ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE PROTEINA FIZIKALNO-KEMIJSKIM METODAMA

ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE PROTEINA FIZIKALNO-KEMIJSKIM METODAMA Izbor metode za određivanje koncentracije u pojedinom slučaju ovisi o količini kojom se raspolaže, njihovoj koncentraciji, prisutnosti različitih agenasa koji mogu utjecati na rezultate mjerenja (detergenti, organska otapala, reducirajući agensi, soli, kiseline, lužine itd.), o vrsti i čistoći u otopini te o potrebnoj preciznosti mjerenja. Fizikalnokemijske metode za određivanje koncentracije se dijele na apsorpcijske i kolorimetrijske metode. APSORPCIJSKE METODE Apsorpcijske metode se baziraju na apsorpciji svjetlosti određene valne duljine u otopini. Proteini imaju apsorpcijske maksimume pri valnim duljinama od 280 nm i 205 nm (UV dio spektra). Svjetlost valne duljine 280 nm u molekulama apsorbiraju aromatski prstenovi aminokiselina (Trp, Phe, Tyr). Proteini sa manjim udjelom aromatskih aminokiselina stoga imaju manju A 280 u odnosu na proteine koji sadrže više aromatskih aminokiselina. Nadalje, na vrijednost A 280 utječu faktori koji djeluju na tercijarnu strukturu (budući da interakcije aminokiselinskih ostataka u tercijarnoj strukturi doprinose stabilizaciji elektrona u aromatskim prstenovima) kao i prisustvo drugih molekula u otopini koje apsorbiraju svjetlost pri 280 nm. Svjetlost valne duljine 205 nm apsorbiraju peptidne veze u proteinima pa aminokiselinski sastav znatno manje utječe na vrijednost A 205 nego što je to slučaj kod A 280. Veliki broj pepetidnih veza u molekuli rezultira visokom vrijednošću apsorbancije pa je mjerenjem A 205 moguće detektirati znatno manje koncentracije nego pri 280 nm (A 205 su oko 30 puta veće nego A 280 za istu koncentraciju ). Međutim, znatno veći broj kemikalija apsorbira svjetlost pri ovoj valnoj duljini nego što je to slučaj pri 280 nm (pogotovo one koje sadrže dvostruke veze između atoma ugljika ili ugljika i kisika). Određivanje koncentracije mjerenjem A 280, odnosno A 205 je brzo i jednostavno, a odnos koncentracije i vrijednosti apsorbancija je linearan u širokom opsegu koncentracija. Dodatna prednost ovih metoda je što se proteinima tijekom mjerenja ne dodaju nikakvi reagensi, niti se na bilo koji način utječe na njihova svojstva, pa se nakon završetka mjerenja mogu koristiti u daljnjim eksperimentima. KOLORIMETRIJSKE METODE Kolorimetrijske metode se baziraju na kemijskoj reakciji sa različitim reagensima pri čemu se razvija karakteristično obojenje otopine. Intenzitet razvijene boje je u određenom opsegu koncentracija proporcionalan koncentraciji, a najpreciznija su mjerenja u središnjem dijelu područja proporcionalnosti. Na točnost mjerenja mogu utjecati i druge molekule koje su prisutne u otopini (puferi, soli, detergenti itd.), a na rezultate mjerenja utječe i vrsta tako da različiti proteini jednake koncentracije mogu pokazivati različite vrijednosti apsorbancije. Stoga je od iznimne važnosti da se za izradu baždarnog dijagrama, ukoliko je to moguće, koristi protein čiju koncentraciju kasnije želimo određivati u uzorcima, odnosno, ako to nije moguće, protein koji daje najsličnije vrijednosti apsorbancije. Osim toga slijepa proba mora sadržavati sve komponente koje sadrži i uzorak u kojem mjerimo koncentraciju kako bi se eliminirao njihov utjecaj na vrijednosti apsorbancije. 1

Određivanje koncentracije metodom po Lowry-u Metoda se bazira na reakciji Cu 2+ sa peptidnim vezama u lužnatom mediju pri čemu dolazi do redukcije Cu 2+ u Cu +. Nakon toga se u reakcijsku smjesu dodaje Folin- Ciocalteu reagens koji reagira sa Cu + -protein kompleksom kao i sa pobočnim lancima Tyr, Trp i Cys stvarajući u početku nestabilan kompleks koji se polako reducira pri čemu se razvija plavo obojenje. Prisustvo agenasa koji zakiseljuju otopinu (npr. kiseline, jaki kiseli puferi, visoka amonij sulfata i sl.), kelirajućih agenasa koji vežu Cu 2+ (npr. EDTA) ili reducirajućih agenasa (npr. -merkaproetanol, ditiotreitol i sl.) znatno utječe na rezultate mjerenja. Također na rezultate mjerenja utječu i razlike u sadržaju Tyr i Trp u proteinima. Određivanje koncentracije metodom po Bradford-u Metoda se bazira na reakciji sa bojom Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBB) u kiselom mediju. CBB reagira prvenstveno sa pobočnim grupama Arg, a u manjoj mjeri i sa pobočnim grupama His, Lys, Tyr, Trp i Phe. Boja se na proteine veže hidrofobnim interakcijama i ionskim vezama što stabilizira boju u anionskom obliku i dovodi do vidljive promjene boje iz smeđe u plavu. Pri tome se apsorpcijski maksimum boje pomiče sa 465 nm na 595 nm što se prati spektrofotometrijski. Ova metoda je u širokoj upotrebi zbog svoje jednostavnosti, brzine i širokog opsega proprocionalnosti intenziteta obojenja i koncentracije. 2

ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE PROTEINA MJERENJEM APSORPCIJE U UV DIJELU SPEKTRA Pripremiti uzorke otopine albumina iz goveđeg seruma (BSA), odnosno albumina iz bjelanjka kokošjeg jajeta (Alb), mješanjem otopine početne koncentracije 5 mg/ml; 0,5 mg/ml odnosno 0,05 mg/ml sa odgovarajućim om destilirane vode tako da konačne koncentracije u uzorcima odgovaraju vrijednostima navedenim u tablici 1., pri čemu konačni uzorka treba biti 1 ml. (mg/ml) Tablica 1. mjerenje A 280 mjerenje A 205 početna otopine vode (mg/ml) (mg/ml) početna (mg/ml) 2 5 0,1 0,5 1,5 5 0,05 0,5 1 5 0,01 0,05 0,5 0,5 0,025 0,05 0,1 0,5 0,005 0,05 otopine vode izmjeriti A 280 i A 205 (vrijednosti upisati u tablicu 2.) i konstruirati dijagrame ovisnosti A 280 i A 205 o koncentraciji (mg/ml) Tablica 2. A 280 BSA A 280 Alb (mg/ml) 2 0,1 1,5 0,05 1 0,01 0,5 0,025 0,1 0,005 A 205 BSA A 205 Alb usporediti rezultate za BSA i Alb i odrediti područje linearnosti za određivanje koncentracije mjerenjem A 280 odnosno A 205 OTOPINE - vodene otopine BSA koncentracija: 5 mg/ml; 0,5 mg/ml; 0,05 mg/ml - vodene otopine albumina koncentracija: 5 mg/ml; 0,5 mg/ml; 0,05 mg/ml 3

Dijagram ovisnosti A 280 o koncentraciji : Zaključak: 4

Dijagram ovisnosti A 205 o koncentraciji : Zaključak: 5

ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE PROTEINA METODOM PO LOWRY-u Pripremiti uzorke otopine albumina iz goveđeg seruma (BSA), odnosno albumina iz bjelanjka kokošjeg jajeta (Alb), mješanjem otopine početne koncentracije 0,5 mg/ml odnosno 0,05 mg/ml sa odgovarajućim om destilirane vode tako da konačne koncentracije u uzorcima odgovaraju vrijednostima navedenim u tablici 3., pri čemu konačni uzorka treba biti 2 ml. Tablica 3. (mg/ml) početna (mg/ml) 0,2 0,5 0,1 0,5 0,05 0,05 0,01 0,05 0,005 0,05 otopine vode za svaku koncentraciju potrebno je pripremiti tri paralelne probe te za cijelu seriju mjerenja jednu slijepu probu u 0,4 ml otopine dodati 2 ml reagensa C, promiješati potresivanjem i držati na sobnoj temperaturi 10 do 15 minuta naglo dodati 0.2 ml Folin-Ciocalteu reagensa uz snažno mješanje (vortex) i ostaviti na sobnoj temp. 40 do 60 minuta izmjeriti vrijednost A 740 (vrijednosti upisati u tablicu 4.) i konstruirati dijagrame ovisnosti A 740 o koncentraciji Tablica 4. (mg/ml) 0,2 0,1 0,05 0,01 0,005 A 740 BSA A 740 Alb usporediti rezultate za BSA i Alb i odrediti područje linearnosti za određivanje koncentracije metodom po Lowry-u OTOPINE - vodene otopine BSA koncentracija: 0,5 mg/ml; 0,05 mg/ml - vodene otopine albumina koncentracija: 0,5 mg/ml; 0,05 mg/ml - reagens A: 2% Na 2 CO 3 u 0.1 M NaOH 6

- reagens B: 0.5 % CuSO 4 x 5H 2 O u 1% K,Na - tartaratu - reagens C: 50 ml reagensa A + 1 ml reagensa B - Folin-Ciocalteu reagens: komercijalni reagens razrijeđen dest. vodom u omjeru 1:2 Dijagram ovisnosti A 740 o koncentraciji : Zaključak: 7

ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE PROTEINA METODOM PO BRADFORDU Pripremiti uzorke otopine albumina iz goveđeg seruma (BSA), odnosno albumina iz bjelanjka kokošjeg jajeta (Alb), mješanjem otopine početne koncentracije 0,5 mg/ml; 0,05 mg/ml odnosno 0,005 mg/ml sa odgovarajućim om destilirane vode tako da konačne koncentracije u uzorcima odgovaraju vrijednostima navedenim u tablici 5., pri čemu konačni uzorka treba biti 1 ml. Tablica 5. (mg/ml) početna (mg/ml) 0,1 0,5 0,075 0,5 0,05 0,05 0,01 0,05 0,005 0,005 otopine vode za svaku koncentraciju potrebno je pripremiti tri paralelne probe te za cijelu seriju mjerenja jednu slijepu probu u 0,2 ml otopine dodati 0,8 ml Bradfordovog reagensa, lagano promiješati i ostaviti na sobnoj temperaturi 5 minuta izmjeriti vrijednost A 595 (vrijednosti upisati u tablicu 6.) i konstruirati dijagrame ovisnosti A 595 o koncentraciji Tablica 6. (mg/ml) 0,1 0,075 0,05 0,01 0,005 A 595 BSA A 595 Alb usporediti rezultate za BSA i Alb i odrediti područje linearnosti za određivanje koncentracije metodom po Bradford-u OTOPINE - vodene otopine BSA koncentracija: 0,5 mg/ml; 0,05 mg/ml; 0,005 mg/ml - vodene otopine Alb koncentracija: 0,5 mg/ml; 0,05 mg/ml; 0,005 mg/ml; - Bradford-ov reagens: 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250; 50 ml 95% EtOH; 100 ml 85% fosfatne kiseline; H 2 O do 1000 ml 8

Dijagram ovisnosti A 595 o koncentraciji : Zaključak: 9

ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE UGLJIKOHIDRATA Većina metoda za određivanje ugljikohidrata bazira se na reaktivnosti reducirajućih grupa šećera. Rekacije na kojima se baziraju ove metode mogu se podjeliti na redukcijske reakcije, reakcije s aromatskim aminima i reakcije s jakom kiselinom i fenolom ili fenolnim spojevima. Metode koje se baziraju na redukcijskim reakcijama su jednostavne, brze, točne i ne zahtijevaju posebnu opremu, međutim osjetljive su na redukcijske spojeve i ne daju informaciju o kojem ugljikohidratu se radi, a određivanje nereducirajućih ugljikohidrata zahtjeva prethodnu hidrolizu glikozidnih veza. Metode koje se baziraju na reakciji reducirajućeg šećera sa jakom kiselinom i fenolom ili fenolnim spojevima daju obojene komplekse čija je boja donekle specifična za pojedine ugljikohidrate. Fenolni spojevi koji se koriste u tu svrhu su -naftol, 3-indol octena kiselina, rezorcinol, p- bromoanilin, orcinol i sam fenol. 3-indol octena kiselina je specifična za ketoze pa se koristi za određivanje fruktoze u prisutnosti glukoze. Orcinol i p-bromoanilin daju različitu boju s pentozama u odnosu na heksoze. 10

ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE UGLJIKOHIDRATA POMOĆU REAKCIJA KARBONILNE GRUPE DNS METODA DNS metoda je jedna od redukcijskih metoda za određivanje koncentracije ugljikohidrata. Bazira se na reakciji 3,5-dinitrosalicilne kiseline (DNS) sa slobodnom aldehidnom grupom reducirajućih šećera u lužnatim uvjetima. Pri tome se aldehidna grupa šećera okisidira u karboksilnu, a 3,5-dinitrosalicilna kiselina reducira u 3-amino-5-nitrosalicilnu kiselinu. 3- amino-5-nitrosalicilna kiselina apsorbira svjetlost pri 530 nm pa se nastajanje 3-amino-5- nitrosalicilne kiseline može pratiti spektrofotometrijski. oksidacija aldehidna grupa ----------> karboksilna grupa redukcija 3,5-dinitrosalicilna kiselina ----------> 3-amino-5-nitrosalicilna kiselina Različiti reducirajući šećeri međutim daju različit intenzitet obojenja pa je za svaku vrstu šećera potrebno napraviti poseban baždarni dijagram. ORCINOL SULFATNA METODA Orcinol sulfatna metoda se bazira na reakciji šećera sa jakom kiselinom i fenolnim spojem orcinolom. Tijekom zagrijavanjem šećera sa sulfatnom kiselinom šećer se dehidrira i nastaje furfural (pentoze) ili hidroksimetilfurfural (heksoze), koji se zatim kondenzira sa dvije molekule orcinola. Nastali spoj je obojen pa se može detektirati mjerenjem aposorbancije pri 505 nm. 11

ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE UGLJIKOHIDRATA DNS METODOM pripremiti uzorke otopine glukoze, fruktoze, ksiloze, saharoze i ksilana mješanjem otopine šećera početne koncentracije 1 mg/ml sa odgovarajućim om destilirane vode tako da konačne koncentracije šećera u uzorcima odgovaraju vrijednostima navedenim u tablici 1. pri čemu konačni uzorka treba biti 5 ml. šećera ( g/ml) 500 300 100 50 10 Tablica 1. otopine šećera vode 1 ml otopine šećera dodati 250 l DNS reagensa, epruvetu zatvoriti poklopcem i inkubirati 5 minuta na 90 0 C izvaditi epruvete iz kupelji i ohladiti ih pod mlazom vode dodati 1 ml destilirane vode izmjeriti A 530 (vrijednosti upisati u tablicu 2.) prema slijepoj probi i konstruirati dijagrame ovisnosti A 530 o koncentraciji šećera šećera ( g/ml) 500 300 100 50 10 Tablica 2. A 530 glukoza A 530 fruktoza A 530 ksiloza A 530 saharoza A 530 ksilan usporediti rezultate za različite šećere i odrediti područje linearnosti za određivanje koncentracije šećera DNS metodom OTOPINE - vodene otopine glukoze, fruktoze, ksiloze, saharoze i ksilana koncentracije 1 mg/ml - DNS reagens: 1 g DNS-a otopi se u 20 ml 2 M NaOH i doda 50 ml svježe prokuhane destilirane vode (ohlađene na 50 0 C). Zatim se doda 30 g K,Na-tartarata i kada se sve otopi nadopuni vodom do 100 ml. 12

Dijagram ovisnosti A 530 o koncentraciji šećera: Zaključak: 13

ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE UGLJIKOHIDRATA ORCINOL - SULFATNOM METODOM pripremiti uzorke otopine glukoze, fruktoze, ksiloze, saharoze i ksilana mješanjem otopine šećera početne koncentracije 1 mg/ml sa odgovarajućim om destilirane vode tako da konačne koncentracije šećera u uzorcima odgovaraju vrijednostima navedenim u tablici 3. pri čemu konačni uzorka treba biti 2 ml. šećera ( g/ml) 500 350 250 100 50 Tablica 3. otopine šećera vode u 0,5 ml otopine šećera dodati 4,5 ml orcinol-sulfatnog reagensa, epruvetu zatvoriti poklopcem i inkubirati 50 minuta na 80 0 C izvaditi epruvete iz kupelji i ohladiti ih pod mlazom vode izmjeriti A 505 (vrijednosti upisati u tablicu 4.) prema slijepoj probi i konstruirati dijagrame ovisnosti A 505 o koncentraciji šećera šećera ( g/ml) 500 350 250 100 50 Tablica 4. A 505 glukoza A 505 fruktoza A 505 ksiloza A 505 saharoza A 505 ksilan usporediti rezultate za različite šećere i odrediti područje linearnosti za određivanje koncentracije šećera orcinol-sulfatnom metodom OTOPINE - vodene otopine glukoze, fruktoze, ksiloze, saharoze i ksilana koncentracije 1 mg/ml - orcinol-sulfatni reagens: 8 ml 1,6% -tne vodene otopine orcinola pomješati sa 60 ml razrijeđene H 2 SO 4 (300 ml H 2 SO 4 + 200 ml H 2 O) Dijagram ovisnosti A 505 o koncentraciji šećera: 14

Zaključak: 15

PROIZVODNJA PROTEINA Scw4-HA U STANICAMA KVASCA S. cerevisiae pripremiti 50 ml YNB podloge (tablica 1) za uzgoj kvasca S. cerevisiae transformiranog plazmidom koji nosi gen za protein Scw4p obilježen HA-oznakom pod kontrolom promotora za galaktozidazu Tablica 1. otopine (ml) 50% vodena otopina glukoze 2 ili 20% vodena otopina galaktoze 5 vodena otopina His 20 mg/ml 0,15 vodena otopina Lys 3,6 mg/ml 0,4 vodena otopina Trp 4,8 mg/ml 0,415 vodena otopina YNB 6,7 g/l 45 prije inokulacije odvojiti 10 ml podloge i izmjeriti ph te koncentraciju po Bradfordu i koncentraciju šećera DNS metodom u podlozi (rezultate upisati u tablicu 2) Tablica 2. podloga prije inokulacije nakon uzgoja ph (mg/ml) šećera (mg/ml) uzgojiti stanice kvasca preko noći na tresilici pri temperaturi 30 0 C odvojiti stanice kvasca od podloge centrifugiranjem 5 min / 3000 rpm odvojiti 10 ml podloge i izmjeriti ph te koncentraciju po Bradfordu i koncentraciju šećera DNS metodom u podlozi (rezultate upisati u tablicu 2) proteine izlučene u podlogu istaložiti dodatkom hladnog acetona u omjeru 11 ml podloge: 7,5 ml acetona, 1 sat na +4 0 C talog odvojiti centrifugiranjem 1 sat na 10 000 rpm pri +4 0 C, osušiti na zraku i otopiti u 50 l Laemmli pufera stanice kvasca isprati s 20 ml vode pa 2 puta sa po 20 ml pufera A resuspendirati stanice u 0,5 ml pufera-a i prebaciti ih u Eppendorf-epruvetu centrifugirati stanice u Eppendorf-centrifugi 30 sek., resuspendirati u 0,2 ml pufera A i dodati 0,3 ml staklenih kuglica za razbijanje stanica razbiti stanice vorteksiranjem 4-5 min užarenom iglom probiti dno Eppendorf-epruvete i postaviti je u drugu Eppendorfepruvetu. Tako centrifugirati 15 sekundi pri čemu suspenzija razbijenih stanica prolazi u drugu epruvetu, dok u prvoj zaostaju staklene kuglice baciti supernatant (intracelularni sadržaj), a talog (stanične stijenke) isprati 3 puta sa po 1 ml pufera A uz centrifugiranje u Eppendorf-centrifugi 1 min. 16

resuspendirati stijenke u 1 ml Laemmli - pufera za uzorke i inkubirati ih 10 min. u vrijućoj vodenoj kupelji centrifugirati u Eppendorf-centrifugi 1 min i uzeti supernatant prirediti 12%-tni poliakrilamidni gel za elektroforezu po 20 l uzoraka istaloženih iz podloge i izoliranih iz stijenke opomiješati sa 5 l Laemmly pufera i inkubirati 2 min. u vrijućoj vodenoj kupelji. Uzorke nanijeti na gel i provesti elektroforezu. Na isti gel nanijeti još po 20 l uzorka kao kontrolu koja će biti bojana na proteine. po završetku elektroforeze dio gela s kontrolnim uzorcima odrezati i staviti u otopinu Coomassie boje. Drugi dio gela pripremiti za prijenos sa gela na nitrocelulozu ( bloting postupak) provesti bloting 1,5 sat pri konstantnoj jakosti struje od 380 ma blot inkubirati 30 min. u 10 ml pufera za blokiranje blot inkubirati 60 min. u 5 ml pufera za blokiranje blota uz dodatak 5 l otopine anti-ha isprati nitrocelulozu 3 puta 5-10 min. puferom za ispiranje dodati po 0,2 ml svake ECL-otopine na blot i pokriti nitrocelulozu folijom u kazeti za razvijanje filmova pokriti nitrocelulozu rendgenskim filmom 2 sata ili preko noći i razviti film YNB-podloga za uzgoj kvasca: 6,7 g/l YNB; 2% glukoza ili galaktoza; 60 g/ml His; 40 g/ml Trp; 30 g/ml Lys pufer-a: 50 mm K-fosfatni pufer ph 8,0 Laemmli pufer za uzorke koji će se analizirati elektroforezom: 0,05 M Tris- HCl pufer ph 6,8; 2% SDS; 5% -merkaptoetanol; 10% glicerol; 0,001% bromfenol plavo aceton 12 % poliakrilamidni gel za elektroforezu pufer za provedbu elektroforeze: 25 mm Tris; 0,25 M glicin; 0,1% SDS otopina boje Coomassie Briliant Blue R-250 za bojenje u gelu: 0,1 g boje Coomassie Brilliant Blue R250; 50 ml metanola; 7 ml ledene octene kiseline; destilirana voda do 100 ml pufer za elektrobloting : 10 mm NaHCO 3 ; 3 mm Na 2 CO 3 ; 20% MetOH pufer za ispiranje nitroceluloze: 50 mm tris-hcl ph 7,5; 150 mm NaCl; 0,1% Triton X- 100 pufer za blokiranje nitroceluloze: pufer za ispiranje nitroceluloze; 1% obranog mlijeka u prahu otopina antitijela na HA-oznaku ECL-otopine za reakciju peroksidaze ( razvijanje blota ) razvijač i fiksir za razvijanje rendgenskog filma 17

Skica gela i blota: Zaključak: 18

ODREĐIVANJE ČISTOĆE, KVALITETE I KOLIČINE DNA Čistoću, koncentraciju i kvalitetu DNA je moguće analizirati spektrofotometrijskim, fluorometrijskim te elektroforetskim metodama. Spektrofotometrijski se može odrediti koncentracija DNA te ispitati čistoća uzorka tj. detektirati prisutnost RNA, i fenola. Najjednostavnija spektrofotometrijska metoda se bazira na mjerenju apsorbancije u UV dijelu spektra. Postoje i druge, nešto složenije spektrofotometrijske metode za određivanje koncentracije DNA kao npr. Burtonova kolorimetrijska metoda koja se bazira na reakciji deoksiriboze sa difenilaminom pri čemu nastaje kompleks koji apsorbira svetlost pri 600 nm. Fluorometrijske metode se baziraju na reakciji DNA sa nekim fluorescirajućim reagensom kao što su npr. etidij-bromid i diaminobenzoična kiselina (DABA). Etidij-bromid interkalira između susjednih baza u molekuli DNA pri čemu se razvija fluorescencija, dok DABA reagira sa aldehidnom grupom deoksiriboze (sa koje je prethodno pomoću jake kiseline uklonjena baza) dajući fluorescentni spoj. Elektroforeza DNA se može provesti u agaroznom ili akrilamidnom gelu. Elektroforeza se standardno koristi za brzu i jednostavnu analizu DNA, a omogućuje identifikaciju, razdvajanje, određivanje količine i pročišćavanje DNA. SPEKTROFOTOMETRIJSKE METODE Purinske i pirimidinske baze apsorbiraju svijetlost valne duljine 260 nm pri čemu vrijednost A 260 =1 (mjereno u kiveti širine 1 cm) odgovara približno koncentraciji dvolančane DNA od 50 g/ml. Jednolančana DNA i RNA jače apsorbiraju svjetlost pa tako vrijednost A 260 =1 približno odgovara koncentraciji od 37 g/ml jednolančane DNA, odnosno 40 g/ml RNA. Čistoća DNA se može spektrofotometrijski ispitati mjerenjem A 280 i A 230 te izračunavanjem omjera A 260 /A 280 i A 260 /A 230. Čista DNA daje omjer A 260 /A 280 između 1,8 i 2,0. Vrijednost omjera A 260 /A 280 manja od 1,8 je pokazatelj prisutnosti, dok su vrijednosti veće od 2,0 pokazatelj prisutnosti RNA. ELEKTROFORETSKE METODE U neutralnom ili bazičnom mediju fosfatne grupe u molekuli DNA su negativno nabijene pa sve molekule DNA u električnom polju putuju prema anodi. Razdvajanje molekula različite veličine (koja se izražava brojem parova baza - bp) u električnom polju postiže se provođenjem elektroforeze u gelu određene veličine pora koji pruža otpor prolazu molekula. Brzina putovanja je obrnuto proporcionalna logaritmu veličine molekula, a ovisi i o konformaciji molekula DNA, veličini pora gela, jakosti električnog polja i svojstvima pufera u kojem se provodi elektroforeza. Veličina pora u gelu se podešava ovisno o veličini molekula DNA koje želimo razdvajati elektroforezom, pa tako u agaroznom gelu odgovarajuće gustoće možemo razdvojiti molekule dvolančane DNA duljine od 50 do 50000 pb. Elektroforeza u akrilamidnom gelu omogućuje bolje razlučivanje fragmenata DNA sličnih duljina nego elektroforeza u agaroznom gelu i može se koristiti za veličine molekula od 6 do 5000 pb. Nakon provedene elektroforeze molekule DNA u gelu se još uvijek najčešće vizualiziraju pomoću etidij-bromida budući da se je metoda brza, jednostavna (etidij-bromid se može dodati u gel, u uzorak ili se gel nakon provedene elektroforeze uroni na nekoliko minuta u otopinu boje) i jeftina. Nedostatci metode su visoka toksičnost etidij-bromida, brzo razlaganje DNA pod UV svjetlom što rezultira gubitkom signala te štetnost UV zračenja za čovjeka. Zbog jake toksičnosti etidij-bromida sve se više koristite druge, uglavnom 19

fluorescirajuće boje koje su manje toksične i osjetljivije, ali višestruko skuplje. Nakon elektroforeze u akrilamidnom gelu DNA se može bojati srebrom. Bojenje srebrom je vrlo osjetljiva, jeftina i trajna metoda bojanja DNA, ali je kompliciranija i dugotrajnija od bojenja etidij-bromidom. Bazira se na reakciji srebrnog nitrata u kiselim uvijetima sa DNA, nakon čega se u lužnatim uvijetima ioni srebra reduciraju djelovanjem formaldehida i dolazi do pojave obojenja. Boja se razvija zbog razlike u oksido-redukcijskom potencijalu između područja u kojem se nalazi DNA i ostatka gela (redoks-potencijal dijela gela u kojem se nalazi DNA je veći nego u ostatku gela). Veličina molekula DNA na osnovu duljine putovanja u gelu može se odrediti usporedbom sa duljinom putovanja DNA fragmenata poznate veličine (standardi). Pri tome se, ukoliko je potrebno precizno određivanje veličine molekule DNA, mora konstruirati baždarni dijagram koji prikazuje ovisnost logaritma veličine molekula DNA (bp) i duljine njihovog putovanja. Budući da je osim veličine fragmenata poznata i količina DNA u standardima moguće je ujedno, usporedbom intenziteta obojenja vrpce DNA sa vrpcom standarda jednake (ili približno jedanke) veličine, procjeniti i količinu DNA. Broj vrpci nakon provedene elektroforeze daje informaciju o integritetu i čistoći uzorka, a može se uočiti i eventualno prisustvo RNA kao difuzna mrlja na dnu gela (RNA molekule su znatno manje od DNA i međusobno vrlo različitih veličina pa smjesa stanične RNA zaostale, za razliku od DNA, ne daje oštro razlučene vrpce u gelu). 20

ODREĐIVANJE ČISTOĆE I KONCENTRACIJE DNA MJERENJEM APSORPCIJE U UV DIJELU SPEKTRA Pripremiti uzorke otopine DNA (genomska DNA izolirana iz stanica kvasca S. cerevisiae), mješanjem otopine DNA početne koncentracije 50 g/ml sa odgovarajućim om destilirane vode tako da konačne koncentracije DNA u uzorcima odgovaraju vrijednostima navedenim u tablici 1. (konačni uzorka treba biti 1 ml) DNA ( g/ml) 50 35 20 10 5 Tablica 1. otopine DNA vode izmjeriti vrijednost A 260 (vrijednosti upisati u tablicu 2.) prema slijepoj probi i konstruirati dijagram ovisnosti A 260 o koncentraciji DNA Tablica 2. DNA ( g/ml) 50 35 20 10 5 A 260 odrediti koncentraciju DNA plazmidne DNA pomoću pripremljenog baždarnog dijagrama izmjeriti A 280 za uzorke plazmidne DNA te izračunati omjer A 260 /A 280 (vrijednosti upisati u tablicu 3) Tablica 3. A 260 DNA ( g/ml) A 280 A 260 / A 280 OTOPINE - otopina genomske DNA koncentracije 50 g/ml - otopine plazmidne DNA 21

Dijagram ovisnosti A 260 o koncentraciji DNA: Zaključak: 22

ODREĐIVANJE ČISTOĆE, KOLIČINE I INTEGRITETA DNA ELEKTROFOREZOM pripremiti 20 ml 1%-tnog agaroznog gela (izvagati agarozu i dodati u 20 ml TAE pufera), rastaliti zagrijavanjem i kada se ohladi na 50 60 0 C izliti u kalup za gel te umetnuti češljić za jažice pustiti da se gel skruti na sobnoj temp., izvaditi češljić i gel položiti u kadicu za elektroforezu tako da pufer prekriva površinu gela pripremiti uzorke za elektroforezu (linearizirani plazmid, plazmid nakon restrikcije sa EcoRI i DdeI restrikcijskim enzimima) mješanjem otopine DNA sa puferom za uzorke u omjeru 6:1 i nanjeti ih u jažice gela; u jednu jažicu staviti 1 l otopine standarda koncentracije 0,5 g/ l provesti elektroforezu gel nakon elektroforeze uroniti u otopinu etidij-bromida na 15 minuta pogledati gel pod UV svjetlom i skicirati položaj i jačinu fragmenata u odnosu na standarde konstruirati baždarni dijagram (ovisnost logaritma veličine molekula DNA (bp) standarda i duljine njihovog putovanja) izračunati udio (%) i masu (ng/0,5 g) pojedinog fragmenta u standardima i usporedbom intenziteta vrpci u DNA procjeniti količinu DNA u jažici Skica gela: bp % ng/0,5 g linearizirani EcoRI DdeI plazmid restrikcija restrikcija Materijali: - DNA standardi (λ /HindIII) - otopina linearizirane plazmidne DNA - otopine plazmidne DNA nakon restrikcije sa EcoRI - otopine plazmidne DNA nakon restrikcije sa DdeI - agaroza - TAE pufer (50x koncentriran: 242 g TRIS; 57,1 ml octena kiselina; 37,2 g Na 2 EDTA; ph 8,5) 23

Baždarni dijagram: Zaključak: 24