Биолошки макромолекули II

Transcript

1 Биолошки макромолекули II Структура биолошких макромолекула може се приказати моделом којим се описује сложени систем са особином хијерархијске организације. Биомакромолекули (као сложени системи), су полимери састављени из мноштва различитих подсистема - градивних јединица, поређаних у специфичан редослед који одређује тзв. примарну структуру. Од тог редоследа зависе сви виши нивои структура: секундарна, терцијерна и кватернарна, односно, зависе сви типови просторне организације - конформације макромолекула. Од тродимензионалне структуре, тј. од облика биомолекула зависи његова функција од које, надаље, зависе све међумолекуларне интеракције, које су од пресудног значаја за одржавање виталних функција целокупног организма. Један од главних задатака биофизике је испитивање и моделовање структуре биолошких макромолекула коришћењем параметара добијених на основу физичких мерења. Примарна и секундарна структура нуклеинских киселина Молекули ДНК могу се замислити као ланци у којима је свака карика један нуклеотид, с тим, што се молекули ДНК састоје од два ланца, док су молекули РНК једноланчани. Нуклеотиди су међусобно везани ковалентним везама између фосфатне групе једног и пентозе (шећера) наредног нуклеотида у низу, одређеним редоследом, који чини примарну структуру полинуклеотида. Фосфатне групе и пентозе чине окосницу полинуклеотидног ланца. На једном крају ланца налази се слободна фосфатна група везана за 5' ланца. На другом крају налази се слободна ОН група везан 3' С атом пентозе, и тај крај се назива 3' крај ланца. Слика 2. Примарна структура ДНК и РНК. Секундарна структура нуклеинских киселина (ДНК и РНК) формира се захваљујући водоничним везама које се успостављају између комплементарних база аденина и тимина A = T и гуанина и цитозина G ª C. Нуклеинске киселине могу формирати различите типове секундарне структуре. Неке од њих налазе се у природним полинуклеотидним ланцима и то су линеарне структуре, разгранате структуре и прстенасте структуре које могу градити различите мотиве у оквиру секундарне структуре (слика 2А) а друге се могу добити вештачком синтезом (слика 2В). 1

2 страни. Ход завојнице има дужину од 3.6 nm и садржи 10.5 нуклеотида. Пошто је пречник завојнице исти целом дужином закључено је да се наспрам пуринске (велике) базе у једном ланцу налази пиримидинска (мала) база у другом. Слика 2. Типови структура које образују ланци нуклеинских киселина, спирализовани делови су шрафирани (водоничне везе); (А) структуре које се налазе у природнимуклеинским киселинама;(в ) вештачки синтетисане структуре. Секундарна структура ДНК Секундарну структуру ДНК чине два ланца антипаралелне оријентације која су повезана комплементарним базним паровима: A = T, G ª C. Просторна конформација ДНК је дволанчана завојница, која може бити десно или лево оријентисана и могуће је да се, у највећем броју случајева, јави у А, В или Z форми (као на слици). В форма има 10.5 базних парова унутар једног завоја. Растојање између два базна пара је 0.36 nm. А ДНК форма је компактнија и има 11 базних парова по завојници и велики нагиб базних парова у односу на осу хеликса. Z ДНК форма је лево оријентисан дупли хеликс и има 12 базних парова. Основу секундарне структуре ДНК по Вотсону и Крику чини десногира дволанчана завојница (слика 2). Два полинуклеотидна ланца су антипаралелна што значи да се наспрам 5' једног ланца налази 3' крај другог. Ланци су увијени 1 око другог, тако да се дуж дволанчане завојнице простиру два спирално увијена жљеба од којих 1 има већу дубину и ширину (велики жљеб) од другог (мали жљеб). Пречник дволанчане завојнице једнак је целом дужином и износи 2 nm. Пуринске и пиримидинск базе налазе се у унутрашњости завојнице густо спаковане над другом због хидрофобних интеракција, а равни база су нормалне на осу завојнице. Окосницу завојнице чине фосфатне групе и пентозе (шећери), које су окренуте према спољашњој Слика 2. (а )Дупли хеликс; (б) Антипаралелна оријентација хеликса. Иако је В завојница најстабилнији и најзаступљенији облик секундарне структуре ДНК, у појединим деловима хромозома ДНК формирају десногире завојнице које се по оријентацији и збијености база разликују од В завојница (А - завојница). Неки региони, који садрже карактеристичне редоследе нуклеотида, као што су на пр. наизменично везани C и G нуклеотиди формирају сасвим различиту левогиру завојницу означену као Z ДНК. Постоји полиморфизам секундарних структура унутар фамилија А и В завојнице. Међутим, треба напоменути да сви облици секундарне структуре ДНК задржавају основне особине комплементарност и антипаралелност два ланца који граде дволанчану завојницу. Секундарна структура ДНК није статична и крута, већ је динамична и флексибилана и може се мењати у зависности од услова као што су концентрација соли и алкохола и температуре. Такође зависи од базног састава и редоследа нуклеотида у полинуклеотидним ланцима. 2

3 Денатурација ДНК Зависност тачке топљења ДНК од базног састава Молекул ДНК који има више G ª C парова теже се топи него онај који има A = T због тога што су G и C везани са 3 а A и T са две везе. Ако се тачке топљења ДНК изолованих из различитих врста прикажу у зависности од процентуалног садржаја парова G ª C, добија се права линија, која се може приказати једначином: T t = T t(at) + k (% G ª C) = (% G ª C). Хибридизација нуклеинских киселина Слика 3. Крива топљења ДНК. Под одређеним условима (повишена температура, промена рн) долази до нарушавања секундарне структуре ДНК (кидања Н веза), односно, до денатурације макромолекула. Приликом денатурације раздвајају се дволанчани молекули ДНК на једноланчане полинуклеотидне ланце. Сваки од њих прелази у клупчасти, случајно испресавијани облик без уређене секундарне структуре. Под одређеним условима може доћи до ренатурације тј. до поновног спајања ланаца ДНК. Уређена дволанчана завојница ДНК испољава хипохроморни ефекат: апсорбује мање светлости таласне дужине 260 nm него једноланчани полимер а овај још мање него слободни нуклеотиди у раствору (за исту количину нуклеотида). У току денатурације долази до пораста А260 хиперхромни ефекат, због стварања једноланчаних полимера ДНК. Температура на којој је пораст А260 једнак половини максималног пораста криве топљења ( на слици 3) назива се тачка топљења и представља мерило стабилности ланца ДНК. Тачка топљења дволанчане завојнице ДНК зависи од: базног састава, распореда нуклеотида у ланцу, процента исправно спарених база и дужина ланаца. Такође, зависи и од карактеристика раствора у коме се ДНК налази: јонске јачине, рн поларности растварача и температуре. Једноланчани полинуклеотиди који имају комплементарне редоследе нуклеотида, у раствору ће наградити хибридне дволанчане молекуле и тај процес се назива хибридизација. Денатурисан ДНК (једноланчани полинуклеотиди ) може да хибридизује са денатурисаном ДНК исте или различите врсте или са РНК. Количина хибрида која се награди између два полинуклеотидна ланца, односно ефикасност хибридизације, одлична је мера за комплементарност редоследа нуклеотида у молекулима који хибридизују. Хибридизација је нашла веома широку примену, коришћена је за индентификовање различитих врста РНК, дала драгоцене податке огенима који учествују у синтези различитих РНК. Она је дала и низ информација важних за еволуцију, за испитивање транскрипционе активности појединих делова генома итд. Данас се хибридизација широко користи у генетичком инжењерству и биомедицини. Терцијерна структура ДНК Интензивним испитивањима структуре хроматина, тј. начина паковања ДНК у хромозом добијене су прве електронске микрографије на којима се могла видети под микроскопом нит дебљине око 30 nm. Хроматин обрађен неким ензимима изгледао је као танка нит на коју су нанизане перле. Танка нит била је ДНК, док су перле представљале комплексе ДНК са спефичним протеинима - хистонима и назване су нуклеозоми. Појединачни нуклеозоми изоловани 3

4 су и испитавани. Електронским микроскопом су виђени као дискови дијаметра 11 nm од којих сваки садржи ДНК дужине 146 базних парова и 8 молекула хистона. Хистонски октамер формира језгро око кога је дволанчана ДНК намотана као левогира суперзавојница која окружује језгро 1.8 пута. Дужина између нуклеозома дволанчане ДНК варира око 60 базних парова. Нуклеозом, према томе, садржи око 200 базних парова и предтављају структурну јединицу хроматина која се понавља. Степен компактности који се постиже паковањем ДНК у нуклеозоме још увек није задовољавајући. Овако испресавијана ДНК једног хромозома била би још увек превише дугачка да би се могла сместити у једра. То говори о постојању додатних нивоа структурне организације хроматина. Претпоставља се да она изгледа као серија густо спакованих петљи које су још једном спирализоване. Овај ниво суперспирализације објашњава се на различите начине а може се показати моделима који су дати на слици 4. секундарну структуру преко водоничних веза комплементарних база. Конформација секундарне структуре молекула зависи од примарне структуре РНК. Примарна и секундарна структура веома су добро проучене на примеру транспортне РНК трнк. Примарна и секундарна структура трнк Транспортне РНК садрже нуклеотида. Констатовано је да се на неким местима у % случајева налази одређена база у примарној структури трнк. Те позиције означене су као непроменљиве. Нађено је, такође, да се на неким положајима, који су означени као полупроменљиви, увек налази пурински, односно пиримидински нуклеотид. Транспортне РНК, за разлику од осталих РНК, садрже у примарној структури необичне, односно, модификоване базе. Оне настају модификовањем уобичајених база (A, G, U, C) после уграђивања у полинуклеотидни ланац. Сматра се да ове промене у примарној структури обезбеђују структуну разноликост трнк и могу бити важне за њихове функције. Присуство неких модификованих база на одређеним позицијама у ланцу трнк је непроменљива карактеристика њихове примарне структуре (на пр. код свих трнк на одређеном месту се налази ТYС, Y - псеудоуридин, ана 3' крају антикодона модификовани пурин ). Неке модификоване базе карактеристичне су само за неке трнк ил поједине изоакцепторске групе. Секундарна структура трнк може се приказати моделом тролисне детелине. Четири крака сегмента молекула имају облик дволанчане А завојнице. Молекул садржи 4 крака, а у оквиру 3 од њих по 1 дволанчани сегмент (''дршку'') и једноланчану петљу. Слика 4. РНК, примарна и секундарна структура Примарна структура РНК је редослед рибонуклеотида у полинуклеотидном ланцу. РНК је једноланчани полимер који остварује Секундарна структура трнк садржи следеће карактеристичне мотиве: 1) акцепторски крак - једини крак који не садржи петљу ; на 3' крају ланца сваке трнк налази се ССА триплет за који се везује аминокиселина; 2) Т крак или ТYС крак садржи спирализовани део од 5 базних парова и петљу од 7 нуклеотида, међу којима се налази триплет ТYС, по којем је овај крак добио 4

5 име; 3) антикодонски крак садржи ''дршку'' од 5 парова нуклеотида и петљу од 7 нуклеотида у чијој се средини налази антикодон, тј. триплет нуклеотида комплементаран кодону у ирнк; 4) Д крак (или дихидроуридински крак) садржи дволанчани сегмент (3 4 базна пара) и петљу од 8 12 нуклеотида, међу којима се налази дихидроуридин по којем је клрак добио име. Модификоване базе су увек присутне на истом месту у примарној структури трнк. Дужина трнк варира (од 74 до 95 нуклеотида), а варијације потичу од дужине Д петље и тзв. променљиве петље. полупроменљивих база, што значи да је облик молекула заједнички за све трнк (највећи број терцијерних Н веза формира се у пределу ТYС и Д петље). Слика 6. Нивои организације протеинске структуре Слика 5. Терцијерна структура трнк Терцијерна структура трнк има облик слова L. Спирализовани делови распоређени су тако да формирају две завојнице које стоје под правим углом (акцепторски и ТYС формирају једну а антикодонски и Д крак другу). Различите трнк разликују се по величини угла између два крака слова L (и још неким детаљима терцијерне структуре). Терцијерну структуру одржавају Н везе између база којенису спарене у секундарној структури. Терцијерне Н везе углавном се формирају између непроменљивих и Протеини су неразгранати једноланчани молекули састављени из аминокиселина. Постоје 4 нивоа структуре у оквиру организације молкеула: примарна, секундарна, терцијерна и кватернарна. Сваки ниво организације одржава се помоћу карактеристичних типова веза унутар структуре. У оквиру примарне структуре, аминокиселина су везане у секвенцу ковалентним пептидним везама. Секундарна структура протеина представља савијање полимера са карактеристичним мотивима који се јављају унутар конформације молекула. Типични примери су алфа хеликс, бета плоча, неуређена структура. Секундарна структура се успоставља и одржава помоћу унутармолекуларних водоничних веза. Тродимензионално савијање једног пептидног ланца (терцијерна структура) остварује се посредством више типова унутармолекуларних веза, и то су: дисулфидне везе, водоничне везе, јонске везе, Ван дер Валсове интеракције, хидрофобне интеракције. Асоцијацијом 2 или више полипептида са формираном терцијерном структуром стварају се протеински ансамбли што чини тзв. кватернарну структуру протеина. Овакви ансамбли обезбеђују 5

6 функцију протеина. Хемијске и унутармолекуларне везе које учествују у формирању кватернарне структуре, исте су као везе које учествују у формирању терцијерне структуре. Постоји хијерархијска организација и повезаност структуре и функције протеинских молекула и она се шематски може описати као што је приказано на слици. БИОФИЗИКА Слика 8. Секундарна структура протеина Слика 7. Молекуларне структуре протеина и њихове функције. Примарна структура протеина Протеини су састављени из аминокиселина. Редослед аминокиселина представља његову примарну структуру. У састав протеина улази само 20 аминокиселина од укупно 2000, колико се налази у природи. Основне јединице грађе протеина су L изомери аминокиселина. У полипептидном ланцу сау аминокиселине еђусобно повезане пептидним везама (ковалентна хемијска веза), које се граде између СООН једне аминокиселине и NH 2 групе наредне аминокиселине у низу, тако да полипептидни ланац има једну слободну аминогрупу на једном крају ланца а СООН групу на другом крају полипептидног низа (N и С терминус). Формирање пептидне везе остварује се реакцијом кондензације (ослобађа се молекул воде) уз утрошак енергије која се добија разлагањем АТП. Аминокиселине се међусобно разликују по R аминокиселинском остатку. Могу бити, у зависности од хемијске структуре, R, поларне, неполарне, алифатичне, ароматичне, велике и мале. Од примарне структуре протеина зависе и све остале структуре: секундарна, терцијерна и кватернарна, а сходно томе, и њихова функција. Линерни полипептидни ланац савија се градећи локалне структуре у облику различитих карактеристичних мотива, као што су алфа хеликс, пи хеликс, бета плоча, бета заокрет, гама заокрет и све ове структуре остварују се преко водоничних веза које се могу успоставити у линеарном ланцу аминокиселина, као што је приказано на слици: Слика 9. 6

7 карактеристичним комбинацијама мотива секундарне структуре. Постоје и фибриларни протеини, као што су колаген, алфа кератин на пр. који имају специфичности у секундарној структури. Фибриларни протеини имају углавном структурну функцију. (а) (б) (ц) Слика 10. Секундарна структура протеина, алфа хеликс и бета плоча. Алфа хелијачна структура протеина остварује се тако што је сваки заокрет хеликса стабилизован водоничним везама између карбонилне групе једне аминокиселине и иминогрупе друге. Водоничне везе су паралелне оси завојнице и стоје једна испод друге (Слика 10). У секундарној структури бета плоче окоснице протеина леже на појединачним равнима док R аминокиселински остаци штрче изнад или испод равни. Водоничне везе се граде између карбонилне и иминогрупе пептидних веза у наспрамним сегментима полипептида. Слика 11. Протеини са различитом терцијерном структуром. (а) претежно алфа хелијачна структура, протеин омотача вируса дувана (tobacco mosaic); (б) претежно структура бета плоче, протеин имуноглобулин V 2 домен; (ц) комбинована алфа хеликс и бета плочаа структура, протеин хексокиназа. Кватернарна структура протеина настаје удруживањем две или више субјединица протеина, при чему се остварује структурна организација која обезбеђује функцију. Структурни мотиви могу се међусобно комбиновати формирајући уобичајене сегменте - јединице секундарне структуре, и то су, на пример: 1) бета алфа бета; 2) бета петља - бета ; 3) хеликс заокрет хеликс. Терцијерна и кватернарна структура протеина Терцијерна структура протеина је савијање полипептидног ланца до финалне тродимензионалне форме. Та форма представља једну субјединицу, односно, један полипептидни ланац или мономер. У оквиру глобалног облика мономера (на пр. глобуларна форма) налазе се карактеристични делови домени (преко којих се често одвија функција протеина). У оквиру глобуларних протеина запажају се домени са Слика 12. Структура интегрина Интегрини су трансмембрански протеини. То су рецептори који се својим једним делом молекула налазе на површини ћелијске мембране, а другим делом са унутрашње стране мембране. Део који се налази на спољној површини мембране везује 7

8 конституенте екстрацелуларног матрикса. Мада остварују мноштво функција, ова велика фамилија трансмембранских протеина добила је име интегрини због њихове улоге у интеграцији цитоскелета (актин) са екстрацелуларним матриксом. Преко интегрина компоненте екстрацелуларног матрикса као што су колаген и други протеини (фибронектин и ламинин) везују се за ћелију и тиме утичу на њену структуру и функцију. Интегрини се састоје из алфа и бета субјединица, које су међусобно нековалентно повезане. На делу протеина који се налази на спољашњеој страни мембране постоје везујућа места за протеине екстрацелуларног матрикса. RGD је секвенца од 3 аминокиселине (аргинин глицин - аспарагин) која се налази унутар секвенце већине протеина екстрацелуларног матрикса. RGD препознаје ''RGD везујуће место'' на интегрину, и за њега се везује. На унутрашњој страни мембране налазе се везујућа места за специфичне протеине цитоскелета. Алфа субјединице већине интегрина састоје се из два сегмента која су повезана дисулфидним мостом (S-S веза). Интегрини нису директно везани за цитоскелет, већ индиректно, преко специфичних протеина (талин). nm а унутрашњи око 15 nm. Сваки протофиламент је полимер алфа - бета тубулинских димера (дугих око 8 nm), односно, сваки протофиламент је састављен од наизменично поређаних тубулинских субјединица. Појединачни мономери су елипсастог облика димензија 4 nm пута 5 nm. Слика 13. Структура интегрина. Супрамолекуларне структуре Супрамолекуларне структуре су структуре које настају полимеризацијом мноштва субјединица и тиме се обезбеђују разноврсне функције. Постоје многобројни примери ових великих и сложених протеинских ансамбала као што су, на пример, микротубуле и колаген. Структура микротубула Микротубуле су састављене из протеинских јединица алфа и бета тубулина. Тубулин се налази у готово свим ћелијама, односно, у свим деловима ћелије. Функције микротубула су многобројне и разноврсне: одређују облик ћелије, организацију цитоплазме, транспорт покрете и имају значајну улогу у ћејској деоби. Типична микротубула има тринаест протофиламената који формирају отворени цилиндар. Спољњи дијаметар је око 25 Слика 14. Структура микротубула. Структура колагена Скоро све ћелије стварају специфичне структуре које се налазе изван њих, односно изван плазма мембране и никада нису интегрални, структурни или функционални део ћелије. Ове екстраћелијске 8

9 структуре претежно се састоје од макромолекула. То су дугачки флексибилни фибрили (влакна) уроњени у аморфни хидратисани матрикс разгранатих молекула обично гликопротеина или полисахарида. Животињске ћелије имају екстрацелуларни марикс (ЕЦМ) који може бити различитих форми и игра важну улогу у ћелијским процесима, као што су деоба, покретљивост, диференцијација и атхезија. Међусобна атхезија ћелија према томе, одвија се преко ЕЦМ, преко различитих веза које повезују ћелије у ткиво. Поред тога, што ЕЦМ игра улогу детерминисању облика и механичких особина органа и ткива, он игра улогу у ткивној екстензији, ћелијском облику и покретљивости и развоју специјализованих ћелијских карактеристика. Слика 15. Структура колагена. Један од главних структурних који улазе у састав ЕЦМ животињских протеина је колаген. Структура колагена виђена методом SEM (сканирајућа електронска микроскопија) има изглед влакна (слика 15). Колагенско влакно садржи много фибрила које представљају свежањ колагенских молекула тропоколагена. Сваки молекул колагена је троструки хеликс. На влакну се запажају траке које се понављају и то су места где се колагенски молекули везују бочно да би формирали фибриле (слика 15). Сваки полипептидни ланац у колагену се савија у издужени полипролински тип два хеликса са 3.3 аминокиселине у оквиру једне завојнице хеликса (9.6 ангстрема). У примарној структури аминокиселинске секвенце садрже поновке кратких низова глицин х у, где је х често пролин, а у често хидроксипролин (слика 16). У колагену 3 ланца су суперспирализована око заједничке осе формирајући врпчасти молекул (3000 ангстрема). Водоничне везе између ланаца у триплхеликсу колагена фомирају се између СО група пролина и NH група глицина. У региону око аланина три полипептидна ланца садрже 4 молекула воде која су уметнута између ланаца, што доводи до феномена да се директне водоничне везе између протеинских ланаца замењују посрденим водоничним везама (слика 17). Слика 16. Примарна и секундарна структура колагена. Слика 17. Водоничне везе: 1) директне између полипептидних ланаца; 2) индиректне, преко молекула воде. 9

10 Физичке методе испитивања конформације биомакромолекула Све методе овде наведене користе зрачења у његовом корпускуларном (у смислу геометијске оптике) или таласном виду. Зато је од интереса, на овом месту, да се укратко изнесу физичке основе геометријске и таласне оптике за електромагнетне таласе. Слика 18. Рефлексија зрака, упадни угао и угао одбјања су једнаки. Основни оптички појмови У геометријској оптици основни појам је зрак. Он представља линију дуж које се ''путује'' електромагнетна енергија (или кванти - фотони). Реалнији случај од зрака је електромагнетни талас. Зрак би, у односу на талас, представљао простирање малог дела таласне површине (величине тзв. таласне дужине l таласа, к = 2 p / l таласни број ), који се слабо шири. Извор електромагнетне енергије је убрзано кретање наелектрисања. Сам електромагнетни талас представља преношење осцилација електричног и магнетног поља кроз простор. Неки од основних закона геометријске оптике су: закон одбијања (уводи појам огледала) и закон преламања (уводи појам оптички хомогене провидне средине, кроз коју се зрак простире праволинијски) зрака (или равног таласа). Индекс преламања дефинише се као однос брзине светлости у вакууму и брзине електромагнетног поремећаја у датој средини: n = c/v (c = l n, n - фреквенција осциловања електромагнетног таласа). Брзина светлости једнака је, по Мексвеловој теорији, брзини свих електромагнетних поремећаја у вакууму. Оптички нехомогена средина јесте провидно тело код које индекс преламања зависи од тачке до тачке (кретање зрака светлости је криволинијско). Добар пример такве средине је оптичко влакно. Слика 19. Рефракција равног таласа. Односи релативних индекса преламања односе се као синуси одговарајућих углова. Ако се ради о рефракцији у оптички ређу средину, као на слици, талас се прелама од нормале. Основни инструменти који раде на овим принципима су огледала, сочива, призме, микроскопи и други сложени оптички инструменти. Сви микроскопи, у принципу јасно увећавају објекте чије су димензије много веће од таласне дужине кваната помоћу којих се посматрање врши. У супротном случају долази до појаве дифракције и одступања од закона геометријске оптике. Ако се осветли неки предмет извором зрака, на заклону ће се јасно разликовати сенка од осветљеног дела. Међутим, за монохроматски (једнобојан, онај који има једну фреквенцију емитовања) таласни извор, талас са њега ће скренути у геометријску сенку предмета, заобилазећи га. Предмет мора бити димензија таласне дужине извора. На заклону, у геометријској сенци ће се детектовати низ светлих и тамних пруга. Ова појава се назива дифракција - скретање таласа у геометријску сенку. Ако више истобојних извора могу да остваре стабилну дифракцију на датим телима, називају се кохерентни извори. Дифракциона решетка је основни уређај за испитивање наведене појаве. Она представља систем паралелних прореза који имају ширину (заједно са непропусним делом) реда величине таласне 10

11 дужине и на коју упада равни монохроматски талас. На екрану ће се онда видети низ паралелних једнобојних линија. Слика 20. Дифракциона решетка. У пракси, уместо квалитативног описа ''линијама'', мери се интензитет таласа I (овде дифрактованог). Интензитет таласа представља средњу енергију која је пада у јединици времена, нормално на дату површину (јединица за интензитет је W/m 2 ). Електромагнетни талас и светлост су трансверзални таласи, вектори њихових осцилујућих електричних и магнетних поља нормални су међусобно и на смер кретања. Интензитет таласа пропорционалан је квадрату јачине електричног поља (а самим тим и магнетног, због њихове везе). линеарно поларизован. Нуклеинске киселине су оптички активне у односу на упадну равански поларизовану светлост и обрћу раван поларизације у смеру казаљке на часовнику за одређен угао - оптичка ротација (L изомери, супротно: D - изомери). Природна светлост је неполарисана има много равни поларизације. Елиптична поларизација таласа (најопштији случај) означава појаву да врх вектора јачине електричног поља осцилује у равни описујући елипсу, посматрано у смеру кретања таласа. Кретање овог врха вектора може бити у смеру казаљке на часовнику (лева елиптична поларизација L) или обратно (десна елиптична поларизација D). На то кретање суперпонира се његово кретање дуж смера простирања (добија се крива - елиптична хеликоида). Циркуларна поларизација је варијанта елиптичне поларизације када врх наведеног вектора, при истим условима, описује кружницу. Оптички метод мерења промене интензитета и углова поларизације приликом проласка светлости кроз материјал назива се полариметрија. Просторни распоред дифракционих интензитета на екрану је приказан на слици: Слика 22. Дифракциона слика са дифракционе решетке. Слика 21. Електромагнетни талас је трансверзалан. У најједноставнијем случју, на слици 11, вектор јачине електричног поља осцилује у xоy равни дуж у осе, док магнетно поље осцилује дуж z осе. Када су осцилације сваког поља у једној равни дуж једне осе, каже се да је талас равански или Диракциона решетка представља просторно познат распоред непоропусних и пропусних објеката. Другачије речено, дифракциона решетка има познат геометријски структурни фактор. Поред тога, она је теоријски добро описана. За дифракциону решетку се једнозначно утврђује однос дифракционе слике и просторног распореда њених прореза и непрозирних делова. Призма припада класи временских дисперзионих система: упадну сложену белу 11

12 светлост разлаже на боје спектар фреквенција (видети слику). И дифракциона решетка и призма могу издвојити једну таласну дужину. Зато они представљају оптичке уређаје монохроматоре. Спектрофотометар, као уређај, састоји се извора светла, монохроматора, испитиване супстанце и фотометра са уређајем који меморише податке. Често се користи за мерење апсорбанције (видети даљи текст). Слика 23. Концептуални приказ једног једноставног дисперзионог система призме. Коначно, интензитет електромагнетних таласа опада са проласком кроз неку средину услед апсорпције (енергија таласа се трансформише у топлоту) или расејања. Ако упадни талас утиче на осциловање честица у средини, које постају извори новог зрачења, ради се појави која се назива расејање таласа. Веће честице (промера око 200 nm) карактерише појава опалесценције (раствор осветљен белом светлошћу, под различитим угловима показује различиту боју) или мутноћа раствора. Мање описује теорија Рејлијевог расејања. Дебајево расејање карактеристично је за макромолекуле које имају једну изразиту димензију. Помоћу ових метода може се добити маса молекула, те окарактерисати његов облик и димензије. Просторна структура биополимера се, дакле, одређује помоћу : 1) рентгенске дифракције - Х зрака (одређује се положај атома у молекулу, односно, структура); 2) преламања, расејања и апсорпције електромагнетног зрачења (тзв. линеарани, циркуларни дихроизам; Раманововог расејања - инфрацрвеног зрачења; врши се индентификација, облик, структура и маса молекула); 3) електронске микроскопије (електрони се крећу као честице у електромагнетним пољима; врши се индентификација, димензије и облик молекула ); 4) методе луминисценције (луминсценција је накнадно светљењео полимера); 5) неутронске дифракције (одређује се положај атома водоника); 6) НМР - ом (индентификују се атоми елемената чија језгра поседују ненулти магнетни момент); 7) СТМ - ом (такође прецизно одређује просторну структуру биополимера, ради на принципу тунел ефекта) итд. Дифракција Х зрака на кристалима била је позната тридесетих година ХХ века. На основу дифракционе слике било је могуће утврдити просторни распоред атома у једноставној кристалној решетки. За опис сложенијих кристалних решетака и биополимера неопходно је разматрати разне експерименталне модификације овог метода и моделе стуктуре (уводе се компликованији геометријски структурни фактори и аналогије са другим материјалима). Тако су Вотсон и Крик 1953, уз пробе и грешке, открили секундарну структуру ДНК. Теоријском рачунањем односа између интензитета упадног зрачења и расејаног у неком правцу над различитим геометриским облицима (сфера, елипсоид, трака, штап) и њиховим комбинацијама, могуће је практично одредити просторне распореде терцијарну и кватернарну структуру неких протеина. Ова метода је основна, најпоузданија и најтачнија. Слика 24. Дифрактограм и модел ДНК Вотсона и Крика. 12

13 Циркуларни дихроизам Један од много коришћених теорија апсорпције упадне светлости или UV зрачења у биофизичким мерењима је Ламбер - Бугер Беров закон апсорпције: I = I e 0 kx. Он описију нормалан упад зрачења одређене таласне дужине l, дуж х осе, у средину, обично раствор биомолекула, која се налaзи у полупростору х > 0. I 0 = I(x=0) упадни интензитет. Апсорбанција или екстинкција раствора биомолекула дефинише се на следећи начин: I0 A = log10 = 0.4kx = 0.4ε Cx I ( λ). С је моларна концентарција биомолекула. Биополимери имају хиралну структуру немају ни центар ни раван симетрије. То значи да се њихов лик у огледалу не може просторним кретањем поклопити са самим молекулом. При проласку линеарно поларисане монохроматске светлости кроз слој биополимера дужине l, један део равни поларизације заротира за угао j. Он је у вези, по теорији, са разликом индекса преламања за лево и десно циркуларно поларисану упадну светлост (n L и n D ) за угао: π ϕ = ( n n ). l λ L D Други део наведене упадне светлости ће се, по теорији, елиптички поларизовати приликом проласка кроз биомолекуле, што се описује параметром углом q: π θ = ( A A ). l λ L D А L и A D су апсорбанције у односу на упадну лево и десно циркуларно поларисану упадну светлост. У експериментима се више користи специфични угао: [ θ ] = 100θ / Cl. Биополимери поседују двоструку хиралност (мономера и виших структура), па променом конформације може доћи до велике промене наведених величина. О поузданости методе сведочи чињеница да се упоређују експерименталне криве j(l) и q(l) са теоријским квантномеханичким прорачунима. Другачија варијанта мерења користи Фарадејев ефекат тј. појаву оптичке ротације пропуштене светлости кроз супстанцу у спољњем магнетном пољу. Један модел одређивања процентуалног односа типова секундарне структуре протеина (посматрају се протеини који садрже алфа хеликс, бета плочу и неодређену структуру) методом циркуларног дихроизма је модел Vetlaufer а. Уз неке модификације, овај модел се може користити и за одређивање терцијерне структуре и структуре ДНК. За задате таласне дужине l упадне светлости, на основу експерименталне анализе, у првој апроксимацији може се записати: Овде индекси a, b и r одговарају редом, алфа хелијачној структури, структури бета плоча и осталим, неодређеним структурама. Коефицијенти c (процентуални односи) су они који се рачунски одређују за упадно зрачење различитих таласних дужина. Одређивање секундарне структуре протеина методом Раманове спектроскопије У нееластичном судару између фотона упадне светлости одређене таласне дужине и молекула може доћи до промене његове таласне дужине (енергије) и то се назива Раманово расејање. Промена таласне дужине може се мерити методом Раманове спектроскопије. Рамановом спектроскопијом могуће је добити информацију информацију о вибрационим стањима појединачних веза у молекулу. Вибрациона стања хемијских веза зависе од 13

14 конформационих карактеристика једињења, па се Раманови спектри користе као индикатори специфичних структурних особина молекула. Узорци који се испитују овом методом могу бити у било ком агрегатном стању (што је предност методе). Анализом Раманових линија може се предвидети секундарна структура протеина и делимично терцијерна, односно, геометрија дисулфидних мостова, а такође се може детектовати положај стање и интеракција са околином аминокиселина тирозина, триптофана и метионина. фреквенција максимума; n L, n D, су лева и десна фреквенца на половини максимума интензитета) и а су коефицијенти добијени методом најмањих квадрата мноштва протеина познате секундарне структуре из литературе. Вибрације пептидне везе Пептидна веза СОNH испољава више различитих вибрација у Рамановом спектру. Од свих Раманових линија највише корелирају са структурним особинама протеина тзв. амид I и амид III траке. Амид I води порекло од вибрације С=О (карбонилне групе) у оквиру пептидне везе. Појављује се у Раманоивом спектру у опсегу таласних бројева cm -1. Одређивање структуре протеина помоћу модела Alix a Математички модел Alix a представља квантитативно (процентуални однос) одређивање типова секундарне структуре протеина (алфа хеликс, бета плоча, бета заокрет, неодређена структура) помоћу параметара добијених из Рамановог спектра у облсти амид I вибрације. Статистички је анализирана корелација између структурних података кристалографске методе дифракције х зрака и података Раманове спектроскопије за велики број протеина. Према моделу Alix a, проценат појединих структуре (алфа хеликс, бета плоча, бета заокрет, неодређена структура) израчунава се коришћењем параметара добијених из амид I вибрације. Квантитивно одређивање појединих конформација је линеарна функција парамтара спектроскопских мерења: Слика 25. Параметри модела Alix a. Литература 1. Wayne M. Becker, Lewis J. Kleinsmith, Jeff Hardin, The World of the Cell, Benjamin Cummings Gordana Matić, Osnovi molekularne biologije, Biološki fakultet univerziteta u Beogradu, Charles R. Cantor, Paul R. Shimel, Biophysiacal chemistry, part II,San Francisco Dušan Ristanović, Jelena Simonović, Jovan Vuković, Radoslav Radovanović, Biofizika, Medicinska knjiga, Beograd Zagreb, Јована Симић Крстић, Докторска дисертација, Машински факултет, Београд, %S = a 0 + a 1 P 1 + a 2 P 2 + a 3 P a m P m, где је S специфичан тип структуре (алфа хеликс, бета заокрет, неодређена структура), P 1, P 2,..., P m изабрани параметри амид I траке (на пр. n max 14