Univerza v Ljubljani Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo Univerzitetni študijski program Kemija Izbirni sklop analizna in anorganska kemija Avtomatizirana analiza Seminar 2011 Predavatelj: prof. dr. Boris Pihlar Seminarska naloga je izdelana v okviru študijskih obvez dodiplomskega izbirnega predmeta Avtomatizirana analiza (30-0641). Delo ni lektorirano ali vsebinsko korigirano s strani predavatelja ali drugih univerzitetnih inštitucij. Avtor in inštitucija ne jamčita za pravilnost podatkov in navedb ter ne izključujeta možnosti, da so v objavljenem gradivu napake ali druge nepravilnosti. Gradivo predstavljeno v tem delu je avtorska lastnina, oziroma last navedenih virov, iz katerih je bilo povzeto.
Univerza Ljubljana Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo AMPEROMETRIČNI SENZOR ZA DOLOČANJE CIANIDA, KI IZKORIŠČA CIANIDAZO IN FORMAT DEHIDROGENAZO Seminarska naloga pri predmetu Avtomatizirana analiza Laura Učakar Mentor: prof.dr. Boris Pihlar Ljubljana, 23. maj 2011
Kazalo 1. LASTNOSTI CIANIDOV... 3 2. PREDSTAVITEV ČLANKA... 4 2.1. NAMEN... 4 2.2. PREDSTAVITEV... 4 2.3. POSKUS... 4 2.4.1. Aparatura... 4 2.4.2. Priprava vzorca... 5 2.4.3. Referenčna metoda... 5 2.5. REZULTATI... 5 3. ZAKLJUČEK... 7 4. VIRI... 8 2
1. LASTNOSTI CIANIDOV Cianid je kemična spojina,ki vsebuje CN (ciano) skupino. Cianid je zelo strupeno sredstvo in je lahko pripravljen umetno ali pa ga najdemo v naravni obliki. Veliko se uporablja v industriji (plastična, fotografska, kovinske prevleke) in v rudarstvu, kjer se uporablja predvsem za pridobivanje zlata in srebra. V medicini so ga med prvo svetovno vojno uporabljali na Japonskem za zdravljenje gobavosti in tuberkuloze, danes se uporablja za merjenje ketonskih telesc v urinu in v nujnih primerih se uporablja za zmanjšanje krvnega tlaka.[3] Sporno področje uporabe cianida pa je ribolov zlasti v jugovzhodni Aziji, kjer se uporablja s ciljem omamljanja rib. Te ribe nato prodajo kot žive ribe v restavracijah in trgovinah z domačimi živalmi. Takšna praksa je nezakonita v večini držav in predstavlja resno grožnjo koralnim grebenom.[1] V zvezi z omejitvijo cianida v pitni vodi Svetovna zdravstvena organizacija (WHO) predpisuje vrednost 0,07mg/l (2,7µM). Ameriška agencija za varovanje okolja (US EPA), ki določa najvišjo stopnjo onesnažil, pa je za prosti cianid določila koncentracijo 0,2mg/l (7,68µM).[1] Mehanizem toksičnosti temelji na zaviranju celičnega dihanja. Citokrom c oksidaza ali kompleks IV je velik transmembranski protein, ki se nahaja v fosfolipidnem dvosloju notranje membrane mitohondrijev in je zadnji protein v dihalni verigi. Kompleks IV prejme po en elektron od vsake molekule citokroma c in jih prenese na eno molekulo kisika, kar spremeni molekularni kisik v dve molekuli vode. V procesu so hkrati premeščeni štirje protoni. V primeru, da se cianid veže na Fe 3+, preprečuje transport elektronov iz citokroma c na kisik. Celica ne more več proizvajati ATP in tkiva, ki so močno odvisna od aerobnega dihanja so še posebej prizadeta (centralni živčni sistem, srce).[2] Cianide proizvajajo nekatere bakterije, glive in alge in jih najdemo v številnih rastlinah. V majhnih količinah se nahajajo v nekaterih semenih, na primer v jabolku, mangu, breskvi in grenkih mandljih. V rastlini so Slika 1: Kompleks IV ali citokrom c oksidaza [7] cianidi večinoma vezani na molekule sladkorja v obliki cianogen glikozida (GCs). Te rastline vsebujejo tudi encime, ki katalizirajo deglikolizacijo in cepitev cianidov. Ti encimi in GCs so shranjenih v različnih delih celice in pridejo v stik, ko se celica zdrobi. To se zgodi, ko živali pojedo te rastline in se zastrupijo. Za rastline torej služi cianid kot obramba pred rastlinojedci. Cianid najdemo tudi v kasavah (tapioka), ki je glavni vir ogljikovodikov za revno prebivalstvo v regijah Južne Amerike, Azije in Afrike.[1] Obdelovanje kasave je zelo preprosto, prav tako njeno shranjevanje. Ne zahteva posebnih razmer in posebne nege in kmetje lahko gomoljasto odebeljen korenine izkopljejo že po šestih mesecih ali šele po treh letih. Zato jo radi gojijo tudi med vojnami ali po naravnih katastrofah.[4] Ob pravilni pripravi hrane, je cianid iz rastline odstranjen, vendar obstajajo poročila o zastrupitvi pri ljudeh zaradi neustrezno predelane in pripravljene kasave.[1] Slika 2: nasad kasave [5] Slika 3: gomolj kasave [6] 3
2. PREDSTAVITEV ČLANKA 2.1. NAMEN Predstaviti nov senzor za določanje cianida v bioloških vzorcih, glavni cilj so bile cianogene rastline. 2.2. PREDSTAVITEV V preteklosti so bile razvite številne metode za določanje in kvantifikacijo cianida in vodikovega cianida v tekoči in plinasti fazi. Novejše raziskave so osredotočene predvsem na elektrokemijo in uporabo encimov. Osnove delovanja lahko razdelimo na tri korake: I. V prvem koraku se cianid encimsko hidrolizira do amoniaka in hidrogenkarbonata s cianidazo Dokazali so že, da je detekcija možna že na tej stopnji. Količino amonijaka se lahko dokaže potenciometrično z LOD 6 µm in linearnim območjem med 20 in 300 µm. Druga možnost je, da cianid določamo z EIS načinom merjenja spremembe ph. Da bi odpravili nekatere pomanjkljivosti tega potenciometričnega pristopa (zelo občutljiv na sestavo topila), je bil v tej študiji sprejet amperometrični pristop in predlagali so nov encimski korak. II. Drugi korak je sestavljen iz oksidacije hidrogenkarbonata do ogljikovega dioksida z encimom FDH, medtem ko se NAD + pretvori v reducirano obliko NADH III. V zadnjem koraku se amperometrično določi količina proizvedene NADH. 2.3. POSKUS Vsi uporabljeni reagenti so bili analitski. 2.4.1. Aparatura Pufer, ki vsebuje 0,1 M kalijev fosfat in 0,1 M kalijev klorid služi kot nosilni pufer (ph 7). Ta pufer je bil uporabljen tudi za pripravo raztopin NAD + različnih koncentracij. Raztopini sta transportirani s peristaltično črpalko. Hitrost pretoka je za pufer približno 0,5 ml/min, za raztopino NAD + pa 0,4ml/min. Slika 2: Shema aparature Za povezavo komponent so uporabili teflonske cevi TFE z notranjim premerom 0,8 mm in dolžine 20 cm. Injekcijski ventil zagotavlja konstanten volumen vzorca in sicer 300 µl. Vzorec potuje mimo cianidaze, ki se primeša vzorcu, prav tako pa se vzorcu doda tudi NAD +. V mešalni koloni, ki je dolga 50 cm in je narejena iz teflona, se raztopine dobro premešajo. Po tem, ko se doda še FDH, izmerimo vzorec v tankoplastni celici (wall-jet), ki vsebuje keramični čip z elektrodami. Ta čip vsebuje tri elektrodni amperometrični sistem s Pt protielektrodo (CE), Ag/AgCl referenčno elektrodo (RE) in grafitno delovno elektrodo (WE). Celica ima prostornino približno 20µl. Uporabili so potencial 0,8 V proti Ag/AgCl referenčni elektrodi. Nastali vrhovi so bili ocenjeni z izračunom višine vrha glede na izhodišče. 4
2.4.2. Priprava vzorca Vzorci, ki vsebujejo cianid, so shranjene pri ph 12, da se prepreči nastanek HCN. Pri tem ph bi encimi trpeli zaradi denaturacije. Zato je bil vsak končni vzorec raztopine pripravljen z uporabo 3,80 ml nosilnega pufra in 200 µl surovega vzorca ali osnovnega cianida. Standardna raztopina cianida je bila pripravljena tako, da so raztopili kalijev cianid v 30 mm raztopini natrijevega hidroksida (ph 12). Če je bilo potrebno surov vzorec ali raztopino cianida razredčiti pred mešanjem z nosilnim pufrom, so uporabili 30 mm raztopino natrijevega hidroksida. Vsi rastlinskimi vzorci so bile za analizo pripravljeni z mešanico 30 ml nosilnega pufra, 1,35 µl raztopine natrijevega hidroksida (5M) in 68065 ml KCl/KOH (0,1M/30mM). Rastlinski izvleček so pripravili tako, da so en list lovorikovca (0,7-1,2 g) natančno stehtali, ga narezali na majhne koščke in drobili 2-3 minute z 250 mg morskega peska. Zdrobljen material so kvantitativno prenesli v merilno bučko s pomočjo 15 ml nosilnega pufra. Bučko so zaprli in nekajkrat skrbno premešali. Po 30 minutah so dodali 675 µl raztopine NaOH. Bučko so zaprli in zopet temeljito pretresli. Dodali so skupaj 50 ml raztopin KCl (0,1M) in KOH (30mM). To mešanico so nato filtrirali skozi frito na kateri je bil morski pesek. Ostanek so sprali z destilirano vodo. Filtrat so prenesli v 100 ml merilno bučko in dopolnili do oznake z destilirano vodo. 2.4.3. Referenčna metoda Za referenčno metodo je služila nekoliko spremenjena različica standardne metode nemškega inštituta za standardizacijo (DIN) za določevanje prostega cianida. Pri tej metodi damo vzorec v aparaturo s pretokom zraka in jo nakisamo. Nastalo HCN ujamemo v bučko, ki vsebuje raztopino alkalnega absorberja. Za določitev količine cianida v absorbirani raztopini uporabimo fotometrične metode po Kӧnigovi reakciji. 2.5. REZULTATI Optimalna koncentracija NAD + je bila določena z enako sestavo aparature kot je prikazana na Slika 4, vendar brez dela, kjer vstopa cianid. Standardni raztopini formata in NADH (obe 0,1 mm) sta bili merjeni pri različnih koncentracijah dodanega NAD +. Višine vrhov NADH standardov so bile opredeljene kot 100% pretvorbe, vrednosti višin injeciranih formatov pa so bile podane relativno. Testirali so tri raztopine NAD + koncentracij 1, 10 in 100 mm in so določili stopnjo pretvorbe 16, 22 in 45%. Zadostovala je hitrost pretvorbe 16%, zato so v nadaljnjih poskusih uporabili NAD + koncentracije 1 mm. Za preverjanje skladnosti mehanizma senzorja, so hkrati odstranili komponente iz aparature in sicer raztopino NAD +, cianidazo in FDH. Pred, med in po tej menjavi so dvakrat merili standarno raztopino 100 µm cianida. Ob odsotnosti NAD + in FDH je bazna linija padla na najnižjo raven. Pomembneje je, da ni bilo opaziti vrhov v odsotnosti NAD + ali FDH, kar dokazuje, da sta oba bistvenega pomena za delovanje senzorja. Z odsotnostjo cianidaze so nastali manjši vrhovi pri injeciranju cianida, kar pa ne bi smelo povzročati težav. Pomembna slabost je zmanjšanje odziva po večkratnem injeciranju. To je najverjetneje posledica pasivizacije elektrode zaradi neposredne oksidacije NADH. Slika 3: Senzogram, ki je bil posnet pred, med in po odstranitvi NAD +, cianidaze in FDH: a)prvotna sestava, b) odsotnost NAD + c) odsotnost FDH, d) odsotnost cianidaze 5
Nekaj cianidnih standardov med 20 in 800 µm je bilo trikrat izmerjenih z encimskim senzorjem. Pokazalo se je široko linearno območje od LOD do 800 µμ, kar je več kot tri dekade. Za določanje LOD in LOQ so bile izmerjene različne koncentracije cianida od 0 do 1,6 µμ. Višina vrha in koncentracija standarda sta pokazali jasno linearno korelacijo. Za LOD in LOQ sta bili izračunani koncentraciji, ki ustrezata povprečju slepega vrha plus 3 oz. 10- krat bazna linija šuma. Poskus so izvedli dvakrat in dobili LOD 0,66 in 0,70 µμ ter LOQ 2,27 in 2,39 µm. Opozoriti je potrebno, da se te vrednost nanašajo na koncentracijo v končnem vzorcu senzorja, ki je razredčen s faktorjem 20. Zato so ustrezne vrednosti za surov vzorec 20- krat večje. Da bi lahko določili količino cianida v pitni vodi, redčimo s faktorjem 2. Poleg tega bi bilo mogoče doseči nižje vrednosti z zamenjavo peristaltične črpalke z batno črpalko, ker imajo nižjo bazno linijo šuma. Lahko pa bi povečali tudi koncentracijo NAD + in volumen zanke z vzorcem. Za analizo navzkrižne občutljivosti so uporabili acetonitril, benzonitril, izovaleronitril, amonijev tiocianat in natrijev sulfid. Slika 7: Senzogram določanja LOD in LOQ Izmerili so tri koncentracije vsakega analita 0.1, 0.3 in 0.5 mm. Naklon regresijske črte za višino signala proti koncentraciji cianida so primerjali z naklonom za cianid. Samo tiocianat kaže ustrezen odziv. Tabela 1: občutljivost na analite podobne cianidu Analit Odziv senzorja (%) acetonitril 0,013 amonijev tiocianat 6,8 benzonitril 0,1 izovaleronitril 0,047 natrijev sulfid 0,41 Slika 6: Senzogram linearnosti Kot je bilo že opisano, je bila za referenčno metodo uporabljena metoda DIN. Analizo so naredili trikrat z 0,5 mm standardno raztopino cianida in rezultat je bil, da je povprečna stopnja pretvorbe 95,3% z relativno standardno deviacijo 2,8%. Vsebnost cianida v rastlinskih izvlečkih so določili z referenčno metodo in z encimskim senzorjem. Kot je bilo pričakovati rastlinski izvlečki vsebujejo substance, ki so elektrokemijsko aktivne pri potencalu 0,8 V. Vsak vzorec rastline je bil injeciran dvakrat. Pred drugim injeciranjem je bila raztopina NAD + zamenjana s čistim pufrom, tako da ni moralo priti do pretvorbe NAD + v NADH. Ta vrh, ki smo ga dobili pri drugem injeciranju, vsebuje le tisti del prvega vrha, ki ne vsebuje cianida. Tako so odšteli višino drugega vrha od prvega in dobili višino, ki pripada le cianidu. Primerjava rezultatov analize z encimskim senzorjem in z DIN metodo pokaže splošno dobro korelacijo med meritvama, z izjemo ene meritve, ki ima standardno deviacijo -18,2 %. Točnost 6
senzorja so testirali s tremi zaporednimi injeciranji istega vzorca in dobili so dokaj dobro ponovljivost z relativno standardno deviacijo 1,7 % s pritokom NAD + in 3,7 % brez pritoka NAD +. Tabela 2: Rezultati analize resničnih vzorcev in primerjava z DIN metodo Št. vzorca Koncentracija cianida (µm) Deviacija DIN metoda Encimski senzor (%) 1 1015,4 1078,6 +6,2 2 993,5 813,1-18,2 3 880,2 858,8-2,4 Slika 8: Senzogram analize pravega vzorca: a)standardna razt. cinida, b) razredčen rastlinski ekstrakt, c) referenčna metoda, d)103,3µm standardna razt. cianida, e)nad + raztopina zamenjana s pufrom Skozi analizo se opazi izguba občutljivosti pri večjem številu analiz. Standard, ki je bil injeciran na koncu analize je pokazal le 91 % višine vrha, ki je pripadal standardu injeciranemu na začetku analize. Kljub podobnim količinam izgube občutljivosti, pa to zmanjšanje ni ponovljivo. 3. ZAKLJUČEK Predstavljen je bil amperometrični encimski senzor za določanje cianida. Z LOD 0,7 µm lahko senzor zazna majhne koncentracije cianida v istem obsegu kot oba prejšnja senzorja, ki izkoriščata cianidazo in večina drugih metod za določanje cianida. Sulfid, ki predstavlja problem za potenciometrične metode, ki uporabljajo srebrovo elektrodo, ne moti. Za razliko od večine drugih senzorjev, bi ta senzor lahko uporabili za določanje cianida v zahtevnejših materialih, kot so rastlinski izvlečki, s čimer je izpolnjen namen. S senzorjem bi lahko opravili tudi analizo vode, saj je LOQ 2,7µM, kar je nižje od EPA MCL, ki je 7,68 µm. To bi bilo potrebno preizkusiti še v nadaljnjih raziskavah. Pričakovano je, da bo senzor zaznal je prosti cianid, da pa bi analizirali kompleksno vezan cianid, bi bilo potrebno vzorec še nadaljnje obdelati. Široko linearno območje se razteza od LOD do 800 µm, vendar se opazovani signal zmanjša tekom števila analiz, kar lahko prepreči uspešno določanje v primeru večjega števila vzorcev. Nadaljnje raziskave bo treba posvetiti odkrivanju zakaj pride do tega zmanjšanja. Po vsej verjetnosti gre to predpisati pasivizaciji elektrode kot posledica neposrednega določanja NADH. Do pomembnih podatkov bi lahko prišli, če bi pojasnili pojave opažene pri čiščenju elektrode. Poleg izboljšav senzorja, pa bodo v prihodnosti poskušali predstaviti elektrokemični biosenzor, ki bo primeren za terenske meritve. 7
4. VIRI [1]: Analytica Chimica Acta 2010,673,54-59:Amperometric sensor for cyanide utilizing cyanidase and formate dehydrogenase, LOTHAR KETTERER, MICHAEL KEUSGEN [2]: http://sl.wikipedia.org/wiki/dihalna_veriga [3]: http://en.wikipedia.org/wiki/cyanide [4]: http://www.om-govinda-damodar.com/shop/web_pages/tapioca.php [5]: http://www.itswild.org/n0408/cassava-food-reserve [6]: http://www.learnnc.org/lp/multimedia/6985 [7]: http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbase/biology/etrans.html 8