Istraživanja amiloidnih fibrila na modelu čovječijeg stefina B i njegovih tačkastih mutanata

Transcript

1 Univerzitet u Tuzli Farmaceutski fakultet Doktorski studij Školska: 2014/2015 Istraživanja amiloidnih fibrila na modelu čovječijeg stefina B i njegovih tačkastih mutanata Dr.sc. Aida Smajlović, docent

2 BIOHEMIJSKA OSNOVA NEURODEGENERATIVNIH BOLESTI Neurodegenerativne bolesti su stanja gubitka nervnih ćelija u mozgu i kičmenoj moždini što je praćeno funkcionalnim padom (ataksija) ili senzornom disfunkcijom (demencija). Među najpoznatijim neurodegenerativnim bolestima su Alzheimerova bolest (AB), Parkinsonova bolest (PB), Huntingtonova bolest (HB), amiotrofična lateralna skleroza (ALS), multipla skleroza, demencija sa Lewyevim tijelima... Prisustvo filamentoznih (vlaknastih) inkluzija u nervnim ćelijama karakteristika je niza neurodegenerativnih bolesti.

3 Biohemijske karakteristike nekih neurodegenerativnih bolesti BOLEST BIOHEMIJSKA KARAKTERISTIKA Alzheimerova bolest Parkinsonova bolest Amiloid-β plakovi, neurofibrilarne nakupine Lewyjeva tjelašaca Huntingtonova bolest Huntingtin sa poliglutaminskim produžetkom Amiotrofična lateralna skleroza Inkluzije superoksid dizmutaze

4 Neurodegenerativne bolesti koje zahvataju slična područja u mozgu naginju stvaranju mnogih sličnih kliničkih sindroma, pa se tako bolesti kore mozga mogu očitovati kao demencija, a bolesti bazalnih ganglija kao ekstrapiramidne bolesti pokreta. Neurodegenerativne bolesti su vrlo široka skupina bolesti čija osnovna karakteristika je propadanje određenih dijelova mozga što dovodi do smanjenja kvaliteta života.

5 Uzroci nastanka neurodegenerativnih bolesti Upala Djelovanje priona Trauma Neravnoteža neurotransmiterskih sistema Autoimuni poremećaji Genetska predispozicija Djelovanje teških metala Akumuliranje proteina Djelovanje slobodnih radikala

6 Sve je više dokaza da ove bolesti imaju zajedničke ćelijske i molekularne mehanizme, uključujući proteinsku agregaciju i formiranje inkluzionih tjelašaca. Agregati se obično sastoje od vlakana koji sadrže nepravilno svijene proteine sa β-pločastom konformacijom, pod nazivom amiloid. Ćelije koje degenerišu uglavnom sadrže abnormalne proteine koji se talože u vidu agregata. Istaloženi amiloid

7 BOLESTI ETIOLOGIJA POGOĐENE REGIJE KARAKTERISTIČNA PATOLOGIJA PROTEINSKI AGREGATI Huntingtonova bolest Huntingtin (dominnatan) Striatum,bazalne ganglije, korteks, drugi regioni Intranuklearne inkluzije i citoplazmatski agregati Huntingtin sa poliglutaminskim produžetkom Ostale poliglutaminske bolesti Atrofin-1, ataksin1-3 (dominantan) Bazalne ganglije, kičmena mozdina Intranuklearne inkluzije Atrofin-1, ataksini ili AR Alzheimerova bolest (AD) sporadično (Apo E rizični faktor),amilod prekursor protein (APP) (dominantan) Presenilin 1,2 (dominantan) Cortex, hipokampus Bazalne gangije Neuritski plakovi i neurofibrilarne nakupine A peptid (od APP) i hiperfosforilisani tau protein Fronto-temporalna demencija sa parkinsonizmom Tau mutacija (dominantna) Frontalni i teporalni cortex i hipokampus Pikova tjelašca Hiperfosforilisani tau protein Parkinsonova bolest (PD) Sporadična -sinuklein Parkin (recesivna, nekad dominantna) Supstancia nigra, cortex Lewyjeva tjelašca -sinuklein Amiotrofična lateralna skleroza (ALS) Sporadična, Superoksid dizmutaza- 1 (dominantna) Spinalni motorni neuroni, motorni korteks Periferin Nepoznato (neurofilamenti) Prionske bolesti (kuru, CJD, bolest) Sporadična, genska ili infektivna korteks, mali mozak, talamus Amiloid i ostali agregati Prion protein

8 Reaktivni oblici kisika i azota zajedno posreduju u oksidativnim oštećenjima Akumulacija proteina kod kojih je došlo do promjene konformacije i formiranje amiloidnih fibrila ZAJEDNIČKE KARAKTERISTIKE NEURODEGENERATIVNIH BOLESTI Poremećaj funkcije mitohondrija koje imaju ključnu ulogu u metabolizmu i regulaciji životnog ciklusa ćelije. Poremećaj ravnoteže izmeďu redoks-aktivnih (željezo i bakar) i redoks-neaktivnih (cink) metalnih jona

9 Proteini uključeni ustvaranje agregata su β-amiloid, tau protein, α- sinuklein, parkin protein, prionski proteini i proteini koji sadrže poliglutamin. Karakteristične neuropatološke lezije kod neurodegenerativnih bolesti

10 Neurodegenerativna oboljenja odlikuju se sličnom molekulskom osnovom: promjenama konformacije proteina, njihovim taloženjem sa nastajanjem toksičnih oligomera i fibrila. Jedna od najvažnijih karakteristika neurodegenerativnih oboljenja jeste da većina proteina koji su uključeni u patogenezu ovih oboljenja pokazuju izraženu sklonost ka agregaciji. AMILOIDNA HIPOTEZA METALNA HIPOTEZA ZNAČAJNE HIPOTEZE HIPOTEZA JONSKIH KANALA HIPOTEZA SLOBODNIH RADIKALA

11 Pokretanje agregacije može nastupiti kovalentnom modifikacijom proteina bolesti, npr., fosforilacijom, olakšavajući konverziju proteina ka abnormalanoj konformaciji. Aβ nastaje iz protofibrila. Protofibrile se mogu prikupiti u protofilamente i formirati konačno zrela vlakna. Agregati protofibrila

12 Dijagram toka, moguće terapijske intervencije tokom agregacije proteina

13 Običan protein postaje amiloid ukoliko pređe u nerastvorljivu formu sa karakterističnim motivom svijanja koji se naziva cross- ( poprečni ; unakrsni ), čija struktura je različita od nativnog stanja.

14 (A) Shema poliglutaminskog produžetka, sa β-zavojima ograničenim sa prolin-glicin insertima na svaki deveti glutamin. B (B) Model za Aβ (1-40) sa β-nabranom ravni formiranom od i ostataka.

15 ALZHEIMEROVA BOLEST Alzheimerova bolest se karakteriše oštećenjem kognitivnih sposobnosti koja se razvija postepeno, ali nezaustavivo progredira. Simptomi Alzheimerove bolesti mogu se šire kategorizovati u : Kognitivne Funkcionalne Psihičke

16 AMNEZIJA Gubitak pamćenja gubitak sposobnosti prepoznavanja AGNOZIJA Smanjena sposobnost prepoznanja ljudi i objekata AFAZIJA Smanjena sposobnost komunikacije, pisanja, razumijevanja APRAKSIJA Poremećaj pokreta, smanjenje sposobnosti pokreta koji zahtijevaju vještinu

17 Dijagnoza se postavlja na osnovu historije bolesti psiholoških testova Magnetna rezonanca magnetne rezonancije kako bi se isključile eventualne strukturne promjene mozga poput infarkta koje mogu uzrokovati demenciju.

18 Mozak bolesnika sa Alzheimerovom bolesti izgleda difuzno atrofičan, dok je ukupna težina mozga smanjena za 20 i više posto. Gledano svjetlosnim mikroskopom uočavaju se široka područja bez nervnih ćelija (više od 40 % ćelija većih od 90 milimikrona zauvijek propada) dok su preostale ćelije smanjena volumena s umanjenim dendritima i gubitkom sinapsi. Mozak kod AB

19 Glavne patohistološke promjene kod Alzheimerove bolesti su ekstracelularni depoziti amiloida-β (Aβ ) amiloidni ili senilni plakovi (SP) i intracelularne nakupine tau proteina neurofibrilarne nakupine, zatim gubitak sinapsi i, na kraju, i samih neurona. Neuron sa degeneriranim neurofibrilama

20 Alzheimerova bolest je obilježena i poremećajem unutar svih znanih neurotransmiterskih sistema: noradrenergički, GABA - ergički, serotoninergički, glutamatski, peptidergički. Biohemijski su najstalniji manjci acetilholina i njemu pridruženih enzima (holin acetil transferaze i acetilholinesteraze) u kori mozga hipokampusu, i amigdali C H 3 O + CH 3 -N -C H 2 -C H 2 -O -C -C H 3 C H 3 Struktura acetil-holina

21 β-amiloid zapravo nastaje od većeg proteina tzv. amiloidnog prekursor proteina (APP). Gen za taj protein smješten je na 21. kromosomu. Nepravilna razgradnja APP-a stvara peptide koji tvore netopljivi β-amiloid, a koji se gomila u senilnim plakovima. Aβ plakovi.

22 Neurofibrilarne nakupine se sastoje od parnih helikalnih filamenata, čiju strukturu čini za mikrotubule vezan protein u hiperfosforilisanom stanju. Važna dijagnostička karakteristika Alzheimerove bolesti je degeneracija neurofibrila. Degeneracija neurofibrila

23 Sniženje acetilholina Sniženje serotonina Sniženje somatostatina Sniženje GABA-e BIOHEMIJSKE PROMJENE KOD ALZHEIMEROVE BOLESTI Sniženje noradrenalina Sniženje neuropeptida Sniženje glutamata

24 Pod normalnim okolnostima razlaganje APP odvija se po neamiloidogenom putu, djelovanjem α i γ sekretaze, koje djeluju na transmembranski domen. Kod AB umjesto α, aktivira se β sekretaza ( amiloidogeni put ) što dovodi do stvaranja amiloida-β koji se sastoji iz dijela transmembranskog domena i kratkog ekstracelularnog fragmenta.

25 Stvaranje β-amiloida Cijepanjem APP na N-terminalnom kraju Aβ sekvence oslobađaju se topivi (solubilni APP) sappβ i C terminalni fragment, C99. Fragment C99 dalje se cijepa pod dejstvom γ-sekretaze dajući solubilni Aβ, najviše Aβ 1-40 i AICD fragment.

26 Escitotoksičnost sa nakupljanjem kalcijuma u ćeliji oksidativni stres PATOLOŠKI EFEKTI AMILOID β Smanjenje fluidnosti membrana smanjenje energetskih zaliha izmjena citoskeleta podsticanje upalnih procesa promjena homeostaze metala

27 Alzheimerova bolest nastaje kada se poremeti balans produkcije i uklanjanja Aβ, te se zbog toga stvara veći broj molekula nego što može da se ukloni.

28 inhibitori acetil holin esteraze (donepezil, rivastigmin) koji povećavaju koncentraciju acetil holina bolesti, u ranoj i srednjoj fazi NMDA antagonisti (memantin) koji utiču na regulaciju funkcije glutamatergičkog sistema, u srednjoj i kasnoj fazi bolesti, antidepresivi, antipsihotici

29 U novije vrijeme se pribjegava terapiji antitijelima koja mogu prepoznati nepravilno svijene proteine i izvršiti njihovo uklanjanje. Ovo podrazumijeva terapijsku strategiju koja za AB koristi antitijela (ABS) usmjerena na β amiloid i tau protein. Anti-amiloid-β monoklonska antitijela mogu otopiti amiloid β agregate in vitro i spriječiti amiloid β monomere da agregiraju. Struktura antitijela

30 Parkinsonsonova bolest nastaje usljed smanjenja dopamina u subkortikalnim ganglijama koje nastaje usljed oštećenja nervnih ćelija koje sadrže dopamin (arterioskleroza) usljed pražnjenja depoa dopamina u tim ćelijama (reserpin) kao i usljed blokade dopaminskih receptora. Struktura dopamina

31 SIMPTOMI PARKINSONIZMA TREMOR Nevoljni pokreti tijela BRADIKINEZIJA sporost pokreta RIGIDITET Ukočenost u mišićima POSTURALNA NESTABILNOST gubitak refleksa

32 Potreban je detaljan neurološki pregled i obrada kako bi se postavila dijagnoza bolesti. Makroskoski se vidi samo gubitak pigmenta substancije nigre Mikroskopski u tim područjima postoji gubitak neurona koji sadrže melanin, nakupljanje ekstraneuralnog pigmenta i prisutnost Lewyjevih tjelašaca u nekima od sačuvanih neurona.

33 Lewijeva tjelašaca su sastavljena uglavnom od proteina koji se naziva α-sinuklein. Taj protein se inače nalazi i u ćelijama mozga zdravih ljudi, meďutim kod oboljelih od Parkinsonove je izmijenjen. bolesti on Lewyjevo tjelašce

34 α-sinuklein se metabolizira, ubikvitiskim proteasomskim putem, a mutacije na α-sinukleinu dovode do sporije razgradnje na ubikvitinskom proteasomskom putu. Nakupljanje proteina Smrt ćelije Model molekule ubikvitina

35 Levo dopa (l-dihidroksi-fenilalanin) LIJEKOVI KOJI SE KORISTE U TERAPIJI PARKINSONIZMA Antiholinergički lijekovi ( triheksifenidil, prociklidin) Amantadin Bromokriptin Pergolid Selegilin

36 Huntingtonova bolest je nasljedni progresivni neurodegenerativni poremećaj, čiji su karakteristični simptomi koreja, nepravilnosti u kretnjama očiju, psihološki i kognitivni poremećaji te progresivna demencija. Jedan segment na genu Huntingtin sadrži određeni dio DNA poznat kao ponavljajući slijed trinukleotida CAG. U normalnim okolnostima CAG se ponavlja 10 do 35 puta unutar gena. Osobe sa HB imaju abnormalno visok broj tripleta CAG čak i do 120 ponavljanja.

37 U osnovi ove bolesti je mutirani gen za protein huntingtin. Inkluzije koje sadrže huntingtin su prisutne u regionima mozga koji se degeneriše. Trodimenzionalna struktura, proteina Huntingtin.

38 Dokazano je da se protein huntingtin direktno veže na drugi protein p53 uzrokujući njegovu pojačanu aktivnost, a on dalje uzrokuje pojačanu aktivnost velikog broja gena i proteina u ćeliji. Neki od tih proteina uzrokuju poremećaje u mitohondrijama, energetskoj centrali ćelije, te se na taj način izaziva poremećaj u metabolizmu ćelije dovodeći na kraju do smrti ćelije.

39 Lijekovi koji su u upotrebi; Tetrabenazin godine odobren od strane FDA (Agencija za hranu i lijekove), SAD odobrio tetrabenazin za liječenje grčevitih, nevoljnih pokreta koji su povezani sa Huntingtonovom bolesti.

40 Amiotrofična lateralna skleroza je degenerativno oboljenje ćelija prednjih rogova motornih neurona i motornog sistema koje dovodi do slabosti, atrofije mišića, hiperrefleksije i progresivne iznurenosti sa smrtnim ishodom za 3-5 godina.

41 Nervna ćelija kod ALS-a Najznačajniji nalaz kod ALS je gubitak motornih ćelija prednjih rogova kičmene mozdine i motoričkih jezgri donjeg moždanog stabla.

42 Kod 5 10% svih slučajeva riječ je o familijarnom obliku, a 20% familijarnih oblika bolesti uzrokovano je mutacijom gena za bakar-cink superoksid dizmutazu (CuZn SOD). Ovaj enzim ima značajnu ulogu u regulaciji oksidativnog oštećenja ćelija, jer katalizuje prevoďenje superoksidnog radikala u vodonik peroksid.

43 Povećanje proizvodnje reaktivnih oblika kisika Povećanje ekstracelularnog glutamata OKSIDATIVNI STRES KOD ALS-a Povećena proizvodnja peroksinitrita i hidroksi radikala Reaktivni oblici kisika aktiviraju mikroglijalne ćelije Reaktivni oblici kisika uzrokuju agregaciju neurofilamenata

44 Riluzol je jedini lijek za koji postoji preporuka FDA da se koristi kod ove bolesti. Smatra se da smanjuje ekscitotoksičnost, koja kod ALS ide najvjerovatnije preko non-nmds glutamatnih receptora. U završnoj fazi su testiranja za lijekove koji bi mogli poslužiti u terapijske svrhe, a to su gabapentin, ksaliproden, meskamserin.

45 U istraživanju je terapija matičnim ćelijama iz koštane srži samog pacijenta (NurOwn) gdje za razliku od embrionskih matičnih ćelija, nema opasnosti od odbacivanja ili razvoja kancera. Ovom terapijom se pomaže organizmu pacijenta da proizvede neuroprotektorne proteine koji štite mozak od neurodegenerativnih poremećaja, čime bi moglo da se uspori napredovanje bolesti.

46 Zajedničko svojstvo neurodegenerativnih bolesti da imaju polagani i progresivan tok, nepoznatu patogenezu i ne reaguju na bilo koju poznatu terapiju, kao i akumulacija patoloških proteina u nervnim ćelijama. Alzheimerova bolest, Parkinsonova bolest, Huntingtonova bolest i Amiotrofična lateralna skleroza opisuju se kao konformacione bolesti proteina. Neurodegenerativna oboljenja odlikuju se sličnom molekularnom osnovom: promjenama konformacije proteina i taloženjem proteina uz nastajanje toksičnih oligomera i fibrila. Mada se trodimenzionalne strukture ovih proteina u njihovim nativnim stanjima enormno razlikuju, abnormalne amiloidne strukture imaju karakterističan motiv svijanja koji se naziva cross- ( poprečni ; unakrsni ), različit od strukture nativnog proteina. Ćelije koje se degenerišu uglavnom sadrže abnormalne proteine, koji se talože u vidu agregata.

47 Sa druge strane, ove bolesti se međusobno mnogo razlikuju, neke imaju jasan uzrok nasljeđivanja, druge su sporadične, neke pokazuju više, neke manje specifične intracelularne abnormalnosti, dok kod nekih bolesti je patološki proces predstavljen atrofijom i gubitkom zahvaćenih neurona, bez posebnih svojstava. Niti jedna od ovih bolesti nije izlječiva, terapija je uglavnom simptomatska, mada se u novije vrijeme istražuje i primjena genske terapije, terapije monoklonskim antitijelima i primjena matičnih ćelija, a sve u cilju usporavanja progresije oboljenja i eventualnog izlječenja. Pojašnjenje patoloških procesa kod ovih bolesti, dovest će do razvoja novih strategija u terapiji, otkrića novih lijekova i procedura za poboljšanje kvaliteta života bolesnika.

48 Zajednički ćelijski i molekulski mehanizmi čine osnovu različitih neurodegenerativnih bolesti, kao što su: - Alzheimerove bolesti (AD) - Parkinsonove bolesti (PD) - Hantingtonove bolesti demencije sa Lewyevim tijelima - Amiotrofne lateralne skleroze (ALS) Alzheimerova bolest (AD) i Parkinsonova bolest (PD) su najopštije forme od starosti ovisnih neurodegenerativnih oboljenja.

49 Molekulski mehanizmi uključuju pogrešno svijanje proteina i agregaciju u formu amiloidnih fibrila. Iako se za vezu između formiranja amiloidnih fibrila i niza poremećaja, uključujući neurodegenerativne bolesti poput Alzheimerove, Parkinsonove, a i prionskih bolesti već dugo zna, mehanizam formiranja amiloidnih fibrila kao osnova za rješavanje bolesti još uvijek je daleko od potpunog razumjevanja. Agregaciji proteina pripada centralno mjesto u ovim neurodegerativnim bolestima: - istraživanja na modelima transgenskih miševa - primjeri familijarnih oblika ovih neurodegenerativnih bolesti

50 Agregaciju proteina u ćeliji mogu uzrokovati različiti oblici stresa (kao što su infekcija, temperatura, oksidativno oštećenje). Ćelija raspolaže regulatornim mehanizmima kojima joj se može suprostaviti. U normalnim uslovima, vitalnu ulogu imaju sistem ubikvitinproteasom (UPS) i autofagija.

51 Struktura amiloidnih fibrila Iako se trodimenzionalne strukture proteina koji grade amiloidne fibrile u njihovim nativnim stanjima enormno razlikuju, abnormalne amiloidne strukture koje grade, imaju karakterističan motiv svijanja koji se naziva cross-β ( poprečni ; unakrsni β ), različit od strukture nativnog stanja. Fibrilogeneza zahtjeva djelimično odvijanje globularnih proteina odnosno nepotpuno svijanje nativno nesvijenih proteina. Nativno nesvijeni proteini mogu preći u metastabilnu parcijalno svijenu konformaciju koja se stabilizira oligomerizacijom. Aβ α-sinuklein Tau protein

52 In vitro istraživanja su pokazala da veliki broj proteina, za koje nije dokazano da su uključeni u neku poznatu patologiju, također mogu agregirati u amiloidne fibrile, pa takvi proteini mogu služiti kao modeli za studij procesa agregacije. Proteini koji nisu uključeni u neku poznatu amiloidogenu bolest mogu agregirati i postati toksični kao i patološki proteini. - Čovječija acilfosfataza (AcP) dobar model-sistem za studiranje važnosti aromatičnosti za amiloidnu agregaciju - Inzulin model protein za istraživanja strukture amiloidnih fibrila -Transthyretin Hipoteza o generičkom mehanizmu stvaranja amiloidnih fibrila (Dobson i sar., 2002). - Jedan model bi trebao biti validan za većinu proteina.

53 Kinetičke zamke na putu svijanja -izlažu hidrofobne aminokiselinske ostatke -izlažu regione sa nestruktuiranom kičmom polipeptidnog lanca prema otapalu Nepravilno svijena stanja Hrapavost lijevka energetskog miljea svijanja rezultat je nastajanja intermedijata svijanja sa nenativnim metastabilnim interakcijama. amorfne strukture Agregacija amiloidni fibrilarni agregati

54 Cistatinska superfamilija inhibitora cisteinskih proteinaza široka rasprostranjenost u svim višim organizmima visoko amiloidogeni in vitro i in vivo njihova oligomerna stanja pristupačna su za strukturne i termodinamičke karakterizacije pogodni za studije agregacije i fibrilogeneze, jer su strukturno homologni proteini, pa predstavljaju prirodan set varijanti aminokiselinske sekvence imaju znatno očuvano svojstvo oligomerizacije

55 molekulska masa 11 kda ne sadrži disulfidne veze 98 aminokiselinskih ostataka mali α/β globularni protein Lokalizovan je u vezikularnim strukturama tj., Golđijevom aparatu/lizozomima, dokazano mu je prisustvo u primarnim mioblastima u diferenciranim ćelijama nalazi i u nukleusu i u citoplazmi Konfokalne mikroskopske analize subcelularne lokalizacije ukazale su na pretežno intranuklearnu lokalizaciju u proliferirajućim ćelijama inhibitor cisteinskih proteaza familije papaina Stefin B (cistatin B) odreďena mu je kristalna struktura (Stubbs i sar., 1990) okarakterisana mu je enzimska aktivnost. in vitro, vezuje se na katepsine B, L, H i S, lizozomske cisteinske proteaze tipa papaina njegova široka i ravnomjerna distribucija ukazuje na opštu protektivnu ulogu stefina B u organizmu sisara Najvjerovatnije da spriječava neodgovarajuću proteolizu lizozomskim cisteinskim proteinazama, prvenstveno katepsinima B, H, K, L, S, a moguće su i njegove druge funkcije

56 Struktura i funkcija čovječijeg stefina B drugi β-zavoj prvi β-zavoj, koji sadrži QVVAG sekvencu N-terminalni segment Visoko očuvani dijelovi sekvenci stefina smješteni u prvom i drugom β-zavoju koji povezuju antiparalelne lance β-strukture, kao i N-terminalnom dijelu inhibitora tvore tripartitni klin koji priliježe u aktivno mjesto papaina

57 Stefin B kao model za istraživanje mehanizma amiloidne fibrilacije Istraživanja u zadnjih nekoliko godina ukazuju da bi sposobnost stvaranja amiloidnih stuktura mogla biti opšta osobina polipeptidnog lanca i da se radi o generičkom svojstvu proteina. Pojedinačne studije pokazuju da bi važnu ulogu mogli imati: stabilnost proteina, neutralizacija ionskih interakcija i nakupljanje aromatskih ostataka

58 Amiloidni fibrili se ne stvaraju direktno iz nativne konformacije, nego iz intermedijata koji su samo djelomično svijeni, a stabilnost nativnog stanja disfavorizuje tranziciju u visoko odvijeno stanje, koje se transformira u skup odgovarajućih intermedijata N*. Za istraživanje i razumjevanje fenomena agregacije proteina nužan je razvoj in vitro modelnih sistema, kojima je moguće okarakterizirati strukturu, kinetiku i termodinamiku.

59 Istraživanja raďena na transgenskim miševima sugeriraju specifičnu funkciju stefina B u CNS i još nepoznatu fiziologiju ovog proteina. Novija istraživanja sugeriraju na esencijalnu ulogu stefina B u nekim neuronima u CNS, koji ove ćelije štiti od apoptoze. Tehnikom sistem dvostrukih hibrida dokazali su interakciju stefina B sa velikim brojem citoplazmatskih proteina (β-spectrin, NF-L, RACK-1, TCrp i Mtrp) koji su uključeni u regulaciju funkcija citoskeleta. In vivo je detektovan multiproteinski kompleks stefina B sa nekim od gore navedenih proteina, specifičan za cerebelum. Novije studije su raďene na interakciji izmeďu čovječijeg stefina B i amyloid-β (1-40) peptida (Aβ) metodom površinske plazmonske rezonance (SPR) i masene spektroskopije sa elektroraspršenjem (ESI MS) su pokazali, da egzistira direktna interakcija izmeďu dva proteina. Stefin B je drugi APP / Aβ vezujući protein in vitro i vjerovatno pogodan i za ćeliju.

60 Fibrili stefina B pokazuju karakteristike koje su zajedničke svim amiloidnim fibrilima: - u pogledu oblika, - dužine (preko 1 µm), - kinetike rasta, -specifičnog vezivanja boja Kongo crvenog i Tioflavina T Lako gradi amiloidne fibrile već pri ph nešto nižem od 5, za razliku od njemu homolognog stefina A. Različita sklonost ka gradnji fibrila ova dva proteina moguće da je posljedica prisustva ionskih mostova u stefinu A. Generalno protonizacija malog broja ili samo jednog bočnog lanca u hidrofobnom središtu proteina nekada je dovoljna za narušavanje nativne strukture, usljed kidanja unutrašnjeg ionskog mosta ili nastajanjem naboja u unutrašnjosti proteina.

61 Najistraživanija patologija vezana za mutaciju na genu za čovječiji stefin B je progresivna mioklonusna epilepsija Unverricht-Lundborg tipa (EPM1) autozomno recesivna bolest zamjenu nukleotida 426G u C na egzonu 1 supstitucija Gly4Arg Gen za stefin B lociran je na hromozomu 21 mutacije na genu za citatin B (EPM1) ponavljajući tandem dodekamera na 5` području gena - (polimorfizam) delecija prvih 18 nukleotida sa 5` položaja introna 2 mutacija Gln71Pro mutacija G u C na zadnjem nukleotidu introna 1 mutacija CGA u TGA supstitucija Gly50Glu (G50E)

62 Amiloidni fibrili - Specifična tinktorijalna svojstva, tj. vezuju Kongo crveno i Tioflavin S - Zajedničke strukturne karakteristike amiloida

63 Korištenje lanaca stefin B amiloidogenog polipeptida, kao model sistema, pokazuju da tokom reakcije fibrilacije njegov polipeptidni lanac prolazi kroz lag fazu, fazu rasta i fazu elongacije. Na tom putu prolazi kroz niz transformacija, niz koje je vrlo teško identifikovati. Svi proteini lako stvaraju amiloidne fibrile,ako su odabrani pogodni uslovi i odgovarajuća koncentracija proteina u otopini

64 Model stefina B Divlji-tip (wt) čovječijeg stefina B (E31) (Y31) Mutant P74S(E31) Izo-obliku (wt) čovječijeg stefina B Mutant H75W(Y31) Metode za praćenje kinetike formiranja amiloidnih fibrila ThT fluorescenca -482 nm -ph 4,8 Transmisijska elektronska mikroskopija (TEM)

65 Metode za induciranje fibrilacije in vitro održavajući pri tome stanja koja favorizuju formiranje sekundarne strukture favorizuju intermedijatna stanja ( I stanja) kod nekih proteina su to prekursori amiloidnih fibrila destabiliziraju nativno stanje denaturacijska sredstva ili temperatura

66 Tačkaste mutacije kod rekombinantnih proteina P74S(E31) i H75W(Y31) ugrađene su na sredini treće petlje.

67 C ThT fluoroscenca 482 nm stb(e31) stb(e31)* P74S(E31) P74S(E31)* A Vrijeme [h] ThT fluoroscenca 482 nm B 30 C stb(e31) stb(e31)* 290 P74S(E31) -10 P74S(E31)* 3,5 53,5 103,5 153,5 203,5 253,5 Vrijeme [h] ThT fluoroscenca 482 nm C C stb(e31) stb(e31)* P74S(E31) P74S(E31)* Time [h]

68 ThT fluorescencom praćena kinetika fibrilacije divljeg-tipa (wt) čovječijeg stefina B i tačkastog mutanta P74S(E31) je pokazala da je zamjena Pro u položaju 74 čovječijeg stefina B Ser vodila značajnom smanjenju sklonosti ka fibrilaciji. Fibrile je gradio na višim temperaturama (30 C i 37 C), ali sa znatno produženijom lag fazom u odnosu na divlji-tip (wt) čovječijeg stefina B.

69 TEM slike divljeg-tipa čovječijeg stefina B i njegovog mutanta P74S(E31) sedmi dan nakon postavljene fibrilacije St B (wt) P74S(E31) rezolucija 2 µm rezolucija 0,5 µm rezolucija 200 nm

70 ThT fluoroscenca 482 nm H75W H75W* P74S(E31) P74S(E31)* stb(y31) stb(y31)* C Vrijeme [h] Mutant H75W u kome je His u položaju 75 zamjenjen Trp pokazao je manju konformacijsku stabilnost u odnosu na divlji-tip (wt) čovječijeg stefina B, ali ne i značajno smanjenu sklonost ka fibrilaciji.

71 Mutant stefina B P74S(E31) na temperaturi od 25 C ne fibrilira u posmatranom vremenu od 500 sati, ukazujući na ključnu ulogu Pro 74 u divljem-tipu (wt) čovječijeg stefina B (E31) i njegove cis-trans prolinske izomerizacije za proces formiranja amiloidnih fibrila. Sklonost ka fibrilaciji H75W(Y31) je manja u odnosu na divlji-tip (wt) čovječijeg stefina B, što pokazuje 3,7 puta duža lag faza mutanta H75W(Y31), a neznatno manja u odnosu na izo-oblik divljeg tipa (wt) čovječijeg stefina B (Y31) (1,12 puta duža lag faza).

72 Rezultati istraživanja stabilnosti odnosno fibrilacije divljeg-tipa (wt) čovječijeg stefina B (E31) i tačkastih mutanata P74S (E31), P79S (Y31) odnosno H75W (Y31) pokazuju da globalna stabilnost proteina ne utiče toliko na fibrilaciju proteina, nego da na fibrilaciju više utiču specifični efekti prolinske izomerizacije, naboja i aromata.

73 Kliničke i predkliničke studije nekoliko da sada razvijenih terapijskih pristupa u liječenju ovih bolesti, kao onaj sa stem ćelijama koje proizvode nervne faktore rasta koji se bore protiv smrti neurona i anti-amiloidnim antitijelima, koja uklanjaju amiloidne plakove pokazala su nus-efekte pri liječenju čovjeka. Pristup koji mnogo obećava je genska terapija, ali ovo je složen i zahtjevan pristup i treba vremena. Čini se da bi razumjevanje primarnog uzroka patologije i usmjeravanje terapije na taj put moglo ponuditi efikasna rješenja u budućnosti. Sve više je dokaza da su manji, rastvorljivi proteinski agregati, čak oligomeri, mnogo toksičniji od samih zrelih fibrila. Stoga bi bolje razumjevanje molekulskog mehanizma agregacije proteina, tj. procesa amiloidne fibrilacije, identificiranje i strukturno okarakteriziranje intermedijata od kojih ovaj proces započinje doprinijelo racionalnom dizajniranju lijekova za ovaj tip bolesti.

74 Istraživanja su raďena na Odsjeku za biohemiju, molekularnu i strukturnu biologiju Instituta Jožef Stefan u Ljubljani. HVALA NA PAŽNJI!