Spektroskopske metode 1 Spektroskopske metodezasnivaju se na analizi energije elektromagnetnog zračenja koju ispitivana supstanca apsorbuje odnosno emituje. Apsorpcionemetode analit apsorbuje energiju i izosnovnog prelazi u pobuđeno stanje. Emisione metode analit emituje energiju vraćajući se iz pobuđenog u osnovno stanje. 2 1
Elektromagnetno zračenje Radio talasi Radio talasi Talasna dužina Vrsta promene 100 m 1 m 1 m 1 cm Mikrotalasi 1 cm -100 µm Infracrveno zračenje 100 µm - 1µm Vidljiva oblast UV oblast X zračenje Gama zračenje Prelazi nuklearnih spinova Prelazi elektronskih spinova Prelazi u rotacionim stanjima Promena vibracionih stanja 1µm 10 nm Promena stanja valencionih elektrona 10 nm-100 pm 100 pm 1 pm Promena stanja unutrašnjih elektrona Promena nuklearnih stanja Spektroskopska metoda NMR Elektronska spinska rezonancija Mikrotalasna spektroskopija IR Ramanska spektroskopija UV/VIS Fuorescentna Atomska Rendgenska Elektronska Gama spektroskopija 3 4 2
Manja talasna dužina, veća energija. Rotacioni nivoi u molekulu blizu su jedan drugom, pa je energija mikrotalasa i daleke IR oblasti dovoljna da izazove prelaze u rotacionim stanjima. Promene vibracionih stanja dešavaju se pod dejstvom infracrvenog zračenja. UV/VIS zračenje menja stanje valencionih elektrona. Kod molekula složenije strukture energetski nivoi mnogo su bliži jedan drugome pa zračenje u bliskoj UV oblasti i VIS oblasti može izazvati elektronske prelaze. 5 UV/VIS spektrofotometrija Apsorpcija UV i VIS zračenja uzrokuje elektronske prelaze. To znači da elektroni iz osnovnog prelaze u pobuđeno stanje. Elektronski prelazi σ-tipa, π-tipa i n tipa, što znači da apsorpcija UV i VIS zračenja pobuđuje elektrone σ, π i n elektrone. σ-σ* alkani σ- π* karbonilna jedinjenja π-π* alkeni, karbonilna jedinjenja, alkini, azo jedinjenja n -σ* jedinjenja koja sadrže atome kiseonika, azota, sumpora i halogene n - π* karbonilna jedinjenja 6 3
7 Atomi ili grupe atoma (funkcionalne grupe) odgovorni za apsorpciju svetlosti zovu se RMFRE(gr. chroma-boja, phorein nositi). Npr. karbonilna, imino ili azo grupatj. -dvostruka i trostruka veza zasićenih aldehida i ketona, imina i azo jedinjenja,kao i slobodni elektronski parovi ovih atoma. Svakuhromoforukarakterišu λ max i ε max. 8 4
romofora Elektronski prelaz λ max nitril C N n - π* 160 alkin C C π- π* 170 alken C C π- π* 175 alkohol R n - σ* 180 etar n - σ* 180 R R keton C π- π* 180 n - π* 280 aldehid π- π* 190 C n - π* 290 amin R N 2 n - σ* 190 kiselina R C n - π* 205 estar R CR 1 n - π* 205 amid R CN 2 n - π* 210 tiol R S n - σ* 210 nitro R N 2 n - π* 271 azo R N N R n - π* 340 9 Konjugovane hromofore Konjugovanjemjednostavnih hromofora (istih ili različitih) nastaju tzv. višestruke hromofore, pa dolazi do batohromnog i hiperhromnogpomeranja apsorpcionog maksimuma. Batohromno pomeranje pomeranje λ max ka višim talasnim dužinama ipsohromno pomeranje -pomeranje λ max ka nižim talasnim dužinama iperhromno pomeranje veća apsorbancija ipohromno pomeranje manja apsorbancija 10 5
C C λ max 180-200 nm λ max 217 nm λ max 258nm N N N λ max 250nm λ max 290nm λ max 360nm Konjugacijom se elektronski nivoi približavaju jedan drugome, pa se energija potrebna za pobuđivanje elektrona smanjuje povećava se talasna dužina. 11 Ukoliko je karbonilna grupa konjugovana sa jednom ili više dvostrukih veza javlja se batohromni efekat na n- π* prelaz. R 2 R 1 PRIMER 1 C C C R 3 R 1 =, R 2 =, R 3 = R 1 = C 3, R 2 =, R 3 = R 1 =, R 2 = C 3, R 3 = C 3 R 1 = C 3, R 2 = C 3, R 3 = C 3 λ max 208 nm λ max 220 nm λ max 230 nm λ max 242 nm R 2 R 1 R 2 R 1 PRIMER 2 C C R 3 CR R 1 = C 3, R 2 =, R 3 = R 1 = C 3, R 2 = C 3, R 3 = R 1 = C 3, R 2 = C 3, R 3 = C 3 R 3 C C C λ max 208 nm λ max 217nm λ max 225 nm 12 6
Sterni efekat kod konjugovanih sistema Ukoliko je konjugovani sistem planaran veći je uticaj na apsorpcioni maksinum. Cisi transizomeri imaju različite spektre. Trans izomeri imaju duže konjugovane hromofore nego cis, pa ih karakteriše veće λ max i ε max. 13 Auksohromne grupe (gr. auxanien pojačava; chrome- boja) ve grupe same ne pokazuju značajnu apsorpciju u oblasti od 200 nm 800 nm. Imaju slobodne elektronske parove i mogu biti kiselih osobina: -C, -, -S 3 baznih osobina: -N 2, -NR, -NR 2 ostale: -X(halogeni) Uticaj auksohromne grupe na alkene Auksohromne grupe imaju najjači batohromni i hiperhromniefekat ukoliko su vezane za hromoforu sa dvostrukom vezom, tzv. produžavanje konjugacije rezonantnim efektom. Batohromni uticaj na π- π* prelaz. 14 7
Uticaj auksohromne grupe na karbonilnu grupu 3 C C λ max 293 nm Supstitucija karbonilne grupe auksohromnom grupom ima jako izražen hipsohromni efekat na n- π* prelaz. 3 C C C 3 λ max 279 nm Negativnim induktivnim efekta atomi kiseonika, azota, odnosno halogena otežavaju n- π* prelaz potrebna je veća energija, tj. manja talsna dužina. 3 C 3 C C Cl C N 2 λ max 235 nm λ max 214 nm 3 C C C 2 C 3 λ max 204 nm 3 C C λ max 204 nm 15 Uticaj auksohromne grupe na benzenov prsten U molekulima lekova najčešća hromofora je benzenov prsten. Elektronski prelazi u osnovi su π- π*, ali daleko komplikovaniji nego kod drugih jedinjenja. Kod svih derivata benzena dolazi do batohromnog pomeranja apsorpcionog maksimuma -koliko je pomeranje zavisi od prirode i položaja (o-, m-ili p-) supstituenta. Auksohromne grupe mogu da produže π sistem rezonantnim efektom batohromni efekat. Ukoliko je jedinjenje kiselog ili baznog karaktra p može imati značajan uticaj na izgled apsorpcionog maksimuma. 16 8
Prokain romofora (benzen) produžena prisustvom karbonilne grupe (-C=). Prisutna auksohromna grupa (-N 2 ). U baznoj sredini slobodan elektronski par na amino grupi stupa u interakciju sa hromoforom batohromno pomeranje. U kiseloj sredini dolazi do protonovanja amino grupe više nije auksohromna grupa jer nema slobodnog elektronskog para. 17 Fenilefrin Prisutna auksohromna grupa (-). U baznoj sredini nastaje fenolatni anjon sa tri slobodna elektronska para koji stupaju u interakciju sa hromoforom batohromno i hiperhromno pomeranje. U kiseloj sredini fenolna grupa ima dva slobodna elektronska para slabija apsorpcija nego u baznoj sredini. 18 9
Direktna spektrofotometrija u UV oblasti Postavljanje metode Izbor rastvarača za spektrofotometrijsku analizu u UV oblasti je NAJZNAČAJNIJI, jer fizičko-hemijske karakteristike rastvarača mogu značajno da utiču na apsorpciju u UV oblasti, tj. položaj maksimuma apsorpcije. Prvi kriterijumza izbor rastvarača je dobra rastvorljivost ispitivane supstanceu tom rastvaraču. Drugikriterijumje da rastvarač ne apsorbuje u istoj oblasti talasnih dužina kao supstanca koja se analizira treba da se primenjuju transparentni rastvarači. Najčesće se koriste: voda, etanol, metanol, acetonitril i heksan 19 Treći kriterijumje uticaj rastvarača na apsorpcioni spektar. U nepolarnim rastvaračima se ne stvaraju vodonične veze pa se vidi fina struktura apsorpcionog spektra. U polarnim rastvaračima, usled stvaranja vodoničnih veza, nastaje rastvarač-analit kompleks i fina struktura se ne može videti. 20 10
Četvrti kriterijumje mogućnost rastvarača da stabiliše molekul analita u osnovnom ili pobuđenom stanju stvaranjem vodonične veze. Primer I - polarna jedinjenja (karbonilna, nitro i nitrozo grupa sa n π π* prelazima) u polarnim rastvaračima voda, alkohol, aceton Rastvarač formira vodonične veze sa analitom u osnovnom stanju i ima izražen hipsohromni efekat na n- π* prelaz. Polarne supstance treba rastvarati u NEPLARNIM rastvaračima za UV analizu. Primer II -nepolarna jedinjenja (nezasićene ugljovodonične strukture hromofore sa π π* prelazima) u polarnim rastvaračima alkohol, aceton Rastvarač formira vodonične veze sa analitom u pobuđenom stanju i ima izražen batohromni efekat na π π* prelaz. Nepolarne supstance treba rastvarati u PLARNIM rastvaračima za UV analizu. 21 Primer III - polarna jedinjenja kiselog ili baznog karaktera (mogu da jonizuju) Konjugovani parovi (kiselina-baza) imaju različite apsorpcione maksimuma u istom rastvaraču. Tautomerni oblici, čije postojanje je uslovljeno promenom p, imaju različite apsorpcione maksimume. Uloga pufera je da izdiferencira jedan oblik, molekulskioblikili odgovarajući konjugovani jonizovani oblik. Položaji apsorpcionih maksimuma zavise od osobina rastvarača i p rastvora. 22 11
Apsorpcija u VIS oblasti Rastvori obojenih supstanci -direktna spektrofotometrijau oblasti od 380 nm do 780 nm Supstance su obojene veliki broj konjugovanih hromofora i auksohromnih grupa,pa je došlo do jakog batohromnog pomeranja apsorpcionog maksimuma Boja apsorbovane svetlosti λapsorbovane svetlosti (nm) ljubičasta 400 žuta Supstanca apsorbuje svetlost određene λ. ko vidi propuštenu svetlost komplementarne boje. Boja propustene svetlosti plava 450 narandžasta plavo-zelena 500 crvena žuto-zelena 530 crveno-ljubičasta žuta 550 ljubičasta narandžasto-crvena 600 plavo-zelena crvena 700 zelena 23 Apsorpcija u VIS oblasti Rifampicin kristalni prašak crveno-braon boje u fosfatnom puferu p 7,8 λ max 445 nm Riboflavin kristalni prašak žute ili narandžasto-žute boje 24 12
Apsorpcija u VIS oblasti Supstance koja se određenim hemijskim reakcijama sa pogodnim reagensima kvantitativno prevode u jedinjenja koja apsorbuju u VIS oblasti- indirektna spektrofotometrijska analiza. Indirektna spektrofotometrija Kada je potrebna hemijska transformacija? Ispitivana supstanca nema jasno izražen apsorpcioni maksimum uuv oblasti. Kada je potrebno sprečiti interferencijeu UV oblasti pomoćne materije iz farmaceutskog oblika interferiraju, zato što apsorbuju svetlost u UV oblasti. 25 Apsorpcija u VIS oblasti Postavljanje metode Izbor reagensa stabilan u rastvoru, manje stabilni reagensi moraju da budu sveže pripremljeni, stehiometrijski reaguje sa ispitivanom supstancomidodaje se u višku, sa analitom daje kvantitativnu reakciju, selektivan i specifičan, obojeno jedinjenje proizvod reakcije brzo nastaje i ne apsorbuje u istoj oblasti talasnih dužina kao supstanca koja se analizira (ε= 0) 26 13
Apsorpcija u VIS oblasti Digoksin Kardiotonični glikozidi daju veliki broj hemijskih reakcija čiji su proizvodi obojeni. ve reakcije mogu se podeliti u tri grupe, prema tome da li u njima učestvuje: C 3 1. nezasićeni laktonski prsten na C17 C 3 2. alkoholna grupe steroidne strukture 3. šećerna komponenta. (D-digitoksoza) 3 Prvu grupu reakcija daju reagensi koji sa metilenskom grupom, odnosno sa aktivnim vodonikovim atomima α,β nezasićenog laktonskog prstena, daju karakteristično obojena jedinjenja. d reagenasa za ovaj tip reakcije najčešće se koriste pikrinska kiselina (Baljetova reakcija). vu reakciju daju glikozidi sa alkalnim rastvorom pikrinske kiseline, pri čemu nastaje jedinjenje žute boje koje se može odrediti spektrofotometrijski: N 2 N 2 - N 2 27 Primena spektrofotometrije e u farmaceutskoj analizi metoda izbora za kvantitativnu analizu primenjuje se kad god je to moguće, određivanje pka vrednosti farmaceutskih supstanci, određivanje particionog koeficijenata farmaceutskih supstanci, određivanje brzine rastvaranja kod farmaceutskih oblika (eng. dissolution test) i primenjuje se kao farmakopejski test za identifikaciju u rutinskoj kontroli farmaceutskih supstanci. Prednosti jednostavna, laka za upotrebu, jeftina metoda Nedostaci metoda nije selektivna 28 14