Fizičkohemijske metode za određivanje molarnih masa i veličine makromolekula Prof. dr Gordana Ćirić-Marjanović Fakultet za fizičku hemiju e-mail: gordana@ffh.bg.ac.rs
NAUKA O POLIMERIMA obuhvata hemiju, fizičku hemiju i fiziku polimera; obezbeđuje fundamentalna znanja potrebna za industrijsku primenu polimera (plastike, elastomeri, adhezivi, prevlake..). Takođe, ona je jedna od centralnih nauka za molekularnu biologiju, biohemiju i biofiziku. MAKROMOLEKUL: makros = veliki (grčki); molecula = mala masa (latinski) Makromolekul je molekul sastavljen od velikog broja atoma, stoga ima veliku relativnu molekulsku masu (Mr) koja može da iznosi kod sintetičkih makromolekula od nekoliko stotina do nekoliko miliona, a kod nekih bioloških makromolekula Mr je u rangu milijardi. POLIMER: polis= mnogo; meros = deo (grčki) IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) tretira pojmove makromolekul i polimer kao sinonime. Termin polimerni molekul implicira višestruko ponavljanje. Ovaj pojam znači da se polimerni molekul sastoji od mnogo delova (tzv. mer-ova) koji predstavljaju jedinice izvedene iz molekula niskih relativnih molekulskih masa i da se ovi mer-ovi višestruko ponavljaju u polimernom molekulu. Primer je polistiren. Termin makromolekul ne implicira ništa o strukturi, ali govori o tome da je molekul veliki. Na primer, molekuli enzima su makromolekuli sastavljeni od stotine ili hiljada jedinica koje su α-amino kiseline -NH-CHR-CO- sa do 0 različitih supstituenata R. Same α-amino kiseline su u enzimu poređane po neponavljajućem redosledu, npr. ala-gly-lys-leu-...
Oligomeri su molekuli srednjih relativnih molekulskih masa, sa malim brojem ponavljajućih monomernih strukturnih jedinica, najčešće do 0. Na osnovu broja strukturnih ponavljajućih jedinica polimeri se dele na homopolimere i kopolimere (heteropolimere). Homopolimer je sastavljen od samo jedne vrste monomera (mer-a), a kopolimer je polimerni molekul sa više vrsta mer-ova (tj. kopolimeri nastaju reakcijom više različitih monomera) A A A A A A A A A Homopolimer A = Monomerna jedinica (ponavljajuća jedinica; mer) H C CH CH CH CH CH CH CH CH CH n stiren-monomer polistiren polistiren Samo raskidanjem kovalentne veze između monomernih jedinica (merova) može doći do razlaganja makromolekula. MONOMER (G: monos = jedan; meros = deo) linearan razgranat umrežen lestvičast cikličan
POLIMERI u svakodnevnom životu MONOMER(I) POLIMER PRIMENA i identifikacioni kod Etilen (eten) Polietilen LDPE HDPE Propilen (propen) Polipropilen
Polimeri u svakodnevnom životu MONOMER(I) POLIMER PRIMENA i identifikacioni kod Etilen glikol Poli(etilen tereftalat) Tereftalna kiselina PET Stiren Polistiren
Polimeri u svakodnevnom životu MONOMER(I) POLIMER PRIMENA Za najlon-6,10: Najlon Električni izolatori (najlon 6,10) Sebacoil hlorid Najlon-6,10 Heksametilendiamin
Polimeri u svakodnevnom životu MONOMER(I) POLIMER PRIMENA Izopren Gume Poliizopren Izobuten i izopren Butil guma Stiren i butadien Stiren-butadien guma (SBR) Butadien Polibutadien
Makromolekuli u našem organizmu Deoksiribonukleinska kiselina (DNA) Svaki makromolekul DNK se sastoji od dva lanca, povezana vodoničnim vezama u dvostruki heliks. Ćelija je osnovna jedinica života, a DNA se nalazi u jedru ćelije i služi da skladišti praktično sve informacije neophodne za funkcije ćelija, pre svega skladišti informacije o strukturi proteina (enzima). Ribonukleinska kiselina (RNA) je jednolančana, strukturno slična molekulu DNA i služi za prenos informacija koje su uskladištene u DNA do npr. mesta gde se sintetiše protein u ćeliji. Genetska oštećenja su u stvari oštećenja na DNA. Polimerizacija i razgradnja makromolekula se stalno dešavaju u organizmu.
Makromolekuli u našem organizmu Glikogen eritrociti Glikogen je razgranati polisaharid. Jedna globula glikogena sadrzi oko 30 000 jedinica glukoze. U jezgru je protein glikogenin koji katalizuje pretvaranje glukoze u glikogen. Glikogen se nalazi u mišićima, jetri i eritrocitima. Glukoza Kada je potrebna dodatna energija za rad misića glikogen se razlaže na manje molekule glukoze koji dalje učestvuju u procesima koji daju tu dodatnu energiju.
Makromolekuli koje unosimo u organizam hranom Polisaharidi: skrob, celuloza Skrob i celuloza su homopolimeri glukoze Amiloza SKROB Amilopektin Ugljeni hidrati (šećeri) dele se na: -Monosaharide (glukoza) -Disaharide (maltoza) -Oligosaharide -Polisaharide CELULOZA
Makromolekuli koje unosimo u organizam hranom Proteini: iz jaja, mesa, soje Proteni su polipeptidi koji sadrže veliki broj različitih aminokiselina Albumin glicin alanin valin leucin Albumin je glavni protein krvne plazme ljudi. On reguliše osmotski pritisak krvi. Vezuje vodu, katjone, masne kiseline, transportuje hormone, bilirubin i dr. Nalazi se u belancetu jajeta. To je globularni protein. izoleucin
Veličina makromolekula Veličina polimernih lanaca predstavlja jednu od najvažnijih karakteristika polimera od koje zavise mnoga druga njihova svojstva (npr. mehanička i toplotna svojstva, viskoznost rastopa ili rastvora polimera i dr.). Tako na primer, tvrdoća polimera raste sa njegovom molarnom masom. Zbog veličine molekula polimeri su neisparljivi. Molarna masa (M) predstavlja masu jednog mola supstancije (makromolekula) i izražava se u kg/mol.. Kao mera veličine makromolekula koristi se i relativna molekulska masa (M r ) koja predstavlja odnos mase makromolekula i 1/1 mase atoma ugljenika ( 1 C). M r je bezdimenziona veličina. Molarna masa izražena u jedinicama g/mol brojno je jednaka relativnoj molekulskoj masi, zbog čega IUPAC preporučuje upotrebu ove jedinice (iako nije po SI sistemu). Treći način da se opiše veličina makromolekula je stepen polimerizacije (X), koji predstavlja broj monomernih ostataka od kojih je izgrađen jedan homopolimerni lanac. Stepen polimerizacije je direktno proporcionalan molarnoj masi polimera. Za homopolimere, stepen polimerizacije se izračunava kao količnik molarne mase makromolekula M i molarne mase monomernog ostatka, M o : X = M / M o Tako na primer, za polietilen sa stepenom polimerizacije X=100 molarna masa M predstavlja proizvod 100 i M o =8 g/mol, odnosno M=800 g/mol.
Srednje molarne mase makromolekula
Srednja brojna molarna masa
Srednja brojna molarna masa
Srednja masena molarna masa
Srednja masena molarna masa
Indeks polidisperznosti
Srednja z-vrednost molarne mase
Srednja viskozimetrijska molarna masa
Raspodela molarnih masa polimera Diferencijalna kriva raspodele može se predstaviti i kao masena raspodela molarnih masa: m i = n i M i = f (X i ) ili n i M i = f(m i ) ili w i = f(m i ). U zavisnosti od broja pikova raspodela molekulskih masa može biti monomodalna, bimodalna, trimodalna... Slika 1. Diferencijalna raspodela molarnih masa (dužina lanaca) polimernog uzorka.
Kapilarni viskozimetri Viskozimetri koji se uobičajeno koriste za rastvore polimera su Ostwald-ovog, Fenski-jevog i Ubbelohdeovog tipa. Svi su bazirani na merenju toka tečnosti kroz cev. Ostwald-ov viskozimetar Određivanje molarne mase polimera na osnovu viskoznosti Ostwald-ovim viskozimetrom meri se vreme t proticanja tečnosti kroz kapilarnu cev dužine l odnosno vreme za koje menisk padne od tačke A do tačke B. Viskoznost se računa prema Poazejevom zakonu: 4 r t η = π 8lV Pritisak pod kojim se tečnost kreće kroz cev je: Δp = ρgh gde je ρ gustina tečnosti, g gravitaciono ubrzanje i h razlika nivoa tečnosti između dva kraka viskozimetra. p gde je r radijus kapilare, Δp razlika pritisaka na početku i na kraju posmatranog dela cevi, V zapremina tečnosti koja protekne za vreme t kroz deo cevi dužine l. Najčešće se vrši relativno određivanje nepoznatog koeficijenta viskoznosti η 1 ispitivane tečnosti u odnosu na tečnost poznatog koeficijenta viskoznosti η. Za dve različite tečnosti 1 i meri se vreme za koje iste zapremine tečnosti isteknu kroz istu vertikalnu kapilarnu cev (V, r, l je isto), tako da je: η 1 = η ρ t 1 ρ t 1
Unutrašnja viskoznost Relativna viskoznost, η r, predstavlja količnik viskoznosti rastvora i viskoznosti rastvarača: η η r = η η ( ρ t) rastvor rastvor = = rast var ač ηo ( ρ t) rast var ač t t rastvor rast var ač t-vreme isticanja Specifična viskoznost, η sp je data izrazom: η sp Unutrašnja viskoznost, [ η] η ηo = ηr 1 = η =lim c 0 η [ η] sp c o, definisana je kao: gde je c koncentracija polimera u g/100 ml ili u g/ml rastvora. Jedinica za [η] je ml/g ili 100 ml/g (dl/g), u zavisnosti od jedinice koncentracije rastvora. Unutrašnja viskoznost se naziva i granični broj viskoznosti ili Staudinger-ov indeks. η red = Redukovana viskoznost = η sp /c
Mark-Houwink-Sakurada (M-H-S) jednačina povezuje unutrašnju viskoznost sa viskozimetrijskom srednjom molarnom masom: gde su K i a konstante. Mark-Houwink-Sakurada jednačina je primenljiva na mnoge polimere i široko korišćena za određivanje molekulskih masa. Konstante K i a su specifične za dati sistem i zavise od para polimer- rastvarač i temperature. Eksponent a zavisi od oblika makromolekula. Teorija predviđa: a = 0 za sfere a = 0,5 0,8 za statistička klupka a = za krute štapiće Vrednost a je veća što su lanci krući i nižih molarnih masa (i obrnuto). Konstante K i a određuju se za svaki sistem polimer-rastvarač-temperatura kalibracijom pomoću molekulski uniformnih polimera (sa sa indeksom polidisperznosti ~1), iste strukture. Umesto korišćenja (frakcija) polimera sa indeksom polidisperznosti 1 kalibracija se može uraditi i sa polimerima koji imaju široke raspodele molarnih masa ako su im poznate srednje viskozimetrijske molarne mase.
Na θ temperaturi postoje samo interakcije kratkog ranga između susednih ili bliskih polimernih segmenata. Polimerni molekuli skupljeni su u kompaktnu formu. Flori i Foks su sugerisali da unutrašnja viskoznost na θ temperaturi, [η] θ, može da se smatra merom odnosa efektivne hidrodinamičke zapremine polimera i njegove molekulske mase M. Oni su radijus 1/ hidrodinamičke zapremine smatrali jednakim za nasumično klupko. R Unutrašnja viskoznost na teta temperaturi ( [ η] θ ~ R M 1/ ) 3 Hidrodinamička zapremina makromolekula R je srednja vrednost kvadrata rastojanja između krajeva polimernog lanca. Veličina (zapremina) nasumičnog klupka makromolekula u rastvoru izražava se preko R o se odnosi na neperturbovano klupko, na teta temperaturi.. Flori-Fox jednačina K = φ θ 3/ R o M 3/ 3/ R R o o 1/ [ η] θ = φθ = φθ M = K M M M Florijeva konstanta viskoznosti (univerzalna konstanta) φ θ Konstanta proporcionalnosti je univerzalna konstanta za neperturbovana klupka velikih molarnih masa. Flori i Foks su delimično objasnili značenje konstanti K i a u Mark-Houwink ovoj jednačini. Na θ temperaturi, K je definisano jednačinom ispod, dok je a = ½. 1/ =,1 10 1 φ θ, kada je [η] θ izraženo u dl/g, a R u cm. R 1/ R 0
U dobrom rastvaraču ili u slabom rastvaraču na temperaturi koja nije θ, prisutne su interakcije dugog ranga usled čega se polimerni molekul izdužuje. Uvodi se ekspanzioni faktor α (faktor širenja) koji opisuje ove efekte. 1/ 1/ R o R α = [ ] [ ] ) ( 3 3/ 0 3 α η η η α = = = o R R [ ] [ ] 3 α η η o = [η] = K M 1/ α 3 3/ 3/ 0 = = α φ φ M R M R K Kada [η] nije merena na teta temperaturi, konstanta K je data izrazom: Za perturbovana klupka (temperature koje nisu teta):
Merenje unutrašnje viskoznosti i određivanje M v Huggins-ova jednačina η sp = [ η] + k [ η] Ubeholde-ov viskozimetar (U-cev da bi se izbeglo dopunjavanje rastvorom do marke svaki put) c c k je bezdimenzionalna konstanta, Huggins-ova konstanta, čija vrednost zavisi od strukture polimera i temperature. Primer izračunavanja M v Uzorak polistirena rastvoren je u butanonu (0,1 % rastvor), merenje viskoznosti vršeno je na 5 o C, dobijena su vremena isticanja rastvora i rastvarača 110s i 140 s. Uz aproksimaciju da je korišćena koncentracija blizu c=0 K i a se nalaze iz tablica
Gel-propusna hromatografija Gel-permeation chromatography (GPC) Size exclusion chromatography (SEC) Hromatografija razdvajanja po veličini Ova metoda je jedna od najčešće primenjivanih metoda za određivanje molarnih masa makromolekula. SEC analize su relativno jednostavne i koriste standardnu HPLC instrumentaciju. Osnovni delovi instrumenta su HPLC pumpa, SEC kolona, detektor (diferencijalni refraktometar, spektrofotometrijski detektor i dr.) i sistem za sakupljanje i obradu podataka, odnosno računanje prosečnih molekulskih masa. Slika. Shematski prikaz osnovnih delova GPC (SEC) instrumenta.
Gel-propusna hromatografija GPC je generalno relativna tehnika koja zahteva kalibraciju ili standardizaciju pomoću polimernog uzorka poznate molarne mase. Međutim, jedanput kalibrisana, GPC može dati raspodelu molarnih masa i vrednosti srednjih molarnih masa M n i M m za ~ 30 min. GPC tehnika je zasnovana na različitim brzinama propuštanja makromolekula različitih veličina (molarnih masa) kroz pore materijala kojim je napunjena kolona. Ova hromatografija funkcioniše kao molekulsko sito. Makromolekuli se razdvajaju na osnovu njihove hidrodinamičke zapremine odnosno veličine. U GPC eksperimentu, uzorak se ubacuje (injektuje) u hromatografsku kolonu koja je punjena poroznim materijalom. Kada rastvor uzorka prolazi kroz kolonu, veći makromolekuli, koji su suviše veliki da bi mogli da prodiru u pore materijala kolone, eluiraju prvi, praćeni manjim molekulima koji mogu prodirati u pore materijala kolone i koji eluiraju u kasnijim vremenima. Kolone za GPC Pora stacionarne faze Kolone za GPC Makromolekul Stacionarna faza kolone može biti organska (na bazi umreženog poroznog polimera, npr. polistirena, poli (vinil alkohola)) ili neorganska (npr. na bazi SiO ). Veličina pora je 10-400 nm a veličina čestica (loptastog oblika) stacionarne faze je 5-10 μm. Rastvarači (mobilna faza): THF, toluen, NMP, voda i dr.
Gel-propusna hromatografija Tipično, u eksperimentu se injektuje 5 100 μl rastvora polimera čija je koncentracija niža od 1% i primenjuje se protok od 1mL/min.
Rezultat GPC analize je hromatogram koji predstavlja zavisnost odgovora detektora (osetljivog na koncentraciju ili molarnu masu) od vremena eluiranja. Sirovi podaci se kompjuterski obrađuju: vreme eluiranja (retenciono vreme) se transformiše u zapreminu eluiranja (retencionu zapreminu V R ), a zapremina eluiranja u molarnu masu, dok se odgovor detektora transformiše u koncentraciju odnosno maseni udeo. Dok mobilna faza teče konstantnom brzinom kroz kolonu punjenu poroznom stacionarnom fazom, rastvor polimernog uzorka se ubacuje (injektuje) u mobilnu fazu na vrhu kolone. Pod dejstvom istog gradijenta pritiska koji dovodi do toka rastvarača, makromolekuli uzorka takođe putuju kroz kolonu, od vrha naniže, sa vremenima zadržavanja koja zavise od njihove veličine. Vrlo veliki makromolekuli ne prodiru u pore stacionarne faze i putuju kroz tzv. intersticijalnu zapreminu kolone V 0 izlazeći iz kolone prvi. Makromolekuli nižih molarnih masa prodiru u pore stacionarne faze i eluiraju kasnije. Kada je veličina makromolekula relativno mala u odnosu na prosečnu veličinu pora, makromolekul će slobodno difundovati u pore i izvan pora i eluiraće na totalnoj zapremini mobilne faze, V t gde je V i0 ukupna zapremina pora. V t = V 0 + V i0 Koeficijent raspodele molekula u porama različitih veličina, K, definiše se u GPC metodi kao gde je V i zapremina pora dostupna datoj (i-toj) vrsti makromolekula. Retenciona zapremina polimera V R (zapremina eluiranja polimera) se sada može izraziti u formi: V R = V 0 + K V i0 Vrednost K kod SEC metode je: 0 K 1 Najvećim molekulima odgovara K = 0 (iz gornje jednačine sledi da je V R tada jednako V 0 ), a najmanjim molekulima K = 1 (tada je V R jednako V 0 + V i0 ).
Obrada GPC podataka Kompjuterizovano sakupljanje i obrada podataka uključuju sledeće korake: 1. konverziju vremena eluiranja u zapreminu eluiranja V R,. konverziju V R u molarnu masu, 3. konverziju odgovora detektora u koncentraciju polimerne vrste i 4. konverziju koncentracije polimerne vrste u masenu frakciju w i. Kalibracijom serijama polimernih standarda poznate molarne mase (sa uskom raspodelom M), dobija se zavisnost između logm i V R. Ova zavisnost, odnosno kalibraciona kriva, koristiti se za određivanje raspodele molarnih masa i srednjih molarnih masa uzoraka. Slika 5. GPC Hromatogram log M 1 = C V R Analiza hromatograma Slika 4. GPC kalibracioni grafik za polistirenske standarde u THF na 5 o C. Kao standardi koriste se polistiren, poli(metil metakrilat), poliizopren, polibutadien, poli(etilen oksid) i dr. Molarne mase standarda su u rangu od nekoliko stotina g/mol (oligomeri) do 0.000.000 g/mol.
Univerzalna kalibracija Pošto razdvajanje makromolekula kod GPC zavisi više od hidrodinamičke zapremine makromolekula nego od njihove molarne mase, koristi se GPC kalibracija bazirana na zavisnosti hidrodinamičke zapremine [η]m od retencione zapremine V R, gde [η] predstavlja unutrašnju viskoznost. Ovakva kriva zove se univerzalna kalibraciona kriva: Ako je V R nekog ispitivanog polimera poznata, direktno sa kalibracione krive može se pročitati vrednost [η]m. Vrednost M se može onda odrediti ako je [η] takođe poznata (izmerena). Ova procedura je pogodna kod procene molarnih masa novih polimera. Takođe, ona koriguje razlike koje potiču iz hidrodinamičkih zapremina kada se porede M nekoliko polimera a samo jedan od njih (npr. polistiren) se koristi za kalibraciju. Ne može se koristiti za visoko razgranate polimere. Slika 6. «Univerzalna» GPC kalibraciona kriva dobijena merenjima sa različitim polimernim standardima.
Modifikovani metod je predložen u pokušaju da se poboljša univerzalni kalibracioni pristup. Na datoj zapremini eluiranja, dva polimera, 1 i, treba da imaju iste hidrodinamičke zapremine [η] M: [η] 1 M 1 = [η] M [η] = K M a log M = A+ B log M 1 K1 1+ a1 = log + log M 1+ a K 1+ a 14 44 3 13 1 A = A+ BCV R B 1 = gde je C nagib kalibracione krive log M 1 = C V R, oznaka 1 odnosi se na standard (npr. polistiren), a oznaka na ispitivani uzorak. Ako su K 1 i a 1 za standardni polimer i K i a za analizirani polimer poznati iz literature, M se može odrediti za ispitivani uzorak iste vrste iz GPC podataka za V R. Iz kalibracione krive (log M 1 = C V R ) se može odrediti nagib C. Novije generacije GPC instrumenata poseduju detektore osetljive na molarnu masu (npr. na bazi rasejanja svetlosti) koji direktno daju apsolutnu srednju molarnu masu analiziranog polimera i u tom slučaju univerzalna kalibracija nije potrebna. Takav light-scattering fotometar meri direktno molarnu masu za svaku eluiranu frakciju (SEC-MALS instrumentacija).
Slika 3. GPC instrument (Waters): A-nosač uzorka B-kolona C-pumpa D-detektor (refraktivni) E-detektor (UV-Vis) Detektori kod GPC: 1. Detektori osetljivi na koncentraciju, na bazi: indeksa prelamanja (RI) ili razlike u indeksu prelamanja čistog rastvarača i eluirane vrste, tzv. diferencijalni refraktometar (DRI); odgovor detektora srazmeran je masenoj koncentraciji eluirane polimerne frakcije UV apsorpcije IR apsorpcije. Detektori osetljivi na molarnu masu: na bazi rasejanja svetlosti (light-scattering)- omogućavaju određivanje apsolutne molarne mase: low angle light scattering (LALS), multi angle light scattering (MALS); viskozimetrijski A
Jednostruka detekcija Kod starijih modela instrumenata GPC je opremljen samo jednim detektorom (single detector). Ako GPC sistem ima samo jedan detektor-obično RI ili UV koji su osetljivi na koncentraciju, povoljno svojstvo ovakve detekcije je što rezultati omogućavaju izračunavanje količine svake eluirane frakcije datog uzorka. U tom slučaju koriste se kalibracione krive da bi se Vr prevele u molarne mase. Podaci o koncentracijama omogućavaju da se dobije raspodela molarnih masa. Međutim, bitno ograničenje ovog pristupa sa kalibracionom krivom predstavlja korišćenje polimernih standarda koje podrazumeva sličnost u strukturi ili gustini ispitivanog uzorka i standarda. Ukoliko ovo nije ispunjeno u dovoljnoj meri, to dovodi do nedovoljno tačnog određivanja raspodela molarnih masa. Ako se analiziraju poznati polimeri poznatih struktura, odgovarajući standardi su generalno poznati i lako dostupni tako da kalibracioni metod doje dobre rezultate. Medjutim, u slučaju novih polimera odnosno polimera čija struktura nije potpuno poznata, tip odgovarajućeg standarda nije očigledan, tako da metod kalibracione krive može da ne bude dovoljno tačan ukoliko nisu odabrani odgovarajući standardi. Ova ograničenja GPC sa jednim detektorom prevazilaze se upotrebom višestruke detekcije.
Višestruka detekcija U novije vreme GPC sistemi sadrže veći broj detektora (multiple detection); najčešće su prisutna 3 detektora, na bazi rasejanja svetlosti, viskoznosti i UV apsorpcije. Ovi detektori obezbeđuju različiite ali komplementarne informacije koje sve zajedno daju detaljniju sliku o strukturi polimera. Detektori na bazi rasejanja svetlosti imaju tu prednost što mere apsolutnu molarnu masu, bez potrebe za kalibracijom, standardima. Oni koriste lasersko zračenje koje se upućuje na makromolekule. Meri se intenzitet rasejane svetlosti i M se računa direktno iz tih snimljenih podataka pod uslovom da je poznata koncentracija rastvora (korišćenjem Zimm-ove jednačine). Viskozimetrijski detektori omogućavaju da se dobiju različiti parametri viskoznosti, pre svega [η]. Vrednosti viskoznosti dobijaju se obično pumpanjem rastvora kroz kapilarni most i merenjem razlike pritisaka između kapilara. Metodom univerzalne kalibracije se zatim računa molarna masa. Prevazilaze se problemi klasične kalibracije. UV apsorpcioni detektori mere koncentraciju. Ovi detektori se mogu koristiti jedino u slučaju kada polimer poseduje hromoforu(e). Jednostavni UV detektori mere samo na jednoj talasnoj dužini, tako da daju podatke o koncentraciji određene komponente uzorka. Fotodiodni detektor (photodiode array, PDA) može da meri apsorbanciju na svim talasnim dužinama iz UV oblasti istovremeno. Ovo omogućava da se odrede varijacije sastava polimera kao funkcija molarne mase.polymer industry
Koligativna svojstva rastvora polimeraodređivanje srednje brojne molarne mase M n Koligativna svojstva rastvora: sniženje napona pare, povišenje tačke ključanja, sniženje tačke mržnjenja i osmotski pritisak; zavise samo od broja molekula u rastvoru, ne od hemijskog sastava. Povišenje tačke ključanja Latentna toplota isparavanja po gramu rastvarača Sniženje tačke mržnjenja Koncentracija rastvorene supstancije (g/cm 3 ) Gustina rastvora Latentna toplota topljenja po gramu rastvarača Za polimere sa M ~ 0.000 i većim, od ovih metoda pogodno je samo merenje osmotskog pritiska.
Određivanje srednje brojne molarne mase makromolekula membranskom osmometrijom Osmotski pritisak je jedna od koligativniih svojstava rastvora neelektrolita. Sva ova svojstva izražavaju se preko promene aktivnosti rastvarača a 1 kada je prisutna rastvorena supstancija. Rastvor i rastvarač razdvojeni su polupropusnom membranom, koja propušta rastvarač, ali ne i rastvorenu supstanciju. Usled razlike hemijskog potencijala o rastvarača u njegovo čistoj fazi µ 1 i hemijskog potencijala rastvarača u rastvoru, μ 1, rastvarač spontano prelazi kroz membranu u rastvor, da bi se hemijski potencijali izjednačili. Polupropusna membrana V1 Π = RT ln a1 = ( µ 1) Osmotski pritisak П je u stvari pritisak kojim treba delovati na rastvor da bi se sprečio tok rastvarača u rastvor kroz polupropusnu membranu.
Aktivnost a 1 definisana je kao: o μ 1 = RT lna 1 (1) µ 1 µ (1a) 1 = RT ln a 1 U idealnom ratvoru, aktivnost a 1 jednaka je molskoj frakciji, tj. a 1 x 1 x 1 + x = 1 Aktivnost rastvarača a 1 može se izraziti preko molske frakcije rastvorene supstancije x : a 1 = 1 x () Za idealne razblažene rastvore (n 1 > n, V 1 > V ), dalje se može pisati ln (1-x ) -x (3) lna 1 = ln (1-x ) -x (3a) Tako imamo sledeću korelaciju: П a 1 x M Vrednost a 1 se može odrediti na osnovu merenja osmotskog pritiska П.
Diferencijal Gibsove energije izražava se preko promene parcijalne molarne Gibsove energijeg i pritiskom, temperaturom i molskom frakcijom x i : Gi Gi G d G i i = ( ) dp + ( ) dt + ( ) dxi P T xi dgi = Vi dp Si dt + RT d ln ai d G = V dp S dt + d µ ) (4) i i i ( i sa U osmometriji, hemijski potencijal rastvarača u rastvoru (μ 1 ) izjednačava se sa hemijskim o potencijalom čistog rastvarača ( ) primenom diferencijala pritiska dp. µ 1 U izotermskom procesu (dt=0), u ravnoteži ( dg 1 = 0), ova razlika pritisaka jednaka je diferencijalu osmotskog pritiska, dπ. Jednačina (4) prelazi u V1 dπ = RT d lna1 = d( µ 1) odnosno V1 Π = RT ln a1 = ( µ 1) (5) gde je Π osmotski pritisak, a V 1 Primenom izraza (3a) jednačina (5) prelazi u je parcijalna molarna zapremina rastvarača. V 1 Π = RT x (6)
V 1 Π = RT x Molska frakcija x se prevodi u masenu koncentraiju c (g/100 cm 3 ) na sledeći način: m m n M n M x M c = = = ( V1 + V ) V1 V1 n1 V1 V1 (6) x V 1 = c M (7) Izražavanjem V 1 iz (7) i uvođenjem u (6) dobija se van t Hoff-ova jednačina: lim c 0 Π c = RT M (8) koja govori da je redukovani osmotski pritisak Π/c (J/kg) obrnuto srazmeran molarnoj masi M rastvorka pri beskonačnom razblaženju (c 0). Osmometrijski se određuje srednja brojna molarna masa M n M n Prednosti metode su: daje apsolutnu vrednost, nema potrebe za kalibracijom standardima, primenljiva je na polimere širokog opsega molarnih masa (~10.000 10 6 ). Najniža vrednost opsega određena je karakteristikama membrane (propustljivošću), a gornja granica opsega određena je najmanjim osmotskim pritiskom koji može da se meri.
lim c 0 Π c = RT M (8) Grafik Π/c u zavisnosti od c, prema ovoj jednačini, daje karakterističnu pravu liniju sa nagibom 0 (slika 7, prava X). Molarna masa M rastvorene supstancije određuje se iz odsečka prave na y osi ekstrapolacijom na c =0 (odsečak je 1 M n. Samo pri niskim koncentracijama u tzv. teta rastvorima (tj. na Florijevoj θ-temperaturi) Π/c ne zavisi od koncentracije (prava X, slika 7 ). A > 0, A 3 > 0 Slika 7. Zavisnost redukovanog osmotskog Π pritiska od koncentracije c, za poli(metil c RT metakrilat) u različitim rastvaračima na 0 o C: -m-ksilen (X) je teta rastvarač (A = 0); A > 0, A 3 = 0 -u 1,4-dioksanu (D) A >0 dok je A 3 =0 (dobar rastvarač); 1 M n A = 0, teta stanje -za hloroform (C) postoje i drugi i treći virijalni koeficijent (dobar rastvarač) Zajednički odsečak na c 0 jednak je 1 M n
Pri većim koncentracijama i usled interakcija polimernih molekula sa rastvaračem, prisutna su značajna odstupanja od idealnosti i grafik Π/c u zavisnosti od c, koji je još uvek prava linija, daje različite nagibe, u zavisnosti od hemijskog sistema (slika 7, prava D). Van t Hoff-ova jednačina se u tom slučaju modifikuje uvođenjem drugog virijalnog koeficijenta, A : Π c Drugi virijalni koeficijent A je mera odstupanja od idealnosti i zavisi od temperature i rastvarača, za dati polimer. U komplikovanom sistemu, kada su interakcije polimer-rastvarač još jače izražene, u zavisnost Π/c od c uvode se viši virijalni koeficijenti (A 3, A 4 ) i ona može da ne bude prava linija. U tom slučaju osmotski pritisak se izražava pomoću virijalne jednačine: Π = RT( A c 1 = RT ( + A M c n 1 + A c + A3 c + gde je A 1 = 1/M n prvi virijalni koeficijent, a A i A 3 su drugi i treći virijalni koeficijent. Virijalni koeficijenti A, A 3,... zavise od raspodele molarnih masa rastvorenog polimera, sistema rastvaračrastvorena supstancija i temperature. Virijalni koeficijenti iza A 3 se obično mogu zanemariti. Rastvor sa A = 0 zove se teta-rastvor, a za polimer se u tom slučaju kaže da je u teta stanju koje se dobija na određenoj temperaturi, teta-temperaturi za dati rastvarač (koji postaje teta-rastvarač na ovoj temperaturi). )...) (9) (11) Membranska osmometrija omogućava dobijanje informacija o interakcijama polimer-rastvarač na osnovu drugog virijalnog koeficijenta.
Membranski osmometri Statički membranski osmometar -Ravnoteža se postiže prirodnom difuzijom -Velika zapremina ćelije -Velika vremena za postizanje ravnoteže (~sati) Helfritz-ov osmometar Neke uobičajene membrane: celuloza acetat, celuloza hidrat, celuloza nitrat, celulozni estar, poliuretani, poliakrilonitril, poli(hlorotrifluoroetilen). Osmotski pritisak se računa na osnovu izraza: Schultz-ov osmometar Π= ρ 1 g h gde je ρ 1 gustina rastvarača (izražena u g/cm 3 ), g gravitaciona konstanta, 0,981 m/s, h je visina u centimetrima (razlika nivoa rastvora u jednoj cevi i rastvarača u drugoj cevi, slike desno). Slika 8. Statički osmometri
Dinamički membranski osmometar -Kod dinamičke osmometrije meri se brzina toka rastvarača i primenjuje kontra-pritisak koji će zaustaviti njegov tok, tj. ravnoteža se postiže smanjenjem pritiska na rezervoar sa rastvorom polimera -Mala zapremina ćelije -Kratka vremena postizanja ravnoteže (10-30 min) Osmomat 090 (Gonotec) Meri Mn od 10,000 do,000,000 g/mol Slika 9. Dinamički osmometar Kretanje vazdušnog mehura unutar kapilare smeštene neposredno ispod ćelije sa rastvaračem koristi se kao indikacija (mera) brzine toka rastvarača. Takvo kretanje se detektuje fotoćelijom koja je kuplovana sa servomehanizmom koji kontroliše tok rastvarača. Pritisak u delu sa rastvaračem se direktno menja promenom visine rezervoara rastvarača, a razlika pritisaka između dva odeljka, sa rastvorom i rastvaračem, je osmotski pritisak koji se može računati merenjem promene visine.
a) b) SEM fotografije membrana od a) celuloze, b) celuloza nitrata Problemi/nedostaci kod membranske osmometrije su u najvećoj meri prouzrokovani samom membranom-npr. asimetrijom membrane, brzom degradacijom membrane (usled dejstva nekih rastvarača), prisustvom rastvorenog vazduha (obavezno degasiranje rastvora i rastvarača pre unošenja u ćeliju), prolaskom molekula malih molarnih masa kroz membranu (što vodi većim vrednostima M od stvarnih) - metoda nije pogodna za polimere sa velikom polidisperznošću.
Određivanje molarne mase i veličine makromolekula metodom rasejanja svetlosti Metoda koja koristi rasejanje svetlosti je glavna tehnika za određivanje srednje masene molarne mase makromolekula. Tehnika je bazirana na optičkoj heterogenosti rastvora polimera a razvio je nobelovac Peter Debye na osnovama Rayleigh-eve teorije za gasove. Na osnovu Debye-eve teorije merenje intenziteta rasejane svetlosti koristiti se za određivanje molarne mase makromolekula u razblaženim rastvorima a takođe i za određivanje njihove veličine i oblika. Rasejanje svetlosti znači odstupanje zraka od njegovog pravolinijskog puta usled nailaska na neregularnosti sredine kroz koju se prostire, prisustva čestica, hrapavosti površine. Rasejana svetlost prostire se u svim pravcima.
Ovde je od interesa Rejlijevo rasejanje to je elastično rasejanje svetlosti molekulima odnosno česticama koje su mnogo manje od talasne dužine upadne svetlosti. Intenzitet Rejlijevski rasejane svetlosti zavisi od veličine i oblika čestica koje rasejavaju i obrnuto je proporcionalan λ 4. To znači da se kraće talasne dužine vidljive svetlosti (plava i lubičasta) rasejavaju jače nego veće talasne dužine (prema crvenoj oblasti vidljivog dela spektra). Ovaj tip rasejanja je razlog za plavu boju neba u toku dana i narandžaste tonove neba u toku izlaska i zalaska sunca (svetlost se rasejava na molekulima vazduha, kapljicama vode i česticama prašine). Fenomen rasejanja svetlosti prouzrokovan je fluktuacijama u indeksu prelamanja sredine (koje su posledica fluktuacija gustine) na molekulskom ili supramolekulskom nivou. Rejlijev odnos intenzitet rasejane svetlosti I r θ R = I o θ r -rastojanje od dipola do posmatrača, θ - ugao između ose dipola i pravca posmatranja intenzitet upadne svetlosti Napomena: postoje dva generalna slučaja. U prvom, kada su čestice organizovane u regularne nizove kao što je to slučaj kod kristala, zračenje će biti difraktovano, tj. rasejanje se primećuje samo na određenim uglovima, dok za sve druge uglove postoji destruktivna interferencija zraka rasejanih sa različitih tačaka u nizu (difrakcija X-zraka na kristalima). Međutim, ako čestice (molekuli, atomi) nisu organizovane u regularne nizove, rasejanje se uočava na svim uglovima. Generalno, promena intenziteta rasejane svetlosti sa uglom daće informaciju o veličini struktura.
Upadna svetlost može se izraziti pomoću jednačine E = Eo cos π ν t x λ gde je E jačina električnog polja, E o amplituda upadnog talasa, ν frekvencija svetlosti u rastvoru, t vreme. c ν = λ 1871. Rayleigh je pokazao da kada upadna svetlost padne na molekul u gasu, raspodela elektrona u molekulu se remeti i kao rezultat nastaje polarizacija molekula, koji sada deluje kao indukovani oscilujući dipol p. Ovaj dipol osciluje u fazi sa upadnim poljem. Prema Maxwell-ovoj teoriji, ovaj oscilujući dipol postaje sekundarni izvor zračenja amplitude Es. Indukovani dipol je povezan sa električnim poljem relacijom: x gde je α polarizabilnost molekula p = α E = α Eo cos π ν t λ Drugi izvod oscilujućeg dipola u odnosu na vreme, d p/dt, opisuje električnu jačinu rasejane svetlosti: d p x = α E cos π ν t ( 4π ν ) o (1) dt λ Ako je upadna svetlost ravanski polarizovana, rasejana svetlost se može izraziti u formi: E s ( d = p / dt c sinθ )( ) r () Unošenjem izraza (1) za d p/dt u jednačinu (), dobija se gde je θ ugao između p i r 4 π ν α E o sin θ x E s = cos π ν t c r λ (3)
Pošto je merljiva veličina kod svetlosnog talasa intenzitet (I), konvertuje se E u I. Intenzitet svetlosti je količina energije koja pada na jedinicu površine po jedinici vremena: Ovde je E I = c E (4) ε o usrednjeno polje u periodu vibracije od t = 0 do t = 1/ν. E (=) N/C ε o = 8,85418 x 10 1 C N -1 m -. I (=) J m - s -1 Odnos intenziteta rasejane svetlosti I i intenziteta upadne svetlosti I o je I I o E = E s {[(4π = (5) ν α E [ E o o sinθ ) / c cos π ( νt x / λ)] r]cos π ( νt x / λ)} Nakon skraćivanja dobija se Rejlijeva jednačina za ravanski polarizovanu upadnu svetlost, za gasove: I I 0 4 16π α sin θ = 4 λ r Upadni zrak Orijentacija oscilujućeg dipola p i vektora r položaja posmatrača za vertikalno polarizovani upadni zrak (p je u pravcu z ose). U ovom slučaju uvek je sinθ=1, nema ugaone zavisnosti Rejlijevog odnosa. Ugaona zavisnost Rejlijevog odnosa postoji za horizontalno polarizovano ili nepolarizovano upadno zračenje Ukoliko je upadni snop nepolarizovan, jednačina (5) se modifikuje u: I I o = 4 16π α 1+ cos θ) ( 4 λ r (6)
Debajeva fluktuaciona teorija prilagođava Rejli-jevu teoriju (koja je primenljiva na gasove) na tečne sisteme (rastvore). U tečnom rastvoru postoji fluktuacija koncentracije u elementu zapremine. Fluktuacija koncentracije c rezultuje fluktuacijom polarizabilnosti α. Otuda, da bi se Rejlijeva jednačina rasejanja primenila na rastvore, potrebno je modifikovati (7) parametar α. Za gasove važi p = α E, dok je za rastvore p = α E Jednačina rasejanja za rastvore je I I 0 Fluktuacija polarizabilnosti povezana je sa fluktuacijom koncentracije izrazom: α 16π α (sin θ ) V = 4 (8) V-zapremina rastvora λ r = 4 n o 4π dn dc gde je n o indeks prelamanja rastvarača na talasnoj dužini λ, n je indeks prelamanja rastvora polimera, c je koncentracija rastvora polimera, a dn/dc je porast indeksa prelamanja sa koncentracijom i određuje se iz nagiba zavisnosti n od c za dati par rastvarač-polimer. Fluktuacija koncentracije je c cm = N V A c (9) c-masena koncentracija rastvora, g/ml M-molarna masa, g/mol Unošenjem (9) i (10) u (8) i preuređivanjem dobija se jednačina rasejanja za ravanski-polarizovanu upadnu svetlost za rastvore: I r I o 4π n = o ( dn / dc) 4 λ N (10) A (sin θ ) M c (11)
Ako upadna svetlost nije polarizovana, jednačina (11) se modifikuje do oblika I r I π n ( dn / dc) (sin θ ) M c = (1+ cos θ ) 4 λ o N A (1) Ako upadna svetlost nije polarizovana i ugao θ = 90 o, jednačina je: I r I π n ( dn/ dc) 4 o λ N A Uvođenjem konstante K koja je jednaka jednačina (13) postaje R θ M c = (13) = I r I o π K = = K M c n λ ( dn/ dc) 4 N A odnosno Kc 1 = R M θ (14)
Ako ponašanje rastvora nije idealno, jednačina rasejanja svetlosti ima sledeću formu: Kc Rθ 1 = + A c + 3A3 c +... M (15) Molarna masa može se dobiti kao recipročna vrednost odsečka na ordinati grafika Kc/R θ = f(c). Nagib prave Kc/R θ = f(c) predstavlja dvostruku vrednost drugog virijalnog koeficijenta A. Jednačina (15) je izvedena pod pretpostavkom da su rasejavajuće čestice male u poređenju sa λ. Ako ovo ne važi, kao što je slučaj kod makromolekula, javlja se dis-simetrija rasejanja. Različiti delovi makromolekula izloženi su upadnoj svetlosti različite amplitude i faze. Rasejana svetlost je sačinjena od talasa koji dolaze sa različitih delova čestice i interferiraju jedan sa drugim, tzv. unutrašnja interferencija (postoji više tačaka rasejavanja na istom makromolekulu). Generalno rešenje koje opisuje raspodelu rasejane svetlosti za velike čestice (dimenzija ~ λ/0) je složeno: Kc R θ 1 = + A c + 3A3 c +... M P( θ ) w Funkcija rasejanja P(θ) ( particle scattering factor ) zavisi od oblika čestica (sfere, statist. klupka, štapići, diskovi...) i povezana je sa radijusom žiracije izrazom: (16) P(θ) =1 za polimere nižih molarnih masa 1 1 0 s ) (3λ ) sin = 1+ (16π n P( θ ) ( θ ) L+... (17)
Slika 10.. Prikaz omotača rasejane svetlosti ( light scattering envelope ). U slučaju malih rasejavajućih čestica (a) rasejavajući omotač ima 4 jednaka kvadranta. U slučaju velikih rasejavajućih čestica, čija se dimenzija približava λ/0 (b) javlja se dissimetrija rasejanja usled interferencije, rasejavajući omotač više nije simetričan i za taj slučaj važi jednačina (16). Količnik rasejavanja na uglu 45 o sa rasejavanjem na 135 o naziva se faktor dissimetrije (Z). Kada se nacrta grafik Z u funkciji koncentracije polimera i uradi ekstrapolacija do c=0, odsečak na ordinati predstavlja redukovani faktor dissimetrije, Z o, koji je povezan sa funkcijom rasejanja P(θ).
Radijus žiracije 1/ Radijus žiracije S se pored rastojanja kraj-do-kraja lanca koristi za opis veličine makromolekula (nasumičnog klupka). On predstavlja koren srednjeg kvadrata rastojanja elemenata lanca od njegovog centra gravitacije. Definiše se izrazom: S gde m i predstavlja masu i-tog elementa lanca (atom, atomska grupa, jedinica...), a r i njegovo rastojanje od centra mase (C): = i i m r i m i i Kod linearnih lanaca 1/ 1/ S je povezan sa R relacijom:
Zimm-ov metod određivanja M w U eksperimentu rasejanja svetlosti, analizira se serija polimernih rastvora različitih koncentracija, i intenzitet rasejane svetlosti se meri kao funkcija ugla θ. Za svaku koncentraciju rastvora crta se grafik zavisnosti Kc/R θ (leva strana jednačine 15) od sin θ/ + kc, gde je k proizvoljna konstanta (slika ). Kc/R θ u funkciji od sin θ/ + kc daje rektilinearne grafike kao na slici, tzv. Zimm-ov dijagram, koji omogućava ekstrapolaciju na c = 0 i θ = 0, gde je P(θ)=1. Za svaku koncentraciju, podaci Kc/R θ se ekstrapolišu do ugla θ =0. Slično, za svaki ugao merenja vrši se ekstrapolacija do koncentracije c =0. Odsečak na y osi daje recipročnu vrednost od M w. Nagib 1= (16π S )/3λ Nagib = A Slika 11. Zimm-ov dijagram, dobijen variranjem koncentracije polimera c i ugla merenja θ. Odsečak na ordinati je recipročna vrednost M w. Radijus žiracije S 1/, koji je mera veličine makromolekula, može se dobiti iz nagiba 1, a drugi virijalni koeficijent iz nagiba (A je jednak polovini nagiba ekstrapolisanih podataka za ugao θ=0).
Savremeni fotometri kojima se meri intenzitet rasejane svetlosti i određuje M m koriste kao izvor zračenja laser koji daje monohromatsku svetlost velikog intenziteta. 18 uglova 10 mw Laser Opseg molarnih masa: 10 3 do > 10 9 g/mol Opseg veličina makromolekula (R): 10 nm do > 500 nm Slika 1. Multi-angle light scattering (MALS) - instrument za merenje apsolutne srednje masene molarne mase M m, veličine i konformacije (oblika) makromolekula u rastvoru. MALS meri intenzitete rasejane svetlosti na svakom od uglova detekcije. MALS prevazilazi probleme koji se javljaju kod LALS detektora (low angle light scattering detector) kao npr. taj da je šum veći oko 10 puta na uglu od 11 (ili manjem) nego na uglu od 90 i omogućava tačnije merenje rasejane svetlosti. Količina rasejane svetlosti se zatim korelira sa molarnom masom. MALS takođe određuje veličinu makromolekula izraženu kao "radius of gyration (radijus žiracije).