Univerzitet u Tuzli Farmaceutski fakultet Doktorski studij Školska: 2014/2015 Istraživanja stabilnosti proteina (toplotnom denturacijom, ph denaturacijom, denaturacijom ureom) na rekombinantnim proteinima. Dr.sc. Aida Smajlović, docent
Biofarmaceutci savremeni način liječenja, naročito malignih i tumorskih oboljenja. Biofarmaceutici su uglavnom proteinske strukture, koja je jako nestabilna, čak i pri malim promjenama uslova (ph, tamperatura, prisustvo nekih otapala,...), kada može doći do promjene konformacijskog stanja.
Biofarmaceutici su proteini (antitijela), nukleinske kiseline (DNA, RNA, antisense lijekovi, oligonukleotidi) koji se koriste za terapijske ili in vivo dijagnostičke svrhe. Modifikatori biološkog odgovora (engl. biological modifiers) Prirodne supstance identične humanim koje mogu modifikovati normalan imuni odgovor organizma. U biofarmaceutike spadaju: interleukini, hormoni, vakcine... proteini, antitijela, enzimi,
FDA (Food and Drug Administration) Biofarmaceutici se definišu kao biotehnološki proizvodi odnosno bilo koji virus, terapijski serum, toksin, antitoksin ili analogni proizvod koji se može primijeniti u prevenciji, tretmanu ili liječenju bolesti ili povreda kod ljudi. Većina biofarmaceutika proizvedena je genetskim inženjeringom; prva takva supstanca koja je administrirana u terapeutske svrhe je biosintetisani humani inzulin, pripremljen metodama rekombinantne tehnologije,1982. godine.
Razvoj biofarmaceutika Proizvodnja biofarmaceutika je najvažniji sektor u biotehnološkoj industriji i jedna je od najbrže razvijajućih industrija visoke tehnologije. Trenutno su u toku istraživanja na više od 100 potencijalno terapijskih gena. Prvi primjeri biotehnoloških lijekova bili su jednostavni proteini replacement therapy. Kasnih 90-tih godina više od 350 biotehnoloških lijekova bilo je u različitim fazama razvoja u više od 140 farmaceutskih i biotehnoloških kompanija. Kasnije je razvoj usmjeren ka molekularnoj medicini i otkrivanju većeg broja gena koji su povezani sa malignim oboljenjima. Otkriveni su i klonirani neki kancer-determinišući geni, zbog čega se biotehnološki lijekovi sve više koriste kao zamjena za hemoterapiju. Tada se procijenilo da će pacijenti oboljeli od hemofilije, ozbiljne sepse, ulcera kože,reumatoidnog artritisa i brojnih kancera imati koristi u narednim godinama kada lijekovi prođu kroz klinička ispitivanja i dobiju dozvolu za puštanje u promet.
Neki od ovih lijekova već su na tržištu (Refacto za hemofiliju, Fuzeon za terapiju HIV-a, Kineret za hemoterapiju, Xigris za teške sepse). Genetski inženjering (tehnologija rekombinantne DNA)- vještačko obrazovanje novih kombinacija nasljednog materijala. Genetički kod je univerzalan i može se prenositi iz jednog organizma u drugi čime se dobija organizam sa drugačijom kombinacijom gena. Takva DNA je hibridna (rekombinantna) - u prirodi se nikada ne nalazi.
Genetski inženjering ima za cilj: -stvaranje novih farmaceutika odnosno biofarmaceutika (lijekova); -stvaranje sigurnijih i/ili efikasnijih verzija već postojećih farmaceutika odnosno biofarmaceutika; -proizvodnju supstanci identičnih konvencionalnonapravljenim farmaceuticima, u cilju uštede. Primjer biofarmaceutika koji je efikasan u tretmanu kancera dojke je trastuzumab (Herceptin ), monoklonsko antitijelo protiv Her2 receptora za tirozin kinazu, koji je pre-eksprimiran u oko 1/3 tumora dojke.
Klasifikacija biofarmaceutika Biofarmaceutike možemo svrstati u dvije skupine: biofarmaceutike prve generacije i biofarmaceutike druge generacije. Biofarmaceutici prve generacije - uglavnom kopije endogenih proteina ili antitijela, proizvedeni rekombinantnom DNA tehnologijom. Biofarmaceutici druge generacije - proteini ili antitijela čije su fizičkohemijske karakteristike dodatno poboljšane inženjeringom.
Klasifikacioni sistem biofarmaceutika-bcs (Biopharmaceutical Classification System) uzima u obzir tri glavna faktora: rastvorljivost, topivost i intestinalnu apsorpciju lijekova nakon oralne primjene po trenutnom oslobađanju doze iz čvrste oralne forme. Prema BCS, ljekovite supstance su klasifikovane u različite grupe: 1.klasa (visoka topivost i visoka permeabilnost) 2.klasa (niska topivost, visoka permeabilnost) 3.klasa (visoka topivost, niska permeabilnost) 4.klasa (niska topivost i permeabilnost).
Vrste biofarmaceutika Biofarmaceutici se danas razvijaju kako bi se pomoću njih borilo sa karcinomom, virusnim infekcijama, dijabetesom, hepatitisom, multiplom sklerozom. Prema tome, oni su grupisani u slijedećih sedam glavnih kategorija: Citokini Enzimi Hormoni Faktori zgrušavanja Vakcine Monoklonska antitijela Peptidni terapeutici. Trodimenzionalna struktura humanog hormona rasta koji se može svrstati u biofarmaceutike prikazana je na slici.
Stabilnost biofarmaceutika Stabilnost lijekova se definiše kao stepen u kome dozirni oblik zadržava sve svoje strukturne karakteristike u navedenim granicama, kroz cijeli period čuvanja i upotrebe koje je posjedovao i u vrijeme izrade. Cilj ispitivanja stabilnosti ljekovitih preparata je da se odredi vremenski period u kojem je lijek stabilan, odnosno za koje vrijeme izgubi najviše 10% dejstva aktivnog principa, skladišten pod normalnim uslovima.
Stabilnost: hemijska, fizička, mikrobiološka. Na hemijsku stabilnost utiču: ph, temperatura, svjetlost, priroda rastvarača, prisustvo kiseonika, joni teških metala, prisustvo peroksida... Biotehnološki lijekovi su uglavnom proteini- imaju nestabilnu strukturu i osjetljivi su na promjene in vivo i in vitro okruženja. Relativno male promjene nekih faktora mogu narušiti strukturu proteina. Ti faktori su: - temperatura - koncentracija soli -denaturirajuća sredstva (urea, GdnHCl) - ph
Terapijska efikasnost biofarmaceutika određena je njihovom proteinskom trodimenzionalnom strukturom koja je ovisna o interakcijama između aminokiselina. Trodimenzionalna struktura se održava slabim, nekovalentnim vezama i veoma je osjetljiva čak i na male promjene u temperaturi ili ph. Može doći do denaturacije ili čak razgradnje u organizmu i eliminacije. Proteini mogu umjesto nativnog stanja prilikom svijanja zauzeti formu agregata ili amiloida,što je nepoželjno.
Neophodne su mjere za određivanje i poboljšanje stabilnosti- proteini se koriste u terapeutske svrhe! Najpoznatije metode koje se bave studijama stabilnosti biofarmaceutika su: Metoda cirkularnog dihroizma Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija UHPLC ( Ultra-High Performance Liquid Chromatography) Fluorescentna spektroskopija
Primarna struktura proteina - podrazumijeva redoslijed vezivanja aminokiselina u peptidnom lancu. Sekundarna struktura- podrazumijeva položaj koji u prostoru zauzimaju atomi peptidnih veza u molekuli. Tercijarna struktura- prostorni raspored svih atoma u molekuli proteina predstavlja Kvaternarna struktura- proteini čija se molekula sastoji iz više od jednog polipeptidnog lanca.
Stabilnost biofarmaceutika tokom skladištenja Tokom skladištenja biofarmaceutika može doći do: racemizacije, izomerizacije, oksidacije i agregacije. Biofarmaceutici se skladište na temperaturi između 2 i 8 ºC Da bi se spriječilo stvaranje agregata - pažljivo se biraju rastvarači i pomoćne supstance- ne smiju imati negativno dejstvo po biofarmaceutik. Sporije rastvaranje smanjenje agregacije Protresanje oblika- uzrokuje pjenjenje- smanjuje se međuprostor između vode i zraka. Mehanički stres - tokom procesiranja, rukovanja, transporta - uzrokuje agregaciju biofarmaceutika. Jako je bitno: pažljivo rukovanje, transport, skladištenje - mogu se spriječiti mehanički stresovi - povećati i održati stabilnost biofarmaceutika.
Metode za određivanje stabilnosti biofarmaceutika Stabilnost: - hemijska ( stabilnost kovalentnih veza ) - konformacijska ( stabilnost svijenog proteina ) Definicija: promjena slobodne energije u reakciji promjene proteina iz nativnog u denaturisano stanje: G (T) = -RT ln K(T)
1. Cirkularni dihroizam (CD) CD- mjeri razlike u apsorpciji lijevo i desno kružno polarizovane svjetlosti. Mjerenje optičke aktivnosti asimetričnih molekula. Mjeri se u dva područja: - daleki UV CD spektar ( 170-250nm ) - bliski UV CD spektar ( 250-320 nm )
Mjerenje CD spektra radi se na temperaturi od 23 C, pomoću spektropolarimetra. on se sastoji od: izvora monohromatskog linearno - polarizovanog svjetla, optičkog sistema koji ga prevodi u desno i lijevo cirkularno polarizovanu svjetlost (CPL), detektora i računarskog dijela uređaja koji izračunava razliku između apsorbovane lijevo cirkularno polarizovane svjetlosti (LCLP) i desno cirkularno polarizovane svjetlosti (DCLP).
CD je metoda naročito pogodna za: - ispitivanje sekundarne i tercijarne strukture proteina, - poređenje strukture proteina iz različitih izvora ili strukture mutiranih i nativnih proteina, - ispitivanje uticaja temperature, ph i drugih uvjeta u okolini ili interakcije sa drugim molekulama (protein-protein ili protein-ligand) na konformaciju poteina, - ispitivanje stabilnosti konformacije u stresnim uvjetima (ph, T, denaturirajući agensi), pronalaženje uslova koji bi obezbjedili više temperature topljenja i reverzibilnost termalne denaturacije, dakle uslova koji općenito povećavaju stabilnost, - utvrđivanje optimalnih uslova za proizvodnju proteina
Određivanje sekundarne strukture proteina metodom cirkularnog dihroizma Sekundarna struktura se može odrediti CD spektroskopijom u "dalekom-uv" spektralnom području (170-250 nm). Hromofora je peptidna veza, a signal nastaje kada se ona nalazi u normalnom, svijenom stanju.
Daleki-UV CD spektri zahtijevaju 20-200 μl otopine uzorka koja sadrži 1 mg/ml do 50 g/ml proteina, u puferu.
Određivanje tercijarne strukture biofarmaceutika metodom cirkularnog dihroizma CD spektar proteina u "bliskom -UV spektru" (250-350 nm) može biti osjetljiv na određene aspekte tercijarne strukture. Na tim talasnim dužinama hromofore su aromatične aminokiseline i disulfidne veze, a snimljeni CD signali odnosno spektri osjetljivi su na ukupnu tercijarnu strukturu proteina.
Signali u regiji 250-270 nm mogu se pripisati fenilalaninskim aminokiselinskim ostacima, signali 270-290 nm mogu se pripisati tirozinskim, a oni u regiji 280-300 nm mogu se pripisati triptofanskim aminokiselinskim ostacima. Signal u bliskoj- UV CD regiji je dosta slabiji nego u dalekoj -UV CD regiji. Bliski -UV CD spektri zahtijevaju veće količine proteina za određivanje njihove tercijarne strukture.
Upoređivanje konformacijskih stanja biofarmacutika pomoću CD
2. Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija (DSC) Parametar koji karakteriše stabilnost sistema (npr., svijeno stanje proteina odnosno odvijeno stanje proteina) je ravnotežna konstanta (K) ili slobodna energija (ΔG ) koja predstavlja zbir entalpije (ΔH ) i entropije (ΔS ). Ovi parametri su ovisni o temperaturi kroz promjenu toplotnog kapaciteta (ΔCp). ΔH i ΔCp se računaju indirektno pomoću van t Hoffove metode,ili se mjere direktno kalorimetrijom.
DSC- direktno mjerenje termodinamičkih parametara koji karakterišu biomolekule. Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija (DSC) je tehnika koja registruje energiju (energetski fluks) potrebnu za održavanje nulte temperaturne razlike između ispitivanog uzorka i referentnog materijala, pri unaprijed definisanoj brzini grijanja (hlađenja), uz pretpostavku da se oba materijala nalaze pod istim uslovima.
DSC uređaj može raditi u dva režima: izotermskom i adijabatskom (dinamičkom). Izotermski metod: temperatura ispitivanog uzorka i temperatura referentnog materijala održavaju jednakim tokom zagrijavanja, variranjem snage u oba segmenta peći, preko koje se dobija promjena entalpije ili toplotnog kapaciteta u uzorku u odnosu na referentni materijal. Adijabatski režim rada podrazumjeva da DSC kalorimetar obezbjeđuje konstantnost toplotnog fluksa između uzorka i referentnog materijala. U ovom slučaju, promjena entalpije ili toplotnog kapaciteta u uzorku uzrokuje razliku temperature u odnosu na referentni uzorak, a mjeri se preko razlike napona između uzorka i referentnog materijala.
Termodinamički parametri DSC-može pratiti termički inducirane prijelaze, a posebno konformacijske prijelaze bioloških makromolekula. (npr. između svijenog i odvijenog stanja proteina ili između pojedinačne i dvostruke uzvojnice DNA).
DSC mjeri višak toplinskog kapaciteta molekule koju ispitujemo (Cp) u funkciji temperature. Integracija Cp naspram T krive doprinosi promjeni entalpije (ΔH m). DSC je jedina metoda za direktno određivanje promjene entalpije ΔH m
DSC i svijanje proteina / stabilnost Protein u denaturisanom stanju ima veći toplotni kapacitet nego onaj u nativnom- ΔCp odvijenog proteina skoro uvijek pozitivan! Na svijanje biofarmaceutika utiču: hidrofobne interakcije, vodikove veze, konformacijska entropija, temperatura, ph... Temperatura taljenja (Tm)- indikator termostabilnosti; veći Tm- protein je termostabilniji! Uticaj ph na stabilnost- maximalna termička stabilnost je u blago kiselim uslovima! (studija na osnovu ph 2-hidroksipropil-b-ciklodekstrin (HPbCD) saharoze )
3. UHPLC ( Ultra-High Performance Liquid Chromatography) HPLC odnosno tečna hromatografija visokih performansi ili tečna hromatografija pod visokim pritiskom - oblik kolonske hromatografije koji se koristi za radzvajanje komponenti iz smjese na osnovu hemijskih interakcija između supstance koja se analizira i stacionarne faze u koloni. Princip rada HPLC-a je forsiranje prolaska analizirane supstance (ili smjese) kroz kolonu (cijev punjena materijalom sitnih čestica) pumpanjem tečnosti (mobilna faza) pod visokim pritiskom kroz kolonu (stacionarna faza).
Vrijeme zadržavanja zavisi od: prirode supstance koja se analizira, stacionarne faze i sastava mobilne faze. Vrijeme za koje se supstanca eluira (dođe do kraja kolone)- retenciono vrijeme i karakteristično je za određenu supstancu. Veći pritisak- veća brzina razdvajanja. Rastvarači: voda, metanol, organski rastvarači (u vodu se može dodati i pufer).
Hromatografija na normalnim fazama Stacionarna faza- polarna ; mobilna faza- nepolarna Supstanca koja se analizira- polarna! Veća polarnost- veća jačina adsorpcije i duže vrijeme zadržavanja. Hromatografija na obrnutim fazama Stacionarna faza- nepolarna; mobilna faza- polarna Najčešća stacionarna faza je silikatna, tretirana sa RMe 2 SiCl, gdje je R alkilna grupa ravnog lanca kao C 18 H 37 ili C 8 H 17. Dodatkom polarnih rastvarača u mobilnu fazu- povećava se vrijeme zadržavanja. Dodatkom hidrofobnih interakcija- smanjuje se vrijeme zadržavanja.
Uređaj za HPLC se sastoji od sljedećih komponenti: Rezervoar mobilne faze Pumpa Injektor Kolona Detektor Ultra HPLC koristi isti princip metode separacije kao i konvencionalna HPLC, ali razlika je što UHPLC koristi kolone sa česticama manjeg promjera od 2 μm. Manje čestice omogućavaju: veću efikasnost kolone, povećanje masene osjetljivosti, analitičke rezolucije te brzine. Zahtijeva veći pritisak- samim tim i kvalitetnije pumpe.
Otkriće RNA interferencije (RNAi) kao mehanizma za selektivno utišavanje ekspresije messenger RNA (mrna) obezbjedilo je ogroman potencijal u okviru biomedicinskih istraživanja i razvoja lijeka. Upotreba malih posredničkih RNA (sirna) postala je glavni fokus industrijskih i akademskih laboratorija. Jedan od glavnih izazova- učinkovita sistemska dostava sirna na ciljnim stanicama. Formulacije bazirane na liposomima u lipidnim nanočesticama (LNP) najviše obećavaju i naširoko se koriste kao strategija za in vivo isporuku sirna.
UHPLC- ključna uloga u karakterizaciji hemijskih svojstava LNP formulacija! UHPLC- visoka propusnost i vrhunska učinkovitost razdvajanja- brzo i pouzdano određivanje RNA, lipida i srodnih formulacija u složenim frakcijama. Učinkovita i sigurna isporuka sirna na ciljne stanice- glavna prepreka u ostvarivanju velikih mogućnosti sirna kao terapeutika. Katjonski liposomi na bazi lipida u nanočesticama (LNP)- najefikasniji u riješavanju tih problema. LNP- in vivo dostavljanje- poboljšavaju farmakokinetička svojstva sintetičkih oligonukleotida,štiti od enzimske degradacije.
UHPLC u farmaceutskoj analizi UHPLC- uveden je 2004. godine i naširoko je prihvaćena i popularna metoda u mnogim industrijama. UHPLC u odnosu na konvencionalnu HPLC ima slijedeće prednosti: Povećana hromatografska separacija Znatno brža separacija Povećana masena osjetljivost Malo odlaganje volumena (brzo ponovno dovođenje u ravnotežu kolone za gradijent analizu) Brz odgovor detektora za efikasno eluiranje pikova na hromatogramu Korištenje submikroskopskih čestica UHPLC je najsavremenija metoda za farmaceutsku analizu i jako je pogodna za brzo i ultra-brzo odvajanje!
4. Fluorescentna spektroskopija Fluorescencija-pojava koja nastane kada supstanca koja je izložena elektromagnentom zračenju emitira elektromagnetno zračenje veće talasne dužine od onog kojim je izložena. Kod većine proteina nosioc fluorescencije je triptofan. Nukleinske kiseline ne fluoresciraju. Međutim, one se mogu proučavati fluorescentnom spektroskopijom ukoliko se vežu za neku pogodnu fluorescentnu molekulu, tzv. sondu.
Horizontalnim linijama označeni su različiti vibracioni nivoi (v=0,1,2,3...) osnovnog elektronskog stranja (S 0 ), kao i vibracioni nivoi ekscitiranog elektronskog stanja (S 1 ').
Razlika u energiji odnosno talasnoj dužini (predstavljena kao hν EX - hν EM ) se naziva Stokes-ov pomak (promjena). Stokes-ova pomak (promjena) je fundamentalna za osjetljivost fluorescentne metode.
Iako postoje 3 aminokiseline koje posjeduju intrinzna fluorescentna svojstva (Trp, Tyr, Phe) samo tirozin (Tyr) i triptofan (Trp) koriste se tokom istraživanja svijanja proteina jer su njihovi kvantni prinosi (emitirani fotoni/ekscitirani fotoni) dovoljno veliki da bi dali zadovoljavajući fluorescentni signal. Ti aminokiselinski ostaci se mogu upotrijebiti za praćenje svijanja proteina, jer njihova fluorescentna svojstva (kvantni prinosi) su osjetljiva na okolinu, a ona se mijenja tokom svijanja ili odvijanja proteina.
BSA koncentracije 0,1 M pri ekscitacionoj talasnoj doužini od 292 nm. Maksimum intenziteta fluorescence na 340 nm iznosi 135,161 a.u. BSA koncentracije 0,1 M pri ekscitacionoj talasnoj doužini od 295 nm. Maksimum intenziteta fluorescence na 340 nm iznosi 84,226 a.u.
BSA koncentracije 0,2 M pri ekscitacionoj talasnoj doužini od 292 nm. Maksimum intenziteta fluorescence na 340 nm iznosi 180,108 a.u. BSA koncentracije 0,2 M pri ekscitacionoj talasnoj doužini od 295 nm. Maksimum intenziteta fluorescence na 340 nm iznosi 120,087 a.u.
Emisijski fluorescentni spektri nativnog goveđeg serum albumina (C=0,2M), djelimično denturisanog u 1 5 M urei i potpuno denaturisanog u 6M urei, snimljeni u području 300-450 nm pri ekscitaciji od 292 nm nakon ravnotežne denaturacije od 40 min.
Emisijski fluorescentni spektri nativnog goveđeg serum albumina (C=0,2M), djelimično denturisanog u 1 5 M urei i potpuno denaturisanog u 6M urei, snimljeni u području 300-450 nm pri ekscitaciji od 295 nm nakon ravnotežne denaturacije od 40 min.
Procjena konformacijske stabilnosti pomoću fluorescentne spektroskopije triptofana Fluorescencija svijenih proteina predstavlja mješavinu fluorescencija iz pojedinih aromatskih aminokiselinskih ostataka. Većina emisija fluorescencija dolazi od triptofanskih ostataka, rijeđe od tirozinskih i fenilalaninskih. Značajne su i disulfidne veze. Triptofan ima talasnu dužinu sa maksimalnom apsorpcijom od 280 nm i emisiju pika u rasponu od 300 do 350 nm, zavisno od polarnosti lokalnog okruženja. Na fluorescenciju triptofana utiče i blizina drugih a.k. ostataka kao npr. asperginskih i glutaminskih,koji mogu uzrokovati gašenje fluorescencije triptofana.
Triptofan relativno rijetka aminokiselina u proteinima (jedan do nekoliko triptofanskih ostataka). Ako protein koji sadrži 1 triptofanski ostatak denaturira-pojava crvenog pomaka spektra. (zbog izlaganja triptofana vodenom okruženju) Dodatak površinski-aktivne tvari (npr. tenzida) proteinu koji sadrži triptofan-izaziva plavi pomak spektra. (zbog ugrađivanja triptofana u vezikule ili micele tenzida)
Dužina života Absorbancija Fluorescencija Talasna dužina Apsorpcija Talasna dužina Kvant Triptofan 2.6 280 5,600 348 0.20 Tirozin 3.6 274 1,400 303 0.14 Fenilalanin 6.4 257 200 282. 0.04 Fluorescentna spektroskopija triptofana predstavlja dobar, brz i ekonomičan način za provjeru termičke konformacijske stabilnosti različitih formulacija, kakve su i biofarmaceutici.
Karakterizacija rastvora trastuzumaba (Herceptin ) pomoću fluorescentne spektroskopije Terapeutski imunoglobulin trastuzumab (Herceptin ) bi trebao biti topiv u 0.9% NaCl, a uočeno je i otapanje u 5% dekstrozi. Nakon analize određenom metodom separacije, ne može se uočiti razlika između trastuzumaba otopljenog u NaCl-u i trastuzumaba otopljenog u dekstrozi. U 5% dekstrozi se uočavaju agregati.
Fluorescentna spektroskopija prati promjene u strukturi (naročito tercijarnoj) proteinabiofarmaceutika. Analiza pokazuje: dolazi do porasta intenziteta fluorescencije i porasta anizotropija uzorka antitijela, što uzrokuje njegovo vezivanje za trastuzumab otopljen u dekstrozi- što uzorkuje stvaranje agregata.
Spektar anizotropije uzorka antitijela u prisustvu trastazumaba otopljenog u 0.9%NaCl-u (jasna linija) i trastazumaba otopljenog u 5% dekstrozi (isprekidana linija). Fluorescentni emisioni spektar uzorka antitijela u prisustvu trastazumaba otopljenog u 0.9% NaCl-u ( jasna linija) i 5% dekstrozi (isprekidana linija).
Biofarmaceutici su proteini (antitijela), nukleinske kiseline (DNA,RNA) koji se koriste kao lijekovi. Dobijaju se procesima biotehnologije korištenjem živih organizama. Posljednjih godina se zapaža veliki porast ovih lijekova na tržištu i smatra se, da će se ta tendencija za inovacijom i nastaviti. Koriste se u terapiji raznih teških oboljenja a naročitu primjenu su našli u liječenju hroničnih inflamatornih oboljenja kao što je reumatoidni artritis. S obzirom na proteinsku strukturu- nestabilni su i skloni promjeni svog osnovnog stanja.
Velika pažnja se posvećuje proučavanju stabilnosti biofarmaceutika te načinu poboljšavanja iste. Metode koje se uspješno koriste za proučavanje stabilnosti biofarmaceutika su: cirkularni dihroizam, diferencijalna skenirajuća kalorimetrija, UHPLC, fluorescentna spektroskopija i druge. Jako je važno pažljivo rukovanje i skladištenje biofarmaceutika radi očuvanja stabilnosti biofarmaceutika, i spriječavanja pojave mehaničkih stresova koje je narušavaju.
Tačkaste mutacije kod rekombinantnih proteina P74S(E31) i H75W(Y31) ugrađene su na sredini treće petlje.
degcm 2 dmol -1 135 115 95 75 55 35 15-5 -25-45 stb(e31) P74S(E31) H75W 250 270 290 310 λ[nm] Spektri u bliskom UV području, koji pojašnjavaju asimetričnu okolinu aromatskih aminokiselinskih ostataka, pokazali su da oba mutanta P74S(E31) i H75W(Y31) imaju istu poziciju tirozinskog pika u bliskom UV području kod 275 nm. Rekombinantni mutant H75W(Y31) izo-oblika divljeg-tipa (wt) čovječijeg stefina B (Y31) ima dodatni triptofanski pik kod 254 nm. CD spektar mutanta P74S(E31) u bliskom-uv području jasno pokazuje da njegova mutacija ne mjenja tercijarnu strukturu u odnosu na incijalni protein tj. divlji-tip (wt) čovječijeg stefina B, tj. ne opažaju se promjene na rigidnoj okolini aromata
degcm 2 dmol -1 8000 6000 4000 stb(e31) P74S(E31) H75W stb(e31) 2000 0 degcm 2 dmol -1 5000 2000-1000 -2000-4000 -6000 195 205 215 225 235 245 λ[nm] -4000-7000 stb(e31) stb(e31)-m stb(e31)-d 195 205 215 225 235 245 λ[nm] Protein %M %D %T %O stb(e31) 32 33,49 23,54 11,05 P74S(E31) 2,17 73,23 15,92 8,68 Male razlike u dalekim-uv CD spektrima posljedica su različite distribucije oligomera u uzorcima stefina B (E31) i njegovog mutanta P74S(E31).
Stabilnost proteina Metode za određivanje stabilnosti proteina Denaturacija ureom termodinamički parametri ΔG N-U c m m ph denaturacija Toplotna denaturacija termodinamički parametri ΔH Tm
Denaturacija ureom Molarna eliptiènost [deg cm2 / dmol] 0-2000 -4000-6000 0 stb(e31) 2 4 6 Koncentracija uree [M] 8 Molarna eliptiènost [deg cm2 / dmol] 0-2000 -4000-6000 0 P74S(E31) 2 4 6 Koncentracija uree [M] 8 Molarna eliptiènost [mdeg cm2 / dmol] 0-2000 -4000-6000 0 H75W 2 4 6 Koncentracija uree [M] 8 Veća vrijednost kooperativnosti (m) tačkastog mutanta P74S(E31) u odnosu na divlji-tip (wt) čovječijeg stefina B (E31) i tačkasti mutant H75W(Y31), najvjerovatnije je posljedica dimerizacije. Protein ΔGº N-U (kj/mol) m (kj/mol) c m (M) wt stefin B (E31) -31,29 ± 3,9 6,5 ± 0,8 4,9 ± 0,1 P74S(E31) mutant -40,53 ± 4,7 7,7 ± 0,9 5,3 ± 0,1 H75W(Y31) mutant -20,79 ± 3,1 5,4 ± 0,8 4,3 ± 0,1
Denaturacijske krive prikazuju zavisnost udjela odvijenog proteina od koncentracije denaturirajućeg sredstva (uree), a izračunate su korištenjem dvostepene aproksimacije (Santoro i Bolen, 1988): Δε={[(Δε N +m N x [D])+(Δε U +m U x [D]) x exp-(δg N-U /RT+m G x [D]/RT)]/ [1+exp-(ΔG N-U /RT+m G x [D]/RT)]} -Δε je vrijednost signala u mdeg pri izabranoj talasnoj dužini, -Δε N i Δε U su vrijednosti signala pri određenoj talasnoj dužini za svijeni i odvijeni protein, -m N i m U predstavljaju nagib bazne crte u pred- i post-tranzicijskom dijelu krive, -m G nagib pravca u tranzicijskom području, -[D] je koncentracija denaturirajućeg sredstva, -ΔG N-U slobodna energija odvijanja ekstrapolirana na koncentraciju denaturirajućeg sredstva 0. Na osnovu gore navedene jednačine izračunati su udjeli odvijenog proteina u funkciji koncentracije uree: f U =(Δε N - Δε)/(Δε N - Δε U )
udio odvijenog proteina (fu) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 stb(e31) udio odvijenog proteina (fu) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 P74S(E31) udio odvijenog proteina (fu) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 H75W 0 2 4 6 koncentracija uree [M] 8 0 2 4 6 koncentracija uree [M] 8 0 2 4 6 koncentracija uree [M] 8 Ravnotežne denaturacije ureom, pokazuju da se divlji-tip (wt) čovječijeg stefina B i tačkasti mutanati stefina B P74S(3E31) i H75W(Y31) odvijaju kooperativno (sekundarna i tercijarna struktura se odvijaju istovremeno). Ovo je jedna od osobina proteina koji se svijaju dvostepeno.
Toplotna denaturacija CD spektri snimljeni u dalekom UV području, za divlji-tip (wt) čovječijeg stefina B u temperaturnom području od 313 K do 363 K, a za mutantne proteine P74S(E31) i H75W(Y31) u temperaturnom području od 298 K do 368 K, na talasnim dužinama 222 nm i 210 nm, radi određivanja temperature neophodne za potpuno odvijanje proteina. CD signali na talasnoj dužini od 222 nm i 210 nm korišteni su za analizu krivih odvijanja proteina dobivenih toplotnom denaturacijom proteina. Krive toplotne denaturacije su prilagođene i date kao modifikovana forma Van t Hoff-ove jednačine, koja istovremeno prilagođava nativnu i denaturisanu baznu liniju, kao i tranzicijski region. Na osnovu modifikovane forme Van t Hoff-ove jednačine određene su vrijednosti temperature taljenja Tm i promjene entalpije H za divlji-tip (wt) rekombinantnog čovječijeg stefina B, tačkasti mutant P74S(E31) i tačkasti mutant H75W koji su podvrgnuti toplotnoj denaturaciji (Karantzeni i sar., 2003): ε = (mnt + bn) + (mdt + bd) [K / (1+K)] gdje je K = exp[- H(1 T/Tm) / RT]
mdeg (210 nm) -40000-44000 -48000-52000 210 nm stb(e31) A mdeg (222 nm) -50000-52000 -54000-56000 stb(e31) 222 nm A -56000 320 340 360 Temperatura [K] 380 320 340 360 Temperatura [K] 380 mdeg (210 nm) -30000-35000 B -40000-50000 210 nm 222 nm -45000 210 nm P74S(E31) P74S(E31) -52000-50000 222 nm mdeg (222 nm) -48000 B 300 320 340 Temperatura [K] 360 380 300 320 340 Temperatura [K] 360 380-24000 mdeg (210 nm) -28000-32000 -36000-40000 H75W 210 nm 300 320 340 Temperatura [K] 360 C 380 mdeg (222 nm) -35000-40000 -45000-50000 -55000 H75W 222 nm 300 320 340 Temperatura [K] 360 C 380
Protein ΔGº N-U (kj/mol) m (kj/mol) c m (M) wt stefin B (E31) -31,29 ± 3,9 6,5 ± 0,8 4,9 ± 0,1 P74S(E31) mutant -40,53 ± 4,7 7,7 ± 0,9 5,3 ± 0,1 H75W(Y31) mutant -20,79 ± 3,1 5,4 ± 0,8 4,3 ± 0,1 Protein ph c [μm] T m210 [K] Δ H 210 [kj/mol] stb(e31) 7 47 349,91±0,44 756,41±167,95 P74S(E31) 7 47 352,61±0,44 587,40±133,0 H75W 7 47 341,90±0,95 1287,09±218,20 Red stabilnosti proteina P74S(E31) > stb(e31) > H75W(Y31)
Strukturna karakterizacija intermedijata svijanja degcm 2 dmol -1 150 120 90 stb(y31) stb(y31); ph=6,04 stb(y31); ph=4,8 60 30 0-30 250 270 290 310 λ[nm] Ravnotežni spektri izo-oblika divljegtipa (wt) čovječijeg stefina B (Y31) pri ph 6,04 (nativan protein) i ph 4,8 (nepotpunog ponovnog svijanja u 0,015 M acetatnom puferu 0,15 M NaCl, ph 4,8). CD spektar intermedijata svijanja sličan spektru nativnog proteina, ali je nešto nižeg intenziteta Pokazuje vrijednost amplitude približno 66% od amplitude tercijarne strukture nativnog proteina. Dakle, radi se o intermedijatu nativnom stanju sličnom, koji nastaje u uslovima nepotpunog refoldinga kod ph 4,8 (0,015 M acetatnom puferu 0,15 M NaCl), tj. uslovima ph u kojima se opaža nastajanje fibrila izo-oblika divljeg-tipa (wt) čovječijeg stefina B.
degcm 2 dmol -1 stb(y31) 1000-1000 -3000 stb(y31) -5000 195 205 215 225 235 245 Daleki UV CD spektar od 250 do 195 nm izo-oblika divljeg-tipa (wt) čovječijeg stefina B (Y31) snimljen nakon denaturacije u 0,02 M TEA puferu i nepotpunog ponovnog svijanja u 0,015 M acetatnom puferu 0,15 M NaCl, ph 4,8. λ [nm] Nativnom stanju sličan intermedijat, nastao u blago kiseloj sredini kod ph 4,8 (0,015 M acetatnom puferu 0,15 M NaCl, ph 4,8) imao je u potpunosti uspostavljenu sekundarnu strukturu.
Kinetika svijanja izo-oblika divljeg-tipa (wt) čovječijeg stefina B (Y31) i njegovog mutanta H75W(Y31) Metode za određivanje kinetičkih faza svijanja i konstanti brzine svijanja proteina H75W(Y31) metoda Trp fluorescence stb(y31) metoda ANS (1-anilinonaftalen 8 sulfonat) fluorescence metoda ThT fluorescence metoda ANS (1-anilinonaftalen 8 sulfonat) fluorescence
Kinetika svijanja izo-oblika divljeg-tipa (wt) čovječijeg stefina B (Y31) praćena ANS fluorescencom kod ph 4,8 Intenzitet ANS fluorescence ("a.u.") 9,2e+005 8,8e+005 8,4e+005 8e+005 A 1 stb(y31) ANS fluorescenca; 3 mm ANS; ph=4,8; 36 C; k1 Intenzitet ANS fluorescence ("a.u.") 9,2e+005 8,8e+005 8,4e+005 A 2 ANS fluorescenca; 3 mm ANS; ph=4,8; 36 C; k2 stb(y31) 2 4 6 8 8e+005 0 20 40 60 Vrijeme [s] Vrijeme [s] Intenzitet ANS fluorescence ("a.u.") 1,4e+006 1,2e+006 1e+006 8e+005 0 2000 A 3 stb(y31) ANS fluorescenca; 3 mm; ph=4,8; 36 C; k3 4000 6000 8000 U trećoj kinetičkoj fazi svijanja, koja se odvijala u intervalu od 60 do 7000 s, sa konstantom brzine k 3, došlo je do porasta ANS fluorescence i stvaranja nativnom stanju sličnih intermedijata. Vrijeme [s]
Kinetika svijanja izo-oblika divljeg-tipa (wt) čovječijeg stefina B (Y31) praćena ANS fluorescencom kod ph 5,8 Intenzitet ANS fluorescence ("a.u.") 92000 88000 84000 stb(y31) 80000 ANS fluorescenca; 3 mm ANS; ph=5,8; 36 C; k1 Intenzitet ANS fluorescence ("a.u.") 90000 87000 84000 81000 ANS fluorescenca; 3 mm ANS; ph=5,8; 36 C; k2 stb(y31) 3 6 9 12 15 20 40 60 80 Vrijeme [s] Vrijeme [s] Intenzitet ANS fluorescence ("a.u.") 96000 92000 88000 84000 stb(y31) ANS fluorescenca; 3 mm ANS; ph=5,8; 36 C; k3 Intenzitet ANS fluorescence ("a.u.") 96000 93000 90000 87000 ANS fluorescenca; 3 mm ANS; ph=5,8; k4 stb(y31) 0 300 600 Vrijeme [s] 900 0 2000 4000 Vrijeme [s] 6000 8000 Kod ph 5,8 čovječiji stefin B (Y31) se svijao preko dva intermedijata, prvog kratkoživućeg (15 s) i intermedijata 2 (900 s) nakon čega se u 7000 s uspostavila nativna konformacija.
Kinetika svijanja izo-oblika divljeg-tipa (wt) čovječijeg stefina B (Y31) praćena ANS fluorescencom kod ph 7,0 1,8e+005 Intenzitet ANS fluorescence ("a.u.") 1,6e+005 1,4e+005 1,2e+005 0 A 1 stb(y31) ANS fluorescenca; 3 mm ANS; ph=7,0; 36 C; k3 20 40 60 Slična kinetika svijanja opažena je i kod ph 7,0 s tim da su se konformacije intermedijata uspostavljale brže, a nativna konformacija se počela uspostavljati već nakon 60 s. Vrijeme [s] Intenzitet ANS fluorescence ("a.u.") 1,6e+005 1,4e+005 1,2e+005 0 2000 ANS fluorescenca; 3 mm ANS; ph=7,0; 36 C; k4 4000 6000 stb(y31) A 2 8000 Sa povećanjem ph od 4,8 na 5,8 odnosno 7,0 povećale su se konstante brzina nastajanja intermedijata svijanja, a smanjilo se vrijeme njihovog života. Vrijeme [s]
ANS fluorescencom, Trp fluorescencom i ThT fluorescencom praćena kinetika svijanja mutanta H75W(Y31) je pokazala da se protein kod ph 4,8 svijao u jednoj kinetičkoj fazi do intermedijata, na osnovu čega se može zaključiti da se njegov mehanizam svijanja razlikuje od mehanizma svijanja izo-oblika divljegtipa (wt) čovječijeg stefina B (Y31) kod ovog ph. Intenzitet ANS fluorescence ("a.u.") 2e+005 1,6e+005 1,2e+005 80000 40000 H75W Trp fluorescenca Kinetika svijanja mutanta H75W(Y31) kod ph 4,8 ANS fluorescenca; 3 mm ANS; ph=4,8; 36 C; k1 Intenzitet Trp fluorescence ("a.u.") 1000 800 600 H75W Trp fluorescenca; ph=4,8; 36 C; k1 Intenzitet ThT fluorescence ("a.u.") 52000 48000 44000 40000 36000 H75W ThT fluorescenca; 6 M urea; ph=4,8; 36 C; k1 0 2000 4000 Vrijeme [s] 6000 8000 0 2000 4000 Vrijeme [s] 6000 8000 0 2000 4000 Vrijeme [s] 6000 8000
Intenzitet ANS fluorescence ("a.u.") Intenzitet Trp fluorescence ("a.u.") 6000 4000 2000 1000 800 600 400 0 2000 A H75W ANS fluorescenca; 3 mm ANS; ph=5,8; 36 C; k1 4000 6000 8000 Vrijeme [s] B H75W Trp fluorescenca; ph=5,8; 36 C; k1 ANS fluorescencom i Trp fluorescencom praćena kinetika svijanja mutanta H75W(Y31) je pokazala da se protein kod ph 5,8 svijao u jednoj kinetičkoj fazi do intermedijata što je slično kinetici svijanja ovog proteina kod ph 4,8. 0 2000 4000 6000 8000 Vrijeme [s]
Intenzitet ANS fluorescence ("a.u.") 1640 1600 1560 1520 ANS fluorescenca; 3 mm ANS; ph=7,0; 36 C; k1 H75W 4 8 12 16 Vrijeme [s] 20 Intenzitet ANS fluorescence ("a.u.") 1650 1600 1550 1500 1450 1400 0 500 ANS fluorescenca; 3 mm ANS; ph=7,0; 36 C; k2 H75W Intenzitet ANS fluorescence ("a.u.") 1000 1500 2000 2500 Vrijeme [s] 1480 1440 1400 1360 5600 H75W ANS fluorescenca; 3 mm ANS; ph=7,0; 36 C; k3 6000 6400 6800 Vrijeme [s] Intenzitet Trp fluorescence ("a.u.") 1920 1900 1880 1860 2 H75W Trp fluorescenca; 3 mm ANS; ph=7,0; 36 C; k1 4 6 8 Vrijeme [s] Intenzitet Trp fluorescence ("a.u.") 1850 1800 1750 1700 20 40 Trp fluorescenca; 3 mm ANS; ph=7,0; 36 C; k2 H75W 60 80 100 120 Vrijeme [s] Intenzitet Trp fluorescence ("a.u.") 2000 1800 1600 0 2000 H75W Trp fluorescenca; 3 mm ANS; ph=7,0; 36 C; k3 4000 6000 8000 Vrijeme [s] Kod ph 7,0 mutant H75W se svijao u tri kinetičke faze do uspostavljanja strukture intermedijata 2, analogno svijanju čovječijeg stefina B (Y31) na ph 4,8.
Puno zdravlja, ljubavi, sreće i uspjeha na predstojećim ispitnim rokovima u novoj 2015. godini