Praktikum iz biokemije

Transcript

1 Praktikum iz biokemije Interna skripta STUDENT MB INDEKSA Praktikum iz biokemije L i s t o p a d Pripremio: Dr. sc. Ivica Strelec, doc. Sveuč ilište Josipa Jurja Strossmayera u Osijeku Prehrambeno-tehnološki fakultet Osijek Zavod za primjenjenu kemiju i ekologiju K a t e d r a z a b i o k e m i j u

2 Sadržaj ODREĐIVANJE APSORPCIJSKOG MAKSIMUMA I MOLARNOG APSORPCIJSKOG KOEFICIJENTA RIBOFLAVINA... 1 METODE ODREĐIVANJA KONCENTRACIJE PROTEINA... 4 Određivanje apsorpcijskog maksimuma aminokiselina i proteina... 4 Lowry metoda... 9 Bradfordičina metoda IZOLACIJA I PROČIŠĆAVANJE UREAZE IZ SOJINOG BRAŠNA GEL FILTRACIJA PROTEINA ENZIMSKA KINETIKA Vremenski tijek reakcije Utjecaj koncentracije enzima na brzinu enzimske reakcije Utjecaj ph na brzinu enzimske reakcije Utjecaj koncentracije supstrata na brzinu enzimske reakcije Utjecaj inhibitora na briznu enzimske reakcije... 39

3 ODREĐIVANJE APSORPCIJSKOG MAKSIMUMA I MOLARNOG APSORPCIJSKOG KOEFICIJENTA RIBOFLAVINA Svrha vježbe je upoznati se sa osnovama fotometrije i rada na spektrofotometru, snimanja apsorpcijskog spektra te izračuna molarnog apsorpcijskog koeficijenta. Budući mnoge biomolekule apsorbiraju elektromagnetsko zračenje određene valne duljine, to se pomoću spektrofotometra (Slika 1) mjerenjem količine apsorbiranog zračenja neka biomolekula može detektirati i identificirati ili joj se može odrediti koncentracija u otopini. Slika 1. Glavne komponentne spektrofotometra Izvor elektromagnetskog zračenja odašilje EM zračenje širokog spektra koje ulazi u monokromator. Monokromator propušta EM zračenje točno određene valne duljine koje prolazi kroz uzorak u kiveti duljine puta (l). Uzorak apsorbira dio zračenja, a količina apsorbiranog zračenja je proporcionalna koncentraciji uzorka. Dio zračenja koji nije apsorbiran prolazi kroz uzorak (propušteno EM zračenje) i mjeri se na detektoru te najčešće izražava kao apsorbancija (A). O čemu se zapravo radi? Izložimo li otopinu biomolekula elektromagnetskom zračenju određene valne duljine, tada biomolekule apsorbiraju dio tog zračenja, a dio zračenja prolazi kroz kivetu sa otopinom biomolekula i biva detektiran (izmjeren) na detektoru. Količina zračenja kojeg biomolekule apsorbiraju ovisna je o debljini sloja biomolekula (duljina puta kroz kivetu), te o koncentraciji biomolekula u otopini (Slika 1), i što su one veće to je i količina apsorbiranog zračenja veća, Ovisnost količine apsorbiranog zračenja definirana je Lambert-Beerovim zakonom I log I 0 = A = ε c l gdje je I 0 intenzitet ulaznog EM zračenja, I intenzitet propuštenog EM zračenja, logaritam njihova omjera apsorbancija (A) koja je jednaka umnošku molarnog apsorpcijskog koeficijenta, ε ((L/mol cm), koncentracije biomolekula u uzorku, c (mol/l) i duljine puta kroz kivetu, l, (cm). Ukoliko se mjerenje apsorbancije provodi pri konstantnoj duljini puta, tada je apsorbancija proporcionalna koncentraciji biomolekula u otopini, te se poznavajući molarni apsorpcijski koeficijent može odrediti koncentracija biomolekula, odnosno ukoliko je poznata koncentracija biomolekula u otopini, tada se može odrediti molarni apsorpcijski koeficijent. Upravo će se ovom vježbom odrediti molarni apsorpcijski koeficijent riboflavina (vitamina B 2 ), te ustanoviti postojanje više apsorpcijskih maksimuma, odnosno više valnih duljina pri kojima riboflavin apsorbira elektromagnetsko zračenje. 1

4 Zadatak Odrediti apsorpcijske maksimume otopine riboflavina snimanjem apsorpcijskog spektra u području valnih duljina od 250 do 600 nm, te izračunati molarni apsorpcijski koeficijent. Reagensi 50 µm otopina riboflavina u 100 mm fosfatnom puferu ph 7,0 Pribor UV/VIS spektrofotometar UV kivete Postupak 50 µm otopini riboflavina u 100 mm fosfatnom puferu ph 7,0 u UV kiveti snimiti apsorpcijski spektar u području valnih duljina od 250 do 600 nm. Iz dijagrama apsorpcijskog spektra očitati maksimume apsorbancije riboflavina te pri maksimumima apsorbancije očitati vrijednosti apsorbancije. Iz vrijednosti očitanih apsorbancija pomoću formule Lambert-Beerovog zakona izračunati molarni apsorpcijski koeficijent riboflavina pri maksimumima apsorbancije. Rezultati mjerenja Valne duljine apsorpcijskih maksimuma riboflavina i izmjerena vrijednost apsorbancije Valna duljina [nm] Asporbancija Izračun molarnog apsorpcijskog koeficijenta (ε) riboflavina pri maksimumu 1 Izračun provesti na osnovu formule izvedene iz Lambert-Beerovog zakona A=ε c l Izračun molarnog apsorpcijskog koeficijenta (ε) riboflavina pri maksimumu 2 Izračun molarnog apsorpcijskog koeficijenta (ε) riboflavina pri maksimumu 3 2

5 Dijagram apsorpcijskog spektra riboflavina Zaključak Pregledano Potpis asistenta 3

6 METODE ODREĐIVANJA KONCENTRACIJE PROTEINA Svrha vježbe je upoznavanje sa metodama određivanja koncentracije proteina. Određivanje koncentracije proteina mjerenjem apsorbancije pri 280 nm i utjecaj interferencije nukleinskih kiselina. Priprava i uporaba baždarnog dijagrama pri određivanju koncentracije proteina primjenom Lowry i Bradford metode. Zadatak Odrediti apsorpcijski maksimum modelnih otopina proteina mjerenjem apsorbancije u području valne duljine od 250 do 600 nm, te odrediti koncentraciju proteina u modelnoj otopini mjerenjem apsorbancije pri 280 i 260 nm. Pripremiti baždarni dijagram te odrediti koncentraciju proteina u uzorku pomoću Lowry i Bradfordičine metode. Reagensi modelna otopina proteina BSA goveđi serumski albumin alkalna otopina I (2% Na 2 CO 3 u 0,1 M NaOH) ε 1% 1 cm = alkalna otopina II (0,5% CuSO 4 u 1% K Na tartaratu) Folin Ciocalteau reagens (komercijalni reagens razrijeđen s vodom u omjeru 1:1) Bradfordičin reagens Pribor UV/VIS spektrofotometar vodena kupelj vortex mješalica pipetor dispenzor epruvete 10 ml mikropipete 1-10; ; μl pipete 1, 5, 10 ml PMMA i UV kivete 6,5 Određivanje apsorpcijskog maksimuma aminokiselina i proteina Određivanje koncentracije proteina mjerenjem apsorbancije otopine proteina pri 280 nm (UV područje) temelji se na sposobnosti bočnih ogranaka aromatskih aminokiselina Tyr i Trp i Phe u proteinu da maksimalno apsorbiraju UV zračenje pri valnim duljinama oko 280 nm (Slika 2). Slika 2. Apsorpcijski maksimum aromatskih aminokiselina 4

7 Masenu koncentraciju proteina moguće je izračunati primjenom dvije formule: F1 γ(proteina) = 1.55 A A 260 (mg/ml) gdje se apsorbancija izmjerena pri 280 nm umanjuje za određeni iznos apsorbancije izmjerene pri 260 nm zbog moguće interferencije izazvane prisutnošću nukleinskih kiselina, te F2 γ = A e 280 1% 1cm nm o10 o l (mg(ml) gdje se masena koncentracija proteina izračunava na osnovi molarnog apsorpcijskog koeficijenta pročišćenog proteina. Postupak Modelnoj otopini proteina (BSA i hemoglobina) u kvarcnoj kiveti izmjeriti apsorbanciju u području valnih duljina od 250 do 600 nm. Iz dijagrama apsorpcijskog spektra očitati maksimume apsorbancije te pri maksimumima apsorbancije očitati vrijednosti apsorbancije. Očitati vrijednosti apsorbancije pri 260 i 280 nm. Na osnovi rezultata mjerenja odrediti koncentraciju proteina primjenom gore navedenih formula za izračun koncentracije proteina. Rezultati mjerenja Valne duljine apsorpcijskih maksimuma BSA i hemoglobina, i vrijednosti izmjerene apsorbancije Asporbancija Valna duljina [nm] BSA Hemoglobin Očitane vrijednosti apsorbancije pri 260 i 280 nm Protein A 260 nm A 280 nm Goveđi serumski albumin (BSA) Hemoglobin Izračun koncentracije proteina (BSA) F1 F2 Izračun koncentracije proteina (hemoglobina) F1 F2 5

8 Dijagram apsorpcijskog spektra goveđeg serumskog albumina (BSA) 6

9 Dijagram apsorpcijskog spektra hemoglobina 7

10 Zaključak Objasnite princip određivanja koncentracije proteina UV-spektrofotometrijom. Pregledano Potpis asistenta 8

11 Lowry metoda Lowry metoda se temelji na reakciji (a) bakrenih iona vezanih na amino skupine peptidne veze i (b) fenolne skupine bočnog ogranka aminokiseline Tyr u proteinu sa Folin-Ciocalteau reagensom, pri čemu nastaje kompleks plavo-ljubičastog obojenja sa apsorpcijskim maksimumom pri 660 nm (Slika 3). Slika 3. Princip određivanja koncentracije proteina Lowry metodom Na slici lijevo je prikazana koordinativna veza iona bakra sa četiri dušikova atoma peptidne veze, a na slici desno hidroksilna skupina aminokiseline tirozin u proteinu. Bakreni ioni koordinirano vezani na amino skupine peptidne veze i fenolna skupina tirozina (Tyr) reduciraju fosfovolframatnu i fosfomolibdensku kiselinu Folinovog reagensa u volfram i molibden plavilo Folin-Ciocalteau (Folinov) reagens sadrži fosfovolframatnu i fosfomolibdensku kiselinu koje bakreni ioni koordinirano vezani na amino skupine peptidne veze i fenolna skupina tirozina (Tyr) reduciraju u volfram i molibden plavilo. Postupak Iz otopine BSA, γ(bsa) = 1 mg/ml, pripremiti 100 μl standardnog niza prema slijedećoj shemi : Standardni niz S0 S1 S2 S3 S4 S5 S6 μg proteina U epruvete sa 100 µl otopina standardnog niza i epruvetu sa 100 µl reakcijske smjese (otopine nepoznatog proteina i destilirane vode) dodati 1 ml alkalne otopine, smjesu promućkati na vortex miješalici i ostaviti stajati 10 minuta na sobnoj temperaturi. Reakcijsku smjesu koja sadrži nepoznati protein i destiliranu vodu potrebno je napraviti na osnovu teoretskog modela po kojem se pretpostavlja da je koncentracija nepoznatog proteina oko 0,2 mg/ml. Nakon 10 minuta, dodati 100 µl Folin-Ciocalteau reagensa, smjesu dobro promućkati na vortex miješalici te termostatirati u vodenoj kupelji 15 minuta pri 37 C. Po isteku termostatiranja očitati apsorbanciju standardnog niza te otopine proteina nepoznate koncentracije pri valnoj duljini 660 nm, uz baždarenje instrumenta slijepom probom (S0). Na osnovi rezultata mjerenja u programu Excel napraviti baždarni dijagram te linearnom regresijom odrediti proračunsku formulu. Proračunsku formulu koristiti za izračun količine proteina. Priprava standardnog niza Koristeći se formulom za masenu koncentraciju izračunati koliko je μl otopine proteina masene koncentracije γ = 1 mg/ml potrebno dodati u reakcijsku smjesu određenog uzorka standardnog 9

12 niza kako bi se postigla željena količina proteina, i potom izračunati koliko je μl H 2 0 potrebno dodati kako bi ukupni volumen reakcijske smjese iznosio 100 µl. Tablica standardnog niza μg proteina V(BSA 1mg/mL) [μl] V(H 2 O) [μl] Izračun volumena nepoznatog uzorka Koristeći se formulom za masenu koncentraciju izračunati koliko je μl nepoznate otopine proteina (vašeg uzorka) potrebno dodati u reakcijsku smjesu, kako biste bili u sredini standardnog niza, uz pretpostavku da je koncentracija vašeg uzorka oko 0,2 mg/ml, i potom izračunati koliko je μl H 2 0 potrebno dodati kako bi ukupni volumen reakcijske smjese iznosio 100 µl. Izračun μg proteina V(uzorka) [μl] V(H 2 O) [μl] Rezultati mjerenja Izmjerene vrijednosti apsorbancije μg proteina ΔA 660nm Formula iz baždarnog dijagrama Formula za izračun količine proteina 100 Uzorak X 10

13 Izračun količine proteina u nepoznatom uzorku Uzorak Volumen uzorka [μl] ΔA 660nm μg BSA μg/μl Nepoznati uzorak Zaključak Objasnite princip određivanja koncentracije proteina metodom po Lowry-ju. Što je to standardni niz? Objasnite što će te učiniti ukoliko ustanovite da je vrijednost apsorbance vašeg uzorka veća od najviše apsorbance standardnog niza. Pregledano Potpis asistenta 11

14 Bradfordičina metoda Bradfordičina metoda se se temelji na nespecifičnom vezanju anionskog oblika boje Coomassie Briliant Blue G-250 za bazične i aromatske bočne ogranke proteina, uslijed čega dolazi do stvaranja kompleksa protein:boja, koji u kiselom mediju pokazuje apsorpcijski maksimum pri 595 nm (Slika 4). H 3 C N NH O + NH 3 - SO 3 CH 3 H 3 C N + + NH 3 - O3 S Slika 4. Princip određivanja koncentracije proteina Bradfordičinom metodom Postupak Iz otopine BSA, γ(bsa) = 1 mg/ml pripremiti po 100 μl otopina standardnog niza prema slijedećoj shemi: Standardni niz S0 S1 S2 S3 S4 S5 S6 μg proteina Istovremeno sa pripremom standardnog niza, pripremiti i 100 μl reakcijske smjese (otopina proteina nepoznate koncentracije + destilirana voda). Reakcijsku smjesu koja sadrži nepoznati protein i destiliranu vodu potrebno je napraviti na osnovu teoretskog modela po kojem se pretpostavlja da je koncentracija nepoznatog proteina oko 0,2 mg/ml. U epruvete standardnog niza kao i epruvetu koja sadrži 100 μl reakcijske smjese nepoznatog proteina dodati 2 ml Bradfordičinog reagensa te ostaviti stajati na sobnoj temperaturi tijekom 5 minuta. Po isteku vremena očitati apsorbanciju standardnog niza i otopine proteina pri valnoj duljini 595 nm, uz baždarenje instrumenta slijepom probom (S0). Na osnovi rezultata mjerenja u programu Excel napraviti baždarni dijagram te linearnom regresijom odrediti proračunsku formulu. Proračunsku formulu koristiti za izračun količine nepoznatog proteina. Priprava standardnog niza Koristeći se formulom za masenu koncentraciju izračunati koliko je μl otopine proteina masene koncentracije γ = 1 mg/ml potrebno dodati u reakcijsku smjesu određenog uzorka standardnog niza kako bi se postigla željena količina proteina, i potom izračunati koliko je μl H 2 0 potrebno dodati kako bi ukupni volumen reakcijske smjese iznosio 100 µl. 12

15 Tablica standardnog niza μg proteina V(BSA 1mg/mL) [μl] V(H 2 O) [μl] Izračun volumena nepoznatog uzorka Koristeći se formulom za masenu koncentraciju izračunati koliko je μl nepoznate otopine proteina (vašeg uzorka) potrebno dodati u reakcijsku smjesu, kako biste bili u sredini standardnog niza, uz pretpostavku da je koncentracija vašeg uzorka oko 0,2 mg/ml, i potom izračunati koliko je μl H 2 0 potrebno dodati kako bi ukupni volumen reakcijske smjese iznosio 100 µl. Izračun μg proteina V(uzorka) [μl] V(H 2 O) [μl] Rezultati mjerenja Izmjerene vrijednosti apsorbancije μg proteina ΔA 595nm Formula iz baždarnog dijagrama Formula za izračun količine proteina 60 Uzorak X 13

16 Izračun količine proteina u nepoznatom uzorku Uzorak Volumen uzorka [μl] ΔA 595nm μg BSA μg/μl Nepoznati uzorak Zaključak Objasnite princip određivanja koncentracije proteina metodom po Bradfordici. Pregledano Potpis asistenta 14

17 IZOLACIJA I PROČIŠĆAVANJE UREAZE IZ SOJINOG BRAŠNA Svrha vježbe je upoznavanje sa tehnikama izolacije i pročišćavanja proteina. Izolacija i pročišćavanje proteina taloženjem anorganskim solima (amonij sulfat). Načini izražavanja enzimske aktivnosti i Izračun stupnja pročišćenja. Ureaza, sistematskog naziva urea amidohidrolaza, EC , hidrolitički je enzim visoke specifičnosti koji katalizira reakciju hidrolize uree na amonijak (Slika 5). Karbamat zatim spontano hidrolizira dajući još jednu molekulu amonijaka i karbonatne kiseline. Ureaza H 2 O + NH 3 + H 2 O NH 3 + H 2 CO 3 Slika 5. Enzimska hidroliza uree Karbonatna kiselina i 2 molekule amonijaka u otopini uspostavljaju ravnotežu svojih protoniranih i disociranih oblika, što dovodi do povišenja ph vrijednosti otopine iz neutralnog u lužnato. Aktivnost enzima određuje se titracijom reakcijske smjese nakon prekida enzimske reakcije. Reakcijska smjesa titrira se pomoću kloridne kiseline, te se na osnovi utroška kloridne kiseline određuje količina nastalog amonijaka i računa enzimska aktivnost. Ovom će se vježbom enzim ureaza izolirati ekstrakcijom iz sojinog brašna, i potom djelomično pročistiti primjenom taloženja anorganskim solima. Taloženje proteina dodatkom anorganskih soli je jedna od najčešćih metoda razdvajanja proteina u pojedine frakcije koja se koristi u prvim koracima pročišćavanja proteina. Ova metoda se temelji na smanjenju topljivosti proteina kada se u otopinu proteina doda velika količina soli. Topljivost proteina je posljedica sadržaja i položaja hidrofilnih i hidrofobnih aminokiselina u proteinu, a ovisna je o koncentraciji otopljenih soli (ionskoj jakosti), polarnosti otapala, ph i temperaturi. Topljivost proteina prvenstveno je funkcija interakcija koje vladaju među molekulama u otopini interakcije tipa protein-protein i protein-otapalo. Što su interakcije između proteina i molekula otapala (koji je najčešće voda) veće, veća je i sposobnost hidratacije proteinske molekule, a time i topljivost proteina. Povećanje interakcija između proteinskih molekula, odnosno međusobno privlačenje proteinskih molekula, smanjuje ukupnu površinu proteina izloženu otapalu, smanjuje se sposobnost hidratacije proteinske molekule te topljivost proteina opada. Ukoliko se u otopini nalazi ili dodaje sol, poput amonijeva sulfata, tada ona utječe na topljivost proteina i to ovisno o svojoj koncentraciji. Pri manjim koncentracijama sol djeluje na povećanje topljivosti proteina, dok kod većih koncentracija soli u otopini dolazi do smanjenja topljivosti i taloženja proteina (Slika 6). Pogledajmo detaljnije što se zapravo događa. 15

18 topljivost [sol] Slika 6. Utjecaj koncentracije soli na topljivost proteina Dodatkom soli u otopinu proteina, dolazi do disocijacije soli, a nastali ioni vežu se ionskim vezama za kisele i bazične skupine bočnih ogranaka aminokiselina na površini proteina. Vezanjem iona soli na površini proteina povećava se hidrofilnost proteinske molekule koja jače privlači molekule vode, odnosno pojačavaju se interakcije protein-otapalo, a smanjuju interakcije protein-protein, što dovodi do povećanja topljivosti (Slika 7, gornji red). Slika 7. Princip taloženja proteina dodatkom anorganskih soli 16

19 Ovo djelovanje iona soli na topljivost proteina traje sve dok se ioni soli vežu na površinu proteina te kod određene koncentracije soli u otopini protein postiže maksimalnu topljivost. Daljnje dodavanje iona soli u otopinu proteina utječe na smanjenje topljivosti proteina. Naime, kako više ne postoji slobodnih naboja na površini proteina na koje bi se vezali ioni soli iz otopine, ioni soli tada privlače slobodne molekule vode iz otopine za vlastitu hidrataciju, a daljnjim povećanjem koncentracije soli u otopini, ioni kao jači elektroliti počinju privlačiti molekule vode iz hidratacijskog ovoja proteina kao i sa same površine proteinske molekule. Uslijed toga smanjuju se interakcije protein-otapalo, a povećavaju interakcije protein-protein što dovodi do smanjenja topljivosti proteina. Ove protein-protein interakcije pri visokim koncentracijama soli dvojakog su tipa: to su ionske interakcije između suprotno nabijenih grupa na površini proteinskih molekula, i interakcije između hidrofobnih bočnih ogranaka koji su izašli na površinu proteina. Naime, kako ioni soli oduzimaju hidratacijski ovoj s površine proteinske molekule, hidrofobni bočni ogranci se okreću prema površini proteina, što dovodi do hidrofobne interakcije između molekula proteina (Slika 7, donji red). U slučaju kada topljivost proteina padne ispod njegove koncentracije u otopini, dolazi do taloženja proteina. Prilikom taloženja proteina anorganskim solima, potrebno je voditi računa i o ph otopine, budući je topljivost proteina ovisna i o ph otopine, a najmanja je u izoelektričnoj točki proteina. Stoga je taloženje proteina iz otopine solima najbolje provoditi pri takvom ph otopine kod kojeg se protein nalazi u svojoj izoelektričnoj točki. Taloženjem željenog proteina i otapanjem taloga u malom volumenu pufera, ujedno se provodi i koncentriranje proteina, što je najčešće potrebno za daljnje korake pročišćavanja. Zadatak Izolirati i djelomično pročistiti ureazu iz sojinog brašna. U ekstraktu i otopini djelomično pročišćene ureaze odrediti aktivnost ureaze i koncentraciju proteina. Na osnovi rezultata izračunati stupanj pročišćenja ureaze. Reagensi Sojino brašno 100 mm Tris-HCl pufer ph 7,6 sa 30 mm EDTA-2Na i 10 mm DTT Amonijev sulfat (NH 4 ) 2 SO 4 25 mm Tris-HCl pufer ph 7,0 sa 50 mm ureom 25 mm HCl 2 % otopina HgCl 2 Tashiro indikator Bradfordičin reagens Pribor čaša 50 ml menzura 10 i 25 ml kivete za centrifugiranje 25 i 10 ml pipeta 10 ml nabrani filter papir stakleni lijevak laboratorijska vaga centrifuga automatska bireta erlenmeyer tikvice 25 ml vortex miješalica UV/VIS spektrofotometar Postupak Ekstrakcija proteina i djelomično pročišćavanje ureaze U kivetu za centrifugiranje (25 ml) odvagati 3 g sojinog brašna te dodati 18 ml pufera za ekstrakciju (100 mm Tris-HCl pufer ph 7,6 sa 30 mm EDTA-2Na i 10 mm DTT). Smjesu intenzivno promućkati na vortex miješalici, i proces ekstrakcije provoditi 30 minuta pri +4 C uz intenzivno vorteksiranje suspenzije svakih 10 minuta po 30 sekundi. Ekstrakt proteina izbistriti centrifugiranjem pri 4000 o/min tijekom 10 minuta. 17

20 U svrhu uklanjanja tankog sloja masnoće nastalog na površini supernatanta, supernatant profiltrirati kroz sloj nabranog filter papira u menzuru od 10 ml, a filtratu očitati volumen i zabilježiti ga. Ovako pripremljeni ekstrakt nazivamo sirovim staničnim ekstraktom. Filtrat prenijeti u kivetu za centrifugiranje od 10 ml i dodati izračunatu količinu praškastog amonijeva sulfata (AmS) kako bi se postiglo 25 % zasićenje AmS-om. Količinu potrebnog praškastog AmS očitati iz tablice prikazane na sljedećoj stranici, te preračunati na volumen filtrata. Po dodatku praškastog amonijeva sulfata suspenziju intenzivno promućkati tijekom 30 sekundi na vorteks miješalici, i proces taloženja proteina provoditi tijekom 30 minuta pri +4 C uz intenzivno vorteksiranje suspenzije svakih 10 minuta po 30 sekundi. Po isteku 30 minuta, nastali talog proteina odvojiti centrifugiranjem (4000 g, 20 minuta, 24 C). Supernatant koji sadrži ureazu odvojiti od taloga dekantiranjem i izmjeriti mu volumen, a potom zasititi izračunatom količinom praškastog amonijeva sulfata kako bi se postiglo 40 % zasićenje AmS-om. Količinu potrebnog praškastog AmS očitati iz tablice prikazane na sljedećoj stranici, te preračunati na volumen filtrata. Po dodatku praškastog amonijeva sulfata suspenziju intenzivno promućkati tijekom 30 sekundi na vorteks miješalici, i proces taloženja ureaze provoditi tijekom 30 minuta pri +4 C uz intenzivno vorteksiranje suspenzije svakih 10 minuta po 30 sekundi. Nastali nalog proteina koji sadrži ureazu odvojiti centrifugiranjem (3000 g, 20 minuta, 24 C). Supernatant odvojiti od taloga dekantiranjem i odbaciti, a talog otopiti u 3 ml pufera za ekstrakciju (100 mm Tris-HCl pufer ph 7,6 sa 30 mm EDTA-2Na i 10 mm DTT) te koristiti za određivanje koncentracije proteina i aktivnosti ureaze. Napomena Paralelno sa postupkom ekstrakcije i djelomičnog pročišćavanja ureaze, za čitavu studentsku grupu na vježbama potrebno je pripremiti jedan sirovi stanični ekstrakt ureaze. Ovaj ekstrakt će poslužiti za određivanje količine proteina i aktivnosti ureaze prije djelomičnog pročišćavanja enzima, te će se na osnovi tih podataka i podataka dobivenih za djelomično pročišćeni enzim moći izračunati stupanj pročišćenja enzima. Tablica za očitavanje potrebne količine praškastog amonijeva sulfata Željeno zasićenje amonijevim sulfatom; % pri 0 C Početno zasićenje amonijevim sulfatom Masa (g) amonijeva sulfata koju treba dodati u 100 ml otopine da bi se postiglo željeno zasićenje 0 10,7 13,6 16,6 19,7 22,9 26,2 29,5 33,1 36,6 40,4 44,2 48,3 52,3 56,7 61,1 65,9 70,7 5 8,0 10,9 13,9 16,8 20,0 23,2 26,6 30,0 33,6 37,3 41,1 45,0 49,1 53,3 57,8 62,4 67,1 10 5,4 8,2 11,1 14,1 17,1 20,3 23,6 27,0 30,5 34,2 37,9 41,8 45,8 50,0 54,5 58,9 63,6 15 2,6 5,5 8,3 11,3 14,3 17,4 20,7 24,0 27,5 31,0 34,8 38,6 42,6 46,6 51,0 55,5 60, ,7 5,6 8,4 11,5 14,5 17,7 21,0 24,4 28,0 31,6 35,4 39,2 43,3 47,6 51,9 56, ,7 5,7 8,5 11,7 14,8 18,2 21,4 24,8 28,4 32,1 36,0 40,1 44,2 48,5 52, ,8 5,7 8,7 11,9 15,0 18,4 21,7 25,3 28,9 32,8 36,7 40,8 45,1 49, ,8 5,8 8,8 12,0 15,3 18,7 22,1 25,8 29,5 33,4 37,4 41,6 45, ,9 5,9 9,0 12,2 15,5 19,0 22,5 26,2 30,0 34,0 38,1 42, ,9 6,0 9,1 12,5 15,8 19,3 22,9 26,7 30,6 34,7 38, ,0 6,1 9,3 12,7 16,1 19,7 23,3 27,2 31,2 35, ,0 6,2 9,4 12,9 16,3 20,0 23,8 27,7 31, ,1 6,3 9,6 13,1 16,6 20,4 24,2 28, ,1 6,4 9,8 13,4 17,0 20,8 24, ,2 6,6 10,0 13,6 17,3 21, ,2 6,7 10,2 13,9 17, ,3 6,8 10,4 14, ,4 6,9 10, ,4 7, ,

21 Određivanje koncentracije proteina metodom po Bradfordici 100 µl sirovog staničnog ekstrakta ili otopine djelomično pročišćene ureaze (otopljeni talog nakon 55 % zasićenja AmS-om) prenijeti u eppendorf tubicu te razrijediti do 1 ml puferom za ekstrakciju. Otopinu kratko izmiješati na vortex miješalici, te u triplikatu pripremiti reakcijsku smjesu za određivanje koncentracije proteina metodom po Bradfordici prema sljedećoj shemi: Sastav reakcijske smjese V/ µl Razrijeđena otopina 20 µl Milli Q voda 80 µl Ukupni volumen reakcijske smjese 100 µl Određivanje aktivnosti ureaze Aktivnost ureaze odrediti prema sljedećoj shemi: Uzorak mm urea u 25 mm Tris-HCl puferu ph 7,0/mL HgCl 2 /kapi 5 Sirovi ekstrakt ili otopina djelomično pročišćene ureaze/µl Vrijeme inkubacije/min 10 minuta HgCl 2 /kapi 5 5 Po završetku zadanog vremena inkubacije, uzorcima dodati 5 kapi Tashiro indikatora, a zatim titracijom s 25 mm HCl odrediti količinu razvijenog amonijaka. Rezultate korigirati za vrijednost slijepe probe, te izračunati aktivnost enzima. Na osnovi svih rezultata izraditi tablicu stupnja za izračun stupnja pročišćenja ureaze. Rezultati mjerenja Dodani i izmjereni volumeni Koraci pročišćavanja Ekstrakcija Filtracija Taloženje AmS 25 % Taloženje AmS 40 % Pufer za ekstrakciju Filtrat Supernatant Pufer za ekstrakciju Volumen/ ml Izračun količine praškastog amonijeva sulfata prvo taloženje proteina Izračun količine praškastog amonijeva sulfata drugo taloženje proteina 19

22 Određivanje koncentracije proteina Sirovi ekstrakt ΔA 595nm Pročišćena ureaza ΔA 595nm Paralela 1 Paralela 1 Paralela 2 Paralela 2 Paralela 3 Paralela 3 Srednja vrijednost Izračun koncentracije proteina Volumen uzorka Uzorak [μl] Sirovi ekstrakt Srednja vrijednost ΔA 595nm μg BSA Razrjeđenje μg/μl Pročišćena ureaza Određivanje aktivnosti enzima Volumen V(25 mm Uzorak enzima HCl) [ml] [µl] ΔV(25 mm HCl) [ml] n(nh 3 ) [mmol] EA [µmol/ml min] 1 SA [µmol/mg min] 2 Sirovi ekstrakt Pročišćena ureaza 1 Za izračun enzimske aktivnosti (EA) podijeliti vrijednost n(nh 3 ) sa volumenom enzima dodanog u reakcijsku smjesu i vremenom inkubacije 2 Za izračun specifične aktivnosti (SA) podijeliti vrijednost EA sa masenom koncentracijom proteina Izračun stupnja pročišćenja ureaze EA (sr.vr.) Korak pročišćavanja [µmol/ml min] γ(proteina) [mg/ml] SA (sr. vr.) [µmol/min mg] Stupanj pročišćenja* Sirovi ekstrakt 1 Taloženje AmS 40 % * stupanj pročišćenja se računa kao odnos SA ureaze nakon pročišćavanja i SA ureaze u sirovom ekstraktu Zaključak Pregledano Potpis asistenta 20

23 GEL FILTRACIJA PROTEINA Svrha vježbe je upoznavanje sa osnovama gel filtracije.. Razdvajanje molekula različite molekularne mase. Gel filtracija kao metoda za razdvajanje proteina. Gel filtracija je proces razdvajanja proteina i drugih biomolekula na osnovu njihove veličine (molekularne mase) i oblika. Kod ove metode razdvajanja smjesa proteina ili makromolekula nanosi se na kolonu ispunjenu stacionarnom fazom - prethodno hidriranim (nabubrenim) česticama inertne tvari (gela) koje sadrže pore određenih veličina, te ispire (eluira) sa kolone pomoću eluensa tj. pufera za gel filtraciju koji predstavlja mobilnu fazu. Eluira li se otopina koja sadrži proteine različitih veličina (molekularnih masa) kroz kolonu, molekule koje su veće od pora ne mogu ući u pore već prolaze kroz prostor između čestica gela nošene eluensom, dok manje molekule ulaze u pore čestica gela, prave veći put te zaostaju za većim molekulama (Slika 8). Pri tome, što je molekula manja to ona može ući u više pora, pravi veći put te više zaostaje za većim molekulama. Velike molekule stoga brže putuju kroz kolonu od malih molekula. Pojednostavljeno razdjeljivanje gel filtracijom se može opisati na slijedeći način: Tko će prije stići na kraj puta, onaj koji ide pravocrtno ili onaj koji putuje cik-cak? Slika 8. Razdvajanje molekula proteina gel filtracijom Razdjeljivanjem smjese makromolekula ili proteina na aparaturi za gel filtraciju, molekule se prolaskom kroz kolonu razdvajaju, te sa kolone prvo eluiraju veće, a zatim sve manje molekule. Praćenjem elucije molekula s kolone pomoću detektora ili naknadnom analizom skupljenih frakcija dobija se dijagram elucije molekula prikazan na slici 9. Pri tome vrh prvog brijega predstavlja volumen elucije (volumen pufera potreban za izlazak, ispiranje sa kolone) najvećih molekula, a slijedeći vrhovi volumene elucije manjih molekula. Ukoliko se ovakav dijagram obradi na način da se svaki uspon i pad brijega izrazi jednadžbom pravca moguće je odrediti točni volumen elucije svake proteinske frakcije u smjesi. 21

24 Slika 9. Dijagram elucije molekula nakon gel filtracije Zadatak Smjesu otopine proteina propustiti kroz kolonu za gel filtraciju i skupljati frakcije volumena 1 ml. Frakcijama izmjeriti apsorbanciju pri 280 nm, te izraditi dijagram elucije proteina. Reagensi PD-10 kolona (kolona ispunjena sephadexom G-25 medium Destilirana voda Pribor kolona za gel filtraciju PD-10 stalak za PD-10 kolonu čaša 25 ml UV kivete Stalak za UV kivete pipeta 5 ml menzura 25 ml UV/VIS spektrofotometar Postupak 1. Ukloniti gornji poklopac sa kolone i odliti višak tekućine. 2. Ukloniti donji poklopac sa kolone. 3. Postaviti PD-10 kolonu na stalak i isprati sa 25 ml pufera. 4. Nakon ispiranja kolone nanijeti 2,5 ml uzorka i pustiti da se uzorak upije u kolonu uz istovremeno skupljanje frakcija volumena 1 ml u UV kivete. 5. Kad je uzorak ušao u kolonu, eluirati visokomolekularne komponente (proteine) sa 10 ml pufera te skupljati frakcije volumena 1 ml. 6. Kolonu potom isprati sa 25 ml pufera u svrhu uklanjanja soli. 7. U svrhu zaštite od mikrobiološkog zagađenja kroz kolonu propustiti 15 ml 0,1 % (w/v) otopine Na-azida. 8. Postaviti gornji i donji poklopac na kolonu i čuvati pri +4 C. Prikupljenim frakcijama odrediti apsorbanciju pri 280 nm u vodu kao slijepu probu te izraditi dijagram elucije proteina. Frakcije koje sadrže protein skupiti zajedno te u skupnom uzorku odrediti koncentraciju proteina mjerenjem apsorbancije pri 280 nm. 22

25 Rezultati mjerenja Apsorbancija eluiranih frakcija nakon provedene gel filtracije Volumen frakcije [ml] ΔA 280nm Volumen frakcije [ml] ΔA 280nm Dijagram elucije proteina Apsorbancija skupnog uzorka proteina i izračun koncentracije proteina Uzorak A 280nm Izračun koncentracije proteina u skupnom uzorku Skupni uzorak 23

26 Zaključak Definirajte i pojasnite gel filtraciju. Pregledano Potpis asistenta 24

27 ENZIMSKA KINETIKA Svrha vježbe je upoznavanje sa optimiziranjem uvjeta za ispitivanje kinetike enzimski katalizirane reakcije u ustaljenom stanju te sa osnovama kinetike enzimski katalizirane reakcije. Određivanje ph optimuma. Maksimalna brzina enzimske reakcije, V m, Michaelisova konstanta, K m. Inhibicija i tipovi inhibicije. Enzimi su proteini koji ubrzavaju biokemijske reakcije u organizmu. To čine na takav način da snižavaju Gibbsovu slobodnu energiju aktivacije potrebnu da bi se reaktant (supstrat) preveo u produkt. (Slika 10), odnosno stupaju u reakciju sa supstratom te tvore kratkoživući enzimsupstrat kompleks koji se potom raspada u enzim i produkt, i na taj način stvaraju novi reakcijski put sa nižom energijom aktivacije. Slika 10. Reakcijski tok nekatalizirane i katalizirane reakcije Početkom 20. stoljeća Leonor Michaelis i Maud Menten analizirali su kinetiku enzimske reakcije na osnovu jednostavne pretpostavke da je za nastanak produkta potrebno da molekula enzima (E) i molekula supstrata (S) moraju doći u međusoban dodir prije nego dođe do reakcije, odnosno da prvo mora nastati intermedijerni enzim-supstrat kompleks (ES): k k E + S ES E + P k 1 1 Ovaj kompleks mogu zadesiti dvije sudbine; kompleks može disocirati nazad u E i S uz konstantu prvog reda (k -1 ) ili može prijeći u produkt reakcije (P) uz konstantu (k 2 ). Michaelis-Mentenin model pretpostavlja mjerenje početne (inicijalne) brzine enzimske reakcije (v 0 ), pri kojoj je koncentracija P zanemarivo mala, te je povratna reakcija (E+P ES) zanemariva, odnosno kada je k -2 << k 2. U takvom jednostavnom slučaju početna brzina enzimske reakcije proporcionalna je koncentraciji ES kompleksa v k o ES 0 = Budući je cilj Michaelis-Menteninog modela naći izraz koji povezuje brzine pojedinih reakcija sa poznatom koncentracijom E i S, to je potrebno izraziti koncentraciju enzima: E 0 = E + ES gdje je E 0 ukupna koncentracija enzima, E-koncentracija slobodnog enzima, a ESkoncentracija ES kompleksa. Obzirom na postavljene uvjete modela: koncentracija produkta (P) zanemarivo mala, a koncentracija supstrata, S S 0, proizlazi da se inicijalna brzina mjeri u području ustaljenog stanja enzimske reakcije kojeg karakterizira nepromjenjivost koncentracije ES kompleksa : 2 k 2 2 des = 0 dt 25

28 Da bi ovaj izraz bio zadovoljen brzine nastajanja (v f ) i brzine disocijacije ES kompleksa (v d ) moraju biti uravnotežene (v f = v d ). Promotrimo li opću formulu enzimske reakcije, vidljivo je da je brzina nastajanja ES kompleksa jednaka: = k o E o S v f a brzina disocijacije ES kompleksa jednaka: v d = k 1 o ES + k 2 o ES Izjednačavanjem ovih dviju jednadžbi dobijamo izraz k1 o E o S = ( k 1 + k 2 ) o ES odnosno, njegovim preuređivanjem k k E o 1 2 = + 1 o ES k1 S Tri konstante mogu se skupiti u novu konstantu koju nazivamo Michaelisova konstanta (K m ) k 1 + k 2 K m = k1 te se jednadžba onda može pisati K E = m o ES S Uvrstimo li jednadžbu ovu jednadžbu u izraz za ukupnu količinu enzima dobijamo jednadžbu K = m K + = + m E0 ES o ES ES 1 S S 1 a ukoliko iz nje izrazimo koncentraciju ES kompleksa E0 E0 ES = = K m S + K m 1+ S S Uvrštavanjem gornje jednadžbe u izraz za početnu brzinu enzimske reakcije (v 0 = k 2 ES), dobijamo Michaelis-Menteninu jednadžbu: k 2 o E0 k 2 o E0 o S Vm o S v = = = S + K m S + K m K m + S S gdje je V m maksimalna brzina enzimske reakcije izražena kao umnožak konstante brzine reakcije (k 2 ) i ukupne koncentracije enzima (E 0 ), K m Michaelisova konstanta, a S koncentracija supstrata. Krivulja koja opisuje Michaelis-Menteninu jednadžbu je hiperbola, i velik dio enzima za koji se određuje ovisnost brzine enzimske reakcije o koncentraciji supstrata pokazuje upravo ovakav oblik krivulje (Slika 11). 26

29 Slika 11. Dijagram ovisnosti brzine enzimske reakcije o koncentraciji supstrata Michaelis- Mentenin dijagram Iz slike je vidljivo da pri niskim koncentracijama S, kada je S<<K m, brzina enzimske reakcije proporcionalna je koncentraciji supstrata, dok pri visokim koncentracijama supstrata, kada je S>>K m, brzina je najveća, odnosno neovisna o koncentraciji supstrata Određivanje kinetičkih parametara K m i V m bitno je za opisivanje enzimski kataliziranih reakcija. Međutim, kako se iz hiperbole ne može baš najpreciznije očitati, niti iz jednadžbe hiperbole najpreciznije izračunati vrijednosti tih dviju konstanti, uveden je mnogo prikladniji linearni prikaz ovisnosti brzine enzimske reakcije o koncentraciji supstrata, dvostruko recipročni dijagram ili Lineveawer-Burk dijagram (Slika 12). Slika 12. Dvostruko recipročni (Lineveawer-Burk) dijagram Hiperbolni prikaz ovisnosti brzine enzimske reakcije o koncentraciji supstrata prevodi se u linearni (dvostruko recipročni dijagram) na takav način da se vrijednosti koncentracije supstrata i brzine enzimske reakcije izraze recipročnom vrijednošću. Na takav način dobija se pravac iz čijeg se odsječka na ordinati može očitati recipročna vrijednost maksimalne brzine (1/V m ), a iz nagiba omjer Michaelisove konstante i maksimalne brzine (K m /V m ) Budući svaki pravac opisuje jednadžba pravca y = ax + b to se iz jednadžbe pravca vrlo precizno mogu izračunati vrijednosti K m i V m. Iz vrijednosti za odsječak na ordinati, b, može se izračunati maksimalna brzina, a iz vrijednosti za nagib pravca, a, Michaelisova konstanta. 27

30 Na vježbama će se provesti određivanje kinetičkih parametara (K m i Vm ) za enzim ureazu, no prije njihovog određivanja potrebno je ispitati uvjete koji utječu na brzinu enzimske reakcije (ph, koncentracija enzima) te podesiti reakciju u ustaljeno stanje, kako bi se za određivanje kinetičkih parametara nalazili u području početne brzine enzimske reakcije hidrolize uree. Ureaza, sistematskog naziva urea amidohidrolaza, EC , hidrolitički enzim visoke specifičnosti katalizira reakciju hidrolize uree na amonijak i karbamat (Slika 13). Karbamat zatim spontano hidrolizira dajući još jednu molekulu amonijaka i karbonatne kiseline. Ureaza H 2 O + NH 3 + H 2 O NH 3 + H 2 CO 3 Slika 13. Enzimska hidroliza uree Karbonatna kiselina i 2 molekule amonijaka u otopini uspostavljaju ravnotežu svojih protoniranih i disociranih oblika, što dovodi do povišenja ph vrijednosti otopine iz neutralnog u lužnato. Aktivnost enzima određuje se titracijom reakcijske smjese nakon prekida enzimske reakcije. Reakcijska smjesa titrira se pomoću kloridne kiseline, te se na osnovi utroška kloridne kiseline određuje količina nastalog amonijaka i računa enzimska aktivnost. Zadatak Odrediti optimalno vrijeme inkubacije, količinu enzima te optimalni ph za ispitivanje enzimske kinetike, i potom odrediti maksimalnu brzinu i Michaelisovu konstantu. Odrediti tip inhibicije. Reagensi ureaza iz sojinog brašna otopine uree u 25 mm Tris-HCl puferu ph 7,0; koncentracije uree: 5, 10, 25, 50, 100 mm otopine uree u 25 mm Tris-HCl ph 5, 6, 8, 9; koncentracije uree 5, 10, 25, 50, 100 mm 25 mm HCl 2% otopina HgCl2 Tashiro indikator 50 mm tiourea u 25 mm Tris-HCl puferu ph 7,0 Pribor Erlenmeyer tikvice 25 ml pipete 1, 5, 10 ml digitalna bireta automatska bireta elektromagnetska miješalica vodena kupelj vorteks miješalica ph metar s kombiniranom elektrodom 28

31 Vremenski tijek reakcije Kako je već prije rečeno, za određivanje kinetičkih parametara enzima (K m i V m ) potrebno je brzinu enzimske reakcije mjeriti u ustaljenom stanju kojeg karakterizira nepromjenjivost koncentracije enzim supstrat kompleksa, odnosno linearna ovisnost nastalog produkta u jedinici vremena. Ovom će se vježbom pratiti brzina enzimske reakcije ovisno o vremenu, kako bi se ustanovilo tijekom koliko vremena inkubacije enzima i supstrata u tikvici traje ustaljeno stanje, odnosno do kojeg vremena inkubacije postoji linearna ovisnost koncentracije produkta. Zadatak Odrediti vremensko razdoblje ustaljenog stanja enzimske hidrolize uree. Postupak Pripremiti uzorke i inkubirati na sobnoj temperaturi (zabilježiti sobnu temperaturu) prema slijedećoj tablici : Uzorak otopina uree/ml HgCl 2 /kapi 5 Ureaza/mL Vrijeme inkubacije/min HgCl 2 /kapi Po završetku zadanog vremena inkubacije, uzorcima dodati 5 kapi Tashiro indikatora, a zatim titracijom s 25 mm HCl odrediti količinu razvijenog amonijaka. Rezultate korigirati za vrijednost slijepe probe. Grafički prikazati odnos aktivnosti enzima izražene u μmol razvijenog amonijaka i vremena enzimske hidrolize te odrediti vremensko razdoblje ustaljenog stanja enzimske hidrolize uree. Rezultati mjerenja Uvjeti enzimske hidrolize γ(enzima) [mg/ml] c(uree) [mm] ph otopine uree T/ C Određivanje aktivnosti ureaze V(25 mm HCl) ΔV(25 mm HCl) t [min] [ml] [ml] n(nh 3 ) [mmol] EA [µmol/ml min] 1 SA [µmol/mg min] Za izračun enzimske aktivnosti (EA) podijeliti vrijednost n(nh 3 ) sa volumenom enzima dodanog u reakcijsku smjesu i vremenom inkubacije 2 Za izračun specifične aktivnosti (SA) podijeliti vrijednost EA sa masenom koncentracijom enzima 29

32 Dijagram vremenskog tijeka enzimske hidrolize uree Zaključak Na osnovu grafičkog prikaza količine u funkciji, može se zaključiti da ustaljeno stanje enzimske hidrolize uree traje min, pri koncentraciji uree mm, ph otopine i temperaturi C. Predlažem da se u daljnjim ispitivanjima enzima ureaze pri koncentraciji uree mm, vrijeme inkubacije postavi na min pri temperaturi C. Pregledano Potpis asistenta 30

33 Utjecaj koncentracije enzima na brzinu enzimske reakcije Ustaljeno stanje enzimske reakcije podrazumijeva i linearnu ovisnost brzine enzimske reakcije (količine nastalog produkta) o količini dodanog enzima. Ovom će se vježbom odrediti kolika se maksimalna količina enzima može dodati u reakcijsku smjesu, a da pri tome enzimska reakcija pokazuje linearnu ovisnost o količini dodanog enzima, odnosno nalazi se u ustaljenom stanju. Zadatak Odrediti utjecaj koncentracije enzima na brzinu enzimske reakcije. Postupak Pripremiti uzorke i inkubirati na sobnoj temperaturi prema slijedećoj tablici : Uzorak otopina uree/ml HgCl 2 /kapi Ureaza/mL γ(ureaze)/mg/ml Inkubirati na sobnoj temperaturi* u vremenu** HgCl 2 /kapi *zabilježiti sobnu temperaturu **vrijeme inkubacije određeno raspravom rezultata vježbe: Vremeski tijek reakcije Po završetku zadanog vremena inkubacije, uzorcima dodati 5 kapi Tashiro indikatora, a zatim titracijom s 25 mm HCl odrediti količinu razvijenog amonijaka. Grafički prikazati odnos aktivnosti enzima izražene u μmol razvijenog amonijaka/min ml o količini enzima izražene kao mg proteina te definirati utjecaj koncentracije enzima na brzinu enzimske reakcije. Rezultati mjerenja Uvjeti enzimske hidrolize c(uree) [mm] ph otopine uree t(inkubacije) [min] T/ C Određivanje aktivnosti ureaze γ(ureaze) V(25 mm [mg/ml] HCl) [ml] ΔV(25 mm HCl) [ml] n(nh 3 ) [mmol] EA [µmol/ml min] SA [µmol/mg min] 31

34 Dijagram ovisnosti brzine enzimske reakcije o koncentraciji enzima Zaključak Objasnite što će te učiniti ukoliko je koncentracija enzima u reakcijskoj smjesi tolika da za određeno vrijeme inkubacije izlazite iz ustaljenog stanja. Pregledano Potpis asistenta 32

35 Utjecaj ph na brzinu enzimske reakcije Aktivnost enzima ovisna je o ph otopine u kojem se enzimska reakcija odvija (Slika 14). Svaki enzim posjeduje optimalni ph pri kojem je najaktivniji, odnosno postiže maksimalnu aktivnost, koja se sniženjem ili povišenjem ph značajno smanjuje. Ovisnost enzimske aktivnosti o ph posljedica je utjecaja ph otopine na ionizacijsko stanje bočnih ogranaka aminokiselina u afinitetnom i katalitičkom mjestu enzima, te ionizacije i naboja ionizacijskih skupina supstrata. Uz navedeno, drastične promjene ph otopine mogu dovesti do denaturacije enzima. Ovom će se vježbom odrediti optimalni ph pri kojem je enzim ureaza najaktivnija. Slika 14. Ovisnost brzine enzimske reakcije o ph otopine Zadatak Odrediti utjecaj ph na brzinu enzimski katalizirane reakcije, te optimalni ph enzimske hidrolize uree. Postupak Pripremiti niz reakcijskih smjesa prema slijedećoj shemi : Uzorak otopina uree/ml ph otopine uree HgCl 2 /kapi Ureaza/mL Inkubacija na sobnoj temperaturi* u određenom vremenu** HgCl 2 / kapi * zabilježiti sobnu temperaturu ** vrijeme inkubacije određeno raspravom rezultata vježbe : Vremenski tijek reakcije Po završetku zadanog vremena inkubacije, uzorcima dodati 5 kapi Tashiro indikatora, a zatim titracijom s 25 mm HCl odrediti količinu razvijenog amonijaka. Grafički prikazati odnos specifične aktivnosti enzima izražene u μmol razvijenog amonijaka/min mg ekstrahiranih proteina i ph te odrediti optimalni ph. 33

36 Rezultati mjerenja Uvjeti enzimske hidrolize γ(enzima) [mg/ml] c(uree) [mm] T C t(inkubacije) [min] Određivanje aktivnosti ureaze V(25 mm HCl) ph [ml] ΔV(25 mm HCl) [ml] n(nh 3 ) [mmol] EA [µmol/ml min] SA [µmol/mg min] Dijagram ovisnosti brzine enzimske reakcije o ph 34

37 Zaključak Objasnite kako ph utječe na brzinu enzimske reakcije te prikažite dijagram ovisnosti. Pregledano Potpis asistenta 35

38 Utjecaj koncentracije supstrata na brzinu enzimske reakcije Zadatak Odrediti maksimalnu brzinu V m i Michaelisovu konstantu K m enzimske hidrolize uree. Postupak Pripremiti uzorke i inkubirati na sobnoj temperaturi prema slijedećoj tablici : Uzorak ml uree/mm HgCl 2 /kapi 5 Ureaza/mL Inkubirati na sobnoj temperaturi* u vremenu** HgCl 2 /kapi *zabilježiti sobnu temperaturu **vrijeme inkubacije određeno raspravom rezultata vježbe: Vremenski tijek reakcije Po završetku zadanog vremena inkubacije, uzorcima dodati 5 kapi Tashiro indikatora, a zatim titracijom s 25 mm HCl odrediti količinu razvijenog amonijaka. Rezultate korigirati za vrijednost slijepe probe. Grafički prikazati ovisnost aktivnosti ureaze izražene u μmol razvijenog amonijaka/ml i koncentracije supstrata Michaelis-Menteninim i Lineweaver-Burk dijagramom. Iz dijagrama očitati K m i V m. Linearnom regresijom podataka u dvostruko recipročnom dijagramu odrediti jednadžbu pravca te izračunati K m i V m. Rezultati mjerenja Uvjeti enzimske hidrolize γ(enzima) [mg/ml] ph otopine uree t(inkubacije) [min] T/ C Određivanje aktivnosti ureaze V(25 mm HCl) c(urea) [mm] [ml] ΔV(25 mm HCl) [ml] n(nh 3 ) [mmol] EA [µmol/ml min]

39 Dijagram ovisnosti brzine enzimske reakcije o koncentraciji supstrata Michaelis-Mentenin dijagram K m V m Dvostruko recipročni dijagram ovisnosti brzine enzimske reakcije o koncentraciji supstrata K m V m 37

40 Izračun K m i V m vrijednosti iz jednadžbe pravca Zaključak Definirajte što je to K m. Objasnite zašto krivulja enzimske reakcije ima oblik hiperbole. Pregledano Potpis asistenta 38

41 Utjecaj inhibitora na brzinu enzimske reakcije Brzina enzimske reakcije može se usporiti dodatkom tvari koje usporavaju enzimsku reakciju - inhibitora. Pri tome razlikujemo dva osnovna tipa inhibitora: ireverzibilne i reverzibilne inhibitore. Ireverzibilni (nepovratni) inhibitori se najčešće kovalentno vežu za aktivno mjesto enzima i na takav način onemogućavaju vezanje supstrata i provođenje enzimske reakcije. Reverzibilni (povratni) inhibitori vežu se za enzim nekovalentnim molekulskim interakcijama, usporavaju rad enzima, ali sa enzima mogu disocirati. Postoje dva osnovna tipa reverzibilnih inhibitora: konkurentni (kompeticijski) inhibitori, i nekonkurentni (nekompeticijski) inhibitori (Slika 15). Konkurentni inhibitori se natječu sa supstratom za aktivno mjesto enzima. Uslijed toga dio enzimskih molekula u aktivnom mjestu ima vezan inhibitor, a dio supstrat, što se onda bilježi kao smanjene (usporenje) brzine enzimske reakcije. Nekonkurentni inhibitor se ne natječe sa supstratom za aktivno mjesto enzima, nego se veže na neko drugo mjesto na enzimu, što dovodi do promjene konformacije enzimske molekule koja se odražava na promjenu konformacije katalitičkog mjesta enzima, te enzimska molekula sa vezanim nekonkurentnim inhibitorom ne može prevesti supstrat u produkt. To se onda bilježi kao smanjenje brzine enzimske reakcije. Slika 15. Dva osnovna tipa reverzibilnih inhibitora Ukoliko pratimo ovisnost brzine enzimske reakcije o koncentraciji supstrata u prisutnosti i bez prisutnosti konkurentnog ili nekonkurentnog inhibitora, tada se tip inhibicije enzimske reakcije (konkurentna ili nekonkurentna inhibicija) može razaznati iz dvostruko recipročnog ili Lineweaver-Burkovog dijagrama, usporedbom neinhibirane i inhibirane enzimske reakcije kako je to prikazano na slici 16. Slika 16. Raspoznavanje konkurentne i nekonkurentne inhibicije dvostruko recipročnim dijagramom Upravo će se ovom vježbom odrediti na koji način tiourea inhibira enzim ureazu. 39

42 Zadatak Odrediti vrstu inhibicije ureaze tioureom, K' m i V' m. Postupak Pripremiti uzorke i inkubirati na sobnoj temperaturi prema slijedećoj tablici : Uzorak Ureaza/mL Tiourea/mL 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Predinkubacija na sobnoj temperaturi* tijekom 5 minuta HgCl 2 /kapi 5 10 ml uree/mm Inkubirati na sobnoj temperaturi* u vremenu** HgCl 2 /kapi *zabilježiti sobnu temperaturu **vrijeme inkubacije određeno raspravom rezultata vježbe: Vremenski tijek reakcije Po završetku zadanog vremena inkubacije, uzorcima dodati 5 kapi Tashiro indikatora, a zatim titracijom s 25 mm HCl odrediti količinu razvijenog amonijaka. Rezultate korigirati za vrijednost slijepe probe. Grafički prikazati ovisnost aktivnosti ureaze izražene u μmol /min ml i koncentracije supstrata Michaelis-Menteninim i Lineweaver-Burk dijagramom. Iz dijagrama očitati K'm i Vm te usporediti sa vrijednostima dobivenim iz jednadžbe pravca. Grafički usporediti neinhibiranu i inhibiranu reakciju. Definirati tip inhibicije. Rezultati mjerenja Uvjeti enzimske hidrolize γ(enzima) [mg/ml] ph otopine uree t(inkubacije) [min] T/ C Određivanje aktivnosti enzima V(25 mm HCl) c(urea) [mm] [ml] ΔV(25 mm HCl) [ml] n(nh 3 ) [mmol] EA [µmol/ml min]

43 Dijagram ovisnosti brzine enzimske reakcije o koncentraciji supstrata u prisutnosti inhibitora K' m V' m Dvostruko recipročni dijagram ovisnosti brzine enzimske reakcije o koncentraciji supstrata u prisutnosti inhibitora K' m V' m 41

44 Izračun K' m i V' m vrijednosti iz jednadžbe pravca Usporedba neinhibirane i inhibirane reakcije dvostruko recipročnim dijagramom Zaključak 42

45 Navedite glavne tipove inhibicije i ukratko ih objasnite Objasnite kako biste mogli poništiti djelovanje tiouree na ureazu. Pregledano Potpis asistenta 43