Enzýmová kinetika - úvod

Transcript

1 Enzýmoá knetka

2 Enzýmoá knetka - úod noho bochemckých reakcí je katalyzoaných molekulam, ktoré sa nazýajú enzýmy Z bochemckého hľadska sú to najčastejše proteíny, ašak yskytujú sa aj né typy molekúl, ktoré dokážu katalyzoať bochemcké procesy (napr rbonukleoé kyselny rbozýmy) V nektorých prípadoch dokážu enzýmy urýchlť prebeh reakce až krát Enzymológa - edná dscplína, ktorá sa zaoberá mechanzmam enzýmoých reakcí a skúma záslosť rýchlostí týchto reakcí od onkajších podmenok Podmenky oplyňujúce rýchlosť enzýmoých reakcí:koncentráca enzýmu, koncentráca substrátu, prítomnosť a koncentráca nhbítoro enzýmo, teplota, ph Rýchlosť enzýmoej reakce ne je lneárnou funkcou koncentráce substrátu

3 Ronoážny model enzýmoej knetky O ysetlene nelneárnej záslost rýchlost enzýmoých reakcí od koncentrácí substráto sa zaslúžl počatkom 20storoča acerí edc: Brown, Henr, chaels, entenoá E k k S 2 ES P E E - enzým, S - substrát, P - produkt Rýchlosť znku produktu: Ronoážny model predpokladá rýchlu ronoáhu medz ES a ES s následným znkom produktu a oľného enzýmu E V tomto model sa taktež predpokladá, že koncentráca [S]>>[E] [E] f -koncentráca oľného enzýmu S [ P] dt k [ ES ] d 2 [ E ] [ S ] [ ES ] [ E ] [ E ] [ ES ] f [ ES ] ( [ E ][ S ]) ([ S ] S ) k [ ES ] k ([ E ][ S ]) ([ S ] ) [ S ] ([ S ] ) 2 2 f s s

4 odel ustáleného stau enzýmoej knetky Brggs a Haldane ukázal (925), že ronoážny model enzýmoej knetky môže byť ešte obecnejší a narhl model ustáleného stau, ktorom sa neyžaduje podmenka k - >>k 2 Ustálený sta sa zťahuje na časoý nteral, ktorom rýchlosť znku komplexu ES sa roná rýchlost zánku tohto komplexu Predpoklady modelu ustáleného stau: - procese sa neyskytujú žadne né ntermedáty okrem ES [E] f [E]- [ES] - [S]>>[E] torba ES komplexu ýrazne nezníž koncentrácu S - počas počatočnej fázy procesu sa dostane [ES] na určtú koncentračnú hladnu a ďalšej fáze enzýmoého procesu zostáa [ES] konštantná d [ ES ] d t k [ E ] [ S ] ( k k )[ ES ] f 2 0 [ ES ] [ E ] f [ S ] ( k k2 ) k - chaels-entenoej konštanta

5 odel ustáleného stau enzýmoej knetky Po dosadení za [E] f [E]- [ES] do predchádzajúcej ronce a malých úpraách získaame: Pre rýchlosť enzýmoej reakce platí: [ ES ] [ E ] [ S ] ([ S ] ) Ide o ústrednú roncu enzýmoej knetky (chaels-entenoej ronca) - ak tedy [ ] moldm -3 yjadruje koncentrácu substrátu, pr ktorej je rýchlosť enzýmoej reakce roná poločke málnej rýchlost tejto reakce V lteratúre sa zykne k 2 označoať aj ako k cat f [ ES ] k ([ E ][ S ]) ([ S ] ) [ S ] ([ S ] ) k [ S ]

6 Expermentálne určene (k cat ) a Zo záslost počatočnej rýchlost enzýmoej reakce od koncentráce substrátu sa snažíme získať hodnoty a - súčasnost sa to najčastejše uskutočňuje ftoaním chaels-entenoej ronce na expermentálne získané hodnoty Lnearzačné metódy zobrazena enzýmoej knetky: - Lneweaer - Burkoo zobrazene - Eade - Hofsteeho zobrazene - Hanes - Wolfoo zobrazene

7 Expermentálne určene (k cat ) a Lneweaer - Burkoo zobrazene: - je to najčastejše použíaná lnearzačná metóda enzýmoej knetke f S [ ] [ S ] Eade - Hofsteeho zobrazene: f [ S] [ S ] Hanes - Woolfoo zobrazene: [ ] [ S ] [ S ] S f ( [ S ])

8 Enzýmoá knetka pr nízkych koncentrácách substrátu V nektorých prípadoch je koncentráca substrátu eľm nízka (slabá rozpustnosť, nedostatok substrátu) Ak m >> [S], tak je nemožné získať parametre enzýmoej reakce Za daných okolností pre rýchlosť enzýmoej reakce platí: [ S ] [ E ][ S ] [ E ] k k kcat Ak je známa koncentráca enzýmu a expermentálne sa stanoí hodnota rýchlostnej konštanty k, potom je možne určť pomer k cat /

9 Odchýlky od hyperbolckej knetky Väčšna enzýmoých reakcí sa spráa podľa chaels-entenoej knetky, ašak nekedy sú pozoroané odchýlky od tejto hyperbolckej ronce Dôody týchto odchýlek: - expermentálne artefakty - prítomnosť nhbítoro - substrátoá nhbíca - prítomnosť acerých typo enzýmo pôsobacch na jeden substrát - kooperatta pr azaní substrátu do enzýmu

10 Substrátoá nhbíca Odchýlky od hyperbolckej knetky Táto nhbíca je pozoroaná pr ysokých koncentrácách substrátu Z komplexu ES sa torí komplex SES, ktorý je neaktíny pr premene S na produkt [ S ] [ S ]( [ S ] ) predstauje dsocačnú ronoážnu konštantu pre znk komplexu SES [ ES ][ S ] [ SES ]

11 Odchýlky od hyperbolckej knetky Prítomnosť acerých typo enzýmo pôsobacch ne jeden substrát V prípadoch, ak enzým ne je dostatočne purfkoaný, alebo sa enzýmoá aktta skúma o zorke, kde sa nachádza ac enzýmo, ktoré môžu oplyňoať substrát (kr, tkanoý homogenát,), potom sa taksto pozorujú odchýlky od jednoduchej hyperbolckej záslost Prípad doch enzýmo pôsobacch na jeden substrát: [ S ] [ S ] [ S ] [ S ] 2 2

12 Odchýlky od hyperbolckej knetky ooperatta pr azaní substrátu do enzýmu V enzýme, ktorý dokáže naraz azať ac molekúl substrátu, môže dochádzať ku kooperatte pr azaní substráto, tedy sa mení hyperbolcký charakter záslost od [S] na sgmodálny V prípade ak sa na enzým môže azať kooperatíne ac molekúl substrátu platí: n [ S ] n [ S ] n - Hllo koefcent - konštanta, ktorá sebe zahŕňa, ale aj efekt relatíneho obsadena äzobných mest na enzýme molekulam substrátu

13 Inhbíca enzýmo Aktta enzýmo môže byť znížená prítomnosťou nhbítoro enzýmo, ktoré môžu oplyňoať enzýmy acerým spôsobm: - reerzblné nhbítory - reerzblné nhbítory - pene ažúce sa nhbítory (z angl tght bndng nhbtors) Štúdu nhbíce enzýmo sa enuje eľm eľká pozornosť o acerých edných odboroch: bochéma, bofyzka, farmakológa, rológa Potencál nhbítora pre äzbu na enzým je daný äzobnou (nhbčnou) roznoážnou konštantou : E I EI [ E ][ I ] [ EI ] Hodnota sa dá určť ako prípade určena äzobných konštánt pre äzbu akéhokoľek lgandu na makromolekulu, alebo zsťoaním plyu [I] na parametre enzýmoej reakce (, )

14 Reerzblná nhbíca Obecná schéma pre nterakcu E, S a I: E S I EI S S α S ES kcat E P I α ESI E P β k cat I α - faktor zohľadňujúc ply nhbítora na ronoážnu konštantu azana S na E β - zohľadňuje ply nhbítora na katalytckú rýchlostnú konštantu k cat β 0 - nhbítor plne blokuje enzým 0< β < - I nhbuje enzým, β > - I aktuje enzým E S S ES ES I α ESI S α E I EI EI α S α S α S S α ESI S α S

15 ompettína reerzblná nhbíca Tento typ nhbíce nastáa ak sa I aže na oľný enzým a ne na komplex ES ompletná kompettína nhbíca α, β 0 Naazane I na enzým znemožňuje naazane substrátu na tento enzým I sa tomto prípade najčastejše aže na katalytcké mesto enzýme ( mesto azana sa substrátu), ašak o šeobecnost sa I môže azať aj na nejaké né mesto a tým zabraňoať naazane substrátu na enzým Pre rýchlosť takto nhboanej reakce platí: [ S ] [ S ] ( [ I ] ) Hodnota ostáa nezmenená poronaní s nenhboanou reakcou, hodnota sa zýš

16 ompettína reerzblná nhbíca V lneárnom zobrazení (Lneweaer-Burk) sa kompettína nhbíca prejauje rôznym sklonom záslost / f (/[S]): [ I ] ( [ S ]) Z podelu náklono nhboanej a nenhboanej reakce je potom možné stanoť

17 Nekompettína reerzblná nhbíca V tomto prípade sa nhbítor aže aj na oľný enzým, aj na komplex ES ompletná nekompettína nhbíca je charakterzoaná β 0 a nejakým číslom α Nekompettíne nhbítory nesúťaža so substrátom o naazane do katalytckého mesta enzýmu Pre rýchlosť takto nhboanej reakce platí: [ S ] ( [ S ]( [ I ] ( α ) ) ( [ I ] ( ) ) ) V tomto prípade poronaní s nenhboanou reakcou prítomnosť nhbítora nemení hodnotu, ale mení hodnotu Ak α potom: [ S ] ([ S ] )( [ I ] ) ( [ I ] )

18 Nekompettína reerzblná nhbíca V Lneweaer-Burkoom lneárnom zobrazení sa pr tomto type nhbíce mení aj sklon, aj presečík s osou y, záslost / f (/[S]) poronaní s nenhboanou reakcou [ I ] ( [ S ]) [ I ] α

19 Akompettína reerzblná nhbíca Akompettíne nhbítory sa ažu do ES komplexu,ale neažu sa na čstý enzým Pre kompletnú akompettínu nhbícu platí β 0, α << Hodnota pre äzbu nhbítora na enzým je eľm ysoká (eľm malá afnta), ašak α je normálna hodnota Pre rýchlosť akompettínej reakce platí: ( [ S ] ( [ I ] α ) ) ([ S ] ( [ I ] α ) ) [ S ] ([ S ]( [ I ] α ) ) Pr akompetínej nhbíc sa mení poronaní s nenhboanou reakcou ako, tak aj V Lneweaer-Burkoom zobrazení je sklon záslost / f (/[S]) stále ronaký, mení sa len presečík s y-oou osou S I α [ ] ( [ ] )

20 Častočné nhbítory V prípade ak β ne je dentcky roné nule (kedy sa kompletne blokuje aktta enzýmu po naazaní nhbítora), tedy dochádza len k tz častočnej nhbíc enzýmu Znamená to, že aj pr ysokej koncentrác nhbítora ešte exstuje enzýmoá aktta Tento ja nenastáa eľm často, ale ak sa pozoruje aktta enzýmo aj pr eľm ysokých koncentrácách nhbítora, je treba túto skutočnosť podrobne a pozorne analyzoať

21 Enzýmoá aktta z hľadska odpoede na dáku nhbítora ( angl dose-response) V tomto prístupe sa sleduje pokles aktty enzýmu zhľadom ku koncentrác nhbítora 0 ( [ I ] [ ]) IC / 0 - yjadruje frakčnú akttu enzýmu pr koncentrác nhbítora [I] poronaní s nenhboaným enzýmom [IC 50 ]- koncentráca nhbítora, pr ktorej klesne enzýmoá aktta na 50% 50 Dose-response expermenty sa často yužíajú pr poronáaní potence rôznych nhbítoro na enzým Hodnota [IC 50 ] sa získaa ľahše než a nekedy je jedným parametrom, o ktorý sa môžeme opreť pr stanooaní plyu nhbítora na enzýmoú akttu Často sa stáa, že neeme hodnoty [S] a [E], alebo ne je sté, č [S] >>[E], potom je eľm ýhodné merať enzýmoú akttu z hľadska odpoede na dáku nhbítora

22 Vzťahy medz a [IC 50 ] V prípadoch ak sú známe hodnoty [S] a, tak je možné na základe znalost eľkost [IC 50 ] určť ompettína nhbíca [ IC ] ( [ S ] ) 50 Nekompettína nhbíca Akompettína nhbíca [ IC50 ] ( [ S ] ) ( [ S ] α ) α [ IC50 ] α [ IC50 ] ( [ S ]) [ S ] > > α [ IC ] 50

23 Častočná nhbíca Častočné nhbítory budú preukazoať nú záslosť odpoede na dáku ako úplné nhbítory V tomto prípade pre akttu enzýmu platí: ( y ymn ) ( [ I ] [ IC50 ]) ymn y y - frakčná aktta enzýmu pr koncentrác nhbítora [I] y - aktta enzýmu neprítomnost nhbítora y mn - aktta enzýmu, ktorá sa dosahuje pr eľm ysokých hodnotách [I] Ak sa zstí, že exstuje enzýmoá aktta aj pr ysokých koncentrácách nhbítora, treba s byť stý, č pozoroaná neúplná nhbíca ne je len dôsledkom nejakého expermentálneho artefaktu