TOKSIKOLOGIJA vježbe Doc. dr. sc. Andrea Prevendar Crnić Jelena Šuran, dr. vet. med.
Nakon vježbi trebali bi znati... SPRIJEČITI OTROVANJE prepoznati otrovanje pravilno postupiti s otrovanom životinjom uzeti i poslati uzorke na toksikološku analizu načine dokazivanja otrova u biološkom materijalu I još mnogo, mnogo toga...
1. Spriječiti otrovanje Edukacija vlasnika Vaš zadatak! Kućanstva prepuna opasnosti za ljubimce OTC lijekovi Off - label upotreba lijekova Čokolada, kakao, kava... Umjetna sladila Grožđice, češnjak, avokado...
Pašnjaci i staje prepuni opasnosti za stoku Neadekvatno skladištenje hrane Otrovno bilje Herbicidi Insekticidi
Životinja se otrovala. Š T O S A D A???
1. Postupak s vlasnikom Smirujući razgovor Ključna pitanja Upute vlasniku Psihičko stanje vlasnika Vaš problem!
2. Stabilizacija pacijenta HITNI SLUČAJEVI POTAKNUTI: RAD SRCA DISANJE ABC reanimacija
ABC reanimacija: Osigurati prohodnost dišnog sustava (Airway) Uspostaviti normalno disanje (Breathing) Zaustaviti krvarenje (Bleeding) Ispraviti cirkulacijske nepravilnosti (Circulation) Suzbiti depresiju SŽS-a (Consciousness)
Poticanje (obnavljanje) vitalnih funkcija srčani glikozidi adrenalin analeptici (metilksantini) sedativi, barbiturati
Što još moramo učiniti? 1. Ukloniti potencijalni izvor otrovanja 2. Spriječiti daljnju resorpciju otrova 3. Inaktivirati i eliminirati otrov iz organizma
Spriječiti daljnju resorpciju otrova Dekontaminacija životinja Koža kupanje blagim deterdžentom i vodom Probavni sustav pražnjenje, lavaža, emetik
EMETIK možemo dati psima, mačkama, svinjama - unutar 2 sata nakon tekuće otrovane hrane - unutar 4 sata nakon krute otrovane hrane NIKAKO NE: konjima, preživačima, glodavcima!!! životinjama koje su već više puta povraćale koje su u nesvijesti ili su popile kiselinu ili lužinu KONJ želudac se ispire sondom kroz nos
LOKALNI NESPECIFIČNI ANTIDOTI daju se per os, stvaraju kompleks s otrovom i sprječavaju njegovu resorpciju aktivni ugljen ili carbo animalis adsorbans, veže na sebe otrov, ali i neke druge tveri dugotrajna primjena nestašica korisnih tvari: Cu, Zn, minerala, mikroelemenata
Inaktivirati i eliminirati otrov iz organizma specifični sistemski antidoti vežu otrove i/ili povećavaju njihovu biotransformaciju i izlučivanje ili kompetitivno zaposjedaju receptore za otrov potaknuti izlučivanje iz organizma LAKSANSIMA Mg sulfat ili Na sulfat Moguća je i promjena ph mokraće za poticanje izlučivanja otrova
Dijagnostika otrovanja Složen, skup i mukotrpan proces ANAMNEZA podatci vlasnika o svemu u vezi životinje: držanje, hranidba, transport, liječenje, ponašanje... KLINIČKA SLIKA sve što se vidi + hematologija, pretraga očne vodice, likvora...
KLINIČKA SLIKA... ataksija povraćanje ikterus salivacija dijareja krvarenje vid / sljepoća melena hemoglobinurija depresija polifagija hematurija ekscitacija polidipsija stenjanje napadaj poliurija groznica disfonija dispneja slabost drugo (opisati)...najčešće je nespecifična.
PATOANATOMSKI I HISTOLOŠKI NALAZ Zavod za veterinarsku patologiju BIOLOŠKI POKUS 2-3 miša, da im se sumnjiva hrana ili iscrpak iz hrane. KLJUČNO : KEMIJSKO-TOKSIKOLOŠKA ANALIZA - državni (MUP) ili privatni forenzički laboratoriji u kojima se može dokazati otrov u organizmu životinje Sud priznaje otrovanje ako je dokazan otrov u tkivima, hrani, vodi...
KEMIJSKO TOKSIKOLOŠKA ANALIZA *ANALITIČKA TOKSIKOLOGIJA*
ZAŠTO ANALIZIRATI? 1. UTVRDITI UZROK INTOKSIKACIJE 2. KONTROLIRATI NAZOČNOST STRANIH ŠTETNIH TVARI: u uzorcima biološkog materijala u namirnicama životinjskog podrijetla u smjesama za ishranu životinja
KOJA JE SVRHA ANALIZE? utvrditi stupanj apsorpcije štetnih tvari utvrditi način i brzinu metaboliziranja: toksikodinamiku i toksikokinetiku dokazati pojavu metabolita, patoloških reakcija i promjena pratiti tijek bolesti i učinak antidota utvrditi prestanak djelovanja otrova
O KAKVIM JE OTROVIMA RIJEČ? Pesticidi Industrijska zagađivala Toksični metali i nemetali Toksične skupine (Prirodni) toksini Kemoterapeutici i hormoni Radionuklidi
VRSTE UZORAKA Biološki materijal (krv, mokraća, sadržaj želuca...) Namirnice animalnog podrijetla Hranidbene smjese, premiksi Voda Ambalaža, slučajni uzorci
KADA UZETI UZORAK? ŠTO PRIJE!!!
KAKO UZETI UZORAK? ZAŠTITITI OD DODATNE KONTAMINACIJE UZORKE TKIVA KONZERVIRATI ZAMRZAVANJEM KRV S ANTIKOAGULANSOM (navesti koji) VODU SMRZNUTI
OD ŽIVE ŽIVOTINJE UZIMAMO I ŠALJEMO... Krv (najmanje 10 ml) Mokraća(50 ili više ml) Balega Povraćani sadržaj želudca Mlijeko (500 ml)
OD LEŠINE UZIMAMO I ŠALJEMO... Mala životinja se šalje cijela Velike životinje: 5 ml krvnog seruma ili 10 ml pune krvi (iz srca) 250-300 g tkiva bubrega, jetre, slezene, mozga, pluća, masnog tkiva, kostiju, kože 2 kg sadržaja želudca, predželudaca ili crijeva (ili podvezani želudac i tanko i debelo crijevo)
ŠALJEMO JOŠ I... Sumnjivu tvar s kojom se životinja (možda) otrovala ili ambalažu u kojoj je ta tvar bila upakirana Sumnjivu hranu (sijena 3-5 kg, zrnja ili smjese 1 kg) Vodu Nekoliko grama dlake kod sumnje na kronično otrovanje arsenom ili živom
PAKIRANJE UZORAKA TKIVNI UZORCI Smrznuti Odvojeni U označenim neupotrijebljenim plastičnim vrećicama ili aluminijskoj foliji (ako se sumnja na otrovanje organskim spojem)
KRV Ne smrzavati, u hladnom Izbor antikoagulansa ovisi o strukturi toksične kemijske tvari; Heparin za ispitivanje anorganskih kationa i aniona Na-citrat ili EDTA pri dokazivanju sumnjivog organskog spoja Serum odvojiti od ugruška u roku od dva sata nakon uzimanja može se smrznuti
Tekući uzorci plastične ili staklene posude koje se mogu dobro zatvoriti UZORCI VODE Konzervansi: Koncentrirana dušična kiselina (metali u uzorku) Koncentrirana sumporna kiselina (organski spojevi koji sadržavaju dušik i fosfor) Natrijeva lužina u obliku granula (za hlapljive spojeve cijanide, organske kiseline)
PISMENO OBRAZLOŽENJE...mora pratiti uzorke Sadržava sljedeće podatke: VRSTA, STAROST, SPOL ŽIVOTINJE ETIOLOGIJA I ANAMNEZA KLINIČKA SLIKA RAZUDBENI NALAZ
UPITNIK ZA PROVJERU MOGUĆEG OTROVANJA ŽIVOTINJE nadnevak: PODACI O VLASNIKU ime vlasnika: adresa: tel.: PODACI O PACIJENTU (O ŽIVOTINJI) vrsta spol težina starost
INSTRUMENTALNE ANALITIČKE METODE U VETERINARSKOJ TOKSIKOLOGIJI
ZADATAK: IZDVOJITI ISTOVRSNE MOLEKULE IZ MASE RAZLIČITIH
TIPIČNA INSTRUMENTALNA ANALIZA 1. UZORKOVANJE 2. PRIPREMA UZORKA: biološki uzorak = skup homolognih smjesa = heterogeni sustav 3. FRAKCIONIRANJE I SEPARACIJA (razdvajanje i odvajanje) 4. MJERENJE SIGNALA 5. STANDARDIZACIJA (kalibracija) 6. PRIKAZIVANJE REZULTATA
INSTRUMENTALNA ANALIZA METODE RAZDVAJANJA ELEKTROANALITIČKE METODE OPTIČKE METODE CILJ: izdvajanje i kvantitativna identifikacija štetnih tvari IMUNOKEMIJSKE METODE Analitički instrumenti mjere fizikalna ili kemijska svojstva ispitivane tvari ili pak mjere određeni parametar koji ukazuje na svojstvo te tvari.
OPTIČKE METODE MJERENJA INTERAKCIJE IZMEĐU TVARI & (atoma, molekula ili većih agregata) ENERGIJE ( ugl. elektromagnetnih zraka) Instrument mjeri količinu elektromagnetskog zračenja koje uzorak ili apsorbira ili emitira ili rasprši.
BEER LAMBERTOV ZAKON Odnos između intenziteta polaznog EMZ (I 0 ) i intenziteta nakon prolaska zrake kroz uzorak (I 1 )
SPEKTROFOTOMETRIJA ATOMSKA APSORPCIJSKA SPEKTROFOTOMETRIJA
SPEKTROFOTOMETRIJA Molekulska apsorpcija UV ili vidljivog zračenja elektronske apsorpcijske vrpce građene od mnogo odvojenih linija Svaka linija = prijelaz elektrona iz osnovnog u pobuđeno energetsko stanje λ pri kojima organska molekula apsorbira ovisi o jakosti kojom su vezani njezini elektroni
Svaki spoj apsorbira elektromagnetsko zračenje određenefrekvencijei valneduljine.
ATOMSKA APSORPCIJSKA SPEKTROFOTOMETRIJA Mjerenje apsorpcije elektromagnetskih zraka od strane atoma u energetski osnovnom stanju Količina energije koja izaziva prijelaz atoma u pobuđeno stanje ovisi o vrsti elementa Atomizacija = uzorak se isparava i razgrađuje uz nastanak atomske pare Veličina apsorpcije ovisit će o broju atoma u osnovnom stanju- atomskoj pari
U atomizatoru dolazi do pobude iz osnovnog u više energetsko stanje. Pri povratku iz pobuđenog stanja atom emitira EM zračenje određene valne duljine. plamen 1. Atomizacija u plamenu 2. Elektrotermička atomizacija 3. Atomizacija u induktivno spregnutoj plazmi (npr. ICP) 4. Atomizacija u plazmi istosmjerne struje (npr. DCP) atomizator (raspršivač) plamenik
Izvor zračenja Uređaj za disocijaciju (atomizator) Sustav za mjerenje zračenja atomska para
AAS je prvenstveno kvantitativna analiza, mada se pomoću nje može odrediti i kvalitativni sastav uzorka. Ovom metodom može se određivati većina elemenata u periodnom sustavu. Najviše se primjenjuje za određivanje METALA U TRAGOVIMA (biološki materijal, uzorci prašine, hrane, površinskih i otpadnih voda).
METODE RAZDVAJANJA Koriste fizikalna ili kemijska svojstva sastojaka ispitivanog uzorka da bi ga razdvojile na komponente. Nakon razdvajanja sastojci se mogu odvojeno analizirati.
KROMATOGRAFSKE METODE prolaženje uzorka (mobilna faza) kroz adsorbens (stacionarna faza) princip različite sposobnosti vezanja pojedinih sastojaka u uzorku na adsorbens uzorak se razdvaja na komponente
~1900. - Mikhail S. Tswett, ruski botaničar razdvojio je biljne pigmente u staklenoj koloni koja je sadržavala CaCO 3 HPLC Kolona mobilna faza prolazi u smjeru strelice i razdvaja se na različite komponente
1. PLINSKA KROMATOGRAFIJA 2. PLINSKO MASENA SPEKTROMETRIJA 3. VISOKO DJELOTVORNA TEKUĆINSKA KROMATOGRAFIJA (HPLC) Metode kromatografije koriste se uglavnom za razdvajanje organskih molekula.
1. PLINSKA KROMATOGRAFIJA : Mobilna faza je plin. Plinska adsorpcijska kromatografija stacionarna faza je čvrsta Plinsko tekućinska kromatografija stacionarna faza je tekućina Za razdvajanje hlapljivih spojeva, te spojeva koji se derivatizacijom mogu prevesti u hlapljivi oblik.
GC MS; 2. PLINSKO MASENA SPEKTROMETRIJA PLINSKI KROMATOGRAF + MASENI SPEKTROMETAR Među najmoćnijim analitičkim sredstvima kojima suvremena analitika raspolaže Idealno za toksikološku analizu nepoznatih tvari daje najsigurniji rezultat
SPEKTROMETRIJA MASA Određuje se masa elementa ili spoja. Uzorak se injektira u spektrometar masa i ionizira pomoću snopa elektrona. Stvoreni kationi ubacuju se u prostor za analizu uz pomoć jakog električnog polja. Magnetsko polje okomito na snop iona zakreće katione prema detektoru. količinaionau uzorku visina vrška
VISOKO DJELOTVORNA TEKUĆINSKA KROMATOGRAFIJA (HPLC) Još manje čestice punila (stacionarna faza), još moćnija pumpa i viši tlak
kromatogram