Ekstrakcije Metode razdvajanja komponenata iz smeše u cilju prečišćavanja, a radi lakše identifikacije ili određivanja sadržaja. Može biti izuzetnokomplikovano zbog velike sličnosti komponenata i složenosti sastava uzorka. Kod prirodnih uzoraka postupak dodatno komplikuje osetljivost komponenata na uticaj svetlosti, temperature, ph ekstraktanata, različitih oksidansa i dr. 1
Iz perspektive analitičara, priprema uzorka treba da bude: jednostavna, iz minimalne količine uzorka, uz minimalnu količinu rastvarača, brza, preciznai isplativa. Tečno no-te tečna ekstrakcija - LLE Zasniva se na particiji ili distribuciji analizirane supstance iz jedne tečne faze u drugu tečnu fazu. Tečne faze međusobno se ne mešaju npr. voda i hidrofobni organski rastvarač, alkohol i etar Ukoliko se analit nalazi u matriksu koji može da utiče na njegovu analizu potrebno ga je ekstrahovati rastvaračem u kome se on dobro rastvara, a matriks se pritom slabo ili uošte ne rastvara u tom rastvaraču. 2
Primenjuje se za: pre-koncentrovanje uzorka ili izolovanje analita iz ispitivanog uzorka pre primene odgovarajuće metode farmaceutske analize. npr. ekstrakcija analita iz biološkog materijala pre HPLC analize Prednosti: jednostavna i jeftina metoda za uklanjanje interferencija Nedostaci: mala selektivnost, ograničeni broj rastvarača koji se međusobno ne mešaju, upotreba velikih zapremina rastvarača Raspodela supstance u određenom binarnom sistemu ima konstantnu vrednost i izražava se kao podeoni ili distribucioni koeficijent (Kp). Kp NE ZAVISI od količine supstance i zapremine rastvarača, ali zavisi od temperature. Faktori koji utiču na Kp mogu biti: a) hemijski: priroda rastvarača, jonska jačina, ph i b) fizički: temperatura, prisustvo interferirajućih supstanci. Ekstrakcija se može izvesti odmah sa celokupnom zapreminom rastvarača (jednokratna) ili više puta sa manjim zapreminama (višekratna), što zavisi od efikasnosti postupka. 3
Efikasnost LLE zavisi od: Količine uzorka. Podeonog koeficijenta. Stepena međusobnog mešanja rastvarača uzorka iekstraktanta (manji bolja efikasnost). Zapremineupotrebljenog ekstraktanta (povećava se efikasnost nekih ekstrakcija). Broja ekstrakcija (veći broj, bolja efikasnost). Dužine i načina mućkanja 5-10 min. (ne jako i nepredugo da se ne stvore emulzije). NH 4 (SO 4 ) 2 se dodaje da spreči nastajanje emulzija kod npr.ekstrakcija jonskih jedinjenjaorganskim rastvaračima iz vodenih uzoraka (rastvaračise mešaju acetonitril i 2-propanol pa nastaje emulzija). Za kvantitativnu analizu potrebno je da efikasnost ekstrakcije bude najmanje 97%. 4
Faktori koji utiču na LLE: Fizički: temperatura, veličine uzorka i prisustvo drugih supstanci u uzorku. Hemijski: vrstaupotrebljenograstvarača, vrstauzorkai mogućih hemijskih reakcija između aktivnih supstanci i rastvarača(aceton kao keton stvara sa 1 aminima Šifove baze; aldehidi i ketoni sa alkoholima poluacetale i acetale) Polarnost rastvarača, po principu slično se u sličnom rastvara. ph rastvora. Jonska jačina. Izbor rastvarača Najvažniji faktor čiji izbor zavisi od fizičko-hemijskih osobina ispitivane supstance. Binarni sistem čine rastvarači koji se međusobno ne mešaju, tj. rastvarači različite polarnosti. npr. ukoliko je voda rastvarač kao ekstraktant bira senepolarni organski rastvarač (hloroform, cikloheksan, dietiletar, itd). Novinu predstavlja primena superkritičnih tečnosti striktnim povećanjem pritiska ugljen-dioksid se prevodi u tečno stanje. Prednost je što lako i brzo isparava sa sniženjem pritiska, a ekstrahovana supstanca zaostaje uparena. Ovakav ekstraktant ne ostavlja onečišćenja. 5
Izbor rastvarača zavisi i od tehnike koja će sekoristiti za dalju analizu. Za UV/VIS analizu ne sme apsorbovati u tojoblasti. Za HPLC analizu mora biti HPLC čistoće. Ukoliko je potrebno uparavanje rastvarača potrebno je upotrebiti lako isparljiv i sl. Faktori koje treba razmotriti prilikom izbora rastvarača: Selektivnost. Distribucioni koeficijent (poželjan veći manje rastvarača). Rastvorljivost u drugom rastavraču (nepoželjna). Mešanje dva rastvarača (nepoželjno mešanjeekstraktanta i rastvora uzorka). Razlika gustine između tečnih faza (mora da postoji). Površinski napon (manji, jer je manja mogućnost za nastajanje emulzija). Hemijska reaktivnost (poželjan inertan rastvarač). Regeneracija nakon ekstrakcije (laka). Cena koštanja (niska). Viskoznost (niska, važno za rukovanje). Pritisak isparavanja (mali). Nezapaljiv, netoksičan. 6
Uticaj gustine na razdvajanje: 7
Rastvorljivost ekstraktanata u vodi: LLE zasnovana na raspodeli između dva rastvarača primenjuje se za ekstrakciju analita iz uljanih nosača. npr. ekstrakcija kortikosteroida iz masti i kremova Najčešče se za ekstrakciju koristi sistem metanol/heksan, etanol/heksan ili acetonitril/heksan. Uljana faza se rastvora u heksanu, a analit kao polarniji prelazi u metanolni sloj. Upotreba internog standarda je obavezna. Kao IS koristi se supstanca strukturno slična sa analitom. 8
Jonska jačina Dodatkom neorganske soli u rastvor neelektrolita smanjuje se njegova rastvorljivost. Podešavanje jonske jačine (primenjuju se 2M 4M rastvori neorganskih soli) u cilju smanjenja rastvorljivosti naziva se efekat isoljavanja. Posledica ovog efekta je potiskovanje neelektrolita iz vode u ekstraktant organski rastvarač. Uticaj katjona i anjona na efekat isoljavanja prikazan je liotropnim nizom: katjoni: Mg 2+ > Ca 2+ > Sr 2+ > Ba 2+ > Li + > Na + > K + > Rb + > Cs + anjoni: citrati > tartarati >SO 4 2- > acetati > Cl - > NO3 - > ClO 3- > J - > SCN - Efekat značajan i u slučaju primene ekstraktanta koji se delimično rastvara u vodi (etar, aceton). Podešavanjem jonske jačine dodatkom npr. MgCl 2, CaCl 2 ili KCl dolazi do smanjenja rastvorljivosti organskog rastvarača u vodi. U ovom slučaju efekat isoljavanja je dvojak, potiskuje i ispitivanu supstancu i organski rastvarač iz vode. Uticaj ph vrednosti Aktivne farmaceutske supstance su najčešće slabe kiseline ili slabe baze, kao i njihove odgovarajuće soli. U zavisnosti od stepena disocijacije u vodenoj fazi biće prisutan i molekulski oblik (ima veći afinitet prema nepolarnom rastvaraču) i jonski oblik (ima veći afinitet prema vodenoj fazi). U takvoj situaciji nemoguće je izvesti kvantitativnu ekstrakciju. Promenom ph vodene faze jonski oblik prevodi se u molekulski i postiže se kvantitativnost ekstrakcije. 9
Kontrola i održavanje ph postiže se dodatkom odgovarajućih pufera. ph vodenog rastvora analiziranog jedinjenja kiselih osobina podešava se da bude 2 ph jedinice ispod pka vrednosti tog jedinjenja. ph vodenog rastvora analiziranog jedinjenja baznih osobina podešava se da bude 2 ph jedinice iznad pka vrednosti tog jedinjenja. Kontrolom i održavanjem ph moguće je razdvojiti smešu kiselina baza, ali se tada ph mora smanjivati, odnosno povećavati za 3 ph jedinice u odnosu na pka vrednost analiziranih jedinjenja. Čvrsto-te tečna ekstrakcija Čvrsto-tečna ekstrakcija (eng. solid phase extraction SPE) je nova i široko primenjivana tehnika pripreme uzorka koji se dalje analizira nekom instrumentalnom metodom. Princip Analit se obavezno rastvara u rastvaraču koji ima malu eluacionu moć (gledano u odnosu na čvrsti nosač). Analit se zbog velikog afiniteta zadržava na čvrstom nosaču. Eluiranje se vrši malom zapreminom rastvarača velike eluacione moći. 10
Prednosti u odnosu na LLE: Ne javlja se problem loše separacije faza ili mešanja faza. Mogu se koristiti hemijski različiti sorbensi, a time se podešava i selektivnost. Prevaziđen problem niskih Recovery vrednosti kod LLE. To znači da su SPE ekstrakcije kvantitativnije. Smanjena je potrošnja skupih organskih rastvarača. Lakše se i brže izvodi, a može se i automatizovati. Nedostaci Iako su Recovery vrednosti daleko bolje nego kod LLE, preporučljivo je koristiti IS koji mora biti strukturno sličan sa analitom. Sorbensi čija je osnova silika gel nisu stabilni u jako alkalnoj sredini. Primenjuje se za: Koncentrovanje uzorka Često je slučaj da analit bude prisutan u veoma niskoj koncentraciji. Primenom SPE moguće je izvršiti koncentrovanje uzorka do nivoa prihvatljivog za kvantitativnu analizu. Ekstrakciju i prečišćavanje uzorka Prisustvo interferirajućih komponenti matriksa (biološki materijal) može onemogućiti kvantitativnu analizu ispitivanog jedinjenja. Primenom SPE uklanjaju se komponente matriksa uzorak se prečišćava, a iz uzorka se ekstrahuje ispitivana supstanca. 11
SPE se zasnivana raspodeli analita između čvrste faze (sorbensa) i tečne faze (eluenta). Postupak zavisi od: strukture i osobina analita koji treba ekstrahovati, prirode organskog rastvarača u kome je analit rastvorljiv, ph vrednosti uzorka, jonske jačine i uticaja matriksa na analit. SPE protokol može sepostaviti tako da se analit: Zadrži na čvrstoj fazi Primenjuje se kada je: 1) analit u uzorku prisutan u niskoj koncentraciji, 2) treba ekstrahovati više analita različite polarnosti. Ne zadrži na čvrstoj fazi Primenjuje se jedino kada je analit u uzorku prisutan u visokoj koncentraciji. 12
SPE postupak obuhvata četiri faze: Kondicioniranje Izvodi se propuštanjem rastvarača ili smeše rastvarača kroz kolonu napunjenu sorbensom čvrstom fazom (kertridž). Kondicionira se rastvaračem koji će biti korišćen za eluiranje. Omogućava aktiviranje čvrste faze. Adsorpcija Rastvor analita, biološki materijal, i sl, propušta se kroz kertridž. Rastvor analita priprema se u rastvaraču koji ga ne može eluirati sa kolone (male je eluacione moći posmatrano u odnosu na sorbens). Sve komponente (analit, nećistoće, komponente matriksa i sl) adsorbuju se na čvrstu fazu. 13
Ispiranje Vrši se rastvaračem koji će odstraniti komponente matriksa i nečistoće, dok analit ostaje vezan za čvrstu fazu. Izbor rastvarača je od presudnog značaja. Vrši se na osnovu fizičko-hemijskih karakteristika analita i sorbensa. Eluiranje analita Vrši se pogodnim rastvaračem. Rastvarač ima veliku eluacionu moć posmatrano u odnosu na sorbens. 14
Polarnost analita Mehanizam zadržavanja analita na čvrstoj fazi Reverznih faza Normalnih faza Izmene jona nepolarni ili slabo polarni polarni polarni - jonizovani Polarnost sorbensa nepolaran polaran polaran Vrsta veza koja se uspostavlja na međufazi Matririks iz koga se vrši ekstrakcija Eluent van der Valsove (hidrofobne, particione) polaran (voda, pufer, biološki materijal) nepolarniji od matriksa (voda-metanol, voda-acetonitril) vodonične, dipol-dipol interakcije, π-π interakcije nepolaran ili slabo polaran (toluen, CH 2 Cl 2, heksan) polarniji od matriksa (etil-acetat, aceton, acetonitril) izmena jona elektrostatičke interakcije polaran (dejonizovana voda, pufer) pufer odgovarajućeg sastava, jonske jačine i ph Redosled eluiranja najpolarnija se eluira prva najnepolarnija se eluira prva slabo jonizovana se eluira prva Lipofilni adsorbensi Lipofilni adsorbensi se koriste za ekstrakciju mehanizmom reverznih faza. Van der Valsovim silama vrše retenciju lipofilnih nejonizovanih analita. 15
Za ekstrakciju analita kiselog karaktera najpre je potrebno rastvor iz kog se analit ekstrahuje zakiseliti-prevesti u molekulski nejonizovani oblik. Za ispiranje se koristi kiseli pufer, voda ili smeša metanola i razblažene kiseline. Eliuranje se vrši metanolom, acetonitrilom, tetrahidrofuranom ili alkalnim puferom. Za ekstrakciju neutralnih jedinjenja nije potrebno kontrolisati ph. Za ispiranje se koristi alkalni pufer ili razblažena kiselina (uklanjaju se nečistoće koje jonizuju) ili smeša metanola i vode. Eliuranje se vrši metanolom, etanolom ili hloroformom. Amini se takođe mogu ekstrahovati primenom ovih sorbensa. Interakcija amina sa sorbensom je preko slobodnih silanolnih grupa - polarne interakcije. Za ekstrakciju analita baznog karaktera najpre je potrebno rastvor iz kog se analit ekstrahuje zaalkalisati (ph 10 je odgovarajući za većinu baza) -prevesti u molekulski nejonizovani oblik. Za ispiranje se koristi alkalni pufer, voda ili smeša metanol-alkalni pufer. Eliuranje se vrši kiselim puferom, metanolom ili etanolom. 16
Polarni adsorbensi Silika gel Polarni adsorbensi se koriste za ekstrakciju mehanizmom normalnih faza. Retencija se zasniva na građenju vodoničnih veza, ostvarivanju dipoldipol interakcija ili π-πinterakcija preko polarnih grupa sorbensa i analita. Koriste se za ekstrakciju polarnih jedinjenja. Aminopropil Diol Za eluiranje polarnih jedinjenja baznog karaktera koristi se smeša metanol - kiseli pufer. Za eluiranje polarnihjedinjenja kiselog karaktera koristi se smeša metanol - alkalni pufer. Jono-izmenjivački adsorbensi U osnovi sadrže silika-gel modifikovan radikalima koji na terminalnom kraju imaju naelektrisane jone. U zavisnosti od naelektrisanja dele se na katjonske i anjonske. Retencija se zasniva na ostvarivanju elektrostatičkih privlačenja između funkcionalnih grupa jedinjenja i adsorbensa. Funkcionalne grupe analita i adsorbensa moraju biti u jonskom obliku, a to se postiže podešavanjem ph vrednosti matriksa u zavisnosti od pka jedinjena i adsorbensa. Za eluiranje se koristi rastvarač koji ima takvu ph vrednost da neutrališe aktivirane grupe adsorbensa ili analita prestaje elektrostatičko privlačenje i analit se eluira. Drugi način za eluiranje je primena rastvarača koji ima toliku jonsku jačinu da dislocira vezano jedinjenje dolazi do razmene analita i jona prisutnih u rastvaraču. 17
Katjonski Silika modifikovana sulfonskom kiselinom. Jaki katjonski izmenjivač. Ima natrijumov jon koji se menja sa pozitivno naelektrisanom grupom analita. Moguća primena u širokom opsegu ph. Silika modifikovana karbonskom kiselinom. Slab katjonskim izmenjivač. Primena moguća u užem opsegu ph, jedna ph jedinica iznad ili ispod pka vrednosti analita. Anjonski Silika modifikovana kvaternernim aminima. Jak anjonski izmenjivač koji se koristi u širokom opsegu ph vrednosti. Silika modifikovana aminopropil radikalima kao slab anjonski izmenjivač primenjuje se za ekstrakciju polarnih jedinjenja. 18
Interakcije između analita i jakih jonoizmenjivača Protokol ekstrakcije mehanizmom reverznih faza Kondicioniranje najpre metanolom ili acetonitrilom, a zatim vodom ili puferom. Sorbens NE SME da se osuši. Adsorpcija Ispiranjeveoma polarnim rastvaračem Eluiranje Prva se eluira najpolarnija komponenta iz smeše primenom odgovarajućeg rastvaraća koji je manje polaran od rastvarača koji je korišćen za pripremu uzorka. Postepenim povećanjem nepolarnosti eluenta eluiraju se i ostale komponente (red eluiranje je red rastuće nepolarnosti). R -(CH 3 ) 2 C 18 H 37 -C 18 H 37 -(CH 3 ) 2 C 8 H 17 -C 2 H 5 19
Primer: Oralna suspenzija hlorpromazina Sadrži: hlorpromazin, metilparaben, neutralnu hidrofilnu boju, Nalaktatni pufer, lipofillni korigens ukusa. U 5ml uzoraka doda se 0,5ml amonijačnog pufera ph 9,5. Kondicioniranje sorbensa: amonijačnim puferom. Hlorpromazin se nalazi u formi slobodnebaze i adsorbuje se na ODS SPE adsorbens. Sve komponente rastvorljive u vodi pribaznom ph se ispiraju sa adsorbensa. Uzorak hlorpromazina se eluira smešom 0,5 Mfosfatni pufer ph 2,0 : metanol (95:5)idopuni volumen potreban za UV spektrofotometriju. Protokol ekstrakcije mehanizmom normalnih faza Kondicioniranjenepolarnim rastvaračem najčeščće rastvarač u kome je pripremljen uzorak. Adsorpcija Ispiranje nepolarnim rastvaračem Eluiranje Prva se eluira najnepolarnija komponenta iz smeše primenom odgovarajućeg rastvaraća polarnijeg od rastvarača koji je korišćen za pripremu uzorka. Postepenim povećanjem polarnosti eluenta eluiraju se i ostale komponente (red eluiranje je red rastuće polarnosti). R -(CH 2 ) 3 NH 2 -(CH 3 ) 2 (CH 2 ) 3 CN -(CH 2 ) 3 OCH 2 CH(OH)CH 2 OH 20
Protokol ekstrakcije mehanizmom jonske izmene Ekstrakcija na anjonskim izmenjivačima Kondicioniranje puferom čiji je ph blizak uzorku (0,01 0,1 M) i koji sadrži lako izmenjive jone (C 2 H 5 COO -, CH 3 COO -, F - ). Joni kao što su Cl -, Br -, NO 3-, HSO 4- ili citratni anjon nisu lako izmenjivi joni i treba ih izbegavati. Adsorpcija: ph rastvorauzorka mora biti 1-2 ph jedinice iznad pka analita. Ispiranje dejonizovana voda ili organski rastvarač Eluiranjerastvorom pufera koji sadrži jon koji može kompetitivno da istisne adsorbovani analit. Vrlo često se mora dodati i organski rastvarač. Primer: Ekstrakcija meticilina Relativno jaka kiselina pa se može ekstrakovati na primenom i jakih i slabih anjonskihjonoizmenjivača. Uzorak: Rastvor u puferu (ph 3.8-4.8) Eluiranje: pufer koji sadrži visoku koncentraciju jona koji kompetitivno istiskuju meticilin (1 M NaCl ili citrat). 21
Ekstrakcija na katjonskim izmenjivačima Kondicioniranje puferom čiji je ph blizak uzorku (0,01 0,1 M) i koji sadrži lako izmenjive jone (K +, Na +, NH 4+ ). Joni kao što su Ca 2+ ili Mg 2+ nisu lako izmenjivi joni i treba ih izbegavati. Adsorpcija: ph rastvorauzorka ph 1-2 ph jedinice ispod pka analita. Ispiranjeistim puferom, dejonizovanom vodom ili organskim rastvaračem. Eluiranjerastvorom pufera koji sadrži jon koji može kompetitivno da istisne adsorbovani analit. Vrlo često se mora dodati i organski rastvarač. Primer: Ekstrakcija adrenalina Uzorak: rastvor u puferu ph 8,3. Eluiranje: pufer koji sadrži visoku koncentraciju jona koji kompetitivno istiskuju adrenalin (1MNH 4 Cl). 22