METODI I PRINCIPI PATOFIZIOLOŠKE DIJAGNOSTIKE

Transcript

1 UNIVERZITET U NOVOM SADU POLJOPRIVREDNI FAKULTET DEPARTMAN ZA A VETERINARSKU MEDICINU PREDMET: PATOLOŠKA FIZIOLOGIJA IOLOGIJA VEŽBA 1. METODI I PRINCIPI PATOFIZIOLOŠKE DIJAGNOSTIKE Dr vet. Marko R. Cincović

2 NA PITANJA POSTAVLJENA REČNIKOM FILOZOFIJE TREBA ODGOVORITI REČNIKOM BIOHEMIJE.

3 DOPUNSKE DIJAGNOSTIČKE METODE- MESTO I FUNKCIJA PACIJENT Anamneza Fizikalni pregled VETERINAR RADNA DIJAGNOZA MORFOLOŠKA ISPITIVANJA PROVERA DOPUNSKIM METODAMA TAČNA DIJAGNOZA I TERAPIJA FUNKCIONALNA ISPITIVANJA

4 ZAŠTO TRAŽITI DOPUNSKU ANALIZU Dopunska analiza je neophodna ukoliko je odgovor lekara DA ili MOŽDA na barem jedno od sledećih postavljenih pitanja Može li povišen, normalan ili snižen nalaz uticati na moju dijagnozu? Može li nalaz uticati na moju terapiju? Može li nalaz uticati na moju prognozu za pacijenta? Može li abnormalnost na koju sumnjam biti asimptomatska i kako je lečiti?

5 ZAŠTO NE TRAŽITI ANALIZU? Upozoravamo na neke neozbiljne razloge za vršenje dodatnog pregleda: Da li to pomaže pacijentu? Bilo bi lepo kada bismo znali Utiče li to na postupak sa bolesnikom ili medicinsku nauku? Da upotpunimo pacijentovu dokumentaciju Da, ali sa kojim pravom? Svi to čine

6 U KAKVIM RAZMACIMA PONAVLJATI PATOFIZIOLOŠKE PRETRAGE? U obzir treba uzeti fiziološku dinamiku organizma i predhodno medicinsko znanje. Da li se zbog promene koncentracije sadržaja u krvi mora menjati terapija? Primeri: Vrlo je neverovatno da će se koncentracija frakcija serumskih proteina značajnije promeniti za manje od sedam dana. Sa druge strane u okviru akutnog hepatitisa transaminaze se mogu povećati u okvru 24h. Brza promena koncentracije kalijuma u krvi kod bolesnika koji primaju diuretike može biti pokazatelj da se još jednom izvrši dijagnostika ika ili promeni vrsta diuretika.

7 KADA JE NEKA PRETRAGA HITNA Pretraga je hitna ukoliko će rezultati pretrage uticati na započinjanje određene vrste terapije: Ukoliko je koncentracija urinarnih soli u toku 24h skočila višestruko, to je znak da se mora započeti terapija diureticima.

8 POSTUPCI ZA DOBIJANJE MATERIJALA ZA PATOFIZIOLOŠKU ANALIZU

9 UZIMANJE KRVI PAS MAČKA SVINJA KRAVA KONJ, OVCA KOZA PTICE v. jugularis externa v.cephalica membri thoracici Kao pas Moguće kapilarno iz marginalne ušne vene v.cava anterior v.jugularis v.cephalica v. jugularis v.caudalis Krilna vena V. femoralis a.femoral emoralis V. Cephalica Za antebrachii gasne analize krvi v.jugularis

10 Plasiranje igle u krvne sudove svinje

11 UZIMANJE KRVI Za uzimanje krvi najbolje je koristiti vakumske epruvete. Mogu biti sa poliestarskom smolom za odvajanje ćelija od seruma ili bez nje Dodatak antikoagulansa ili konzervansa Korišćenje poveske (kontraindikovano za određivanje laktata!!!)

12 DOBIJANJE KOŠTANE SRŽI

13 STERNALNA PUNKCIJA Izvodi se u cilju dobijanja koštane srži. Koristi se igla sa štitom i brizgalica od 10-20ml (zbog dobrog vakuma) Punkcija se izvodiu predelu drugog međurebarnog prostora ili na manubrium sterni. Odraditi asepsu Na dubini većoj od 5 mm dolazi se do srži. Aspirirati 0,2-0,5ml dovoljno za razmaz.

14 DOBIJANJE SADRŽAJA RESPIRATORNIH PUTEVA Bronhoalveolarna lavaža Transtrahealna aspiracija

15 Endoskopija je omogućila vizuelizaciju dubljih segmenata respiratornog tubusa

16 DOBIJANJE ŽELUDAČNOG Sondiranje nosna sonda -konj SADRŽAJA Sondiranjem se postavlja dijagnoza i istovremeno sanira dilatacija želuca. Ponekad se međutim ne može odmah dobiti sadržaj. Najčešće je dovoljno prvo naliti oko 500 ml vode u sondu i potom spustiti glavu na dole. Psi-sonda kroz zalogaj

17 DOBIJANJE MOKRAĆE URETRALNA KATETERIZACIJA

18 DOBIJANJE MOKRAĆE CISTOCENTEZA MOGUĆE I PRILIKOM URINIRANJA KOMORE...,DNEVNI URIN

19 DOBIJANJE BURAŽNOG SADRŽAJA Plasiranje sonde okomito u fossa paralumbalis sinistra Sonda na jednoj strani ima mrežicu (u buragu) a spolja je sud za prikupljanje. Izvaditi 0,5L soka Ispitivanja završiti za najdalje 9 sati ukoliko je uzorak na sobnoj temperaturi.

20 Abdominocenteza Indikacije: abdominalna trauma, izlivi u peritoneumu. Najčešće kod pasa i mačaka Sedacija životinje ako je potrebno. Nešto lateralno i kaudalno od pupka, na životinji koja je u stojećem ili lateralnom ležećem položaju.

21 Ostali bitni postupci

22 Ostali bitni postupci

23 FAKTORI KOJI UTIČU NA LABORATORIJSKE NALAZE

24 PREANALITIČKI GENSKI- rasa, pol, nasledne bolesti STAROST-novoro novorođ- adult-starija jedinka CIKLIČNE PROMENE- godišnje doba, reproduktivni ciklus EKOLOŠKI- ishrana,ekofaktori FAKTORI PO VREMENU DEJSTVA ANALITIČKI Poreklom od bolesnika Poreklom od uzetih lekova Postupak i greške u toku rada POSTANALITIČKI Upisivanje laboratorijskih nalaza od aparata do protokola FAKTORI PO SVOJOJ PRIRODI FIZIOLOŠKI METODOLOŠKI METABOLIČKI: gladovanje, stres, fizički napor HEMODINAMSKI: Dnevni ritmovi UZIMANJE I VRSTA KRVI POSTUPAK UZIMANJA DODACI EPRUVETE DUŽINA I NAČIN ČUVANJA UZORKA

25 Neki od vanlaboratorijskih razloga za dobijanje pograšnog nalaza krvi UZROCI POGREŠAKA Krv ostavljena da stoji preko noći i tek ujutro dostavljena MOGUĆE POSLEDICE Povišena koncentracija kalijuma, fosfata, fosfataze, LD-a i drugih intracelularnih enzima Hemolizirana krv Suviše duga staza prilikom venepunkcije Krv izvađena iz ruke u koju je davana infuzija Krv za određivanje glukoze stavljena u posudicu bez fluorida Kao gore Porast Ca, svih proteina, lipida i T4 Razređenost Krv po sastavu slična aplikovanoj infuziji Niske koncentracije glukoze

26 TUMAČENJE NALAZA U PATOFIZIOLOŠKIM MERENJIMA

27 Matrica odlučivanja za procenu nalaza funkcijskog ispitivanja KONAČNA DIJAGNOZA BOLEST POSTOJI BOLEST NE POSTOJI REZULTAT TESTA TEST POZITIVAN TEST NEGATIVAN Stvarno pozitivan (SP) Lažno negativan (LN) Lažno pozitivan (LP) Stvarno negativan (SN) Senzitivnost = SP/SP+LN Specifičnost = SN/SN+LP Tačnost = (SP+SN)/(SP+SN+LP+LN)

28 TUMAČENJE NALAZA FUNKCIJSKIH ISPITIVANJA Broj ispitanika A B A C D D C Referentne vrednosti Vrednost parametra Normalne vrednosti A-sigurno patološka vrednost, B-sigurno B normalna vrednost, C-lažno pozitivan nalaz, D-lažno D negativan nalaz

29 TUMAČENJE NALAZA FUNKCIJSKIH ISPITIVANJA Prema preporuci Internacionalne federacije kliničkih hemičara svaka laboratorija bi trebala da obradi 120 uzoraka zdravih životinja, kako bi odredila referentne vrednosti.

30 JEDINICE SI-SISTEMA SISTEMA U PATOFIZIOLOŠKIM MERENJIMA STANDARDNE SKRAĆENICE U PATOFIZIOLOŠKIM MERENJIMA TABLICE SA REFERENTNIM VREDNOSTIMA Biće dostavljeno uz handout sa vežbi

31 OSNOVI MIKROSKOPIRANJA

32

33 Standardni mikroskop predstavqa usavršeni model koji omogućava lako rukovanje, brzu izmenu objektiva postavljenih na revolverski nosač, daje oštru sliku i homogeno osvetljeno vidno polje. U njegovoj konstrukciji razlikujemo mehaničke i optičke delove. Najvažniji optički delovi su objektivi i okulari. Opremljen je sa najmanje tri objektiva čija su uvećanja obično 10, 40 i 100x. U kompletu dodatne opreme obično postoji i više zamenljivih okulara uvećanja 5, 10 i 15x. Ukupno uvelićanje slike koju daje mikroskop dobijamo množenjem uvećanja objektiva i okulara, tako da su moguće kombinacije od 50 do 1500x. Čak i u slučaju najkvalitetnijih okulara, obično najoštriju sliku daje onaj sa najmanjim uveličanjem, a dodatno okularno uveličanje slike ne daje i veću razdvojnu moć, ograničenu kvalitetom objektiva i osobinama svetlosti. Objektivi uvećanja 100x mogu se koristiti samo uronjeni u specijalno ulje koje sprečava rasipanje svetla, to su imerzioni objektivi i označeni su pored naznake uvećanja i jednom kružnom crnom linijom. Najbolje imerziono ulje je kedrovo. Na starijim modelima kao izvor svetla obično služi ogledalo, a svetlo se sabira na preparat kroz kondenzor.

34 Na starijim modelima kao izvor svetla obično služi ogledalo, a svetlo se sabira na preparat kroz kondenzor. Mehanički delovi mikroskopa su postolje, stativ, makrometarski i mikrometarski zavrtwi za grubo i fino izoštravanje slike, odn. pomeranje tubusa gore - dole. Radi ugodnijeg korišćenja, može se stativ u zglobu saviti pod određenim uglom.

35

36 Stereološka merenja u svetlosnoj mikroskopiji Za stereološku analizu je potrebno da proučavni objekat presečemo o na nekoliko ravni tako da trodimenzionalna struktura na preseku postaje dvodimenzionalna površina, jednodimezionalna linija ili tačka. Na parafinskim rezovima ovo pravilo je zadovoljeno jer se uzeti isečak serijski seče na veći broj tanjih h rezova. Za stereološka merenja različitih struktura koristimo testne sisteme (mrežice). Testni sistemi su skup geometrijskih elemenata od kojih se najčešće koriste tačke, linije, duži i površine, koji najčešće imaju pravilan raspored i međusobno stalni odnos definisan matematičkim računom. Sistemi sa stalnim odnosom geometrijskih struktura nazivaju se koherentnim sistemima. Testni sistem je definisan: površinom sistema, ukupnim brojem tačaka i linija i/ili dužinom linija sistema.

37 Stereološka merenja u svetlosnoj mikroskopiji Praktično, testni sistem je staklena pločica sa ugraviranim linijama, tačkama ili drugim geometrijskim formama (slično kao linearni mikrometar), koja se može ugraditi u okular mikroskopa ili se nalazi u sastavu kompjuterskog programa. Pored staklene pločice, testni sistemi se mogu preneti na razne providne materije, npr. celulozne folije za stereološka merenj nja na mikrofotografijama elektronske mikroskopije i slično Univerzalni testni sistem M-42M

38 Stereološka merenja u svetlosnoj mikroskopiji Zapreminska gustina je relativna stereološka veličina ina koja pokazuje koliki udeo ukupnog prostora pripada proučavanoj fazi. Zapreminska gustina određuje se tako što se proučavana struktura prekrije testnim sistemom i prebroje tačke koje odgovaraju proučavanoj fazi Pf,, i taj broj podeli sa brojem tačaka aka sistema Pt. Stereologija, u naučnom smislu, počela je zvanično da se razvija početkom 60-tih godina. Nagli procvat stereologije započeo je sa razvojem kompjuterskih programa, sposobnih za analizu slike (imaging analysis).

39 Imunofluorescentna mikroskopija Prikaz tzv. indirektne imunofluorescentne reakcije na toksokarijazu (levo), histološki preparat u kome se nalaze larve parazita služi kao antigen za test, prva inkubacija se radi sa ispitujućim serumom pacijenta u kome se nalaze antitela kao posledica infekcije, zatim se radi druga inkubacija sa antitelima protiv humanih antitela obeleženih FITC-om proizvedenim najčešće na kunićima. Desno - H&E obojeni kontrolni preparat antigena pokazuje larvu nematode Toxocara canis, čestog uzročnika eozinofilije kod dece. dr Dušan Lalošević iz PhD teze

40 OSNOVNE PATOFIZIOLOŠKE METODE

41 BRZI BIOHEMIJSKI TESTOVI Postoje kao monotestovi ili politestovi. Koristi se sveža krv, urin ili serum. Parametar Krv Serum Urin ph + Proteini + Glukoza Ketonska tela + Urobilinogen + Bilirubin + Hemoglobin + Bakterin + Nitriti + Urea + + Eritrociti + Leukociti + Holinesteraza + + Specifična masa +

42 RASTVORI

43 RASTVORI

44 RASTVORI Serija rastvora 1:100 Čitaj: razblaženje jednog dela rastvora da bi se dobilo 100 delova konačnog razblaženja

45 RASTVORI STANDARDNI RASTVOR Predstavlja referentnu vrednost. Služi za upoređivanje sa rastvorima sa kojima radimo. Definiše se kao rastvor tačno odmerenekoličine supstance u određenoj zapremini rastvarača.

46 METODE RAZDVAJANJA

47 DIJALIZA DIJALIZA PREDSTAVLJA PROCES RAZDVAJANJA ČESTICA PRAVOG RASTVORA KROZ MEMBRANU, A POD DEJSTVOM CENTRIFUGALNE SILE. KOLOIDNI RASTVORI I MICELE NE PROLAZE DIJALIZNU MEMBRANU ČIJE SU PORE 1nm

48 CENTRIFUGA Centrifugiranje je metoda razdvajanja čestica na bazi nihove različite gustine (specifične težine). Što su partikule manje, to je potrebna moćnija centrifuga kako bi ih izdvojila.

49 CENTRIFUGA

50 HROMATOGRAFIJA Predstavlja metodu razdvajanja kojom se izdvajaju supstance koje su zastupljene u biološkoj smeši od nivoa pikograma do nekoliko grama, a na osnovu različite brzine prolaska kroz neki medijum. Pri tome na molekul deluju dve sile sa suprotnom tendencijom: jedno je sklonost molekula ka adsorpciji na površini nepokretnog medijuma (stacionarne faze), a drugo je težnja molekula ka rastvaranju aranju u rastvaraču koji protiče kroz medijum. Postoje dve faze: NEPOKRETNA- čvrsta,tečna ili mešovita POKRETNA- tečna ili gasovita koja se propušta kroz nepokretnu ili ide preko nje. Faze se biraju tako da se između u njih stvara dobar koeficijent raspodele. Razlikujemo apsorpcionu, jonoizmenjivačku, distribucionu (hromatografija na papiru), gasnu i gel hromatografiju Hromatografski postupak ne menja nativna svojstva bioloških molekula!!!

51 TANKOSLOJNA HROMATOGRAFIJA Prednost hromatografije na papiru je ta što se papir posle sušenja može okrenuti za 90º i da se ponovo vrši izdvajanje, čime će se izolovati veća količina ispitivane supstance. Rf FAKTOR RELATIVNE POKRETLJIVOSTI

52 HROMATOGRAFIJA U STUBU Gel filtracija se zasniva na sposobnosti da određeni eni molekuli prodiru u pore gela (stacionarna faza) pri kontinuiranom protoku rastvarača. Gel se sastoji od poroznih zrna mikroskopske veličine, na kojima su pore jednakog promera, pa molekuli sa molekulskom masom iznad deklarisane eluiraju samo između u čestica. Dakle, što je manja čestica to je sporiji protok. Razdvojene frakcije se sakupljaju uz pomoć kolektora koji u pravilnim vremenskim razmacija pronosi epruvete ispod ispusta kolone.

53 HROMATOGRAFIJA Identifikacija izdvojenih materija: Papir/tankoslojna Prskanje papira reagensom za otkrivanje Otkrivanje pod UV lampom Obeležavanje radioaktivnom materijom i merenje radioaktivnosti Obeležavanje antitelima (imunoafinitetna hromatografija) Rf Gel filtracija Izračunavanje elucionog volumena za ispitivanu supstancu Elucioni volumen je količina eluensa koja se utroši od momenta nanošenja ispitivane supstance na kolonu do momenta njenog izlaska iz kolone

54 ELEKTROFOREZE Mnoge biomolekule poseduju električni naboj. Zahvaljujući ovoj činjenici ti biomolekuli migriraju u rastvoru kroz koji se propusti struja ka elektrodi koja nosi suprotno naelektrisanje od njihovog. Elektroforeza je metod za odvajanje na osnovu razlike u naboju. Potrebno je imati: izvor struje, elektroforetski aparat - kada, potporni medijum (papir, agar-gel, celuloza acetat, skrobni gel, poliakrilamid gel-page)

55 ELEKTROFOREZE Najčešće se koristi niskovoltažna elektroforeza, a od specijalnih razlikujemo: visokovoltažnu elektroforezu, protčnu elektroforezu, imunoelektroforezu, izoelektrično fokusiranje i izotahoforezu. POSTUPAK: 1. Spremiti uzorak 2. Naneti uzorak 3. Elektroforeza 4. Bojenje gela 5. Ispiranje gela 6. Denzitometrija traka

56 ELEKTROFOREZE

57 ELEKTROFOREZE Praktična upustva prilikom izvođenja elektroforeze: Pre početka elektroforeze sve nosače (osim gelova) treba dobro zasititi puferom, da bi se obezbedila električna provodljivost. Rastvoreni uzorak nanosi se mikropipetom u vidu malog kružića ili crte. Ako molekule koje želimo da izolujemo imaju suprotna naelektrisanja uzorak naneti na sredinu trake. Ako je naelektrisanje isto uzorak naneti na jednom kraju trake, što dalje od elektrode ka kojoj će putovati. Kada je uzorak nanet aparat za elektroforezu se priključi na izvor struje (sa ispravljačem). Prosečno, niskovolražna elektroforeza traje oko 2 sata.

58 ELEKTROFOREZE s Kada se nosač izvadi iz aparata suši se na vazduhu na 110ºC. Cilindrični gelovi i poliakrilamid se posle vađenja fiksira u 7% rastvora sirćetne kiseline. Vizualizacija uzorka: PROTEINI GLIKOPROTEINI LIPOPROTEINI PEPTIDI NUKLEINSKE KISELINE POLISAHARIDI KISELI MUKOPOLISAHARIDI Nitrogei u sirćetnoj ili trihlorsirćetnoj kiselini Bromfenol-ZnSO4 ZnSO4-sirćetna kiselina Lisamin-zeleno u sirćetnoj kiselini Oksidacija jodovodoničnom kiselinom i obrada Schiff-sovim reagensom Sudan cno u etanolu Hlorisanje pa obrada rastvorom skroba sa KJ ili benzidin-sirćetnom kis. Metil-zeleno zeleno-pironin Jod Toluidin-plavo u smeši metanol-voda

59 METODE MERENJA

60 KOLORIMETRIJA Predstavlja merenje koncentracije nekog elementa u biološkm materijalu na osnovu apsorpcije svetla (ekstinkcija). Postoje vizuelni kolorimetri (ljudsko oko) i fotoelektrični kolorimetri (sa fotoćelijom). GALVANOMETAR TUNGSTENOVA LAMPA I OTVOR SOČIVO UZORAK FILTER FOTOĆELIJA

61 Opšti princip merenja kod fortometrijskih metoda REAKCIJE SU UVEK OBOJENE! Merenje ekstinkcije probe (ispitivani rastvor nepoznate koncentracije) započinje podešavanjem instrumenata na nulu, stavljanjem u fotometar slepe probe (kivetica u kojoj se nalaze svi sastojci probe, osim ispitivane materije), pa podesiti iglu na galvanometru na nulu. Kiveta je optički transparentan sud standardne širine oko 1 cm. MERENJE: Upoređivanje sa ekstinkcijom standarda poznate koncentracije i izračunavanje proporcijom Određivanje pomoću standardne krive Pomoću molarnog ekstinkcionog koeficijenta (obnoviti Lembert-Beerov zakon)

62 Opšti princip merenja kod fortometrijskih metoda - FILTRI

63 SPEKTROFOTOMETRIJA Savršenija forma kolorimetrije, gde svetlost prolazi kroz rešetku u ili prizmu, pa je moguće razlikovati materije koje imaju izuzetno usku granicu talasnih dužina. Metoda je toliko osetljiva i specifiča da su izmereni jedinstveni apsorpcioni spektri za pojedina jedinjenja, što omogućuje da lako identifikujemo jedinjenje i odredimo njegovu količinu u smeši.

64 SPEKTROFOTOMETRIJA Primer apsorpcionog spektra Hb i derivati Kombinacija apsorpcionih maksimuma, nm Hemoglobin / Oksihemoglobin Karboksihemoglobin Methemoglobin Značajno u forenzičkoj proceni smrti usled trovanja ugljen-monoksidom

65 FLUORIMETRIJA Izvesna jedinjenja imaju sposobnost da apsorbuju svetlosnu energiju, a zatim da emituju izvesnu količinu apsorbovane i pobuđene energije u formi vidljive svetlosti (fluorescencija i fosforescencija - luminiscencija) Fluorimetar izgleda slično kao i kolorimetar, ali pored izvora svetlosti i sočiva poseduje primarni i sekundarni filter između u kojih se nalazi uzorak i fotopojačivač.

66 POTENCIOMETRIJSKE METODE Ako se dve elektrode povežu odgovarajućim naponom, onda će njihovo uranjanje u razne rastvore dovesti do promene napona, koja se može izmeriti. Ova metoda se koristi za određivanje jonizovanog kalcijuma, po2, pco2 u arterijskoj krvi, vodonikovog jona...

67 POLARIMETRIJA Svi elektromagnetni talasi polarizovane svetlosti osciluju u jednoj ravni. Rastvori optički aktivnih molekula rotiraju ravan polarizovane svetlosti s duž ose zraka proporcionalno koncentraciji rastvora. Merenjem ugla rotacije može se izračunati koncentracija rastvora.

68 IMUNOMETRIJSKE METODE Radioimunološke i radiosaturacione analize: su mikroanalitičke tehnike, bazirane na principu reakcije između biološki aktivnih supstancija u telesnim tečnostima i specifičnih vezujućih proteina uz primenu radioaktivnih izotopa. Vezivni proteini mogu biti: ANTITELA, SPECIFIČNI TRANSPORTNI PROTEINI, RECEPTORI SUŠTINA: Određivanje koncentracije određene materije prema radioaktivnosti uzorka u epruveti posle odlivanja viška obeležene materije

69 RADIOIMUNOLOŠKA METODA (RIA) Radioobeležena materija Materija koja se određuje Merenje radioaktivnosti i poređenje sa standardom

70 IMUNORADIOMETRIJSKA METODA (IRMA) Obeleženo McAb na materiju Materija koja se određuje Merenje radioaktivnosti i poređenje sa standardom

71 IMUNOENZIMSKE METODE

72 Kvantitativna ELISA Mikrotitar ploča i čitač za mikrotitar ploču

73 PCR Polymerase chain reaction Lančana reakcija polimeraze (PCR) Kary Mullis i saradnici godine Reakcija replikacije DNA in vitro U reakciji učestvuju: DNA matrica, jednolančani prajmeri (oligonukleotidi), smeša slobodnih deoksinukleotida (dntp), DNA polimeraza (Taq, Thermus aquaticus) i MgCl2 Omogućena in vitro kloniranje jedne ili više željenih sekvenci Za dijagnostiku dovoljne su sasvim male količine ciljne DNA Sekvence koje su umnožene predstavljaju kopije genoma vizelizuju se elektroforezom u gelu.

74 PCR Polymerase chain reaction PCR se izvodi ponavljanjem više ciklusa (20-30), a ciklus se sastoji od 3 faze: Prva faza: : razdvajanje dvostrukih lanaca DNA zagrevanjem reakcione smeše na 94º-96º 96º C u trajanju oko jednog minuta Druga faza: : vezivanje v primera hlađenjem reakcione smeše na 40º-60º C u trajanju oko 30 sec. Treća faza: : polimerizacija zagrevanjem reakcione smeše na 72º C u trajanju 1-21 min.

75 ANALAJZERI POJEDNOSTAVNJUJU SVAKODNEVNI RAD

76 UTVRĐIVANJE BROJA ĆELIJA U BIOLOŠKOM MATERIJALU

77 Razređivanjem periferne krvi i unošenje u komoru dubine 0,1 mm, i površine 1mm² i manje. Komora se posmatra pod mikroskopom. Odredi se broj ćelija u 1mm² i to pomnoži sa 10, da bi dobili broj ćelija u 1mm³, što ćemo pomnožiti sa faktorom razređenja, da bi dobili konačan broj ćelija u jedinici zapremine. Danas se kompjuterski-laserski, radi protočna citometrija, gde materijal biva razblažen, a njegove ćelije pod pritiskom protiču pojedinačno kroz vrlo tanku cev. Lasersko svetlo se fokusira na svaku ćeliju posebno, a senzori mere stepen apsorpcije svetla rasute pod uglom. Računarskom obradom podataka dobija se citogram.

78 Protočna citometrija FCS (Forward-scattered light) proporcionalan površini i veličini ćelije SCS (Side-scattered light) proporcionalan granularnosti i složenosti građe ćelije FITC analiza i dr. Neutrofili Monociti Limfociti

79 Predstavljanje podataka dobijenih citogramom

80 KOMPONENTE KRVI, PRAVLJENJE KRVNOG RAZMAZA I BOJENJE PREPARATA KRVI

81

82 Bojenja preparata krvi Romanovski Gimza rastvor se pravi na sledeći način: azur II* ,0 g eozin žućkasti (Y) ,8 g glicerin ml metil - alkohol ml *azur II predstavqa smešu jednakih delova azur I i metilenskog plavila. Boja se dobija komercijalno već rastvorena, a za bojenje se razređuje u destilovanoj vodi ph 6,8-7,2 u odnosu jedna kap boje na 1 ml vode. Reakcija destilovane vode je jako važna za kvalitet bojenja, napr. pri ph 6 eritrociti su obojeni crveno a pri ph 8,5 plavo - zeleno. Da bi se osigurao ph 7,2, umesto vode koristi se fosfatni pufer: kalijum dihidrogen fosfat (KH2PO4) ,7 g dinatrijum - hidrogen fosfat (Na2HPO4) ,0 g Kombinacija boja koje su dali Mej destilovana voda lit. i Grinvald (eozin - metilensko Sigurnije je praviti odvojeno ove rastvore na sledeći način: plavo) sa bojom po Gimzi (azur - Rastvor A) eozin - metilensko plavo) ) u jednom postupku koji je uveo Na2HPO4.2 H ,814 g Papenhajm, daje do sada najboqu Destilovana voda lit. kombinaciju boja i omogućava Rastvor B) razlikovawe bazofilije, eozinofilije, KH2PO ,638 g polihromatofilije, azurofilije, što je destilovana voda lit. sve potrebno za kompletnu mikroskopsku analizu krvnih preparata

83 Bojenja preparata krvi Bojenj nje po Gimzi Fiksacija razmaza izvodi se 100% metil - alkoholom, uranjanjem preparata ili kapanjem nekoliko kapi po njemu, u trajanju 30 sekundi do 1 minut. Razmaz se postavi na stalak za bojenje u vodoravni položaj i prelije radnim rastvorom boje, koji se pravi neposredno pre upotrebe, 1 kap na 1 ml destilovane vode ili fosfatnog pufera. Za jedan razmaz dovoljno je 3 ml rastvora boje. Bojenje traje 30 minuta i razmaz se kratko ispere destilovanom vodom ili puferom, te ostavi uspravno da se osuši. Krvni razmazi se ne pokrivaju balzamom, a pregledaju se imerzionim objektivom. Nakon pregleda imerziono ulje se pažljivo obriše vatom namočenom u ksilol ili benzin i preparati se mogu vrlo dugo očuvati. Ukoliko se boji veći broj preparata, boja se rastvara kao 5% u destilovanoj vodi ili puferu, a bojenje se izvodi u kiveti za histološke preparate. Ukoliko je potrebno brzo bojenje razmaza, boja se pravi kao 10% rastvor i drži 5-10 minuta, međutim, bolji rezultati se dobiju sa više razređenom bojom i dužim bojenjem.

84 Bojenja preparata krvi Bojewe po Papenhajmu Fiksacija se ne radi posebno, jer boja sadrži metil - alkohol. Razmaz se prelije sa 1 ml koncentrovane boje Mej - Grinvald. Boja se drži 3 minuta, paziti da se ne osuši, a zatim se na preparat oprezno nalije 1 ml destilovane vode ili pufera, kap po kap, da se pomeša sa bojom. Ova mešavina se drži na pločici 1 minut i odlije. Bez ispiranja se nalije radni rastvor Gimza boje i drži 30 minuta. Kratko isprati i osušiti razmaz kao u metodi po Gimzi. Rezultat bojenja Mej - Grinvald boja ne prikazuje dobro jedra leukocita, dok Gimza boja slabo oboji neutrofilne granulacije. U kombinaciji po Papenhajmu rezultat je sledeći: nuklearni hromatin ljubičasto nukleolusi plavo bazofilna citoplazma plavo bazofilne granule ljubičasto - crno neutrofilne granule ljubičasto granule trombocita ljubičasto eozinofilne granule narandžasto - crveno azurofilne granule ljubičasto eritrociti crveno jedra parazitskih protozoa --- crveno do ljubičasto

85 Bojenja preparata krvi Krv embriona pacova starosti 16 dana, acidofilni megaloblasti prve generacije (1) i sazreli megalociti (2) hiperhromne citoplazme, pojava polihromatofilnih (3) i acidofilnih (4) eritroblasta druge generacije i polihromatofilnih eritrocita druge generacije poreklom iz jetre, koji imaju nepravilnu svetlu zonu u centru (5). Dr D.Lalošević (urednik): Mikroskopska laboratorijska tehnika u medicini,novi Sad, 2005.

86 Komponente krvi tečna - krvni serum/plazma uobličeni ćel. elementi (Ery, Leu, Tro) Puna krv /1500/4 0 C koagulacija krvni SERUM koagulum NE sadrzi fibrinogen II, V, VIII faktor koagulac. Sadrzi aktivne materije 10 /1500/4 0 C Puna krv sedimentacija + antikoagulans krvna PLAZMA uobličeni elementi sadrzi fibrinogen

87 HEMATOKRIT odnos tečne komponente (plazme) i uobličenih elemenata u zapreminskom procentu Buffy coat

88

89 Eritrociti

90 LEUKOCITI Prema poreklu, obliku jedra i izgledu citoplazme: 3 populacije granulocita: neutrofilni bazofilni eozinofilni populacija monocita populacija limfocita

91 Trombociti

92 SKRINING PROGRAMI U PATOLOŠKOJ FIZIOLOGIJI

93 Osnovni skrining program TREBA GA RADITI KADA NE POSTOJE JASNO DEFINISANI SIMPTOMI KOD PACIJENTA, ILI PREVENTIVNO Krvna slika Hemoglobin RBC WBC-diferencijalna krvna slika Urinarni status Hemijsko ispitivanje sastava urina Ispitivanje sedimenta Prisustvo bakterija Prisustvo kristala JETRA ALT/GLDH, SDH/GGT BUBREZI Kreatinin, Urea, Kalijum PANKREAS LIpaza, α-amilaza MINERALI Ca/P ELEKTROLITI Na/K MIŠIĆI CK KOSTI AP FECES -PARAZITI BAKTERIJE Urin,Mleko

94 Skrining program za preoperativno ispitivanje Hematokrit, Hemoglobin Diferencijalna krvna slika, Urea, AP, Ukupni proteini, ALT(psi) GLDH (konj) AST i GLDH (tele i svinja) Skrining program za miopatije CK, Laktat, Aldolaza, AST Skrining program za hemostazu BCT (Burker clotting time) Quick time PTT (partial tromboplastin time) Broj trombocita CILJANI SKRINING PROGRAMI Skrining program za anemije Hemoglobin Hematokrit Gvožđe Broj eritrocita MCHC,MHC,MCV Diferencijalna krvna slika Retikulociti (ne kod konja) Bilirubin (ukupni i direktni) LDH

95 BUBREŽNI PROFILA Urea Kreatinin Ukupni proteini Analiza urina Broj nakterija Elektroliti PANKREASNI PROFIL Glukoza Amilaza Lipaza Tripsin/Himotripsin TIREOIDNI PROFIL T3, T4 TSH PROFIL ADRENALNOG KORTEKSA Glukoza Diferencijalna krvna slika Broj eozinofila Na K AP Urea PARATIREOIDNI PROFIL Ca Fosfati (neorganski P) AP MIŠIĆNI PROFIL CK AST Laktat

96 HEPATIČNI PROFIL Ukupni bilirubin (nebitan kod pasa zbog visokog bubrežnog praga) Direktan bilirubin Urobilinogen+bilirubin u urinu (kuče i mačka) AST ALT (kod konja i GLDH) AP γ-gt (konj,krava,ovca) Amonijum jon Holinesteraza PROFIL ELEKTROLITA I BILANSA VODE Natrijum Kalijum Hlor Hematokrit Ukupni proteini MCV Kalcijum Neorganski fosfor Magnezijum

97 Pitanja?