BIOHEMIJA II LABORATORIJSKE VJEŽBE (INTERNA SKRIPTA)

Anela Topčagić Lejla Klepo Ismet Tahirović BIOHEMIJA II LABORATORIJSKE VJEŽBE (INTERNA SKRIPTA) Student: Grupa: Sarajevo, 2016.

Vježba broj 1 ODREĐIVANJE SADRŽAJA ASKORBINSKE KISELINE U UZORKU VOĆNOG SOKA 1. TEORETSKI DIO Vitamini su spojevi prisutni u hrani životinjskog i biljnog porijekla u malim količinama koji su neophodni za rast i održavanje organizma. Iako su po hemijskom sastavu i fiziološkim ulogama u organizmu heterogeni spojevi, vitamini ipak imaju nekoliko zajedničkih osobina. Prema rastvorljivosti u vodi ili uljima dijelimo ih na hidrosolubilne i liposolubilne vitamine. Vitamini topljivi u vodi (hidrosolubilni) su: Vitamini B kompleksa (B1, B2, B3, B5, B6, B9, B12) Vitamin C Vitamin H Vitamini topljivi u ulju (liposolubilni) su: Vitamin A Vitamin D Vitamin E Vitamin K Vitamini su uglavnom proizvodi biljaka i nekih mikroorganizama. U organizam se unose u malim količinama neki i u mikrogramskim količinama. Poslije resorpcije deponuju se u nizu organa, a prije svega u jetri. Zbog toga i mnoge životinjske namirnice-jetra i drugi unutrašnji organi, riblje ulje, mlijeko, jaja itd., služe kao izvor vitamina. U organizmu vitamini imaju važne fiziološke uloge (Tabela). Mnogi od njih ulaze u sastav koenzima mnogih enzima u organizmu ili su neophodni za plodnost, razvoj embriona i fetusa, za procese rasta i razvoja, za pravilno sazrijevanje eritrocita, za pravilan razvoj i strukturu epiderma i epitela. Nedostatak vitamina u hrani dovodi do određenih poremećaja u organizmu, koji su specifični za svaki vitamin. Primijećeno je da koža osobito osjetljivo reagira na pomanjkanje različitih vitamina. Hipervitaminoze su poznate kod nekih vitamina topljivih u ulju (A, D). One su gotovo uvijek posljedica pogrešnog doziranja pri terapiji vitaminima. U normalnim uvjetima prehrane praktično ne postoje avitaminoze, iako su one uvijek posljedica jednostrane prehrane. Klinički su važnije, hipovitaminoze, tj. relativno stanje pomanjkanja vitamina koje još ne dovodi do klasične slike bolesti. Kod nekih vitamina organizam sisavaca može provesti posljednji stupanj sinteze, tj. može prevesti provitamin u sam vitamin. U tim slučajevima (vitamin A) potreba se najvećim dijelom pokriva uzimanjem provitamina. Pokriću normalne potrebe za vitaminima znatno pridonose bakterije crijeva koje moramo smatrati simbiotima. Npr. potrebu čovjeka za vitaminom K u znatnoj mjeri pokrivaju bakterije. 2

Tabela: Pregled i hemijske strukture vitamina Naziv vitamina Hemijska struktura H3C B1 N N NH2 B2 + CH3 HO H HO H HO H H H H3C N H3C N Cl N - 1,2 mg Dekarboksilacija, transfer aldehidne grupe Beriberi Riboflavin 1,3 mg Reakcije redukcije Ariboflavinoza Nikotinamid, Nikotinska kiselina 16,0 mg Reakcije redukcije Pelagra Pantotenska kiselina 5,0 mg Prenos acilne grupe Parestezija Piridoksin 1,3 1,7 mg Prenos amino grupe Anemija periferne neuropatije O N OH NH O CH3 O OH OH OH B6 CH3 HO 3 Tiamin O NH2 HO Bolest usljed nedostatka vitamina NH B3 H3C Uloga u organizmu HO O B5 Preporučene doze OH S N Hemijski naziv vitamina N

H H N S B7 HO O O NH Biotin 30,0 µg Reakcija karboksilacije Dermatitis Folna kiselina 400 µg Prenos C1 grupe Megaloblastična anemija Kobaltamin 2,4 µg Intramolekularna premještanja Perniciozna anemija H O O B9 NH N N H2N N H O N H2N H3C N H3C N O B12 NH2H C 3 H3C O + Co O H NH2 O N N CH3 CH3 O O N P O HO N O H H H HO 4 N CH3 O NH O CH3 H3C O OH OH O H2N H2N O NH NH2 CH3 CH3

HO C O HO HO CH3 H3C CH3 O Askorbinska kiselina 90,0 mg Hidroksilacija Skorbut Retinol 900 μg Vid, rast i reprodukcija Noćno sljepilo, kseroftalmija Kalciferol 5,0 µg 10 µg Metabolizam kalcija i fosfora Rahitis Tokoferol 15,0 mg Lipidni antioksidant Mišićna slabost Zgrušavanje krvi Usporeno zgrušavanje krvi OH CH3 A OH CH3 CH3 H3C CH3 H3C CH3 H D H CH2 HO CH3 E HO CH3 H3C O CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 Menakinon CH3 O 5 CH3 CH3 O K CH3 H3C CH3 120 µg

L-askorbinska kiselina (vitamin C) Pod vitaminom C podrazumijeva se L-askorbinska kiselina. Vitamin C je ketolakton sa šest ugljikovih atoma, pa je po strukturi jako sličan glukozi i topiv je u vodi. To je kristalni spoj, vrlo kiselog karaktera, ima sposobnost reverzibilnog prelaska iz keto u enolni oblik, te igra ulogu oksidaciono-redukcionog sistema. Najbogatiji izvori su šipak, limun, paprika, kao i drugo svježe voće i povrće. Osim biljaka, mogu ga sintetizirati i mnoge životinjske vrste. Ljudski organizam nije u mogućnosti da sintetizira vitamin C, te ga čovjek mora unositi hranom. Rastvori askorbinske kiseline su nestabilni, jer podliježu razgradnji u prisustvu oksidacijskog sredstva, a pogotovo molekulskog kisika. Oksidacijom L-askorbinska kiselina prelazi u formu L-dehidroaskorbinske kiseline, koja zadržava vitaminska svojstva, a daljnjom oksidacijom i prelaskom u 2,3-diketogulonsku kiselinu gubi se vitaminska aktivnost. Oksidaciju L-askorbinske kiseline potiču i svijetlo, reakcije u baznoj sredini i teški metali (Fe, Cu, Ag). Oksidaciju u biološkom materijalu kataliziraju i razni enzimi. Obzirom da oksidacijom L-askorbinske kiseline nastaju inaktivni spojevi, koji ne posjeduju vitaminsko djelovanje, tokom obrade potrebno je paziti na uslove rada i time smanjiti njenu razgradnju. Kako je L-askorbinska kiselina termolabilna, povišene temperature također pospješuju razgradnju. Kuhanjem namirnica pri visokim temperaturama dolazi do njene razgradnje. Reaguje kao reducent u mnogim biološkim procesima. Važna je za sintezu kolagena i karnitina, kao i za sintezu hormona serotonina i adrenalina, te za metabolizam masnih kiselina. Postoji veliki broj metoda određivanja sadržaja vitamina C. Spektrofluorimetrijska metoda za detekciju vitamina C zasniva se na njegovoj oksidaciji u L-dehidroaskorbinsku kiselinu, koja u reakciji sa o-fenilendiaminom (OFDA) u baznoj sredini daje N-heterociklični spoj sa velikim brojem konjugiranih π-veza, koji može emitovati jaku fluorescenciju. Intenzitet fluorescencije nastalog spoja proporcionalan je koncentraciji i mjeri se pri talasnoj dužini ekscitacije oko 350 nm i emisije oko 430 nm. Mehanizam fluorescirajuće reakcije određivanja vitamina C 6

2. EKSPERIMENTALNI DIO Potrebni reagensi: o Askorbinska kiselina (AK) (radna koncentracija): 0,100 g AK otopiti u 100 ml destilovane vode (1mg/mL) i čuvati u tamnoj reagens boci. o o-fenilendiamin (OFDA): 0,5 g OFDA otopiti u 100 ml 0,1 mol/l HCl i čuvati u tamnoj reagens boci na 4 C. o Pufer NH3-NH4Cl (ph 9,4): 13,5 g NH4Cl i 15,75 ml amonijaka otopiti u 100 ml destilovane vode. Zatim se doda rastvor 0,1 mol/l NaOH, da bi se dobio optimalan ph otopine (provjeriti ph metrom) Upotrebom radne koncentracije, pripremiti u odmjernim sudovima od 10 ml standardne otopine AK slijedećih koncentracija: 0,5; 1; 5; 10; 30; 50 i 70 μg/ml. Izvagati 1g uzorka voća ili povrća i macerirati sa 9 ml destilovane vode, a potom ga centrifugirati pri 15 000obr/min, 15 minuta. Od dobijenih supernatanata pripremiti deset puta razblaženiji uzorak. U slučaju uzorka voćnog soka, uzorak samo centrifugirati prema istim uslovima i razblažiti na isti način kao uzorak voća ili povrća. Ovako pripremljeni rastvori AK i uzoraka se koriste za mjerenje. Rastvori se miješaju po slijedećem redoslijedu: 1 ml AK, 1,0 ml 0,5% OFDA, 1,5 ml pufera NH3-NH4Cl. Rastvor se dopuni do 10 ml s destilovanom vodom, dobro izmiješa i ostavi da stoji 5 minuta prije mjerenja. Intenzitet fluorescencije se mjeri u kvarcnoj kiveti od 1 cm pri talasnoj dužini ekscitacije od 330 nm i talasnoj dužini emisije od 430 nm. Izračunati koncentraciju AK u uzorku i rezultat izraziti kao mg/100 ml uzorka ili kao mg/100 g uzorka. 3. ZADACI I VJEŽBE 1. Koji od navedenih vitamina, kao strukturne elemente, sadrži izoprenske fragmente: a) vitamin E b) vitamin A c) nikotinska kiselina d) vitamin K 2. Koji od navedenih vitamina je derivat sterola: a) vitamin B12 b) vitamin D c) vitamin A d) vitamin B2 3. Kakva je hemijska struktura askorbinske kiseline: a) derivat sterola b) derivat izoaloksazina c) amid piridin-3-karbonske kiseline d) lakton dienilgulonske kiseline (2-keto-L (-)-gulonkiseli-γ-lakton) 7

4. Spojite vitamine sa ponuđenim odgovorima A. Nikotinamid a. Sadrži prsten tiazola B. Tiamin b. U organizmu životinja sintetizira se iz triptofana C. Pantotenska kiselina c. Učestvuje kao koenzim u reakcijama transaminacije i dekarboksilacije aminokiselina D. Piridoksalfosfat d. Ulazi u sastav koenzima A 5. Vitamini A i D se mogu uzeti odmah, u jednoj dozi, u takvoj količini da je dovoljna za održavanje njihove normalne koncentracije u toku nekoliko sedmica. Vitamine B grupe neophodno je uzimati znatno duže i češće. Zašto? 6. Ako je dnevna potreba za vitaminom C 75 mg, koliko mg ili g ispitivanog uzorka je potrebno uzeti da bi se zadovoljila dnevna potreba za vitaminom C? 8

4. REZULTATI Standard / Uzorak Intenzitet fluorescencije Određivanje koncentracije vitamina C u uzorku OVJERA VJEŽBE: 9

Vježba broj 2 KVANTITATIVNO ODREĐIVANJE UKUPNIH LIPIDA I TRIGLICERIDA U SERUMU ILI PLAZMI 1. TEORETSKI DIO Ukupni serumski (plazma) lipidi su sastavljeni od triglicerida, fosfolipida, holesterola, estera holesterola, neesterificiranih masnih kiselina, glikolipida (cerebrozida), acetilfosfatida (plazmalogena), fosfatidnih kiselina, viših alkohola, karotinoida, steroidnih hormona, te vitamina A, D, E. Po svojoj važnosti, naročito je bitno u uzorcima odrediti koncentracije triglicerida i ukupnog holesterola. U analitici ukupnih lipida opisane su gravimetrijske i turbidimetrijske metode, računske, te kolorimetrijske metode. Ukupni lipidi plazme (seruma) se određuju spektrofotometrijski, reakcijom sa vanilinom i fosfornom kiselinom. Predpostavka je da pri dodavanju koncentrirane sulfatne kiseline serumu uz zagrijavanje, svi lipidi koji u svojoj strukturi posjeduju dvostruke veze daju ketone ili ketole. Ovi potom reagiraju sa vanilinom u fosfornoj kiselini uz nastajanje ružičasto crvene boje, čiji intenzitet apsorpcije se mjeri između 510-550 nm. Prema hipotezi Knighta i saradnika, reakcija određivanja ukupnih lipida se odvija u tri stepena: 1. Nezasićena masna kiselina reagira sa H2SO4 stvarajući karbonium jon: 2. Vanilin reagira sa H3PO4 stvarajući aromatski ester: 3. Karbonijum jon reagira s aktiviranom karbonilnom grupom fosfovanilina stvarajući nabijeni ružičasto obojeni kompleks, koji se stabilizira rezonancijom i maksimalno apsorbira kod 525 nm: 10

Trigliceridi su esteri glicerola i masnih kiselina. Glavni su sastojak životinjskih i biljnih masti i ulja. Masti nas opskrbljuju velikom količinom energije. Nalazimo ih u masnom tkivu i u masnim kapljicama ostalih ćelija. Zbog toga su masti i ulja vrlo važna skupina spojeva u ljudskoj prehrani. One su rezerva energije neophodne svakom živom organizmu za njegov razvoj i održavanje. Vrlo su široko rasprostranjene u prirodi, koliko u životinjskom, toliko i u biljnom svijetu. Masti osim biološkog, imaju i veliko tehničko značenje. One služe kao sirovina za proizvodnju sapuna, margarina, raznih maziva, lakova i boja. Maslac i margarin su vrlo česti izvori masti u prehrani. U probavi hrane, mast se razgrađuje tek u tankom crijevu. Žuč, koja dolazi iz žučnog mjehura u duodenum (prvi dio tankog crijeva), zajedno s hranom putuje kroz tanko crijevo i razgrađuje mast na njene komponente: glicerol i masnu kiselinu. Masna kiselina se dalje probavlja, a glicerol se metabolizira u jetri. Trigliceridi se određuju po hemijskom ili enzimskom principu određivanja glicerola. Samo određivanje triglicerida se sastoji od ekstrakcije, potom odvajanja fosfolipida i drugih hromogena, te saponifikacije, odnosno ekstrakcije, nakon čega slijedi direktno određivanje glicerola. Faza ekstrakcije se izvodi u rastvaračima poput metanola, etanola, izopropanola ili hloroforma. Svi ovi rastvarači dovode do denaturacije lipoproteina, dakle disocijacije vezanih triglicerida. Interferirajuće supstance se mogu ukloniti na dva načina i to korištenjem adsorbensa poput zeolita, salicilne kiseline ili aktivnog magnezij-silikata ili pak korištenjem nonana ili heksana. Glavne interferirajuće supstance koje se mogu ukloniti na ovaj način su fosfolipidi i glukoza zajedno sa nekim hromogenima i ponekad sa slobodnim glicerolom. Druga faza u sklopu ovih postupaka uključuje hidrolizu triglicerida na glicerol i masne kiseline i obično se izvodi sa etanolnim rastvorom kalij-hidroksida pri visokim temperaturama (saponifikacija). U trećoj fazi dolazi do oksidacije glicerola u formaldehid, koji se prevodi u reakciji sa acetilacetonom u obojeni spoj. Određivanje triglicerida se može prikazati hemijskim reakcijama u tri stepena: Prvi stepen: O H2C O C O R HC O C O R H2C O C R Drugi stepen: H2C OH HC OH H2C OH Treći stepen: 11 + 3K OH H2C OH HC OH H2C OH O + NaJO4 3 H C H + + 3 RCOOK NaJO3 + H2O

Holesterol je najprisutniji sterol u organizmu, koji po svom hemijskom sastavu sadrži ugljikov skelet ciklopentanoperhidrofenantrena. Struktura holesterola Porijeklo holesterola u organizmu je dvojako, većina ćelija sintetizira holesterol, a drugi njegov izvor je hrana kojom se unosi. Oko 2/3 holesterola nastaje sintezom u organizmu (kod odrasle osobe oko 800-900 mg/dan), a svega 1/3 se unosi hranom (oko 150-300 mg/dan). Djeci je potrebna proporcionalno veća količina, što se opravdava njegovom značajnom ulogom kao strukturnog elementa svih ćelijskih i unutarćelijskih membrana. Najveći dio holesterola nastaje u jetri, a do njegove sinteze može doći i u sluzokoži crijeva i nadbubrežnim žlijezdama. Odatle se putem krvotoka transportuje do ćelija organizma. Pošto je nerastvorljiv u vodi, u krvi se holesterol transportuje tako što se veže za proteine gradeći lipoproteine. Postoji više vrsta ovih lipoproteina i dijele se prema gustoći na: VLDL (Very Low Density Lipoproteins), lipoproteini vrlo male gustoće LDL (Low Density Lipoproteins), lipoproteini male gustoće HDL (Low Density Lipoproteins), lipoproteini velike gustoće Lipoproteini sa dosta lipida imaju nižu gustoću. U krvi holesterol je prisutan u slobodnom i esterificiranom obliku vezan sa jednom molekulom masne kiseline. Esterifikacija holesterola odigrava se u plazmi pod djelovanjem enzima lecitin-holesterol-acetiltransferaze (LHAT), koji se nalazi u krvnoj plazmi. U plazmi je približno 75 % ukupnog holesterola esterificirano najčešće nezasićenim masnim kiselinama, (od toga 55 % linolnom kiselinom). Eliminacija holesterola iz organizma se vrši preko žuči (konverzijom u holne kiseline), perutanjem kože, mala količina se gubi urinom, dok žene koje doje gube nešto holesterola preko mlijeka. Holesterol je neophodan za normalno funkcioniranje svake ćelije, kao bitan strukturni element. Specifične uloge holesterola su: Sinteza žučnih kiselina u hepatocitima Sinteza steroidnih hormona u kori nadbubrežnih i polnih žlijezda Transport liposolubilnih vitamina (A, D, E i K) Štetno djelovanje holesterola se ispoljava kada je u krvi prisutan u znatno većim količinama. Povećanje LDL-a, a time i holesterola u krvnoj plazmi dovodi do povišenog ulaska estera holesterola u ćelije krvnih sudova, gdje dolazi do taloženja estera holesterola, što može da dovede do začepljenja krvnih sudova, smanjenja njihove prirodne elastičnosti, a u kasnijim stadijima, formiranja tromba i infarkta miokarda. Prilikom uklanjanja holesterola iz organizma slobodni holesterol dospijeva u žuč u kojoj je nerastvorljiv. On se u žuči inkorporira u micele koje čine lecitin i žučne soli. Ove micele imaju ograničen kapacitet rastvaranja holesterola. Kod ljudi sa kamenom u žučnoj kesi 12

dolazi do formiranja abnormalne žuči, koja postaje prezasićena holesterolom. Pod djelovanjem različitih faktora dolazi do viška taloženja holesterola u vidu kristala. Ako se kristali ne izluče u crijevo, narastaju i formiraju kamenje. Metode određivanja holesterola su spektrofotometrijske, enzimske i hromatografske. Najčešće se primjenjuje Liberman-Burchard-ova metoda određivanja, gdje holesterol u bezvodnoj sredini sa anhidridom acetatne kiseline i koncentriranom sulfatnom kiselinom daje nezasićene visokomolekularne ugljikovodike, plavozelene boje, tzv. halokrome. Intenzitet nastale boje direktno je srazmjeran koncentraciji holesterola i mjeri se fotometrijski. Acetatna kiselina i anhidrid acetatne kiseline služe kao rastvarači i dehidratacijska sredstva, jer se reakcija odvija u bezvodnom mediju, a sulfatna kiselina dehidrira i ujedno oksidira holesterol. 13

2. EKSPERIMENTALNI DIO 2.1. ODREĐIVANJE UKUPNIH LIPIDA Potrebni reagensi: - Sulfatna kiselina, koncentrirana - o-fosfatna kiselina, p.a. - Vanilin 0,008 M vanilina (C8H8O3, Mr 152,15) otopi se u 100 ml redestilirane vode - Fosfovanilinski reagens: fosfatna kiselina 11,9 M i vanilin 0,008 M, 1 dio fosfatne kiseline pomiješa se s 1 dijelom (1:1) otopine vanilina. Reagens je stabilan u tamnoj boci na sobnoj temperaturi 2 sedmice - Standard maslinova ulja, 1 g maslinova ulja/100 ml etanola. Otopine su stabilne jednu godinu na sobnoj temperaturi, ako su zatvorene. Otopine treba čuvati u tamnim bocama. U epruvete s brušenim staklenim čepom otpipetira se: Proba Standard Serum 50 μl Standard lipida 50 μl H2SO4 2,0 ml 2,0 ml Sulfatna kiselina dodaje se tako da se pokupe svi tragovi seruma na zidovima epruvete na dno. Epruvete se stave 10 minuta u ključalo vodeno kupatilo i ohlade u hladnoj vodi. U nove epruvete se otpipetira: Smjesa analize: Smjesa standarda lipida: Fosfovanilinski reagens: 100 μl 2,0 ml 100 μl 2,0 ml 2,0 ml Miješati i ostaviti da stoji 30 min. a nakon toga se mjeri apsorpcija (A) probe i standarda lipida prema slijepoj probi kod 530 nm u kiveti od 1 cm. Odrediti sadržaj ukupnih lipida u uzorku seruma, a rezultat izraziti kao g/l. Referentne vrijednosti ukupnih lipida: 4 do 8 g/l. 2.1. ODREĐIVANJE TRIGLICERIDA Potrebni reagensi: - n-heptan; - izopropanol; - sulfatna kiselina, 0,04 mol/l; - acetatna kiselina, 1 mol/l; - kalij-hidroksid 6,25 mol/l; 14

- rastvor metaperjodata: rastvoriti 3 g natrij-metaperjodata i 25 ml glacijalne acetatne kiseline u destiliranoj vodi i dopuniti vodom do 500 ml; amonij-acetat, 2 mol/l; rastvor acetilacetona: rastvoriti 0,75 ml acetilacetona i 2,5 ml izopropanola i dopuniti do 100 ml 2,0 mol/l rastvorom amonij-acetata. Rastvor čuvan u tamnoj boci stabilan je mjesec dana na +4 C; standard: maslinovo ulje. Pipetirati u epruvete sa brušenim zatvaračima prema priloženoj tabeli: 1. Ekstrakcija Slijepa proba 0,5 ml Standard Destilirana voda Standard 0,5 ml Serum n-heptan 2,0 ml 2,0 ml Izopropanol 3,5 ml 3,5 ml Sulfatna kiselina 1,0 ml 1,0 ml Miješati na vorteksu oko 30 s i sačekati da se odvoje slojevi. Uzorak 0,5 ml 2,0 ml 3,5 ml 1,0 ml 2. Saponifikacija i oksidacija Na 0,4 ml heptanskog sloja (gornji sloj) dodati 2 ml izopropanola i kap KOH. Dobro promiješati i inkubirati na 70 C u trajanju od 10 min. Nakon toga dodati 0,2 ml reagensa NaJO4 i 1 ml reagensa acetilacetona. Dobijeni rastvor dobro promiješati i inkubirati na 70 C u trajanju od 10 min. Nakon toga, smjesu ohladiti na sobnu temperaturu. Dobijenom rastvoru mjeriti apsorbansu na 425 nm. Boja je stabilna oko sat vremena. Standardne rastvore čije koncentracije idu do 2 g/l tretirati na isti način. Na osnovu dobijenih vrijednosti apsorbansi za standard triglicerida, konstruirati kalibracionu krivu i pomoću jednačine pravca odrediti sadržaj triglicerida. Sadržaj triglicerida izraziti kao mmol/l. 3. ZADACI I VJEŽBE 1. Oslobađanje masnih kiselina u toku posta ide iz kog organa: a) Jetre b) Masnog tkiva c) Epitela tankog crijeva d) Limfe 2. Koji se proces naziva saponifikacija masti: a) Enzimska hidroliza b) Alkalna hidroliza c) Hidrogenizacija d) Reakcija sa olovo-acetatom e) Emulzifikacija masti 15

3. Kakvom pretvaranju podliježe glicerol koji nastaje u prvoj etapi pri razgradnji triacilglicerola: a) Redukciji b) Oksidaciji c) Metiliranju d) Fosforiliranju e) Aciliranju 4. Koji od navedenih lipoproteina se karakterizira kao loši holesterol: a) LDL b) HDL c) Hilomikroni d) IDL 5. Koji se od vitamina ponašaju kao lipidi: a) vitamin C b) vitamin K c) vitamin A d) vitamin E e) vitamin D 6. Koji sastojci ćelije sadrže fosfolipide: a) mijelinski omotač nervnih ćelija velikog mozga b) hijeloplazma c) kompleks membrana 7. Objasniti ulogu sulfatne kiseline u reakciji određivanja ukupnih lipida? 16

4. REZULTATI - Određivanje koncentracije ukupnih lipida Uzorak - Apsorpcija (A) Određivanje koncentracija triglicerida Uzorak Apsorpcija (A) OVJERA VJEŽBE 17

Vježba broj 3 RAZDVAJANJE PROTEINA GEL ELEKTROFOREZOM (RAZDVAJANJE I IDENTIFKACIJA PROTEINA U UZORCIMA GOVEĐEG SERUMA NA AGAROZNOM GELU UZ PRIMJENU ISTOSMJERNE ELEKTRIČNE STRUJE) 1. TEORETSKI DIO Elektroforeza po svojoj definiciji, je tehnika kojom se razdvajaju naelektrisane čestice pod djelovanjem homogenog električnog polja. Tom prilikom otopljena čestica efektivnog naboja q putuje u viskoznom puferu pod djelovanjem električnog polja prema jednoj od elektroda, u ovisnosti od prirode njenog naboja. Ovo je jedna od važnijih tehnika u separaciji bioloških molekula, jer obično ne uzrokuje promjene na nivou strukture molekula koje se separiraju, a osim toga osjetljiva je na male promjene u naboju i masi makromolekula. Kretanje molekula u električnom polju predstavlja funkciju naboja q i koeficijenta trenja f. Brzina koju ostvaruje jedan molekul sa nabojem u električnom polju je funkcija jačine polja E tako da imamo odnos: Eq v= f v - brzina kretanja molekule (m/s) E - jačina električnog polja (V/m) q - naboj molekule f - koeficijent trenja (Vs/m2) Pri tome je razdvajanje čestica u električnom polju ovisno i o vremenu. Kao analitička metoda, elektroforeza je jednostavna, brza i vrlo osjetljiva. U kombinaciji s drugim tehnikama molekularne biologije, postala je jedna od najčešće primjenjivanih metoda. Postoje dva tipa elektroforeze: slobodna i zonska. Kod slobodne elektroforeze naelektrisani joni se slobodno kreću kroz rastvor sve dok postoji djelovanje električnog polja. Ovdje se radi o jednom dinamičkom sistemu koji direktna mjerenja može da vrši samo kod onih čestica koje svojom različitom brzinom putovanja stvaraju mjesta različite gustoće. Za ovu potrebu koristi se U-cijev koja u donjem dijelu sadrži uzorak i krajeve koji su napunjeni elektrolitom kako bi se održavale oštre granice prema uzorku. Kretanje uzorka se mjeri pomoću pomjeranja granica u funkciji vremena. Na ovaj način dolazi do optičke pojave (tzv. šlira), do prelamanja svjetlosti na granici dvije različite koncentracije i one se registruju posredstvom mjerenja indeksa prelamanja svjetlosti. Ova tehnika uglavnom se koristi u analizama fizičkih karakteristika molekula. Mnogo pogodnija tehnika je tzv. zonska elektroforeza. Naelektrisane čestice se kod ove tehnike kreću kroz interni potporni medij koji može biti filter papir, celuloza-acetat, skrobni gel, agar gel, poliakrilamid gel... Prednost ove tehnike je i u tome da se razdvojene supstance u željenom položaju mogu stabilizirati, osušiti i hemijski fiksirati. Potporni medij pri tome ima ulogu da spriječi sve poremećaje vezane za kretanje uzoraka, a osim toga predstavlja u izvjesnom smislu i molekulsko sito ili pak stabilizirajući medij za ph gradijent. Napon koji se koristi kod razdvajanja će ovisiti od tipa uzorka i vrste potpornog medija. Tako npr. visoki naponi se koriste za papirne potporne medije uslijed velikog otpora samog papira. Visoki napon se 18

također koristi za izbjegavanje problema koji bi nastali difuzijom i doveli tako do širenja molekula. Sa velikim naponima stvaraju se i veće jačine struje, dolazi do stvaranja toplote što zahtijeva hlađenje sistema. Dodatni problem u nekim efektivnim potpornim medijima je fenomen elektroendoosmoze u kojem pufer sam pokazuje elektroforetski učinak i time maskira pokretljivost molekule koja se prati. Ova pojava se može kao takva pripisati efektima kretanja pufera koji se javljaju uslijed negativno nabijenog potpornog medija i dovode to toga da pufer, kada se izloži električnom polju se kreće prema katodi. Proteini su negativno nabijeni i kreću se prema anodi. Drugim riječima, kada dolazi do ove pojave dolazi do njihovog kretanja suprotno kretanju pufera. Brzina kretanja pufera se mijenja sa korištenjem različitih potpornih medija. U izvjesnom smislu efekat elektroendoosmoze se pokazao korisnim, jer pomaže kod razdvajanja gama globulina od ostalih proteina. Ova frakcija proteina ima negativan naboj, ali se radi o molekulama velike molekulske mase tako da naboj koji oni posjeduju nije dovoljan da anulira efekat kretanja pufera. Dostupan je širok raspon opreme za elektroforezu, ali u osnovi postoji zajednički bazni dizajn. Dobro dizajnirana komora treba da spriječi bilo koji stepen isparavanja sa potpornih medija, da ima učinkovit sistem hlađenja kada se koriste gelovi ili tehnike visokog napona pri čemu je potrebno posebno voditi računa o sigurnosnim prekidačima. Tipovi elektroforeze su: ELEKTROFOREZA NA FILTER PAPIRU ELEKTROFOREZA NA CELULOZAACETATU ELEKTROFOREZA NA TANKOM SLOJU KAPILARNA ELEKTROFOREZA GEL ELEKTROFOREZA Idealan potporni medij za elektroforezu je hemijski inertan, sa njima se lahko rukuje i u svakom trenu je moguće kontrolirati poroznost. Iako se papir smatra pravim nosačem kod separacije aminokiselina, malih peptida, ovaj medij neosporno pokazuje velike nedostatke, jer se u ovom slučaju poroznost ne može kontrolirati. Supstance sa velikim molekulskim masama poput proteina i nukleinskih kiselina se ne separiraju dobro na papiru, jer celulozna vlakna pokazuju veliki otpor prema kretanju. Gelovi sa varirajućom poroznošću su idealni kod separacije visokomolekularnih supstanci jer dozvoljavaju lagano kretanje makromolekula uz istovremeno spriječavanje konvekcije i uz minimalnu difuziju. Tri tipa gela se koriste u ovu svrhu: skrobni gel, poliakrilamid gel i agaroza. Aparati mogu biti za cilindrične gelove i za gel ploče (gdje broj rupica za uzorke se utvrđuje na osnovu broja zuba na plastičnom češlju koji se koristi). Najpoznatiji gelovi koji se koriste u elektroforezi su: AGAROZNI ŠKROBNI POLIAKRILAMIDNI AGAROZA KAO GEL Agarozni gelovi se stvaraju tako što se suha agaroza otopi u vodenom puferu, potom zagrije dok se ne dobije bistri rastvor, a zatim ohladi na sobnoj temperaturi. Agaroza je prirodni linearni polisaharid građen od galaktoze i 3,6-anhidrogalaktoze. Dobija se iz agara. Visokoporozni gel koji se dobija na ovaj način je pogodan za elektroforezu i za neke imunološke tehnike. Agaroza se obično koristi pri koncentracijama između 1% i 3%. Agarozni gel se odlikuje relativno velikom veličinom para nakon njegovog hlađenja. Ove pore su 19

stabilizirane vodikovim vezama. Veličina pore se kontrolira početnom koncentracijom agaroze. Velike pore se stvaraju pri korištenju niskih koncentracija agaroze, a manje veličine se stvaraju prilikom korištenja velikih koncentracija agaroze. Velike pore i gelovi niskih koncentracija agaroze omogućavaju separiranje vrlo velikih molekula poput DNK, lipoproteina, imunoglobulina i enzimatskih kompleksa. Agaroza predstavlja definitivno metod izbora kod pripreme DNK lanca za sekvencioniranje. Fragmente DNK je pri tome moguće ekstrahirati direktno sa niskotopive agaroze (62 oc-65 oc) nakon zagrijavanja na 65 oc. Ovaj tip gela vrlo se često koristi za imunoelektroforezu gdje se separiraju veliki kompleksi antigen-antitijelo, a također se koristi i kod izoelektričnog fokusiranja. Dobra strana ovih gelova je da su oni fizički jači od niskoprocentnih poliakrilamid gelova. SDS-PAGE kontinuirana elektroforeza (Weber-Osborn postupak) je tehnika kod koje se deterdžent natrijumdodecilsulfat (SDS) dodaje na sistem. Uglavnom se koristi u istraživačke svrhe za karakterizaciju proteina u toku izolacije. Proteini velikih molekulskih masa, proteinski kompleksi ili pak nukleinske kiseline se vrlo često razdvajaju u prisustvu agensa koji djeluju na razbijanje nativne strukture. Natrijum dodecilsulfat (SDS) je deterdžent koji pokazuje polarne i nepolarne karakteristike. SDS se vezuje za najveći broj proteina tako da su njegovi nepolarni hidrofobni dijelovi pohranjeni u nepolarni region proteina, a negativno nabijeni sulfatni izložen prema rastvaraču. Vezivanje SDS-a ima dvojake efekte. Prvi su vezani za interferenciju sa nativnim hidrofobnim i jonskim vezama što dovodi do disocijacije najvećeg broja oligomernih proteina u njihove monomere i do razaranja njihove sekundarne strukture. Ukoliko su polipeptidni lanci povezani disulfidnim vezama, potrebno je dodatno uzorke zagrijati u prisustvu disulfid reducirajućih agenasa (betamerkaptoetanola ili 1,4-ditiotreitola). Da bi se to postiglo, potrebno je da protein disocira na manje podjedinice. Ovaj drugi efekat se pojavljuje kada proteini postanu zasićeni sa negativno nabijenim molekulama SDS-a. Tada elektroforetska separacija ovisi isključivo od molekulske mase, tako monomeri malih molekulskih masa putuju znatno brže jer je koeficijent trenja manji. Elektroforeza koja se izvodi pod ovim uvjetima može da se koristi za utvrđivanje molekulske mase proteina. Weber i Osborn su pokazali da se molekulske mase najvećeg broja proteina mogu utvrditi putem mjerenja pokretljivosti na poliakrilamidnom gelu koji sadrži SDS. Standardi proteina poznatih molekulskih masa se analiziraju elektroforetski i njihova pokretljivost se mjeri i nanosi na graf papir i izražava u obliku logaritma molekulske mase. Ovaj grafikon daje jednu pravu liniju. Pokretljivost nepoznatog uzorka se može odrediti pod identičnim uslovima, a molekulska masa se može dobiti na osnovu grafika pokretljivosti standarda u odnosu na njihove odgovarajuće logaritme molekulskih masa. Molekulske mase utvrđene metodom elektroforeze pod disocirajućim uslovima zadovoljavaju tačnost u rasponu od 5-10 %. SDS-PAGE primjena 20

2. EKSPERIMENTALNI DIO Potrebni reagensi: - Goveđi serum - Standard - albumin goveđeg seruma (BSA) - Agaroza - glicin - tris (hidroksimetil)-aminometan - natrijum-dodecilsulfat (SDS) - 2-merkaptoetanol - glicerol - brom-fenol plavo Za analizu uzoraka koristiće se jednodimenzionalna agarozna gel elektroforeza. Detekcija se vrši pomoću indikatora brom-fenol plavog, komazi briljantno plavog (coomassie brilliant blue) ili bojenjem sa srebrom. Intenzitet trake je veličina za relativno određivanje količinskih dijelova neke komponente. Na osnovu protoka referentnih proteina sa poznatom masom, mogu se odrediti molekulske mase različitih proteina u uzorku i isti mogu biti identificirani. U slijedećoj tablici navedene su relativne molekulske mase različitih proteina određene na poliakrilamidnom gelu: Protein Mr Transferin Albumin goveđeg seruma Ovalbumin (albumin jajeta) Gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza 78 000 66 000 45 000 36 000 Protein Mr Karboanhidraza Tripsinogen Tripsin inhibitor soje -laktoglobulin Mioglobin Lizozim Citohrom c 29 000 24 000 20 100 18 400* 17 800 14 300 12 400 Pređena udaljenost (mm) 6,0 12,5 32,0 38,0 Pređena udaljenost (mm) 50,0 54,0 61,0 69,0 69,0 79,0 86,5 * -laktoglobulin ima Mr od 36 800 jer je dimer od dvije identične subjedinice sa M r od 18 400. Pod reducirajućim uvjetima pufera za uzorak disulfidne veze podjedinica su reducirane (pocijepane) tako da se na gelu vide monomerni lanci. 21

1. Priprema potrebnih pufera a) Elektroforetski pufer Postoji više pogodnih elektroforetskih pufera za analizu proteina, ali je najčešće u upotrebi TRIS-Glicin pufer koji se priprema na slijedeći način: Pripremiti po 1 litar 0,192 mol/dm3 glicina i 0,025 mol/dm3 tris (hidroksimetil)-aminometana. Miješanjem tih komponenata dostići ph vrijednost 8,3. b) Pufer za tretman uzorka 400 l elektroforetskog pufera + 100 l 2-merkaptoetanola + 100 l 2 % SDS-a u elektroforetskom puferu. c) Pufer za aplikaciju uzorka 300 l elektroforetskog pufera + 700 l 87 %-og glicerola + nekoliko kristalića brom-fenol plavog ili komazi briljant plavog. 2. Priprema uzorka ili standarda U kivetu za centrifugu odmjeriti 200 l uzorka ili standarda (pripremljenog tako da se 0,01 g albumina goveđeg seruma otopi sa 1 ml elektroforetskog pufera), dodati 200 l pufera za tretman uzorka, promiješati na vorteks miješalici i držati na ključalom vodenom kupatilu 5 minuta. 3. Eksperimentalna procedura a) Pripremiti 1% rastvor agaroze ukupnog volumena 150 ml (agarozu otopiti u elektroforetskom puferu). b) Miješati na magnetnoj miješalici uz grijanje dok se agaroza ne otopi. c) Nakon otapanja, ostaviti otopinu na sobnoj temperaturi da se hladi uz miješanje na drugoj magnetnoj miješalici. Dok je otopina još vrela popuniti s njom šupljine između ivica staklene ploče i okvira koristeći Pasterovu pipetu. Kada se ruka može zadržati na tikvici sa otopinom, tada dodati 0,1 g SDS-a, promiješati staklenim štapićem da se otopi i sipati otopinu gela na staklenu ploču. d) Odmah uroniti češalj u otopinu blizu jednog od krajeva ploče. Češalj podesiti tako da donji dijelovi njegovih zubaca ne dodiruju površinu ploče (debljina gela na tim mjestima treba da je 0,5 1,0 mm. e) Nakon što prođe 30 45 minuta pažljivo ukloniti češalj i okvir, te staviti ploču s gelom u elektroforetsku jedinicu. f) U udubljenja koja su napravili zupci češlja aplicirati uzorke koji su pripremljeni na odgovarajući način (pomiješati 75 l pufera za aplikaciju uzorka sa 300 l uzorka ili standarda). g) U elektroforetske komore sipati elektroforetski pufer da dodiruje ivice gela. h) Pokriti sistem sa poklopcem i priključiti kablove sa elektrodama koje su spojene sa ispravljačem. i) Uključiti ispravljač uz podešavanje odgovarajućeg napona (u početku dok uzorci ne uđu u gel napon može biti oko 50-60 V, a kasnije 80-100 V). NAPOMENA Prije rada upoznati se sa načinom rukovanja hemikalijama koje se koriste. Podaci o štetnosti kemikalija, kao i načinu pružanja prve pomoći nalaze se u laboratoriju (konsultovati asistenta i laboranta)! Ovdje su navedene neke informacije za supstance povećanog rizika: 22

- 2-Merkaptoetanol Štetan ukoliko se proguta ili udiše. Toksičan u kontaktu sa kožom. Uzrokuje upaljenje. Toksičan za vodene organizme, može uzrokovati dugotrajne štetne efekte u vodenoj sredini! Pri radu sa ovom supstancom obavezno koristiti rukavice i rad obavljati u digestoru! - Natrijum-dodecilsulfat Štetan ukoliko se proguta ili udiše. Iritira kožu, oči i respiratorni trakt. Može uzrokovati alergiju kože ili respiratornu reakciju (kašalj i sl.). Zapaljiv u čvrstom stanju! Pri radu sa ovom supstancom obavezno koristiti rukavice! 3. ZADACI I VJEŽBE 1. Kakav je pravac kretanja peptida (ostaje na startu, kreće se ka anodi ili katodi) u procesu eletroforeze pri ph 2; 3,5; 6,5; 10: a) Lys-gly-ala-glu b) Glu-gly-ala-glu c) Gly-gly-ala-lys 2. Smjesa glicina, glutaminske kiseline, lizina, arginina i serina razdvaja se metodom elektroforeze na papiru pri ph 6,0. Navedite koja su se jedinjenja kretala ka anodi, + (A), katodi, - (K), a koja su ostala na startu C. A: B: C: 3. Navedite pravac kretanja peptida lyz-gly-ala-gly u procesu elektroforeze na papiru pri ph 1,9; 3,0; 6,5; 10,0. 23

4. Navesti u koje svrhe se može koristiti elektroforetska metoda? 5. Koju ulogu u pripremi uzorka za elektroforezu imaju 2-merkaptoetanol i natrijumdodecilsulfat? 24

4. REZULTATI OVJERA VJEŽBE 25

Vježba broj 4 KVANTITATIVNO ODREĐIVANJE UKUPNIH PROTEINA BIURET METODOM 1. TEORETSKI DIO Proteini predstavljaju kompleksne polimere koji se sintetiziraju na nivou svih živih bića. Međusobno se razlikuju po svojim funkcijama, veličini, obliku molekule te strukturi, rastvorljivosti, sastavu, eletroforetskoj pokretljivosti. U odnosu na ulogu koju imaju u organizmu, u principu se mogu podjeliti na proteine katalizatore (enzime), potom regulatorne proteine (receptori, hormoni, represori, inhibitori), transportne proteine, strukutrne proteine, proteine odbrane (imunoglobulini i komplement), onkofetalne i placentalne proteine i proteine čija funkcija još nije poznata. Najstariji pristup određivanja ukupnih proteina jeste utvrđivanje koncentracije azota proteinskog porijekla. Poznati postupak koji se koristi kod određivanja ovog tipa je Khjeldahl-ov postupak. Ovom metodom se utvrđuje koncentracija ukupnog azota u biološkom materijalu. Princip je da se supstance koje sadrže azot pretvore u amonijum jon posredstvom oksidacije u sistemu za razaranje koji sadrži koncentrovanu sulfatnu kiselinu kao katalizator i so koja ima funkciju da podigne tačku ključanja smjese. Amonijum jon se najbolje analizira pretvorbom u amonijak sa dodatkom alkalija. Nakon destilacije upari se u rastvor borne kiseline i amonijak potom titrira sa standardnim rastvorom hlorovodonične kiseline. Korekcija za neproteinski azot se ostvari korištenjem seruma koji ne sadrži proteine. Metoda određivanja po Khjeldahlu odlikuje visokom tačnošću i preciznošću, činjenica je da traje dugo i da je dosta komplikovana sa aspekta izvođenja rutinske analize serumskih proteina čak i u slučajevima kada se amonijak određuje enzimatskim analizama. Postoji također i nesigurnost oko tačnosti faktora konverzije azota u proteine. Historijski se još uvijek koristi faktor 6,25 iako se zna da je vrijednost istog relativno niska. Ova metoda se još uvijek koristi kao standardna metoda sa kojom se upoređuju sve druge metode. Jedna od najčešće korištenih metoda za utvrđivanje koncentracije serumskih proteina je zasnovana na principu Biuret reakcije. U ovoj reakciji bakarni jon reagira sa peptidnim vezama proteina u osnovnom rastvoru gradeći ljubičasto obojene komplekse koji pokazuju apsorpcioni maksimum na 540 nm. Biuretska reakcija predstavlja vrlo pogodnu metodu i odlikuje se dobrom preciznošću (pozitivna bojena reakcija dobija se i pri razblaženju 1:104). Količina boje koju daje Biuret reagens u vrlo bliskom je odnosu sa polipeptidnim dijelom različitih serumskih proteina što je direktna prednost nad Lowry-evom metodom. Reakcija koristi jedan vrlo stabilan reagens i uslijed toga našla svoju široku primjenu u automatizaciji. Nedostatak je što pozitivnu reakciju mogu dati i neke supstance koje ne poseduju peptidnu vezu u molekuli, kao što su histidin, asparagin ili oksamid. Kingsley je 1942. godine koristio prvi reagens koji nije bio veoma stabilan. Prvi stabilan Biuret reagens opisao je Weichselbaum koji je dodao kalij natrij tartarat kao stabilizator i kalij jodid da bi spreiječio autoredukciju alkalnog bakar tartarata i separaciju bakar oksida. Ovaj metod se zasniva na interakciji Cu 2+ jona sa atomima nitrogena i oksigena u peptidnoj vezi proteina u alkalnoj otopini, pri čemu nastaje ljubičasto obojeni kompleks čija apsorpcija se mjeri na 545 nm. 26

Pored ove metode, najčešće korištene metode za kvantitativno određivanje proteina su: 1. Bredford-ova metoda: zasniva se na mjerenju apsorpcije kompleksa proteina sa Bredfordovim reagensom pri 595 nm. Bredfordov reagens je Coomassie briljantno plavo G u fosfatnoj kiselini i metanolu. Linearno područje koncentracija proteina: 0,1-1,4 mg/ml. Ukoliko u uzorku ima tragova deterdženata prikladnija je BCA metoda koja će biti opisana. 2. Lowry-jeva metoda: zasniva se na redukciji fosfomolibden-volfram mješovitog kiselog kromogena u fenolskom Folin-Ciocalteu reagensu od strane proteina, što rezultira u apsorpcionom maksimumu pri 750 nm. Nedostatak je što se na rezultat može negativno odraziti prisustvo ostalih reducirajućih supstanci i što reagens reagira samo sa proteinima koji sadrže tirozin. 3. Metoda sa bicinkoninskom kiselinom (BCA metod) zasniva se na redukciji kupri (Cu ) jona do kupro (Cu+) jona proteinom. Bicinkoninska kiselina se koristi za detekciju Cu +. Ova metoda ima nekoliko interferirajućih supstanci čiji efekat može biti u izvjesnoj mjeri umanjen razrijeđivanjem ispitivane otopine proteina. 2+ 4. Fluorimetrijski metod zasniva se na derivatizaciji proteina sa o-ftalaldehidom (OPA), koji reagira sa primarnim aminima proteina (N-terminalne aminokiseline i -NH2 grupa lizina). Osjetljivost se može povećati prethodnom hidrolizom proteinskog uzorka. 5. Metoda mjerenja refraktivnog indeksa zasniva se na mjerenju prelamanja ulazne svjetlosti na smjesu uzorka, ali za serum, to će u principu odražavati masu prisutnih proteina. Obzirom da serum sadrži i znatnu količinu ostalih tvari, refraktometar se mora specifično kalibrirati sa serumom poznate koncentracije proteina. Vrlo važni koraci na nivou standardizacije prilikom određivanja ukupnih serumskih proteina su poduzeti osamdesetih godina prošlog stoljeća. U tom periodu univerzalno se prihvatilo korištenje goveđeg serumskog albumina kao referentnog materijala koji će se koristiti za određivanje ukupne koncentracije proteina u spektrofotometrijskim metodama poput biuretske i Lowry-eve metode. On se preporučuje kod svih određivanja koja za princip imaju biuretsku reakciju. 27

2. EKSPERIMENTALNI DIO Potrebni reagensi: - 200,00 g 0, 9% vodene otopine NaCl - 100,00 g 6% vodene otopine NaOH - 200,00 ml Biuret reagensa koji se priprema na slijedeći način: 3,46 g bakar (II)-sulfata otopiti u 10,00 ml vruće vode i ostaviti da se ohladi (otopina A). Otopiti 34,6 g natrijumcitratdihidrata i 20,0 g natrijumkarbonata u 80,0 ml vruće vode i ohladiti (otopina B). Pomiješati otopine A i B i razrijediti sa vodom do 200,0 ml. Ovakav Biuret reagens stabilan je pri sobnoj temperaturi 6 mjeseci. Ukoliko se pojavi zamućenje ili talog ne koristiti takav reagens. - 0,2% NaOH u 50% etanolu (za uzorke pšenice, raži, ječma, zobi) Priprema slijepe probe: Na 1 ml otopine NaOH dodati 1 ml Biuret reagensa i sadržaj protresti. Na to dodati 0,4 ml otopine NaCl i promiješati. Priprema i upotreba standardne otopine proteina: Odvagati 0,0500 g albumina goveđeg seruma (BSA) (liofilizirani prah, nabavljen od Sigma ) i otopiti u 5,00 ml 0,9 % NaCl. Dobijenu otopinu izraziti u mg/ml, označiti je kao osnovnu otopinu, te od nje prirediti po 10,00 ml slijedećih radnih otopina: 7.5, 5.0, 2.5, 1.0 i 0.5 mg/ml. Izmjeriti apsorbansu svih otopina (uključujući i osnovnu) pri 545 nm koristeći se slijedećim postupkom: U čiste i označene epruvete (pripremiti istovremeno za standarde, uzorke i slijepu probu) sipati po 1 ml otopine 6% rastvora NaOH, dodati u svaku 1 ml Biuret reagensa i sadržaj protresti. Na to dodati 0,4 ml otopine standarda (ili uzorka) zatvoriti i promiješati. Nakon 15 minuta sadržaj istresti u kivetu, obrisati kivetu i mjeriti apsorbansu. Konstruirati kalibracionu krivu A = f (c), nanoseći na apscisu konačne koncentracije standardnih otopina. Priprema i rad sa uzorkom proteina UZORAK 1: Odvagati približno 2 g sirovog bjelanca (sa preciznošću na četiri decimalne cifre) u prethodno odvaganoj čistoj i suhoj čašici. Pomoću 0,9 % otopine NaCl prebaciti kvantitativno sadržaj bjelanca u odmjerni sud od 50 ml. Izmjeriti apsorbansu tako pripremljenog uzorka pri istim uvjetima korištenim za rad sa standardnom otopinom BSA. Pomoću jednačine pravca dobijene iz kalibracione krive izračunati koncentraciju ukupnih proteina u uzorku bjelanca izrazivši konačan rezultat kao mg proteina/g svježeg bjelanca. UZORAK 2: Odmjeriti ispitivanog uzorka po 1-1,5 g materijala koji je prethodno usitnjem ili izmljeven u staviti u odgovarajuće posebne porculanske avane. Probama dodati 2 g kvarcnog pijeska i dodati po 3 ml NaOH u alkoholu, a zatim pažljivo rastrljavati uzorak u trajanju od tri minute kako bi se razorile ćelije i ekstrahovali proteini. Posle isteka 3 minute dodati u avan još 28

12 ml rastvarača i ponovo homogenizirati u trajanju od dvije minute. Tako dobijenu smjesu kvantitativno prebaciti u odmjerni sud od 50 ml; avan 2-4 puta isprati sa po 5 ml rastvarača i prenijeti u odmjerni sud. Odmjerni sud dopuniti sa rastvaračem do mjerne crte, dobro promućkati i ostaviti sa stoji 1 sat. Sadržaj profiltrirati u suhu erlenmajericu od 50 ml. 10 ml takvog filtrata staviti u kivete za centrifugiranje i dodati po 1 ml 6% NaOH i po 1 ml Biuret reagensa. Smjesu u epruvetama dobro promućkati i centrifugirati u trajanju pd 5 minuta. Ako rastvor nije proziran, onda je potrebno da se eksperiment ponovi uz dodavanje po 2 ml baze i reagensa. Poslije centrifugiranja, rastvor mora biti bistar (proziran). 3. ZADACI I VJEŽBE 1. Prikazati mehanizam Biuret reakcije na primjeru uree? 29

4. REZULTATI Standard Uzorak - A A1 A2 A3 Asr St dev Napomena: Priložiti grafik OVJERA VJEŽBE: 30

Vježba br. 5 ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE ALBUMINA I GLOBULINA 1. TEORETSKI DIO Prečišćavanje proteina je osnovni korak u izučavanju njihovih fizičkih i bioloških svojstava i jedan je od najčešćih postupaka u praktičnoj biohemiji. Za postizanje prečišćavanja protein mora biti oslobođen od svog biološkog matriksa i selektivno odvojen od ostalih proteina odgovarajućim postupkom frakcioniranja. Predmeti izučavanja na prečišćenim proteinima određuju prihvatljivost granica čistoće koju je potrebno dostići. Tako, ispitivanja aktivnosti ne zahtijevaju 100% čist preparat, dok osnovna strukturna izučavanja zahtijevaju. Suprotno, ispitivanja aktivnosti zahtijevaju očuvanje funkcije i stoga smanjenje denaturacije i proteolize, dok strukturna ispitivanja se mogu izvesti na denaturiranom proteinu. Količina prečišćenog proteina potrebna za izučavanje objektivno utiče na izbor metoda prečišćavanja. Neke tehnike imaju visok kapacitet i mogu raditi sa velikim volumenima i koncentracijama proteina, dok druge imaju ograničen kapacitet. Proteini se razlikuju u njihovoj osjetljivosti na denaturaciju tokom procesa ekstrakcije i prečišćavanja, posebno u njihovoj osjetljivosti na povišene temperature (iznad 40 C), na prisutnost deterdženata, teških metala i na ekstremne ph vrijednosti. Ove razlike često su iskorištene u strategiji prečišćavanja pojedinih proteina i tehnika zasnovanih na njihovom zajedničkom svojstvu u ranim fazama procesa prečišćavanja. Topivost prirodnih proteina uvjetovana je ph vrijednošću (topivost postaje minimalna u izoelektričnoj tački), dodatkom soli kao što su amonijumsulfat i prisutnošću organskih otapala, kao što su aceton i butanol, pri niskim temperaturama. Male razlike u ovakvim svojstvima enzima također su iskorištene u postupcima frakcioniranja i prečišćavanja. Spojevi koji sadrže tiolnu grupu kao što su merkaptoetanol i glutation (redukovani oblik) često se dodaju enzimskim preparatima da spriječe oksidaciju sulfhidrilnih grupa, koja se može desiti odmah nakon razaranja stanice i prethodne denaturacije. Tokom odvijanja prečišćavanja proteina često se prave razrijeđene otopine proteina. Nažalost, razrijeđene otopine proteina, posebno prečišćenih proteina, često su nestabilne ili zbog disocijacije subjedinica ili adsorpcije proteina na površini posude. Problemi adsorpcije mogu biti smanjeni upotrebom silikoniziranih posuda uz dodatak malih koncentracija deterdženata kao što su Triton X-100 ili Tween 20. Problemi disocijacije mogu često biti prevaziđeni dodatkom glicerola (10% do 40% (v/v)), glukoze ili saharoze ili povremeno albumina goveđeg seruma (bovine serum albumin, BSA). Čuvanje uzoraka pri 0-4 C je također korisno. Duže čuvanje može biti omogućeno upotrebom visokih koncentracija amonijsulfata (to objašnjava zašto su trgovački preparati enzima često spremljeni u otopini amonijsulfata). Prečišćene proteine moguće je frakcionirati na različite načine: 1. Frakcioniranje denaturacijom koristi razlike u toplotnoj osjetljivosti proteina. Kada je poznata temperatura denaturiranja, moguće je ukloniti više termolabilnih kontaminirajućih proteina grijanjem smjese do temperature koja je 5-10 C niža od ove kritične temperature u trajanju od 15-30 minuta. Denaturirani, neželjeni protein se potom ukloni centrifugiranjem. Prisustvo supstrata, produkta ili inhibitora enzima često 31

2. 3. 4. 5. stabilizira enzim i omogućava da se može primijeniti čak i viša temperatura toplotne denaturacije. Na sličan način, proteini se razlikuju u lakoći denaturiranja pri ekstremnim ph vrijednostima ( 3 ili 10 ). Kompletan proteinski ekstrakt se dovede na ph ne manji od jedne ph jedinice od ph unutar kojeg se ispitivani protein taloži. Osjetljiviji proteini će se istaložiti i ukloniti centrifugiranjem. Frakcioniranje solima izvodi se postepenim dodavanjem odgovarajuće soli. U praksi amonijsulfat je najčešće korišten jer je dobro topiv u vodi, može se dobiti u visokom stepenu čistoće, jeftin je i nema štetnog uticaja na strukturu proteina. Nakon svakog dodatka soli mora se osigurati potpuno otapanje soli i nastajanje homogenog otapala. Istaloženi protein se odcentrifugira, otopi u svježem puferu i ispita u odnosu na ukupni protein i proteinsku aktivnost. Sve faze se izvode pri 0-10 C radi smanjenja denaturacije. Dati protein se normalno isoli u okviru uskog područja koncentracije amonijsulfata. To je posljedica činjenice da protein-protein udruživanje za dati protein naglo postaje dominantno nad protein-voda i protein-so interakcijama. To je zbog toga što dodatak soli uklanja sloj molekula vode koji okružuje hidrofobne grupe na površini proteina, što omogućava hidrofobnim grupama da uzrokuju udruživanje proteina i stoga taloženje. Frakcioniranje organskim otapalom zasniva se na razlikama u topivosti proteina u vodenim otopima organskih otapala kao što su etanol, aceton i butanol. Organsko otapalo snižava dielektričnu konstantu medija putem povećanja privlačnosti između nabijenih molekula proteina i smanjenja njihove interakcije sa vodom. Topivost proteina se stoga smanjuje. Frakcioniranje organskim otapalom u biti je suprotno procesu obuhvaćenim frakcioniranjem solima. Kod prvog procesa, hidrofobne grupe proteina su znatno zaštićene molekulama organskog otapala, a jonske grupe postaju dominantne, dok kod drugog procesa hidrofobne grupe su jako izložene. Frakcioniranje organskim polimerom slično je frakcioniranju organskim otapalom u mehanizmu djelovanja, ali zahtijeva niže koncentracije za izazivanje taloženja proteina. Najčešće korišteni polimer je polietilenglikol (PEG) sa relativnom molekulskom masom u području 6 000-20 000. Izoelektrično frakcioniranje (frakcioniranje taloženjem u izoelektričnoj tački) zasnovano je na tome da proteini imaju minimalnu topivost u izoelektričnoj tački. Pri ovom ph postoji jednak broj pozitivnih i negativnih naboja proteinske molekule i intermolekulska odbijanja su minimalna, a intermolekulska privlačenja maksimalna, što rezultira u nastajanju netopivih agregata. Osnovno što se može iskoristiti je ili uklanjanje neželjenog proteina, podešavanjem ph ekstrakta proteina tako da se izazove taloženje ovih proteina, ali ne i ispitivanog proteina, ili uklanjanje ispitivanog proteina, podešavanjem ph ekstrakta na phi tog proteina. Centrifugiranje je moćna i opće primjenjiva metoda za razdvajanje i analizu stanica, organela i bioloških makromolekula. Čestica koja se kreće kružno sa poluprečnikom r, ugaonom brzinom, izložena je centrifugalnom polju koje iznosi 2r. Brzina taloženja tj. brzina sedimentacije čestice ovisi o nekoliko činioca: o masi čestice teže čestice brže se talože od onih lakših; o obliku čestice koeficijent trenja kompaktne čestice manji je nego u slučaju izdužene čestice iste mase, što znači da će se kompaktnije čestice brže taložiti od izduženih; 32

o gustoći čestice gušće čestice se kreću mnogo brže od onih manje gustoće; o gustoći otopine u kojoj se čestica nalazi. Krvna plazma je svijetlo-žuta tečnost, a najveći dio nje čini voda (oko 90%) u kojoj su otopljene različite organske i anorganske tvari, oko 7% proteina, 1% raznih anorganskih soli i 0,1% glukoze. Među organskim tvarima najvažnije su proteini plazme. U 1 litri plazme ima ih oko 73 grama. Te proteine možemo svrstati u 3 velike grupe: - Albumini 45 g/l to su proteini plazme s najmanjom molekulskom masom, te su vrlo prikladni za održavanje osmotskog tlaka. Osmotski tlak je vrlo važan, jer održava protutežu hidrostatskom tlaku krvi koji stvara srce. Albumini se sintetiziraju u jetri i odatle se otpuštaju u krv. Sudjeluju u prijenosu raznih hormona, različitih jona, aminokiselina, masnih kiselina, lijekova itd. - Globulini 25 g/l važni su nositelji odbrane organizma u obliku različitih antitijela. Dijele se na alfa, beta i gama globuline. Uloga alfa i beta globulina je slična ulozi albumina, a gama globulini su zapravo imunoglobulini (Ig), a to su molekule koje obavljaju zaštitne funkcije. - Fibrinogeni 3 g/l vrlo važni proteini u procesu zgrušavanja krvi, te osiguravaju zaustavljanje krvarenja. Fibrinogeni pomoću trombocita stvaraju «mrežu» u kojoj se onda ulove eritrociti i nastaje ugrušak (tromb). Krv bez fibrinogena je defibrinirana krv. 33

2. EKSPERIMENTALNI DIO Potrebni reagensi: - 0, 9 % vodena otopina NaCl - 2, 0 % otopina trihloracetatne kiseline u 0,9 %-om NaCl - Biuret reagens - 6,0 % vodena otopina NaOH U uzorku goveđeg seruma izmjeriti koncentraciju ukupnih proteina koristeći se Biuret testom (100 l goveđeg seruma razrijediti sa 900 l 0,9 % -ne otopine NaCl, a za daljnju proceduru vidjeti vježbu Kvantitativno određivanje ukupnih proteina Biuret metodom ). Podatak zabilježiti u radni dnevnik i preračunati na sadržaj proteina izražen u mg/100 ml seruma. Nakon toga u dvije ependorf epruvete (centrifugalne kivete) odmjeriti po 100 l uzorka goveđeg seruma i na to dodati po 900 l 2,0 % otopine trihloracetatne kiseline. Propisno zatvoriti kivete, okrenuti ih nekoliko puta da se sadržaj izmiješa i ostaviti ih 10 minuta da se izvrši taloženje. Za to vrijeme podesiti centrifugu na 3 500 o/min i centrifugiranjem u trajanju 5 minuta oboriti globuline na dno kiveta. U supernatantima odrediti sadržaj albumina Biuret testom. Iz razlike koncentracija ukupnih proteina i albumina izračunati koncentraciju globulina. 3. ZADACI I VJEŽBE 1. Glavne osobine albumina (A), globulina (B) i prolamina (C) su: a) Nerastvorljivi u vodi, rastvorljivi u 70-80% alkoholu b) Dobro rastvorljivi u vodi c) Nerastvorljivi u vodi i u rastvorima soli umjerene koncentracije 34

4. REZULTATI Standard Uzorak - A A1 A2 A3 Asr St dev Napomena: Priložiti grafik OVJERA VJEŽBE: 35

Vježba broj 6 ENZIMI 1. TEORETSKI DIO Enzimi su globularni proteini tercijarne ili kvarterne strukture, koji na površini imaju većinu polarnih aminokiselinskih ostataka, dok su nepolarni ostaci okrenuti prema unutrašnjosti molekule. Ovako organizirane proteinske molekule nazvane enzimi imaju visoku katalitičku moć i specifičnost za pojedine hemijske reakcije i supstrate u živim organizmima. Katalitička moć enzima se manifestira njegovom sposobnošću da smanjuje energiju aktivacije potrebnu za odvijanje hemijskih reakcija. Enzimi ubrzavaju reakcije i vrlo često kataliziraju samo jednu hemijsku reakciju ili skup vrlo srodnih reakcija, a specifičnost za supstrat je najčešće potpuna. U trenutku katalitičke promjene supstrat je s enzimom povezan uglavnom slabim nekovalentnim vezama (vodikove, hidrofobne ili Van der Waalsove veze), što omogućava brzu izmjenu molekula supstrata na enzimu. Ta izmjena se događa u jednom dijelu enzima nazvanom aktivno mjesto. Aktivno mjesto predstavlja mali broj aminokiselina smještenih u unutrašnjosti u hidrofobnom dijelu proteinske molekule, čije prostorno uređenje odgovara molekuli supstrata. Taj prostor u hidrofobnoj unutrašnjosti je odgovoran za njegovu katalitičku moć. Internacionalnom konvencijom enzim se svrstava u jednu od šest vrsta na osnovu hemijske reakcije koju katalizira. Svaka vrsta se dijeli prema prirodi hemijske grupe, koenzima i drugih grupa uključenih u reakciju. Saglasno pravilima Evropske komisije (EC), svaki enzim može se označiti jedinstvenim kodom od četiri broja i nedvosmislenim sistematskim imenom zasnovanim prema kataliziranoj reakciji. 36

Šest vrsta enzima su: Oksidoreduktaze, koje prenose atome hidrogena, oksigena ili elektrone od jednog substrata na drugi; Transferaze, koje prenose hemijske grupe između substrata; Hidrolaze, koje kataliziraju hidrolitičke reakcije; Liaze, koje razlažu substrate reakcijama različitim od hidrolize; Izomeraze, koje pretvaraju izomere jedan u drugi intermolekularnim premještanjem; Ligaze (sintetaze), koje kataliziraju nastajanje kovalentne veze, uz cijepanje odgovarajućeg nukleotid-trifosfata. Jedinica za enzimsku aktivnost Jedna enzimska jedinica definira se kao količina enzima koja pri optimalnim uvjetima (25 C, 1 bar), razloži 1 μmol supstrata za jednu minutu. Specifična aktivnost enzima može se izraziti kao broj enzimskih jedinica po miligramu proteina. Nova internacionalna jedinica (IU) određena od strane EC je katal (kat). Definira se kao količina enzima koja pri optimalnim uvjetima (25 C, 1 bar) razloži 1 mol supstrata za jednu sekundu. Iz praktičnih razloga u upotrebi su manje jedinice kao mikrokatal (μkat), pikokatal (pkat), nanokatal (nkat) itd. Amilaza spada u grupu hidrolaza (karbohidraze), jer kataliziraju hidrolizu oligo- i polisaharida. Hidroliza se vrši razlaganjem glikozidnih veza između monosaharida, koji izgrađuju oligo- i polisaharide. α-amilaza se nalazi u svim organima čovjeka i drugih sisara (ubikvitaran enzim), a najveća aktivnost je u pljuvački (gdje se naziva ptijalin) i u pankreasnom soku (gdje se naziva dijastaza). Specifična je za α1-4 glikozidnu vezu u polisaharidima (škrob i glikogen). Pošto ne može da cijepa α1-6 glikozidnu vezu, razlaže se oko 80% molekule škroba tj. potpuno hidrolizira amilozu i amilopektin. Krajnji produkti koji nastaju hidrolizom škroba ovim enzimom su maltoza i granični dekstrini koji nastaju na mjestima grananja u amilopektinu, tj. gdje se nalazi α1-6 glikozidna veza. Zato se α-amilaza još naziva i endoamilaza (unutrašnja) ili dekstrinogena amilaza. Za razliku od α-amilaze, β-amilaza je biljnog porijekla. Specifična je, također, za α1-4 glikozidnu vezu, ali djeluje na krajevima polisaharidnih lanaca. Zato ima naziv-egzoamilaza (spoljašnja) i krajni produkti njenog djelovanja su molekule maltoze. Pepsin je također enzim iz grupe hidrolaza (III grupa enzima) iz grupe peptidhidrolaza. To je proteolitički enzim koji cijepa peptidne veze u denaturiranim proteinima u želucu. Kada se proteini u želucu denaturiraju hloridnom kiselinom iz želučanog soka, dobiju naziv acid albumini (acid proteini). Pepsin prvenstveno cijepa peptidne veze između aromatskih i dikarboksilnih aminokiselina tako da nastaju, kao produkti, duži ili kraći peptidni lanci. Kraći lanci se nazivaju peptoni, a duži albumoze. Smjesa peptona i albumoza se koristi kao podloga za bakterije. Pepsin luče glavne ćelije želučane sluznice u obliku proenzima-pepsinogena koji je neaktivan što se tiče proteolize. Pepsinogen se pri ph ispod 3 reverzibilno aktivira promjenom konformacije, a zatim autokatalizom odcjepljuje dva peptida sa N-terminalnog kraja, prelazeći ireverzibilno u pepsin. 37

Schardingerov enzim katalizira oskidaciju aldehida i otuda se naziva aldehiddehidrogenaza Schardingera (aldehid: O2-oksidoreduktaza 1.2.3.1.). Pored toga, ovaj enzim ubrzava oksidaciju hipoksantina i ksantina u mokraćnu kiselinu. Zahvaljujući drugoj reakciji koju katalizira, dobio je naziv ksantin-oksidaza (ksantin: O2-oksido-reduktaza-1.2.3.2). Dugo se mislilo da su to dva odvojena enzima. Sviježe mlijeko sadrži dosta Schardingerovog enzima. Jetra čovjeka također je bogata ovim ezimom. Schardingerov enzim oksidira podjednako efikasno i aromatske i alifatske aldehide. Da bi se ostvarila oksidacija (putem oduzimanja hidrogena) in vitro, potrebno je reakcionoj smjesi dodati supstancu-akceptor hidrogena. U tu svrhu može da posluži metilensko plavo, jer ono prima hidrogen do oksidiranog supstrata i odmah se obezboji-prelazi u leuko formu. Ako duže stoji, metilensko plavo može ponovo da se oboji, jer lahko predaje hidrogen oksigenu iz zraka. In vivo, hidrogen oduzet od supstrata predaje se direktno oksigenu, ili preko NAD-a, ako je hipoksantin supstrat oksidacije. Schardingerov enzim spada u aerobne dehidrogenaze u oba slučaja: i kada djeluje na aldehide i kada djeluje na purine. Ako upotrebljavamo mlijeko kao izvor enzima, neophodno je da bude svježe. Temperatura ključanja brzo razara enzim. 2. EKSPERIMENTALNI DIO Specifičnosti enzima Specifičnost enzimske aktivnosti može se jednostavno promjeriti sa enzimima amilazom i saharazom, od koji je prva specifična za škrob, koga hidrolizom škrob prevodi u maltozu, a druga vrši hidrolitičko razlaganje saharaze do fruktoze i glukoze. - 2 % ratvor saharoze - 1% rastvor škroba u 0,3% rastvoru NaCl - Rastvor saharaze (100 g suhog kvasca usitniti u avanu do praha, preliti sa 450-500 ml vode, ekstrahovati u toku 1,5-2 sata, zatim filtrirati polako (obično preko noći) i dobiveni filtrat čuvati u boci na hladnom) - Amilaza - 10% NaOH - 5% rastvor CuSO4 - Vodeno kupatilo Specifičnost amilaze. U jednu epruvetu dodati 5 ml rastvora škroba, a u drugu 5 ml saharoze. Dodati u svaku epruvetu po 1-1,5 ml rastvora amilaze, pomješati i uroniti epruvetu u vodeno kupatilo, čija je temperatura 38-40 C. Posle isteka od 8-10 minuta sadržaj obje epruvete ispitati na prisustvo redukujućih šećera (maltoza iz škroba, glukoza i fruktoza iz saharoze) pomoću Fehling-ove reakcije. Epruvete sa škrobom će dati pozitivnu reakciju, jer je nastala maltoza koja ima redukujuća svojsta, pa redukuje rastvor Fehling-a do Cu2O (crvena boja). U drugoj epruveti pozitivna reakcija izostaje jer je saharoza neredukujući šećer. Specifičnost saharaze. Postupak je isti kao u prvom slučaju, samo se umjesto amilaze dodaje rastvor saharaze. Posle inkubacije u trajanju od 15-20 minuta izvrši se testiranje obje epruvete pomoću Fehling-ovo reagensa. Epruveta koja je sadržavaja saharozu i saharazu će dati 38

pozitivnu reakciju uslijed reakcije između reagensa i produkata hidrolize saharoze (glukoze i fruktoze). Dokazivanje aktivnosti i termolabilnosti ptijalina (α-amilaze iz pljuvačke) Sakupiti 2-3 ml pljuvačke, podijeliti na dva dijela. Jedan dio proključati na plameniku ili rešou. U tri epruveta pripremiti smjese prema datoj tabeli: Epruveta Škrob Neprokuhana pljuvačka Prokuhana pljuvačka Lugolov reagens I II III 2-3 ml 2-3 ml 2-3 ml Nekoliko kapi 2-3 kapi 2-3 kapi Nekoliko kapi 2-3 kapi Sve epruvete staviti u vodeno kupatilo na 37 ºC na inkubiranje od 30 minuta. Nakon tog vremena izvaditi epruvete i zaključiti šta se desilo u epruvetama. Izvesti Fehling-ovu reakciju na sadržaje u drugoj i trećoj epruveti. U svaku dodati po 1-2 ml pripremljenog Fehlingovog reagensa i zagrijavati do ključanja. Zaključiti šta se desilo u ovim epruvetama. Optimalni ph za djelovanje amilaze Postupak: U četiri epruvete dodati po 5ml fosfatnog pufera pripremljenog na slijedeći način: Na2HPO4 (0,067 M) KH2PO4 (0,067 M) 0,5% škrob Amilaza (1:15) Epruveta 1 Epruveta 2 Epruveta 3 Epruveta 4 ph=5,59 ph=6,64 ph=7,17 ph=8,04 0,25 ml 2,00 ml 3,00 ml 4,75 ml 4,75 ml 3,00 ml 2,00 ml 0,25 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml Rastvore Na2HPO4 (0,067 M) i KH2PO4 (0,067 M) pažljivo sipati iz birete i dobro izmješati. U svaku epruvetu dodati 0,5 % rastvor škroba i razrijeđene amilaze. Sadržaj promješati i staviti u vodeno kupatilo. Ostaviti 10-15 min na 40 C. Epruvete izvaditi, ohladiti i u svaku dodati po 34 kapi joda u kaloj-jodidu (Lugolov reagens). Prema boji joda može se orediti stepen razgradnje škroba u zavisnosti od ph sredine. Epruveta u kojoj ne nastane plava boja sa micelama škrba imala je optimalan ph za djelovanje amizale. Intezivna plava boja indicira neakrivnost amilaze (izvan dometa ph za djelovanje amilaze), dok blijedoplava boja indicira aktivnost u sredini udaljenoj od optimalnog ph, ali još uvijek u domenu djelovanja pluvačne amilaze. 39

U domenu optimalnog ph za djelovanje amilaze (u epruveti u kojoj nema plave boje sa Lugolovim reagensom) škrob se razlaže na sastojke koji ne daju plavu boju sa jodom, uz povaju pozitivne redukujuće reakcije. U domenu djelovanja enzima izvan optimalnog ph (niži ili viši ph) škrob se djelimično razgrađuje, a za potpunu razgradnju treba više vremena, pa je i rekacija joda sa preostalim škkrobom manje intezivna. Izvan domena djelovanja enzima, pri ph izrazitije udaljenom od optimalnog ph, nema promjena na škrobu, ostaje nerazgrađen, i reakcija sa jodom je maksimalnog inteziteta. Prikaži grafički djelovanje enzima u zavisnosti od ph sredine. Inhibitorsko djelovanje hlorida na dehidrogenazu U krompiru se nalazi dehidrogenaza, čije se djelovanje na zraku zapaža tamnjenjem razrezane površine krompira. Hloridni joni inhibiraju djelovanje dehidrogenaze i izostaje efekat tamnjenja (oksidacije) na površini razrezanog krompira. Postupak: Jedan krompir razrezati na polovine i označiti ih brojevima 1 i 2. Polovina br. 1: Kontrola Polovina br. 2: Posuti kristalima natrij-hlorida. Stajanjem na zraku uočite razliku između polovica krompira. Ureaza Ureaza procesom hidrolize razlaže ureu na amonijak i ugljendioksid. (NH2)2CO + H2O CO2 + 2NH3 U rastvoru oslobođeni amonijak se bolje razlaže, nastaje bazna sredina, pri kojoj fenolftalein prelazi u crvenu boju. Postupak: Na oko 1g uree dodati 5 ml destilovane vode. U dvije epruvete nasuti po 2 ml rastvora uree i po 3 kapi fenolftaleina. U prvu epruvetu na vrhu kašičice dodati malo sojinog brašna (koje sadrži enzim ureazu) i obje epruvete držati 30 minuta na 38 C. U prvoj epruveti će se pojaviti crvena boja, a u drugoj neće. Pepsin Treba pripremiti kuhano bjelance kokošijeg jajeta isjeckano na kockice koje će poslužiti kao supstrat. Uzeti četiri epruvete i dodati u njih: Epruveta I II III IV 40 Bjelance Pepsin Prokuhani pepsin 0,2% HCl 1% Na2CO3 2-3 kockice 2-3 kapi 5 ml 2-3 kockice 5 ml 2-3 kockice 2-3 kapi 5 ml 2-3 kockice 2-3 kapi 5 ml

Sve četiri epruvete staviti u vodeno kupatilo, na 37 C i inkubirati 30 minuta. Pripremiti nove četiri epruvete i nakon inkubacije sadržaje epruveta dekantirati u nove pripremljene epruvete. U izdvojene filtrate dodati 1-2 ml Biuret reagensa. Uočiti gdje se desila Biuret reakcija. Dehidrogenaza mlijeka Ovaj enzim sadrži mlijeko, a funkcija mu je oksidacija nekih aldehida u odgovarajuće kiseline. Reakcija se odvija u anaerobnim ulovima i tada neko organsko jedinjenje služi kao primalac vodika. Bojeni indikator oksido-redukcije je jedinjenje koje gubi boju primajući vodik (nastaje redukovani derivat). Često se u ogledima koristi metilensko-plavo: MP + 2H+ MPH2 Nastali derivat je autoksidabilan, pa se na vazduhu prevodi u svoj oksidovani oblik, pa treba izbjegavati duže izlaganje zraku. MPH2 + O2 MP + H2O2 Postupak: U tri epruvete staviti: - epruveta 1: 5 ml sviježeg, nekuhanog mlijeka + 0,5 ml metilenplavog (0,05%) - epruveta 2: 5 ml sviježeg, nekuhanog mlijeka + 0,5 ml rastvora metilenplavog (0,05%) + 1 ml 0,4% rastvora formaldehida - epruveta 3: 5 ml sviježeg, kuhanog mlijeka + 0,5 ml rastvora metilenplavog (0,05%) + 1 ml 0,4% rastvora formaldehida Svaku epruvetu treba dobro promješati (izbjeći, po mogućnosti, veća izlaganja zraku), pa staviti u vodeno kupatilo na 42 C. Zapaziti da se u epruveti br. 2 metilenplavo dekoloriše, jer prima vodik iz aldehid-hidrata i prelazi u leukoderivat: Napomena: Uslijed neizbježnog kontakta sa kisikom iz zraka i na površini epruvete br. 2 može se zadržati nešto plave boje (autooksidacija redukovanog enzima). Dehidrogenaza djeluje i na ksankin i hipoksantin prevodeći ih u mokraćnu kiselinu, pa se često naziva i ksantin-oksidaza. 41

Tirozinoksidaza krompira Ovaj enzim, sadržan između ostalog i u krompiru, oksidira tirozin koristeći kisik. Tirozin se postepeno prevodi u oksidacione produkte, koji imaju crvene, odnosno, daljom oksidacijomcrnu boju. Postupak: U dvije epruvete staviti po nekoliko kapi 1% rastvora tirozina. U epruvetu 1 dodati 0,5 ml filtriranog, vodenog ekstrakta krompira (narendani krompir-ekstrahovati vodom) (Narendani krompir staviti u gazu, zatim uroniti u laboratorijsku čašu od 500 ml, koja sadrži 200 ml destilovane vode. Lagano istisnuti škrob. Promjeniti vodu i ponoviti ekstrakciju. Pustiti da se iz ekstrakta istaloži škrob i filtrirati supernatant. Dobijeni filtrat koristiti za uzorak u epruveti 1). U epruvetu 2 dodati 0,5 ml vode. Staviti obje epruvete u vodeno kupatilo na 40 C, i tokom inkubacije sadržaj epruveta nekoliko puta promješati rada inteziviranja aeracije. Utvrditi da tokom inkubacije djelovanjem tirozinoksidaze, uz korištenje kisika, tirozin prelazi (u prvoj epruveti) u crveno obojeni derivat. Stajanjem, tj. inkubacijom u roku 1-2 sata tirozin prelazi u crni pigment melanin. U drugoj epruveti nema promjene, jer nije dodan enzim, pa tirozin ostaje nepromjenjen. Katalaza Ova grupa enzima razlaže vodikperoksid (nastao oksidacijom-dehidrogenacijom-kada se ona vrši u aerobnim uslovima). 42

2H2O2 2H2O + O2 Izdvaja se molekularni kisik. Postupak: U epruvetu staviti 1 ml 6% rastvora vodikperoksida i 1 kap krvi. Odmah se izdvajaju mjehurići kisika, tečnost se zapjeni i pjena puni epruvetu. Peroksidaze Peroksidaze kataliziraju oksidacije fenola i polifenola vodikperoksidom ili organskim peroksidima. Prenose nascentni kisik iz peroksida na primaoca, koji se oksidira. Peroksidazna aktivnost hemoglobina Hemoglobin i citohromi imaju izraženu peroksidaznu aktivnost, što se može potvrditi reakcijom sa benzidinom i H2O2. Postupak: Rastvoriti malo benzidina (ima ulogu primaoca aktivnog-nascentnog kisika) u 3-4 ml 25% sirćetne kiseline. Promućkati, pa dodati 1 ml razblaženog vodikperoksida i jednu kap razblažene, defibrirane krvi. Rastvor postaje vrlo plav ( u prisustvu tragova krvi), jer se benzidin oksidiše i prelazi u plavo, odnosno tamno-zeleno obojene oksidacione derivate. Peroksidaza krompira Postupak: Ponoviti postupak sa benzidinom, ali umjesto krvi uzeti 1mL vodenog ekstrakta krompira. Utvrditi da benzedin prelazi u oksidacioni produkt plave boje. Peroksidaze hrena Postupak: Napraviti ekstrakt hrena u vodi (nastrugati korjen hrena u 5-10 ml vode), pa ga poslije 60 minuta stajanja filtrirati. Filtrat sadrži peroksidazu. U dvije numerisane epruvete uzeti po 20 kapi 2% pirogalola u vodi, pa zatim: - epruvetu 1 staviti 20 kapi ekstrakta hrena i 2 kapi vode - u peruvetu 2 staviti 20 kapi ekstrakta hrema i 2 kapi 1 % rastvora vodikperoksida Ekstrakt hrema sadrži peroksidazu, koja u drugoj epruveti koristeći dodani vodikperoksid, prevodi pilogalol u purpurgalin. Purpurgalin je nerastvorljiv i izdvaja se kao talog crvene boje. 3. ZADACI I VJEŽBE 1. Koji enzim pokazuje apsolutnu specifičnost prema supstratu: a) Himotripsin b) Papain c) Ureaza d) Arginaza e) Lizozom 43

2. Koji od proteolitičkih enzima pokazuje esteraznu aktivnost: a) Tripsin b) Karboksipeptidaza c) Aminopeptidaza d) Himotripsin e) Pepsin 3. Na kojoj temperaturi se enzimi denaturiraju: a) 0 C b) 80-100 C c) 20-30 C d) 30-40 C 4. Koja je temperatura optimalna za djelovanje većine enzima: a) 50-60 C b) 15-20 C c) 80-100 C d) 35-40 C 5. Koji optimum ph ima enzim pepsin: a) 1,5-2,5 b) 4-5 c) 6-7 d) 8-9 e) 10-11 6. Kinetika enzima je riješena preko Michael-Mentenove konstante. Napisati jednačinu i prikazati je grafički? 44

4. REZULTATI Specifičnost enzima Specifičnost amilaze Rezultat Fehling-ova proba Komentar Rezultat Fehling-ova proba Komentar Epruveta I Epruveta II Specifičnost saharaze Epruveta I Epruveta II Dokazivanje aktivnosti i termolabilnosti ptijalina (α-amilaze iz pljuvačke) Broj epruvete Rezultat Fehling-ova proba Komentar Optimalni ph djelovanja amilaze Broj epruvete Rezultat Komentar 45

Inhibitorsko djelovanje hlorida na dehidrogenazu Broj epruvete Rezultat Komentar Ureaza Broj epruvete Rezultat Komentar Praćenje aktivnosti pepsina Broj epruvete Biuret proba Komentar 46

Dehidrogenaza mlijeka Broj epruvete Rezultat Komentar Tirozinoksidaza krompira Broj epruvete Rezultat Komentar Katalaza Broj epruvete Rezultat Komentar 47

Peroksidaze Peroksidna aktivnost hemoglobina Peroksidna aktivnost krompira Peroksidna aktivnost hrena Broj epruvete Rezultat Komentar OVJERA VJEŽBE: 48

Vježba broj 7 ODREĐIVANJE AKTIVNOSTI ENZIMA: α-amilaze I KATALAZE 1. TEORETSKI DIO Postoji niz metoda za određivanje aktivnosti amilaze. Prema njihovom principu mogu se podijeliti na slijedeće grupe: o Viskozimetrijske metode (zasnivaju se na smanjenju viskoznosti rastvora škroba zbog hidrolitičkog djelovanja amilaze); o Saharogene metode, zasnivaju se na određivanju reduktivnih spojeva koji nastaju hidrolizom škroba. Ove metode nisu precizne; o Hromogene metode, koriste se u proteklih 20-tak godina, a zasnivaju se na djelovanju amilaze na škrob ili amilozu ili amilopektin koji su kovalentno vezani (eterski ili esterski) za neku boju koja je derivat trijazina, koja se oslobađa pri hidrolizi škroba (amiloze ili amilopektina), centrifugiranjem odvaja i mjeri fotometrijski; o Nefelometrijske metode, zasnivaju se na smanjenju zamućenosti reakcione smjese škroba i ispitivanog materijala (urin, plazma, pljuvačka) nakon hidrolize škroba; o Spektrofotometrijske i fluorimetrijske enzimske metode u kojima se prati oksidoredukcija nikotinamidadenin dinukleotida (NAD-a); o Fotometrijske metode sa sintetskim supstratima čiji se razgradni produkti mogu mjeriti fotometrijski, kontinuirano. Takvi su supstrati razni: p-nitrofenilni i Cl-p-nitrofenilni maltozidi (u obliku testova). To su najnovije i dosta precizne metode. Zamjenjuju klasične metode zbog toga, što hidrolizom škroba pod djelovanjem amilaze nastaju produkti koji nisu tačno definirani u datom momentu (amilo-, eritro-, ahromodekstrini); o Amiloklasične metode-zasnivaju se na svojstvu škroba ili amiloze da sa jodom daju plavi produkt (amilopektin sa jodom daje ljubičastu boju). Djelovanjem amilaze na škrob nastaju prvo amilodekstrini (sa jodom daju plavoljubičastu boju), zatim eritrodekstrini (sa jodom daju crvenu boju), ahromodekstrini (ahrodekstrini) sa jodom se ne boje U grupu amiloklasičnih metoda ubraja se i metoda određivanja amilaze po Wohlgemuth-u. Prva metoda za određivanje aktivnosti amilaze koja se zasniva na tome koje razrijeđenje uzorka još razgrađuje škrob, pa se dodatkom joda (Lugolovog rastvora) ne javlja plava boja. Metodu je uveo Wohlgemuth kao prvu metodu određivanja enzima u dijagnostičke svrhe. Najveću dijagnostičku vrijednost metoda je pokazala kod oboljenja pankreasa i parotitisa. Tako α-amilaza iz pljuvačke (ptijalin) ima povećanu aktivnost u pljuvačci, serumu i urinu kod akutnog parotitisa (zaušnjaka) ili kod čira (ulcusa) na želucu. Amilaza iz pankreasa (dijastaza) ima povećanu aktivnost u serumu i urinu kod akutne nekroze pankreasa u početnom stadiju, akutnog pankreatitisa. Značajno povišenje aktivnosti dijastaze u urinu javlja se kod upala žučne kese, uremije, perforacije čira na želucu, postoperativnih stanja. Katalaza je široko rasprostanjen enzim i sreće se kod prokariaota i eukariota. Predstavlja dio antioksidativne zaštite organizma. Katalaza razlaže toksični vodikperoksid na molekul kisika i vodu. Katalaza je tetramer sastavljen od četiri polipeptidna lanca, svaki sadrži preko 500 aminokiselina. Sadrži četiri porfirinska hema, grupe koje omogućavaju enzimu da reaguje sa vodikperoksidom. 49

Zastupljen je gotovo kod svih organizama, počev od mikroorganizama (aerobnih i anaerobnih), biljaka, životinja do čovjeka. Kod čovjeka je široko zastupljenja posebno u ćelijama jetre u peroksizomima i crvenim krvnim zrncima. Optimalni ph za ljudsku katalazu je oko 7, dok kod ostalih organizama, u zavisnosti od vrste ph se kreće između 4-11. Ljudska katalaza djeluje na 37 C, dok kod nekih jednoćelijskih organizama optimalna temperatura djelovanja je 90 C. Osnovna uloga ovog enzima je razgradnja vodikperoksida. Katalaza je veoma aktivan enzim, jedna molekula katalaze konvertuje million molekula vodikperoksida u vodu i kisik svake sekunde. Katalaza može katalizirati i oksidaciju, pomoću vodikperoksida, različitih metabolita i toksina, kao što su formaldehid, mravlja kiselina, fenoli, acetilaldehid i alkoholi. Dešava se slijedeća reakcija, čiji mehanizam je i dalje nepoznat. H2O2 + H2R 2H 2O + R Joni teških metala (kao što su bakarni joni) mogu da se ponašaju kao nekompeticijski inhibitori katalaze. Otrovi, kao što su cijanidi su kompeticijski inhibitori katalaze, snažno se vezuju za hem katalaze i zaustavljaju enzimsku reakciju. Kod čovjeka i drugi enzimi mogu da razgrade vodikperoksid. Glutationperoksidaza je u fiziološkim uslovima (mala koncentracija vodikperoksida) je čak aktivnija od katalaze. Kada koncentracija vodikperoksida poraste uključuje se katalaza. Katalaza test je jedan od tri glavna testa koji se koristi u mikrobiologiji za identifikaciju bakterija. Prisustvo enzima katalaze se detektuje upotrebom vodikperoksida. Bakterije koje su katalaza-pozitivne dodavanjem vodikperoksida oslobađaju kisik. 50