BIOREAKCIJSKA TEHNIKA II Interna skripta Autor: Dr. sc. Ana Vrsalović Presečki, doc.

Sveučilište u Zagrebu Fakultet kemijskog inženjerstva i tehnologije Zavod za reakcijsko inženjerstvo i katalizu BIOREAKCIJSKA TEHNIKA II Interna skripta Autor: Dr. sc. Ana Vrsalović Presečki, doc. Svibanj, 2013

Zahvaljujem se prof dr.sc. Đurđi Vasić-Rački na poticaju, potpori i korisnim savjetima koji su oblikovali konačan izgled ove skripte. Molila bih studente, ukoliko naiđu na pogeške u ovoj skripti da mi se jave na mail avrsalov@fkit.hr.

SADRŽAJ 1. BIOPROCESI... 1 1.1. UPOTREBA CIJELIH STANICA U BIOPROCESIMA... 1 1.2. PRODUKTI DOBIVENI KORIŠTENJEM CIJELIH STANICA MIKROORGANIZAMA... 2 1.3. UZGOJ MIKROORGANIZAMA... 4 1.3.1. Uvjeti za rast mikroorganizama... 5 1.3.2. Krivulja rasta mikroorganizma... 6 1.4. METABOLIZAM STANICE... 7 1.4.1. Regulacija biosinteze primarnih i sekundarnih metabolita... 9 2. KINETIKA RASTA MIKROORGANIZMA... 12 2.1. MONOD-OV MODEL MIKROBNOG RASTA... 14 2.2. UTJECAJ PRODUKTA NA BRZINU RASTA MIKROORGANIZMA... 14 2.3. MONODOV MODEL RASTA UZ INHIBICIJU SUPSTRATOM... 15 2.4. RAST U PRISUSTVU VIŠE IZVORA UGLJIKA... 16 2.5. KINETIKA POTROŠNJE SUPSTRATA... 18 2.6. KINETIKA NASTAJANJA PRODUKTA... 18 2.7. KONTINUIRANI UZGOJ MIKROORGANIZAMA... 19 2.7.1. Bilanca tvari u kemostatu... 22 2.7.2. Kontinuirani uzgoj mikroorganizama s povratnim tokom biomase... 25 2.7.3. Kontinuirani uzgoj mikroorganizama u bioreaktorima povezanim u seriju... 27 2.7.4. Produkti mikrobnog metabolizma u kontinuiranom procesu... 28 2.8. OCJENA USPJEŠNOSTI MIKROBNIH PROCESA... 28 2.8.1. Prinos produkta... 28 2.8.2. Koeficijent ili stupanj konverzije osnovnog supstrata... 29 2.8.3. Produktivnost... 29 3. BIOREAKTORI... 32 3.1. RAZLIKA KEMIJSKIH REAKTORA I BIOREAKTORA... 32 3.2. IZBOR BIOREAKTORA... 32 3.2.1. Utjecaj prirode proizvodnog mikroorganizma... 33 3.2.2. Utjecaj osobina hranjive podloge... 33 3.2.3. Utjecaj parametara procesa... 34 3.3. OBLICI BIOREAKTORA... 35 3.3.1. Bioreaktori s mehaničkim miješanjem... 35 3.3.2. Bioreaktori sa cirkulacijom i miješanjem pomoću pumpe... 37 3.3.3. Bioreaktori u kojim se podloga miješa sa zrakom... 38 3.4. AERACIJA U BIOREAKTORMA... 38 3.4.1. Mjerenje koncentracije otopljenog kisika... 43 3.4.2. Međufazni prijenos mase kisika... 45 3.4.3. Osnovne teorije međufaznog prijenosa mase kisika... 45 3.4.3.1. Metode određivanja ukupnog volumnog koeficijenta prijenosa kisika... 49 3.5. TEHNIKE IZVOĐENJA BIOPROCESA... 51 3.6. PRAĆENJE BIOPROCESA... 52 3.6.1. Mjerni instrumenti... 54 3.6.2. Mjerenja u biotehnologiji... 55 4. PROCESI IZOLACIJE I SEPARACIJE BIOPRODUKATA... 61 4.1. PROCESI PRI IZDVAJANJU MIKROBNIH STANICA... 63 4.1.1. Koagulacija i flokulacija... 63 4.1.2. Filtracija... 64 4.1.3. Centrifugiranje... 65 4.2. POSTUPCI IZDVAJANJA PRODUKATA IZ BIOMASE... 67 4.2.1. Fizičke metode... 68 4.2.2. Kemijske metode... 69 4.2.3. Biološke metode...70 4.3. KONCENTRIRANJE I PROČIŠĆAVANJE PRODUKATA... 70 4.3.1. Ekstrakcija... 70

4.3.2. Membranski procesi... 72 4.3.3. Taloženje... 76 4.3.4. Adsorpcija... 77 4.3.5. Kromatografija... 78 4.4. SUŠENJE... 81 4.4.1. Sustavi za sušenje suspenzija i otopina... 82 4.4.2. Sublimacijske sušnice - liofilizacija... 86 4.5. MIKROBNI PROCESI SA IZOLACIJOM PRODUKTA IN SITU... 88 4.5.1. Vakuum fermentacija.... 88 4.5.2. Ekstraktivna fermentacija... 90 4.5.3. Fermentacija sa procesom adsorpcije "in situ"... 90 5. LITERATURA... 91 6. POPIS SIMBOLA... 92

1. Bioprocesi 1. BIOPROCESI Mikroorganizmi su prepoznati i iskorištavani već odavnina. Još su Babilonci i Sumerani koristili kvasac za pripravu alkohola. Sredinom devetnaestog stoljeća Louis Pasteur je shvatio ulogu mikroorganizama u fermentiranju hrane, vinu, alkoholu, pićima, siru, mlijeku, jogurtu, te drugim produktima. Identificirao je mnoge mikrobiološke procese, te je otkrio principe fermentacije što uključuje da mikrobi trebaju supstrat za proizvodnju primarnih i sekundarnih metabolita kao i krajnih produkata. U novije doba proširena primjena bioprocesa je stvorila priliku za inženjere da prošire polje biotehnologije. Tako se danas većina bioloških i farmaceutskih produkata proizvodi u dobro opisanim industrijskim procesima. Na primjer bakterije mogu proizvesti većinu aminokiselina koje se upotrebljavaju u hrani ili medicini. Bioproces je glavni dio biotehnološkog proizvodnog postupka u kojem se sirovine djelovanjem biokatalizatora kemijski transformiraju u produkt. Biokatalizatori se mogu koristiti kao izolirani i pročišćeni ili u obliku cijelih stanica. Bioproces se u industrijskoj proizvodnji provodi na dva načina: 1) pojedinačni bioproces sa enzimima kao katalizatorima i 2) bioproces u složenim sistemima sa mikroorganizmima Kod enzimske katalize supstrat se najčešće transformira u produkt bez sporednih produkata, jer je katalizator strogo specifičan. Proces se najčešće odvija u jednom ili dva reakcijska stupnja, te se dobiva produkt koji je strukturno sličan supstrat. Ovi procesi se nazivaju i biotransformacije. Kod katalize s mikroorganizmima bioproces se najčešće sastoji od više uzastopnih biotransformacija, te se tada radi o biosintezi. U ovom slučaju pored glavnog, nastaju i sporedni produkti, jer su stanice složeni sustavi u kojima se nalazi veliki broj biokatalizatora. S inženjerskog aspekta, prostor u kojem se odvija bioproces može se gledati kao reaktor, koji se, kako je proces kataliziran biološkim katalizatorima, naziva bioreaktor. Enzimski kataliziran bioproces u bioreaktoru je analogan kemijski kataliziranom procesu u kemijskom reaktoru, s tim što je prvi strogo selektivan i daje jedan produkt, zbog čega je njegova industrijska realizacija jednostavnija (npr. nema separacije željenog produkta od sporednih itd.). Bioproces u stanicama, zbog mnogobrojnih reakcija u metabolizmu stanice, znatno je složeniji od enzimski kataliziranog bioprocesa. Većina izoliranih enzima koji se upotrebljavaju u industrijskim mjerilima su izvanstanični produkti mikroorganizama. To je zbog toga što ih je lako izolirati iz fermentacijske komine, te što su otporniji na promjene uvjeta u okolišu od unutarstaničnih enzima. No, 90 % enzima koje stanice proizvode su unutarstanični. Njihovo ekonomsko iskorištavanje, unatoč činjenici da imaju veliki biokatalitički potencijal, limitirano je visokom cijenom njihove izolacije. Naime, potrebno je upotrijebiti vrlo precizne i skupe metode da se enzimi izoliraju iz stanice neoštećeni. Također, u usporedbi sa izvanstaničnim enzimima oni su značajno nestabilniji, te je njihova koncentracija unutar stanice relativno mala. Ovi problemi se mogu prevladati upotrebom cijelih stanica kao izvorom intracelularnih (unutarstaničnih) enzima. Naime, osim što se upotrebom cijelih stanica izbjegava dug i skup proces pročišćavanja, enzim se čuva u svom prirodnom okruženju čime se smanjuje mogućnost njegove inaktivacije. 1.1. UPOTREBA CIJELIH STANICA U BIOPROCESIMA Cijele stanice mogu služiti kao nosilac biokatalizatora, posebno u reakcijama u kojim je nužna upotreba više enzima (npr. proizvodnja sekundarnih metabolita kao penicilina ili cefalosporina). Tu se radi o tzv. fermentacijskim procesima (biosintezi), a ne o 1

1. Bioprocesi biotransformacijama. Nedostatak upotrebe cijelih stanica je difuzija supstrata i produkata kroz staničnu membranu, te neželjene sporedne reakcije zbog prisutnosti drugih enzima u stanici. Jedan od načina uklanjanja problema s difuzijom je upotreba permeabiliziranih stanica. Stanice se mogu permeabilizirati upotrebom fizikalnih (zaleđivanjem i otapanjem), kemijskih (organska otapala i detergenti) i enzimatskih (lizozim, papain) metoda. Najčešće se upotrebljava kemijska tehnika pri kojoj se koriste organska otapala kao što su toluen, kloroform, etanol i butanol ili detergenti koji mogu biti ionski (CTAB, SDS) i neionski (natrijev deoksilat, digitonin, TRITON X-100, Tween 80). Kemijskim tretiranjem se stvaraju malene pore, koje nastaju uklanjanjem pojedinih lipida iz stanične membrane. Na taj se način omogućava slobodan prolaz produktima i supstratima male molekulske mase, dok makromolekule kao enzimi ostaju unutar stanice. Iz permeabilizirane stanice se tako uklanjaju male molekule kao koenzimi i metalni ioni, koji su nužni za katalitičko djelovanje većine enzima, što umanjuje mogućnost neželjenih sporednih reakcija. Na primjer stanica kvasca koja sadrži intracelularnu β-galaktozidazu konvertira laktozu u etanol i CO 2, dok ista, ali permeabilizirana stanica konvertira laktozu samo u glukozu i galaktozu zbog nedostatka koenzima. Djelovanje sporednih reakcija zbog prisutnosti drugih enzima u stanici može se umanjiti inaktivacijom tih enzima fizikalnim (grijanje) ili kemijskim tretiranjem (uvođenjem inhibitora karakterističnog za pojedini enzim). Neki od primjera primjene permeabiliziranih stanica u industriji su proizvodnja L-aspartatne kiseline uz aspartazu iz Escherichia coli, te proizvodnja L-jabučne kiseline fumarazom iz Brevibacterium flavus. 1.2. PRODUKTI DOBIVENI KORIŠTENJEM CIJELIH STANICA MIKROORGANIZAMA Biotehnologija sudjeluje u svim bitnim segmentima materijalne proizvodnje koji su od egzistencijalnog značaja za čovjeka. To uključuje proizvodnju hrane, lijekova kemikalija, energenata itd. Specijalizirana područja biotehnologije našla su primjenu u medicini, agronomiji, elektronici, metalurgiji, zaštiti životne sredine, remedijaciji zagađenog zemljišta itd. Korištenjem cijelih stanica mikroorganizama možemo dobiti produkte koje prema procesu dobivanja dijelimo na: 1) Mikrobnu biomasu 2) Primarne, sekundarne metabolite i enzime 3) Produkte pripravljene biotransformacijama iz različitih kemikalija Mikrobna biomasa Primjeri ove vrste produkata koji se uglavnom koriste u prehrambenoj tehnologiji su: pekarski kvasac, starter kulture, bioinsekticidi (spore Bacillus thuriniensis), kulture stanica i tkiva biljaka i životinja Primarni, sekundarni metaboliti i enzimi Industrijski se cijele stanice u fermentacijskim procesima primjenjuju u proizvodnji lijekova i njihovih intermedijera, vitamina, aminokiselina, aditiva za prehrambenu industriju, te insekticida. Tako se u fermentacijskim procesima mogu dobiti slijedeće tvari: - antibiotici: bacitracin, kloramfenikol, cikloserin, eritromicin, gramicidin, kanamicin, neomicin, nistatin, oleandomicin, penicilin, streptomicin, tetraciklin, tirotricin - organske kiseline: limunska, jabučna, itakonska, mliječna, octena, glukonska. - aminokiseline: L-glutaminska, L-lizin, L-metionin, L-triptofan, L-histidin - vitamini i faktori za rast: riboflavin (B 2 ), ciankobalamin (B 12 ), giberelinska kiselina 2

1. Bioprocesi - enzimi: amilaze, katalaza, celulaze, kolagenaza, glukoza oksidaza, lipaza, pektinaza, proteaza - organska otapala: etanol, aceton, butanol, butandiol, dihidroksiaceton, glicerol - goriva: etanol, metan - polimeri: dekstrani, pululani - ostali produkti: nukleotidi i nukleozidi, alkaloidi, vakcine insekticidi Tablica 1.1. Primjena cijelih stanica u industrijskim procesima Grupa Produkt Supstrat Mikroorganizam Enzim Kompanija Lijekovi i njihovi intermedijeri (S)-2-Kloropropionska kiselina L-DOPA (R,S)-2- Kloropropionska kiselina Polikatehol, + piruvat, NH 4 L-Pipekolna kiselina L-Lizin Rekombinantna E. coli CDP-kolin Glutation Orotinska kiselina, kolin klorid Glutamska kiselina, cistein, glicin Pseudomonas sp. dehalogenaza Avecia Erwinia herbicola Tirozin fenol liaza Ajinomoto Corynebacterium ammoniagenses Rekombinantna E. coli Hidroksiprolin Prolin Rekombinantna E. coli Kiralni alkoholi Ketoni Rekombinantna E. coli 5-Hidroksipirazinkarboksilna kiselina (S)-Piperazin-2- karboksilna kiselina Lizin aminotransferaza (iz Flavobacterium lutescenns) Pirolin -5- karboksilat reduktaza (iz E. coli) Višestupnjevita uz generiranje ATP γ-glutamilcistein sintetaza, glutation sintetaza (iz E. coli) uz generiranje ATP Prolin hidroksilaza (iz Streptomyces sp.) Oksidoreduktaze (iz različitih izvora) Mercian Kyowa Hakko Kyowa Hakko Kyowa Hakko Kaneka 2-Cijanopirazin Agrobacterium sp. Nitrilaza, hidroksilaza Lonza (R,S)-Piperazin-2- Klebisella terrigena Amidaza Lonza karboksilna kiselina 4-[6-Hidroksipiridin- (S)-Nikotin Pseudomonas sp. Višestupnjevita Lonza 3-il]-4-oksobutirat Natrij pravastatin Kompaktin Streptomyces Cytochrome P450 Sankyo carbophilus (2R,5R)-Heksandiol (2,5)-Heksandion Lactobacillus kefir Alkohol JFC dehidrogenaza Vitamini Pantotenat - intermedijer DL-Pantoil lakton Fusarium oxysporum Lactonase Daiichi Fine Chemical Askorbat-2-fosfat Askorbinska Sphingomonas Fosfokinaze Kyowa Hakko kiselina trueperi Nikotinamid 3-Cijanopiridin Rhodococcus Nitril hidrataza Lonza rhodochrous J1 Amino L-Amino kiseline DL-Hidantoini Rekombinantna E. L-hidantoiaza i Degussa kiseline coli L-carbamoilaza Aditivi-okus 5'-GMP XMP Rekombinantna E. coli XMP aminaza (GMP sintaza iz E. Kyowa Hakko Insekticidi Guanozin, pirofosfat Rekombinantna E. coli 5'-IMP Inozin Rekombinantna E. coli Inozin, pirofosfat Rekombinantna E. coli 6-Hidroksinikotinska kiselina Niacin Achromobacter xylosoxidans coli) AP/PTaza (iz Escherichia blattae) Guanozin/inozin kinaza (iz E. coli) AP/PTaza (iz Escherichia blattae) Niacin hidroksilaza Ajinomoto Kyowa Hakko Ajinomoto Lonza 3

1. Bioprocesi Produkti pripravljeni biotransformacijom iz različitih kemikalija Kao što je već navedeno cijele stanice se mogu upotrebljavati u nerastućoj fazi kao nosilac biokatalizatora, te na taj način proizvoditi određeni produkt iz odgovarajućeg supstrat. Primjeri primjene cijelih stanica u industrijskim procesima dati su tablici 1.1. 1.3. UZGOJ MIKROORGANIZAMA Mikrobne procese često opisujemo kao procese u kojima sudjeluju tri faze: plin (zrak), tekućina (hranjiva podloga) i čvrsta tvar (mikroorganizam) Međutim to ipak nije tako jednostavno ako znamo da su ti procesi bazirani na biokatalitičkim reakcijama koje kataliziraju enzimi, što ih mikroorganizmi sintetiziraju i razgrađuju u toku svog životnog ciklusa. To su izrazito nestacionarne biokataltičke reakcije jer proces nastajanja produkta mikrobnog metabolizma ovisi prije svega o uvjetima rasta mikroorganizma. Uvjeti za rast i sintezu enzima ne moraju biti i nisu uvijek jednaki uvjetima za biokatalitičku konverziju supstrata u željeni produkt. Zato se često mikrobni procesi provode u dvije vremenski odijeljene faze. U prvoj fazi se osiguravaju optimalni uvjeti za rast mikroorganizama i biosintezu potrebnih enzima. U drugoj fazi se koristi biomasa (cijele stanice) ili enzim za biokatalitičku reakciju. Tok mikrobnog procesa ovisi o tipu procesa vrsti mikroorganizma ili enzima, fizikalnim i kemijskim svojstvima supstrata. Uzgoj mikroorganizma započinje inokulacijom (nacjepljivanjem) hranjive podloge s odabranom mikrobnom kulturom. Inokulum je inicijalna količina aktivnih mikrobnih stanica koje se relativno brzo umnožavaju u hranjivom supstratu s ciljem da: - Tijekom rasta transformiraju osnovni supstrat (izvor ugljika) u željeni produkt (biomasu ili neki drugi metabolit) - U stacionarnoj fazi rasta daju željeni produkt kao rezultat biosinteze nekog sastojka hranjive podloge FAZE PROCESA OPERACIJE Sirovina Pripremna faza Priprava hranjive podloge Priprava inokuluma Sterilizacija Bioreakcija Pročišćavanje produkta Produkt Proizvodnja biomase Biosinteza metabolita Filtracija Centrifugiranje Sedimentacija Flokulacija Razbijanje stanične stijenke Ekstrakcija Ultrafiltracija taloženje Kristalizacija Kromatografija Sušene Pakiranje Slika 1.1. Postupci u procesu uzgoja mikroorganizama i biosinteze. U oba slučaja je brzina nastajanja produkta funkcija koncentracije i biokemijske aktivnosti biokatalizatora u mikrobnoj stanici 4

1. Bioprocesi Uzgoj mikroorganizama i proizvodnja produkata tijekom fermentacije spada u relativno zahtjevnije postupke u biotehnologiji. Sam proces se obično sastoji od tri dijela (Slika 1.1.). Pripremna faza uključuje pripravu hranjive podloge, pripravu biološkog katalizatora (inokuluma), sterilizaciju hranjive podloge, bioreaktora, te dodataka u bioreaktor. Nakon faze pripreme slijedi faza u kojoj se odvija bioreakcija. Cilj ove faze je konverzija supstrata u biomasu ili biokemijske produkte. Navedeno se odvija djelovanje cijelih stanica (živih ili neživih) ili pročišćenih enzima. Ova faza se odvija u bioreaktoru. Materijali proizvedeni u bioreaktoru se obično moraju dalje pročišćavati kako bi se dobili u upotrebljivom obliku. Procesi pročišćavanja odnosno izolacije produkta su uglavnom fizički separacijski procesi. U ove ubrajamo procese kruto-kapljevina (centrifugiranje, filtracija, sedimentacija, flotacija, razbijanje stanica, taloženje, kristalizacija, adsorpcija, separacija kromatografijom, membranska separacija, ekstrakcija kapljevina-kapljevina, destilacija, pervaporacija i sušenje. Pročišćeni produkt može biti u različitim fizičkim oblicima (tekući, prašak, kristalinični, emulzija), te stoga mogu biti potrebni dodatni koraci kako bi se produkt stabilizirao i oblikovao. 1.3.1. Uvjeti za rast mikroorganizama Mikroorganizmi mogu rasti u umjetno stvorenim uvjetima, na ili u specifičnim hranjivim supstratima, koji su slični ili se razlikuju od onih u prirodi. Da li će i kako će neki mikroorganizam rasti u umjetnoj sredini, ovisi o djelovanju te sredine na mikroorganizme. Bitne značajke o kojima ovisi rast mikroorganizama su: sastav hranjiva podloge, koncentracija kisika, ph i temperatura Hranjiva podloga se još naziva komina za uzgoj mikroorganizma, odnosno proizvodnju određenog mikrobnog metabolita. Hranjiva podloga se sastoji od vode, izvora organske tvari, mineralnih soli (K +, Mg 2+, Fe 3+, Zn 2+,Na +, Mn 2+, Cl -, CO 3 2-... elementi u tragovima), pomoćni faktori rasta (vitamini, aminokiseline, purini, pirimidini), prekursori. Voda čini 80-90 % težine mikroorganizma. Gotovo sve kemijske reakcije u živoj stanici odvijaju se u vodenoj otopini. Voda služi i kao reaktant u mnogim kemijskim reakcijama. Ona isto tako omogućava suspendiranje mikroorganizama u otopini hranjivih sastojaka, a pogodan je medij za regulaciju temperature jer omogućava brzi prijenos topline Svi mikroorganizmi trebaju za rast one tvari koje su i same stanični sastojci (elementarni sastav suhe tvari mikrobnih stanica). Te tvari moraju biti otopljene, suspendirane ili emulgirane u vodi bilo u elementarnom ili kompleksnom obliku. Mikroorganizmi koriste različite ugljikove spojeve kao izvor ugljika i kao izvor energije. Kako bi se zadovoljila dvostruka potreba za ugljikom tj. kao sastojkom stanice i izvora energije, hranjiva podloga mora sadržavati više ugljika od onoga što proizlazi iz bilance ugljika u stanici. Izvor ugljika je određen za svaki pojedini organizam. Da određeni mikroorganizam može metabolizirati pojedini izvor ugljika mora imati transportni mehanizam koji će spoj propustiti unutar stanice, te mora imati enzim u stanici koji će razgraditi isti taj spoj. Mineralne soli su potrebne za rast svih mikroorganizama. One djeluju kao aktivatori, ali i stabilizatori pojedinih enzima. Pomoćni faktori rasta se dodaju jer neki mikroorganizmi izgube ili nisu nikad ni imali sposobnost sinteze dovoljnih količina svih organskih spojeva (aminokiselina, purinskih i piridimskih nukleotida, vitamina) potrebnih za sintezu staničnih sastojaka. Mikroorganizmi koji trebaju određene faktore rasta nazivaju se auksotrofni, za razliku od prototrofnih mikroorganizama tj. onih koji ne trebaju faktore rasta jer ih mogu sami sintetizirati. Prekursori su tvari koje mikroorganizmi ne koriste za rast, već ih ugrađuju u produkte sekundarnog metabolizma. Prema potrebi za kisikom mikroorganizme dijelimo na obligatne aerobe koji zahtijevaju kisik za svoj rast i obligatne anaerobe koji rastu jedino u odsutnosti kisika. Između ove dvije 5

1. Bioprocesi skupine postoji mnogo mikroorganizama koji dobro rastu u odsutnosti ili prisutnosti kisika (fakultativni anaerobi ili aerobi). Tijekom mikrobnog rasta ph se mijenja jer se iz hranjive podloge nejednako troše pojedini kationi i anioni, a nastaje čitav niz organskih kiselina (mliječna, octena, pirogrožđana itd.). Zbog toga hranjive podloge moraju biti dobro puferirane ili se ph održava konstantnim pomoću kontrolnog i regulacijskog sistema u bioreaktoru. Bakterije obično traže ph podloge blizu neutralnog. Većina kvasaca raste najbolje u kiselim sredinama pri ph 3-6, a neke plijesni vole još kiseliji medij. S izuzetkom pojedinačnih iznimaka većina mikroorganizama raste u temperaturnom rasponu između 20 C i 30 C. Oni koji imaju maksimalnu brzinu rasta ispod 20 C su psihrofilni, između 30 C i 35 C su mezofilni, a oni iznad 50 C su termofilni (Slika 1.2.). Specifična brzina rasta μ/μ max psihrofili mezofili termofili 0 10 20 30 40 50 60 70 Temperatura, C Slika 1.2. Ovisnost rasta o temperaturi za psihrofilne, mezofilne i termofilne mikroorganizme. 1.3.2. Krivulja rasta mikroorganizma Rast i razvoj mikroorganizama u uvjetima šaržnog uzgoja odvija se u nekoliko faza. Uobičajeno, promjena broja živih stanica mikroorganizma s vremenom, može se prikazati slikom 1.3. Mikroorganizmi se ne počnu odmah razmnožavati kada se nacijepe na hranjivu podlogu jer je potrebno određeno vrijeme da se stanice priviknu na okolinu koja može biti ili je drugačija od one iz koje su stanice prenesene. Pri tome stanice povećavanju svoj volumen, sintetiziraju enzime i intermedijere potrebne za rast i razmnožavanje. To prividno mirovanje nazivamo fazom indukcije koja traje tako dugo dok ne nastane dovoljna količina spomenutih tvari. Ako su stanice mlade, a okolina povoljna ova će faza biti vrlo kratka, a ponekad može potpuno izostati. Kod starih stanica i nepovoljne okoline biti će obrnuto. Kako u inokulumu ima veliki broj stanica očito je da one ne mogu biti jednako stare (nisu rasle sinkronizirano), pa je i njihova fiziološka aktivnost različita. Zato se bez obzira na pogodnost uvjeta okoline sve stanice neće početi istovremeno razmnožavati. U pravilu potrebno je neko vrijeme da se sve stanice počnu dijeliti. Taj vremenski razmak se naziva faza postepenog ili ubrzanog rasta. Kod veoma aktivnih kultura ta faza traje vrlo kratko i eksperimentalno ju je teško odrediti jer se broj novonastalih mladih stanica povećava sa vremenom u geometrijskoj progresiji. Zbog toga se na ovu fazu odmah nadovezuje faza eksponencijalnog rasta ili log faza. To je faza najbržeg razmnožavanja mikroorganizama i proizvodnje metabolita vezanih uz rast koji nastaju kao rezultat kompleksnih oksido-redukcija (npr. etanol, octena i mliječna kiselina). 6

1. Bioprocesi Broj stanica se udvostručava stalnom brzinom dok postoji dovoljno hrane, a koncentracija otrovnih produkata metabolizma ne poraste do vrijednosti koje usporavaju ili onemogućavaju rast. Tijekom stacionarne faze stanice poprimaju maksimalnu veličinu i volumen populacije je najveći. Ova faza nastupa kada koncentracija neke od komponenata neophodnih za rast ili koncentracija nekog katalitičkog otrova dostiže takvu razinu koja više ne može podržati maksimalnu brzinu rasta. Faza odumiranja stanica može imati različito vrijeme trajanja, koje je ovisno o uvjetima provedbe mikrobnog procesa i vrsti mikroorganizama. Ova faza počinje kada pojedine stanice liziraju (dolazi do pucanja stanične stjenke), pa unutarstanične komponente iz takvih stanica (šećeri, aminokiseline, vitamini) služe za održavanje životnih funkcija preostalih stanica. 10 biomasa supstrat BIOMASA, SUPSTRAT 8 6 4 faza indukcije eksponencijalna faza stacionarna faza faza odumiranja stanica 2 0 0 10 20 30 Slika 1.3. Krivulja rasta mikroorganizama VRIJEME Svaka od ovih faza značajna je za mikrobiološki proces koji se proučava ili vodi pa je poznavanje zakonitosti zbivanja u svakoj pojedinoj fazi od izuzetne važnosti. Tako je, primjerice, osnova dobrog oblikovanja procesa smanjiti vrijeme trajanja faze indukcije i što više produžiti vrijeme trajanja eksponencijalnog rasta. 1.4. METABOLIZAM STANICE Biološke stanice djeluju kao složeni kemijski reaktori u kojima se odvija veliki broj kemijskih reakcija kataliziranih enzimima. Ove reakcije omogućavaju razvoj i razmnožavanje stanica i nazivaju se reakcije metabolizma. Reakcije metabolizma dijele se na: reakcije katabolizma u kojima se obavlja razgradnja organskih spojeva sa ciljem dobivanja energije i spojeva male molekulske mase (primarni metaboliti), koji služe kao početne tvari za sintezu sastojaka stanične biomase, i reakcije anabolizma u kojima se, uz trošenje energije, obavlja biosinteza sastojaka mikrobne biomase i sinteza sekundarnih metabolita. Imajući u vidu da u sastav stanica ulazi veliki broj različitih spojeva, kao i činjenicu da ih stanica može skoro sve sintetizirati iz malog broja jednostavnih spojeva, može se zaključiti da su anaboličke reakcije daleko brojnije i složenije. Sve reakcije koje su vezane za rast stanice, i kataboličke i anaboličke dio su takozvanog primarnog metabolizma stanice Na ovim reakcijama bazirana je industrijska proizvodnja 7

1. Bioprocesi stanične biomase koja se direktno koristi za potrebe čovjeka (na primjer, pekarski kvasac) ili se koristi kao izvor proteina jednostaničnih mikroorganizama. Stanice na prijelazu iz eksponencijalne u stacionarnu fazu rasta često počinju sintetizirati i izlučivati u okolinu spojeve u relativno visokim koncentracijama koja nemaju vidljivu ulogu u rastu stanice. Sinteza ovih spojeva se zove sekundarni metabolizam, a nastali spojevi zovu se sekundarni metaboliti. Veći dio biotehnološke proizvodnje baziran je na proizvodnji sekundarnih metabolita. Regulacija metabolizma od životnog je značaja za stanice bioloških vrsta, ali i za biotehnološku proizvodnju. Poremećaj metabolizma izazvan vanjskim utjecajem može imati pozitivan ili negativan utjecaj na razvoj i razmnožavanje stanica. Usmjeravanje staničnog metabolizma, uz očuvanje životnih funkcija, koristi se u biotehnologiji za proizvodnju primarnih (aminokiseline, organske kiseline, etanol, aceton i butanol, vitamini B2 i B12 itd.) i sekundarnih (aminošećeri, kinoni, epoksidi, ergotalkaloidi, glutaridi, laktami, naftaleni, peptidi, polieni, terpeni, tetraciklini itd.) metabolita. S aspekta biotehnološke proizvodnje, namjerno izazvane pozitivne mutacije i genetske transformacije imaju, između ostalog, za cilj metabolizam stanica usmjeriti ka povećanoj produkciji metabolita koji predstavljaju korisne produkte. Pomoću dva osnovna sistema regulacije kontrolira se sinteza primarnih metabolita koji su zasnovani na aktivnosti induktivnih enzima. To su: 1) kontrola enzimske aktivnosti (povratna inhibicija) 2) kontrola sinteze enzima (povratna represija). Kontrola enzimske aktivnosti (povratna inhibicija) Krajnji metabolit metaboličkog puta E inhibira aktivnost enzima koji katalizira jednu od reakcija tog puta, obično prvu (A B). Kada krajnji metabolit dostigne kritičnu koncentraciju, on se veže za enzim na alosteričkom mjestu, čime se onemogućava vezivanje supstrata za enzim i metabolički put se prekida. Ovo vezivanje je reverzibilno i kada koncentracija krajnjeg metabolita opadne, enzim se ponovo oslobađa i omogućava nastavak reakcije metaboličkog puta. A B C D E Kontrola sinteze enzima (povratna represija) Kontrola metabolizma se ostvaruje na nivou gena. U ovom slučaju, krajnji produkt metaboličkog puta E sprječava sintezu jednog ili više enzima koji katalizira reakcije tog metaboličkog puta. Sprječavanje sinteze enzima ostvaruje se tako što se krajnji produkt metabolizma kombinira sa genomom koji je odgovoran za sintezu enzima. A B C D E Kontrola složenijih, razgranatih biosintetskih putova u kojima nastaje više produkata, znatno je složenija. U principu svi krajnji produkti tog puta nisu iste važnosti za stanicu. Zbog toga inhibicija jednostavnom povratnom vezom ili povratnom represijom od strane samo jednog manje bitnog krajnjeg produkta nastalog u suvišku, dovela bi stanicu u situaciju da prestane sinteza i za nju bitnih krajnjih produkta, što bi imalo za posljedicu zaustavljanje njenog rasta. Za sprječavanje takvog slučaja stanica raspolaže sa više mehanizama regulacije: 1) Regulacija izoenzimima 2) Usklađena regulacija 8

1. Bioprocesi 3) Kumulativna regulacija Regulacija izoenzimima. Izoenzimi kataliziraju istu reakciju A B u metaboličkom nizu ali su kontrolirani drugim krajnjim produktom. Prema slici zajednička reakcija je A B i nju kataliziraju tri izoenzima koje pojedinačno inhibiraju krajnji produkti G, H i E. D E A B C F G Usklađena regulacija. U ovom slučaju metabolički put je reguliran samo jednim enzimom. Međutim, za inhibiciju tog enzima, potrebno je da u suvišku bude više od jednog krajnjeg produkta, koji zajedno provode regulaciju. H D E A B C F G H Kumulativna regulacija. Kod ove regulacije svaki krajnji produkt parcijalno inhibira metabolički put ako je u suvišku. Za potpunu inhibiciju potrebno je kumulativno djelovanje više krajnjih produkta. D E A B C F G H 1.4.1. Regulacija biosinteze primarnih i sekundarnih metabolita Osnovne razlike primarnog i sekundarnog metabolizma prikazane su u tablici 1.2. Sekundarni metaboliti najčešće nisu bitni za rast i razmnožavanje stanica, iako imaju funkciju u njenom preživljavanju. Za razliku od primarnog metabolizma, gdje su greške (mutacije) u biosintetskoj osnovi najčešće smrtonosne za stanicu, gubitak sposobnosti sinteze sekundarnih metabolita nije životno bitan. Značajno za sekundarni metabolizam je da se on najčešće događa pri nižoj specifičnoj brzini rasta stanice, odnosno u stacionarnoj fazi. Za sekundarni metabolizam polazni spojevi su isti kao i za primarni metabolizam. To znači da su ova dva metabolizma usko povezana i da je sekundarni metabolizam reguliran na isti način kao i primarni. Klasičan primjer je biosinteza peptidnih antibiotika (bacitracin, geramicin S) kao sekundarnih metabolita koje sintetiziraju bakterije iz roda Bacillus. Kako su za njihovu 9

1. Bioprocesi biosintezu potrebne aminokiseline koje su produkti primarnog metabolizma, narušavanje kontrole njihove biosinteze u primarnom metabolizmu može imati za posljedicu povećanu biosintezu antibiotika. Drugi primjer je kod biosinteze penicilina pomoću pljesni Penicillium chrysogenum u koju su uključeni cistein, valin i α-aminoadipinska kiselina koji su produkti primarnog metabolizma. Poremećaj regulacije njihove biosinteze značajno utječe na sintezu penicilina. Tablica 1.2. Karakteristike primarnog i sekundarnog metabolizma Primarni metabolizam Prisutan kod svih mikroorganizama Značajan za rast mikroorganizama Biosinteza u različitim uvjetima rasta Prisutan tokom cijelog ciklusa rasta Fiziološka uloga poznata Dobiva se jedan određeni produkt Produkti su u principu jednostavne kemijske strukture Generalni način rješavanja proizvodnih (bioloških) problema Sekundarni metabolizam Specifičan za mikrobiološku vrstu Nije neophodan za rast mikroorganizama Biosinteza zavisi o uvjetima rasta Nastaje u kasnijoj fazi rasta (obično u stacionarnoj) Fiziološka uloga najčešće nepoznata Nastaje više sličnih produkata Produkti su u principu složene kemijske strukture Specifično rješavanje proizvodnih (bioloških) problema Postoji i niz drugih načina regulacije biosinteze sekundarnih metabolita. Najznačajniji su: indukcija enzima koji sudjeluju u biosintezi, regulacija povratnom spregom krajnjeg produkta sekundarnog metabolizma (njegovo kontinuirano separiranje), te katabolička regulacija supstrata koji se troši brzo u metabolizmu (zamjena inhibirajućeg supstrata neinhibirajućim, na primjer, glukoze fruktozom ili amonij iona drugim izvorom dušika). Za proizvodnju primarnih metabolita korisni su tzv. auksotrofni mutanti koji su izgubili sposobnost biosinteze nekog enzima. a b c d A B C D E Slika 1.4. Hiperprodukcija međuprodukta C pomoću auksotrofnog mutanta Prekomjerna proizvodnja metabolita kod mikroorganizama izbjegnuta je regulacijskim mehanizmima jer bi to predstavljalo beskoristan proces koji smanjuje sposobnost mikroorganizama da prežive u prirodi. Međutim neki mikroorganizmi s narušenom regulacijom mogu u određenim uvjetima preživjeti. Takvi mutanti dobiveni su kao rezultat programirane selekcije i usmjeravanja metabolizma u cilju dobivanja određenog produkta. Primjer za ovo je pokazan regulacijom prikazanom na slici 1.4. Enzim odgovoran za put iz C u D je izrezan i stanica za rast zahtijeva spoj E. Ako se ovaj spoj dodaje u hranjivu podlogu u maloj količini koja neće izazvati regulaciju inhibicijom ili represijom enzima doći će do povećane biosinteze spoja C. Na primjer, mutant takvih karakteristika dobiven je kod 10

1. Bioprocesi bakterije Bacillus subtilis. On je zavisan od arginina i njegovim dodavanjem u podlogu mutant biosintetizira L-citrulin. Prekursori. Prekursori su spojevi koja se mogu uključiti u metabolički put biosinteze krajnjeg metabolita koji je željeni produkt. Kako ne djeluju inhibirajuće, dodatkom prekursora u hranjivu podlogu moguće je izazvati povećanu produkciju metabolita i kod normalnih sojeva. Poznati prekursor za sintezu benzilpenicilna je feniloctena kiselina, a za vitamin B12, 5,6- dimetilbenzimidazol. 11

2. Kinetika rasta mikroorganizma 2. KINETIKA RASTA MIKROORGANIZMA U bioprocesima, u kojima su biokatalizatori žive stanice mikroorganizama, odigravaju se istovremeno i međusobno povezano rast, razmnožavanje, trošenje supstrata i sinteza primarnih i sekundarnih metabolita. Kinetika ovih procesa uključuje brzine rasta stanica mikroorganizama, potrošnju limitirajućeg supstrata iz hranjive podloge i sintezu metabolita, kao i utjecaj okolišnih uvjeta na kinetiku bioprocesa. Mikrobiološki procesi ovise o dva međusobno povezana faktora: mikroorganizmu okolišnim uvjetima u kojima se odvijaju procesi Mikrobiološki proces počinje inokulacijom hranjive podloge koja se nalazi u bioreaktoru. Komponente hranjive podloge (nutrienti, supstrati) se transportiraju iz okoliša u stanicu, a različiti produkti metabolizma, kao i višak energije iz stanice u okolinu. Nakon adaptacije inicijalne količine čiste kulture mikroorganizma (inokuluma), dolazi do rasta i razmnožavanja stanica i konverzije supstrata iz hranjive podloge u: biomasu, zbog povećanja količine mikroorganizma i željeni produkt, tj. primarni ili sekundarni metabolit. Brzina nastajanja biomase i produkta je funkcija koncentracije i biokemijske aktivnosti stanice mikroorganizma. Za uspješno izvođenje mikrobioloških procesa potrebno je poznavanje brzine rasta mikroorganizma pri određenim uvjetima Potrebno je poznavati uvjete za rast pojedinog mikroorganizma, kao i uvjete potrebne za proizvodnju stanica sa odgovarajućim fiziološkim sastavom nužnim za odvijanje željenog procesa. Za osnovne kinetičke podatke o bioprocesu nužno je mjeriti koncentraciju biomase, te koncentraciju supstrata. Također ako se tijekom proizvodnje dobiva i metabolit, koji je željeni produkt, tada se u kinetička razmatranja uključuje brzina nastajanja produkta. Najbrži rast se odvija u eksponencijalnoj fazi rasta u kojoj se broj stanica udvostručava stalnom brzinom, dok postoji dovoljna količina supstrata (izvora ugljika), a koncentracije toksičnih produkata metabolizma ne narastu do vrijednosti koje usporavaju ili onemogućavaju rast. Modeli mikrobiološkog rasta ovisno o načinu na koji opisuju zbivanja između stanica i okoline mogu se podijeliti u strukturne i nestrukturne modele. Strukturni modeli tretiraju stanicu kao složeni sustav i temelje se na opisu stvarne biološke slike zbivanja u stanici mikroorganizma. Oni uzimaju u obzir fiziološke promjene koje se odvijaju u stanicama. Nestrukturni modeli definiraju rast biomase kao funkciju makroskopskih varijabli - koncentracije i broja stanica, te promatraju stanicu kao crnu kutiju i ne uzimaju u obzir fiziološke promjene koje se događaju u stanici mikroorganizma. Oni se mogu primijeniti samo pri idealnim uvjetima ili u ranoj logaritamskoj fazi rasta. U praksi se koriste uglavnom pojednostavljeni modeli, koji približno realno opisuju mikrobiološke procese. Mikrobni rast je obično definiran vremenom potrebnim za udvostručavanje mikrobne biomase ili broja stanica. To vrijeme se naziva generacijsko vrijeme. Vrijeme udvostručavanja biomase može se razlikovati od vremena udvostručavanja broja stanica jer se biomasa može povećati bez povećanja broja stanica Ako se u nekoj hranjivoj podlozi vrijeme udvostručenja mase ili broja stanica ne mijenja s vremenom trajanja uzgoja, onda organizam raste eksponencijalnom brzinom i može se opisati izrazima 2.1. i 2.2. dx dt dn dt =μ X (2.1.) =μ N (2.2.) n gdje je: 12

2. Kinetika rasta mikroorganizma X- masena koncentracija stanica N brojčana koncentracija stanica μ - specifična brzina rasta na bazi mase stanice μ n - specifična brzina rasta na bazi broja stanica Specifičnu brzinu rasta možemo izračunati ako pretpostavimo da je vrijeme udvostručavanja stanica jednako tj.: t t t t t g g g g g N 2N 4N 8N 16N 32N... 0 tg 1 tg 2 tg 3 tg 4 tg n 2 N 2 N 2 N 2 N 2 N... 2 N a n predstavlja broj dioba i može se izračunati iz omjera ukupnog vremena i generacijskog vremena (jedn. 2.3.): t vrijeme n = = (2.3.) t generacijsko vrijeme g Na osnovu gore navedenih postavki može se izračunati broj stanica u određenom trenutku eksponencijalne faze (jedn. 2.4.) N N 2 N 2 t/t n g t = 0 = 0 (2.4.) U izrazu 2.4. N t je broj stanica u određenom vremenu t, a N 0 početni broj stanica. Logaritmiranjem i raščlanjivanjem izraza 2.4. dobiju se jednadžbe 2.5. i 2.6. N t = ln2 ln N t t 0 g (2.5.) lnn t 0639, = t+ lnn 0 (2.6) t g 0, 639 Uvrštavanjem, μ=, u jednadžbu 2.6. dobije se izraz 2.7. t g lnn t =μ t+ lnn0 (2.7.) μ predstavlja specifičnu brzinu rasta. Specifična brzina rasta je stalni parametar rasta svakog mikroorganizma na podlozi stalnog sastava i pri konstantnim uvjetima. Njezina vrijednost ovisi o nasljednim svojstvima mikroorganizma, vrsti i koncentraciji izvora ugljika, dušika, fosfora, kisika, tvarima rasta i početnoj koncentraciji mikroorganizma u podlozi. Masa mikrobnih stanica se u pravilu lakše određuje nego broj stanica te se jednadžba 2.7. obično piše u obliku: lnx =μ t+ lnx (2.8.) t 0 13

2. Kinetika rasta mikroorganizma 2.1. MONOD-OV MODEL MIKROBNOG RASTA Specifična brzina rasta je kao i brzina kemijske reakcije funkcija koncentracije reaktanata (supstrata). Reaktanti su u ovom slučaju bitni sastojci hranjive podloge ili supstrati za rast. Obično je samo jedan supstrat limitirajući i to izvor ugljika jer se hranjiva podloga sastavlja tako do ostali sastojci budu u suvišku. Kada se taj supstrat potroši prestaje eksponencijalna faza rasta. Ovisnost između brzine rasta i koncentracije limitirajućeg supstrata za rast (slika 2.1.) zapazio je Monod i opisao izrazom 2.9. μ=μ max S K + S S (2.9.) gdje je: μ max - maksimalna specifična brzina rasta S koncentracija supstrata K s - konstanta zasićenja jednaka koncentraciji supstrata kada je μ =0,5 μ max Specifična brzina rasta, μ 0,5μ max μ max K S Koncentracija supstrata, S Slika 2.1. Monod-ov model mikrobnog rasta Tipične vrijednosti K s su uglavnom jako male. Za izvor ugljika iznose 1-120 ovisno o mikroorganizmu. Kada je S >10 x K s, brzina rasta je jednaka maksimalnoj brzini rasta(μ = μ max ). Specifična brzina postaje ovisna o koncentraciji supstrata kada je S < 10 x K s. Zbog niske K s vrijednosti specifična brzina rasta je konstantna u eksponencijalnoj fazi rasta 2.2. UTJECAJ PRODUKTA NA BRZINU RASTA MIKROORGANIZMA Brzina rasta je ovisna i o koncentraciji produkta metabolizma koji može inhibirati rast (npr. etanol, octena kiselina, mliječna kiselina). Ovisnost između brzine rasta i koncentracije produkta koji ograničava rast zapazio je Jerusalimski i opisao izrazom 2.10. μ=μ max KP K + P P (2.10) gdje je: P - koncentracija produkta koji inhibira rast mikroorganizma, K P - konstanta zasićenja produkta koncentracija produkta kada je μ =0,5 μ max. U ovom slučaju je μ m = μ kad je P = 0. 14

2. Kinetika rasta mikroorganizma Specifična brzina rasta, μ 0,5μ max μ max K S Koncentracija produkta, P Slika 2.2. Ovisnost specifične brzine rasta o koncentraciji produkta koji inhibira rast Ovisnost specifične brzine rasta o koncentraciji produkta je prikazana na slici 2.2. Ovisnost brzine rasta o koncentraciji supstrata i produkta se može opisati izrazom 2.11. μ=μ max S KP K + S K + P S P (2.11.) 2.3. MONODOV MODEL RASTA UZ INHIBICIJU SUPSTRATOM Kao i kod enzimskih reakcija, pri rastu mikroorganizama inhibicija može biti kompetitivna i nekompetitivna Kompetitivna inhibicija se može prikazati sljedećim kinetičkim modelom: μ=μ max S (2.12.) KS KS + S + I K I Odnosno u lineariziranom obliku: 1 μ I K 1 1 1 KI μmax S μma x S = + + (2.13.) Jednadžba 2.13. je pravac s koordinatama 1/S i 1/μ, te se iz odsječaka na apcisi i ordinati, te nagiba mogu izračunati kinetički parametri rasta mikroorganizama, μ m, K S i K I. Ako se u jednadžbi 2.13. pretpostavi da I = 0, dobije se linearizirani oblik Monod-ove kinetike: 1 K S 1 1 = + μ μmax S μ max (2.14.) 15

2. Kinetika rasta mikroorganizma Nekompetitvna inhibicija se prikazuje pomoću kinetičkog modela oblika: S KI S μ=μ max =μmax KS + S KI + I I ( KS + S) 1+ KI (2.15.) 1/μ 1/μ max (1+I/K I ) Nekompetitvna Kompetitvna tgα 2 =(1+I/K I )K S /μ max I = 0 tgα 1 = K S /μ max 1/μ max 1/K S -1/K S (1/I+I/K I ) 1/S Slika 2.3. Grafički prikaz Monod-ovog lineariziranog modela rasta uz inhibiciju supstratom Jednadžba nekompetitvne inhibicije je ista kao i jednadžba inhibicije produktom (jedn. 2.11.) pa se može zaključiti da se neki produkti metabolizma ponašaju kao nekompetitvni inhibitori. Linearizirani oblik jednadžbe 2.15. je: 1 I K 1 1 I μ μ μ S = 1+ + 1+ KI max S max KI (2.16.) Jednadžbe 2.13., 2.14. i 2.16. su prikazane na slici 2.3. Iz grafa prikazanog na slici 2.3. može se zaključiti da između kinetičkog enzimskog Michaelis-Menteničinog modela i kinetičkog modela rasta mikroorganizama tj. Monodovog modela postoji analogija. 2.4. RAST U PRISUSTVU VIŠE IZVORA UGLJIKA U diskontinuiranim uvjetima, kada u podlozi ima više izvora ugljika, obično se prvo koristi onaj s najmanjom vrijednosti konstante zasićenja, pa tek kasnije ostali po hijerarhiji povećanja vrijednosti ove konstante. Kada u podlozi ima dva izvora ugljika, onda se ovakav rast naziva diauksični rast (slika 2.4.). 16

2. Kinetika rasta mikroorganizma X S K S,S1 <K S,S2 X S 2 S 1 t Slika 2.4. Diskontinuirani rast mikroorganizama u prisustvu dva različita izvora ugljika (diauksični rast) Ako podloga sadrži veći broj različitih izvora ugljika, onda se faze rasta odigravaju sukcesivno, pa se prelazi sa supstrata na supstrat neće zapaziti, kao kod dva supstrata. Posljedica pojave je smanjenje brzine rasta tokom vremena, ako se usporedi sa brzinom rasta u prisustvu samo jednog izvora ugljika. Kod složenih podloga, koje sadrže, uz više izvora ugljika, i druge komponente, kao što su aminokiseline, nukleotide, vitamine i druge intermedijere metabolizma, stanice prolaze kroz mnoga prijelazna stanja tijekom rasta. Tako, ako stanice rastu na podlozi koja sadrži intermedijer koje same sintetiziraju, do njegove sinteze neće doći dok se on ne iscrpi iz hranjive podloge. Rezultat rasta mikroorganizama na kompleksnim hranljivim podlogama je prikazan na slici 2.5. Na osnovu izgleda krivulje rasta može se pogrešno zaključiti da nema eksponencijalnog rasta. To je samo prividno, jer postoje eksponencijalne faze koji su spojene u nizu, što je prikazano sa isprekidanim linijama. ln (X) μ 3 μ 2 μ 1 Slika 2.5. Rast mikroorganizama na složenim podlogama t Ovakav izgled krivulja rasta je rasprostranjen kod industrijskih bioprocesa u kojima se koriste podloge složenog sastava. Kod bioprocesa, gdje više različitih supstrata ograničava brzinu rasta, koristi se sljedeća jednadžba: μ=μ m S1 S2 K + S K + S S1 1 S2 2... (2.17) 17

2. Kinetika rasta mikroorganizma 2.5. KINETIKA POTROŠNJE SUPSTRATA Razmnožavanje mikrobnih stanica nije moguće bez potrošnje hranjivih tvari iz podloge. Iako svaki od njih može imati utjecaj na brzinu rasta, tehnološki i ekonomski je najčešće zanimljiv samo jedan od njih, a to je najčešće izvor ugljika. Njega stanica troši za - biosintezu sastojaka biomase - proizvodnju energije i održavanje fiziološke aktivnosti stanica - sintezu produkata, odnosno metabolita koji se izlučuju izvan stanice Sukladno navedenom bilancu potrošnje supstrata može se opisati na slijedeći način: Promjena koncentracije supstrata Utrošak supstrata za rast Utrošak supstrata za održavanje = - - - Utrošak supstrata za sintezu proizvoda Potrošnja supstrata se može povezati s rastom pomoću tzv. koeficijenta prinosa biomase Y X/S, a s proizvodnjom produkta pomoću koeficijenta koji pokazuje stupanj konverzije supstrata u biomasu Y P/S. Pod održavanjem života stanica, podrazumijevaju se energetske potrebe za preživljavanjem i očuvanjem određenog stanja biomase, koje nisu direktno vezane sa sintezom biomase (na primjer, aktivan transport iona kroz staničnu membranu, kretanje stanice). Stoga se matematički brzina potrošnje supstrata opisuje izrazom 2.18: ds X = μ m X q X P dt YX/S YP/S (2.18.) gdje je: m energija održavanja (masa supstrata po masi biomase i vremenu) q P - specifična brzina sinteze produkta (masa produkta po masi biomase i vremenu) Y X/S stupanj konverzije supstrata u biomasu Y P/S stupanj konverzije supstrata u produkt 2.6. KINETIKA NASTAJANJA PRODUKTA Stanice mogu sintetizirati različite produkte. Postoji nekoliko sistema za klasifikaciju ovih produkata. Kinetički modeli su razvijeni za neke jednostavnije sustave. Jedan od najčešćih načina, koji se primjenjuje u opisivanju kinetike nastajanja produkta, klasificira produkte na temelju mehanizma njihovog nastajanja, tj. da li su rezultat primarnih metaboličkih funkcija ili nastaju sekundarnim metabolizmom. Konačni produkti energetskog i ugljikovog metabolizma su primarni metaboliti. Obzirom da je njihova proizvodnja proporcionalna rastu populacije stanica, oni se još nazivaju produkti vezani uz rast (growth associated, slika 2.6.A). Produkti kao što su antibiotici i vitamini se uglavnom u šaržnim kulturama proizvode na kraju eksponencijalne faze. Ovi sekundarni metaboliti se najčešće nazivaju produkti nevezani uz rast (non-growth associated, slika 2.6.C), te njihova kinetika ne ovisi o brzini rasta stanica. Uz ove dvije vrste produkata, postoje produkti čija se kinetika nalazi između, te se oni nazivaju produkti djelomično vezani uz rast (partially growth associated, slika 2.6.B). U njih spadaju aminokiseline, mliječna kiselina, intermedijeri iz ciklusa limunske kiseline, te ekstracelularni polisaharidi i otapala kao što su aceton i butanol. 18

2. Kinetika rasta mikroorganizma X P A X P X P B X P X P C X P t Slika 2.6. Kinetika rasta i nastajanja produkta u šaržnom procesu: a) Nastajanje produkta vezano uz rast stanica b) Nastajanje produkta vezano uz rast i masu stanica c) Nastajanje produkta nije vezano uz rast stanica (samo za masu stanica) t t Izrazi za brzinu za ove tri vrste produkata nastali su iz studije Luedekinga i Pireta za stvaranje mliječne kiseline uz Lactobacillus delbrueckii. Naime oni su pronašli da proizvodnja mliječne kiseline ovisi o koncentraciji stanica i o brzini njihova nastajanja, te su predložili slijedeći izraz: r P = α r + β c = αμ c + β c (2.19.) X X X X Vidljivo je da se ovaj izraz može podijeliti na izraz koji je vezan za rast (αμ c X ), te onaj koji nije vezan(βc X ). Prema ovom pristupu proizlaze tri vrste produkata obzirom na rast stanice: - vezani uz rast rp = αμ c X (2.20.) -nevezani uz rast rp = β c X (2.21.) -djelomično vezani uz rast r = αμ c + β c (2.22.) P X X 2.7. KONTINUIRANI UZGOJ MIKROORGANIZAMA Stacionarno stanje mikrobne okoline može se ostvariti tako da se zatvoreni tj. šaržni sistem uzgoja pretvori u otvoreni. To znači da u dobro miješanu mikrobnu kulturu treba dovoditi svježu hranjivu podlogu uz istovremeno odvođenje jednake količine iskorištene podloge koja sadrži mikrobne stanice i produkte mikrobnog metabolizma. U principu to je oponašanje uvjeta kontinuiranog rasta mikroorganizama u prirodnim vodotocima i probavnom traktu ljudi i životinja. Ova prirodna pojava kontinuiranog rasta se nastoji iskoristiti pri umjetnom uzgoju mikroorganizama u laboratoriju i industrijskom mjerilu. Kontinuirani uzgoj mikroorganizama se ostvaruje na način da se u dobro miješanu mikrobnu kulturu dovodi svježa hranjiva podlogu uz istovremeno odvođenje jednake količine iskorištene podloge koja sadrži mikrobne stanice i produkte mikrobnog metabolizma. Koristi se u: 1. Znanstveno istraživačkom radu za proučavanje: - diferencijacije stanica - regulacije sinteze enzima ili staničnih metabolita - transporta hranjivih tvari u stanicu - parametara uzgoja u cilju optimiranja procesa - tehnoloških svojstava mutanata 19

2. Kinetika rasta mikroorganizma 2. Praktičnoj primjeni za proizvodnju: - proteinske mikrobne biomase - mikrobnih metabolita - klasičnih fermentativnih produkata (pivo vino, ocat, etanol, mliječni proizvodi) - biološku obradu otpadnih voda Nakon početnih istraživanja teorije kontinuiranog rasta, u novije doba se ovi procesi naglo razvijaju i počinju primjenjivati u praksi, iako su i danas u industriji znatno više zastupljeni šaržni procesi. Razloga za to ima više, a glavni su: 1) genetske promjene kod mikroorganizama tokom dužeg provođenja procesa, 2) tehnički problemi za održavanje sterilnih uvjeta tijekom dužeg perioda 3) nedostatak pravih informacija o ponašanju mikroorganizama u prijelaznom, tj. nestacionarnom stanju. Uz navedene nedostatke, kontinuirani procesi se koriste u proizvodnji stočnog kvasca, pekarskog neaktivnog kvasca, anaerobnoj i aerobnoj obradi otpadnih voda itd. Produktivnost kontinuiranih procesa je znatno veća nego šaržnih procesa. U tablici 2.1. su navedeni primjeri mikroorganizama koji rastu i proizvode u kontinuiranom načinu rada. Tablica 2.1. Mikroorganizmi koji rastu i proizvode kontinuiranim načinom rada Mikroorganizam Streptomyces Acetobacter Clostridium Bacillus Saccharomyces Candida Penicillium Scenedesmus Produkt Streptomincin Octena kiselina Aceton i butanol Mliječna kiselina Etanol Pekarski kvasac Stočni kvasac Penicilin SCP Shematski prikaz mikrobioloških procesa po operacijama pripreme i izvođenja za diskontinuirani i kontinuirani način rada prikazan je na slici 2.7., a prednosti i nedostaci uzgoja u šaržnom i kontinuiranom reaktoru navedeni su u tablici 2.2. U kontinuiranom uzgoju mikroorganizam se stalno održava u eksponencijalnoj fazi rasta. Dotok svježeg supstrata odgovara brzini rasta odnosno brzini potrošnje supstrata. Za kontinuirani uzgoj mikroorganizma hranjiva podloga je sastavljena tako da su sve hranjive tvari osim supstrata u suvišku. Na taj način se koncentracijom supstrata kontrolira koncentracija stanica u bioreaktoru. 20