi na vreme provođenja nadražaja kroz sinapsu (centar) sa aferentnog na eferentno područje. Od svih karakteristika refleksa jedino celokupno refleksno vreme zavisi od perifernih delova refleksnog luka, tj. kvaliteta aferentnih i eferentnih neurona. Amijelinska nervna vlakna sporije provode impulse, dok mijelinska nervna vlakna brzo provode impulse. Dužina celokupnog refleksnog vremena zavisi od jačine nadražaja i veličine receptorske površine (obrnuto je srazmerna jačini nadražaja i veličini receptorske površine na koju se aplicira nadražaj). ZADATAK: Odrediti celokupno refleksno vreme spinalne žabe. MATERIJAL: Spinalna žaba, 5 laboratorijskih čaša sa rastvorom sumporne kiseline u koncentraciji od 0,1 do 0,5%, štoperica. IZVOĐENJE: Prst jednog zadnjeg ekstremiteta spinalne žabe koja visi na stativu sukcesivno uranjati, uvek jednako duboko, u laboratorijske čaše sa 0,1 do 0,5% rastvorom sumporne kiseline. Posle svakog pojedinačnog uranjanja u kiselinu potrebno je oprati ekstremitet potapanjem u čašu sa vodom. Štopericu pokrenuti u momentu uranjanja prsta u kiselinu, a zaustaviti kada usledi reakcija ekstremiteta (izvlačenje iz kiseline). Rezultate zabeležiti. Na kraju, isti ekstremitet potopiti znatno dublje nego prvi put u 0,1% rastvor sumporne kiseline i opet odrediti refleksno vreme (na ovaj način se povećava receptorska površina). Zabeležiti dobijene rezultate i zapažanja.. 75

85 Skicirati postupak sa modela: PROSTOR ZA RAD: 0,1% H 2 SO 4 : 0,2% H 2 SO 4 : 0,3% H 2 SO 4 : 0,4% H 2 SO 4 : 0,5% H 2 SO 4 : 0,1% H 2 SO 4 (dublje potapanje): ZAPAŽANJA I ZAKLJUČAK: 76

86 5.2.6 Sinapsa pruža otpor provođenju nadražaja Oblast kontakta dva neurona naziva se sinapsa. Ustanovljeno je da baš ova oblast kontakta ima svojstva koja određuju one osobenosti koje karakterišu refleksnu aktivnost (jednosmerno provođenje nadražaja, zamorljivost refleksnog luka, sumacija nadražaja i dr.). Pojedinačni nadražaj koji stiže u centar aferentnim putem neće se preneti na eferentno vlakno ako ne prelazi određeni prag (ako nije dovoljne jačine). Zbog toga se kaže da sinaposa pruža određeni otpor provođenju nadražaja. To se može veoma jednostavno dokazati aplikacijom minimalnih nadražaja na različite delove refleksnog luka i istovremenim posmatranjem reakcije efektora (mišića). ZADATAK: Dokazati da minimalni pojedinačni nadražaji imaju različit efekat zavisno od toga da li se apliciraju na aferentnom ili eferentnom području refleksnof luka (ispred ili iza sinapse). MATERIJAL: Spinalna žaba sa delimično isprepariranim n. ischiadicusom, uređaj za nadraživanje (elektrostimulator), bakarne elektrode. Elektrostimulator je uređaj kojim se može vršiti nadraživanje različitih struktura (mišićno tkivo, nervi). Elektrostimulatorom se mogu aplikovati električni impulsi različitog intenziteta (voltaže) i učestalosti (pojedinačni, frekventni). IZVOĐENJE: Dekapitirati žabu, zatim prorezati kožu na dorzalnoj strani jednog bedra i tupim razmicanjem mišića osloboditi n. ischiadicus od okolnog tkiva u njegovom kanalu. Ispod živca provući bakarne elektrode, elektrostimulator podesiti tako da se dobije pojedinačni nadražaj najmanjeg intenziteta koji može izazvati kontrakciju mišića ispod mesta draženja (pražni nadražaj). Nakon toga elektrode premestiti na presečeni kraj kičmene moždine i ponoviti draženje istom jačinom pojedinačnog nadražaja. U ovom slučaju reakcija mišića izostaje. Ne menjajući jačinu nadražaja, elektrostimulator podesiti na učestalu aplikaciju nadražaja i ponovo dražiti na presečenom mestu kičmene moždine. Nastaje efekat sumacije pojedinačnih minimalnih nadražaja u sinapsi i dolazi do reakcije ekstremiteta. Elektrostimulator ponovo podesiti za stimulaciju pojedinačnim nadražajima i povećati intenzitet nadražaja. Ovakvo draženje u području presečenog dela kičmene moždine će izazvati reakciju ekstremiteta. Zabeležiti sva žapažanja. 77

87 Skicirati postupak sa modela: PROSTOR ZA RAD: Arefleksija izazvana uklanjanjem delova refleksnog luka Da bi se refleks mogao normalno odvijati potrebno je da sve komponente refleksnog luka budu funkcionalno očuvane. U slučaju potpunog uništenja i/ili uklanjanja pojedinih komponenti refleksnog luka dolazi do potpunog gubitka refleksa arefleksije. ZADATAK: Izazvati arefleksiju uklanjanjem receptora i razaranjem centara na preparatu spinalne žabe. MATERIJAL: Materijal za preparaciju spinalne žabe, 0,1% H 2 SO 4, laboratorijska čaša, sonda. IZVOĐENJE: Spinalnoj žabi koja visi u stativu napraviti zarez makazama na koži jednog zadnjeg ekstremiteta i zatim povlačenjem ukloniti kožu distalno od zareza (uklanjanje receptora). Uroniti ekstremitet bez kože u rastvor sumporne kiseline i konstatovati arefleksiju. Zatim uroniti drugi zadnji ekstremitet i konstatovati postojanje refleksne reakcije. 78

88 Sondom razoriti kičmenu moždinu spinalne žabe. Na ovaj način su razoreni refleksni centri koji se nalaze u kičmenoj moždini. Ponoviti ogled na oba zadnja ekstremiteta i konstatovati izostanak refleksa. Zabeležiti sva žapažanja. Skicirati postupak sa modela: PROSTOR ZA RAD: 5.3 Uticaj acetilholina, adrenalina i atropina na pupilarni otvor žabe Veličina (dijametar) pupilarnog otvora (zenice) regulišu dva glatka mišića inervisana vegetativnim nervnim sistemom. Vlakna jednog okružuju pupilu i čine m. sphincter pupilae (inervisan parasimpatikusom), a vlakna drugog mišića su raspoređena radijalno m. dilatator pupilae (inervisan simpatikusom). Draženje simpatikusa dovodi do kontrakcije m. dilatatora pupilaei širenja pupilarnog otvora (midrijaza). Isti efekat se postiže kada se aplicira adrenalin, odnosno noradrenalin koji je neurotransmiter perifernih simpatikusnih nervnih vlakana. Stimulacijom parasimpatikusa nadražuje se m. sphincter pupilae i pupilarni otvor se sužava (mioza). Acetilholin (Ach), kao neurotransmiter postganglijskih parasimpatikusnih nervnih vlakana dovodi do iste reakcije. 79

89 Atropin izaziva midrijazu, ali ne direktno kao adrenalin i noradrenalin, nego indirektno, tako što blokira dejstvo parasimpatikusa, odnosno acetilholina. ZADATAK: Dokazati delovanje acetilholina, adrenalina i atropina na pupilarni otvor žabe. MATERIJAL. Dva preparata oka žabe, Petrijeve šolje, rastvori acetilholina, adrenalina i atropina, Ringerov rastvor za žabe (fiziološki rastvor). IZVOĐENJE: Gornji deo glave žabe, nakon dekapitovanja, uzdužnim presekom podeliti na dva preparata. Svaki preparat staviti u posebnu Petrijevu šolju tako da su oči okrenute prema gore. Preparat zaseniti i posmatrati veličinu pupilarnog otvora. Jedno oko preliti rastvorom acetilholina, a drugo rastvorom adrenalina. Posmatrati zenice dok se ne zapaze promene na njima. Zapisati zapažanja. Oko koje je bilo preliveno rastvorom acetilholina isprati Ringerovim rastvorom za žabe, a zatim preliti rastvorom atropina. Zabeležiti zapažanja. Skicirati postupak sa modela: PROSTOR ZA RAD: 80

90 6.0 Fiziologija čula Prijem signala iz, spoljašnje ili unutrašnje sredine, omogućuju specijalizovane ćelije - receptori, koji funkcionišu pojedinačno ili u kombinaciji sa drugim tipovima ćelija gradeći čulne (percepcijske) organe, kao što su, na primer, uho ili oko. Registrovanje različitih signala je opšti proces koji podrazumeva pretvaranje energije stimulusa u akcione potencijale koji se prenose senzitivnim nervnim vlaknima do centralnog nervnog sistema, gde se obrađuju i prepoznaju. Svaki čulni organ specijalizovan je da pretvori određenu vrstu energije u akcioni potencijal senzornog nerva. Svaki modalitet osećaja ima stalno određen put do mozga, a koji osećaj će biti percipiran, kao i deo tela u koji će se osećaj lokalizovati određen je posebnim delom mozga koji je aktiviran. Razlike u intezitetu nekog osećaja signaliziraju se na dva načina: promenom broja aktiviranih receptora i promenom frekvencije akcionog potencijala u senzornom nervu. Povećanje inteziteta nadržaja na neki osećajni organ ima vrlo mali efekat na kvalitet proizvedenog osećaja. Postoje 4 tipa čulnih receptora koji prepoznaju različite vidove energije: hemoreceptori, mehanoreceptori, termoreceptori i fotoreceptori. Pored navedenih postoje i nocioceptori (receptori za bol) koje predstavljaju nervni završeci senzitivnih vlakana Aδ i C, a koja se nalaze u koži i unutrašnjim organima. Osetljivost (prag receptora) nije ista za sve tipove receptora. Nadražaj za koji je receptor specijalizovan i za koji ima najniži prag naziva se pražni nadražaj. Receptori mogu da reaguju i na druge vrste nadražaja ali ako su oni znatno većeg intenziteta od onih koji deluju na specifične receptore. Adaptacija receptora je svojstvo da prestaju da stvaraju impulse i ako nadražaj još deluje. Modalitet osećaja je određena vrsta osećaja koja nastaje kao odraz draženja specifičnih receptora, a nakon percepcije signala u specifičnim oblastima kore velikog mozga (mesta projekcije). Način na koji se oseća i interpretira određeno razdraženje receptora zavisi, pored svojstava receptora i neurona i od prethodnog iskustva koje je upamćeno. Somatski (telesni) osećaji predstavljaju senzibilitet tela koji se doživljava preko adekvatnih receptora. Ovaj senzorni sistem prenosi i obrađuje informacije iz eksteroreceptora (osećaji iz spoljašnje sredine) i proprioreceptora (osećaj položaja tela). Receptori somatskog senzibiliteta tela su mehanoreceptori, termoreceptori i nocioceptori. Na osnovu receptora se razlikuju mehanoreceptivni osećaji, termoreceptivni osećaji i osećaj bola. Mehanoreceptivni osećaj može biti: osećaj dodira, osećaj pritiska i osećaj vibracija. Za sve ove modalitete receptori su slobodni ili učaureni završeci senzitivnog neurona koji predstavljaju neurone I reda. Neuroni I reda u kičmenoj moždini ostvaruju sinapse sa neuronima II reda čiji aksoni formiraju ushodni put do talamusa koji predstavlja glavni relej senzornih puteva. Talamus je struktura u kojoj se ostvaruje sinapsa neurona II reda sa neuronima III reda.iz talamusa neuroni III reda odlaze u određenu zonu senzorne kore velikog mozga. Neuroni I reda se označavaju kao senzitivni a neuroni II i III reda kao centralni neuroni. U nekim ushodnim putevima može da postoji 81

91 i više od navedena tri neurona. Svaki senzorni neuron, kao i centralni neuroni imaju svoje receptorno polje. U koži su prisutni sledeći receptori: mehanoreceptori: Merkelove ploče, Pačinijeva telašca, Rufinijevi završeci, nervni završeci oko folikula dlaka, Majsnerova telašca, termoreceptori - slobodni nervni završeci i nociceptori - slobodni nervni završeci. Deo kože u kome se nalaze završeci jednog senzitivnog neurona, koji se odgovarajućim stimulusom mogu aktivirati, čini njegovi receptorno polje. Centralni neuroni imaju veće i složenije receptorno polje. Ovo je posledica toga što na njih konvergira odrenen broj neurona nižeg reda. Između senzornog i centralnih neurona se mogu uključiti i interneuroni. Ovi interneuroni omogućavaju postojanje ekscitatorne i inhibitorne regije na receptornom polju neurona višeg reda. Postojanje ovih regija omogućava bolje prostorno razdvajanje (rezoluciju), odnosno povećava kontrast izmenu pojedinih stimulusa. Informacije iz mehanoreceptora prenose se mijeliziranim nervnim vlaknima (brže), a mogu i nemijeliziranim nervnim vlaknima (sporije). Svi senzitivni putevi, izuzev čula mirisa, prolaze kroz jedra talamusa na putu za koru velikog mozga. Pored kore velikog mozga talamus je povezan i sa mnogim drugim strukturama u centralnom nervnom sistemu (mali mozak, bazalne ganglije, hipotalamus itd.). Svaki receptor ima svoju projekciju u talamusu a zatim i u senzitivnoj kori velikog mozga. Projekcioni delovi korteksa su označeni kao primarna senzitivna polja ili zone. Kortikalna projekcija pojedinih delova tela zavisi od gustine receptora u koži na pojedinim delovima tela. Veličina kortikalnih prijemnih područja za impulse iz pojedinih delova tela je direktno srazmerna broju receptora u tim delovima. Područja u senzitivnoj kori velikog mozga za osećaje iz trupa i leđa su mala, dok se vrlo velika polja odnose na impulse koji dolaze sa ekstremiteta i glave. Obe strane senzitivne kore velikog mozga primaju informacije isključivo sa suprotne strane tela (izuzetak je glava). Za razliku od primarnih somatskih senzitivnih zona koje su usko ograničene na određeno receptivno polje, neke zone reaguju na draženje većih površina tela. One nisu oštro ograničene i označavaju se kao sekundarne somatske senzitivne zone. Za razliku od primarnih, primaju signale sa obe strane tela. 6.1 Prag za dve tačke Prag za dve tačke je minimalna udaljenost koja mora postojati između mesta dva dodira da bi se osetili kao razdvojeni. Korišćenjem ovog testa moguće je okvirno odrediti kolika je gustina receptora za dodir na odrenenom delu tela. 82

92 Veličina praga za dve tačke zavisi od: gustine receptora, veličine receptorskog polja neurona, postojanja inhibitorne komponente centralnog neurona, samog nadražaja (dodira i postojanja dodatnog stimulusa), uzrasta (sa starošću se smanjuje broj receptora) i pola (kod ženskih jedinki je prag manji). ZADATAK: Izvršiti merenje praga za dve tačke bez uticaja i sa uticajem dodatnog stimulusa. MATERIJAL: Šestar (sa dve igle), lenjir, cimet, led. IZVOĐENJE: Izvršiti prvo merenje praga za dve tačke bez uticaja dodatnog stimulusa. Vežba se radi na studentu subjektu, a potrebno je da student - subjekat žmuri tokom testiranja. Eksperiment se vrši na različitim delovima tela: čelo, obraz, vrat, podlaktica, dlan, vrh palca i vrh kažiprsta. Cilj je uporediti njihovu međusobnu osetljivost koja je posledica različite gustine senzornih receptora u koži i veza koje senzorni neuroni prave u mozgu. Prvi razmak između vrhova šestara koji eksperimentator primenjuje na studentasubjekta je 50mm (oba vrha šestara treba da dotaknu kožu u istom momentu). Ukoliko student-subjekat oseti dve tačke (slika 6.1), potrebno je približiti vrhove šestara na 45mm, i tako se redom razmak izmenu vrhova šestara smanjuje za po 5mm dok se ne dostigne najmanji razmak pri kome se oseti dodir u dve tačke. Slika 6.1 Osećaj dve tačke 83