Zisťovanie kinetických parametrov katalyzovanej reakcie vo vsádzkovom reaktore TEORETICKÝ ÚVOD Dôležitou súčasťou pri navrhovaní ale aj prevádzkovaní všetkých typov chemických reaktorov je znalosť kinetiky dejov prebiehajúcich v reaktore. Je teda dôležité vedieť ako rýchlo prebieha chemická reakcia, kedy dosiahnem požadovanú konverziu, aká bude maximálna produktivita a aké budú celkové náklady pri požadovanej konverzii alebo produktivite. Vyšetrovanie kinetiky je však na rozdiel od vyšetrovania rovnováh podstatne zložitejšie, pretože časová zmena stavu nezávisí len od začiatočného a konečného podmienok, ale je nutné vedieť aj akým mechanizmus sa chemická premena realizuje. Napriek mnohým pokusom spracovať kinetiku teoreticky, jediným možným riešením zistenia kinetiky chemickej reakcie je experiment Základom kinetických experimentov je meranie rýchlostí chemickej reakcie pri rôznych koncentráciách substrátov, zisťovanie vplyvu teploty a tlaku na rýchlosť reakcie, ale aj zisťovanie vplyvu látok ktoré síce nie sú síce zahrnuté v stechiometrickej rovnici ale v značnej miere ovplyvňujú priebeh reakcie (katalyzátory, inhibítory). Katalyzátory sú látky ktoré neovplyvňujú rovnováhu reakcie ale prispievajú k jej rýchlejšiemu priebehu. Toto je možné iba tak že premena substrátov na produkt za prítomnosti katalyzátora prebieha menej náročným energetickým spôsobom ako v prípade reakcie bez katalyzátora. Na predstavu najjednoduchším typom katalyzovanej reakcie je homogénna katalýza kde reaktanty aj katalyzátor majú rovnaké skupenstvo( kvapzln0, plynné). Typickou homogénnou katalýzou je výroba kyseliny sírovej komorovým(1746) spôsobom kde sa urýchľuje oxidácia SO2 na SO3 pomocou oxidov dusíka. Avšak homogénnu katalýzu reprezentujú aj všetky biochemické pochody v bunke kde reaktanty ale aj katalyzátory(enzýmy) sú vo vodnej fáze. Princíp katalyzovanej reakcie je teda bez ohľadu na štruktúru použitého katalyzátora (enzým, oxidy dusíka, Pt,V2O5, Fe2O3) rovnaký a rovnakým spôsobom sa sleduje a vyhodnocuje aj kinetika reakcií. Jediným rozdielom medzi enzýmami a klasickými katalyzátormi používanými v tradičných chemických výrobách sú podmienky za akých pracujú a ich špecificita. Väčšina enzýmov je na rozdiel od syntetických katalyzátorov vysoko špecifická a daný enzým je katalyzátorom len pre jednu 1
reakciu, kde sa premieňa len určitý substrát na príslušný produkt. To prináša veľké výhody pretože odpadajú dodatočné náklady na separáciu nežiaducich reakčných produktov. Špecifičnosť enzýmu je dôsledkom jeho trojrozmerného priestorového usporiadania, ktoré umožňuje len určitému substrátu, o danom tvare a veľkosti, sa s ním spojiť na aktívnom mieste enzýmu. Z dôvodu relatívne krehkej priestorovej štruktúry enzýmy pracujú pri podstatne miernejších podmienkach (nižšia teplota, tlak, konštantné ph) ako klasické katalyzátory. Navyše pre enzýmy je charakteristická vysoká účinnosť, napr. jedna molekula enzýmu je schopná pri 20 až 38 C premeniť 10 až 10 5 molekúl substrátu za sekundu čo o mnoho poriadkov prevyšuje rýchlosti reakcií katalyzovaných klasickými katalyzátormi. Pre priebeh homogénnych katalyzovaných reakcií bol vypracovaný veľký počet modelových predstáv. Väčšina z nich predpokladá vznik aktivovaného komplexu medzi katalyzátorom a aspoň jedným reaktantom. Po rozpade komplexu sa uvoľní reakčný produkt a voľný katalyzátor ktorý opäť vytvára komplex s novou molekulou substrátu. V prípade enzýmov je za katalytickú aktivitu zodpovedná relatívne malá oblasť molekuly, nazývaná aktívny centrum. Toto miesto obsahuje skupinu alebo skupiny, schopné reagovať s molekulou substrátu. Ak sa molekula enzýmu a substrátu zrazí vo vhodnej orientácii, je substrát v aktívnom mieste viazaný a vzniká tzv. komplex enzým-substrát (ES). Existencia komplexu bola reálne preukázaná pomocou elektrónovej mikroskopie a rentgenoštrukturnou analýzou, v niektorých prípadoch bol komplex aj izolovaný z reakčnej zmesi. Samo aktívne miesto tvorí zvyčajne priehlbinu na povrchu molekuly a substrát do neho zapadá ako do určitej "formy". Tým je zabránené väzbe iných látok a zaručená presná orientácia substrátovej molekuly. Väzbou substrátu sa súčasne mení štruktúra aktívneho miesta aj substrátu samého. Vzniká labilná konfigurácia, ktorá vyvoláva ďalšie štrukturálne zmeny, tj práve príslušnú katalyzovanú reakciu. Ako náhle je substrát chemicky zmenený na produkt, stráca schopnosť väzby na enzým, uvoľňuje sa produkt a aktívne miesto sa vracia do pôvodného stavu. Vyššie uvedený mechanizmus znázorňuje nasledujúca rovnica: S k1 k 3 k 2 + E SE E + P (1) kde E,S,SE,P sú enzým, substrát, komplex enzýmu so substrátom a produkt, k 1, k 2, k3 sú rýchlostné konštanty. Vyššie uvedený mechanizmus v podmienkach ustáleného stavu (steady-state) opisuje rovnica Michaelis Mentenovej v tvare: dc v= dt P dc = dt S V = K Max M * c + c S S 2
kde v, V sú rýchlosť a maximálna rýchlosť reakcie a Michaelisova konštanta. Pre Max, K M maximálnu rýchlosť reakcie a Michaelisovu konštantu platí: V = k * c (2) Max 3 E K k + k 2 3 M = (3) k1 kde c E je celková koncentrácia enzýmu. Z rovnice (1) je zrejmá súvislosť medzi rýchlosťou reakcie a koncentráciou substrátu. Pri veľmi malej koncentrácii substrátu, keď je c s oveľa menšie ako K M, rýchlosť je priamo úmerná koncentrácii substrátu podľa rovnice: V * c Max S v= (4) KM Naopak pri príliš vysokej koncentrácii substrátu, keď c s je oveľa väčšie ako K M rýchlosť dosiahne maximálnu hodnotu a nezávisí od koncentrácie substrátu: v= V Max (5) Keď c s = K M, potom VMax v= a hodnota K M je teda taká koncentrácia substrátu pri ktorej 2 je reakčná rýchlosť rovná polovici maximálnej rýchlosti a z fyzikálneho hľadiska reprezentuje mieru afinity enzýmu k danému substrátu. Zistenie parametrov v Michaelis Mentenovej rovnici (Vmax, Km) je dôležité z hľadiska prevádzkovania reaktora Na základe zistených parametrov je teda možné vypočítať čas potrebný na dosiahnutie predpísanej konverzie alebo opačne ak reaktor prevádzkujem predpísaný čas až k akej konverzii sa môžem dostať. Pomocou parametrov je možné predigovať aj priebeh reakcie pri zmene teploty alebo pri zvýšení koncentrácie katalyzátora. Priebeh reakcie môže ovplyvňovať aj zdroj z akého bol enzým izolovaný, to jest afinitu enzýmu voči substrátu. Tento fakt vyjadruje hodnota Michaelisovej konštanty. Parametre Vmax, Km sa zisťujú z kinetického experimentu vo vsádzkovom reaktore. V čase nula sa do vodného roztoku substrátu vyhriateho na reakčnú teplotu pridá enzým a v presných časových intervaloch sa odoberajú vzorky kde sa reakcia zastaví. Koncentrácie spotrebovaného substrátu alebo vzniknutého produktu v jednotlivých vzorkách sa stanoví vhodnou analytickou metódou. 3
V prípade reakčnej kinetiky je možné vyhodnotiť kinetické parametre (Vmax, Km) z diferenciálnych alebo integrálnych experimentálnych údajov. V prípade integrálnych údajov meriame časovú zmenu koncentrácie produktu alebo substrátu v reakčnej zmesi (priebehové krivky (cs,cp=f(t)) a celá časová závislosť sa využije na vyhodnotenie parametrov. V prípade diferenciálnych údajov (obr.1) meriame koncentráciu produktu alebo substrátu v rôznych reakčných zmesiach vždy s rôznou začiatočnou koncentráciou substrátu. Potom sa pre vyhodnotenie použijú len tie údaje kde zmeny koncentrácie od času (rýchlosť vzniku resp. zániku zložky diferenciálne údaje) sú lineárne. Začiatočná rýchlosť sa potom vypočíta ako smernica priamkovej závislosti pre danú začiatočnú koncentráciu substrátu: dc dt ) dc = r ( dt p S ( ) = (v ) t = 0 t= 0 0 t= 0 (6) Potom zo závislosti v 0 = f(c. ) sa vypočítajú hodnoty kinetických parametrov S Michaelis Mentenovej rovnice. Obr. 1 Typické experimentálne údaje rýchlosti enzýmovej reakcie namerané metódou začiatočných rýchlostí. Hodnoty kinetických parametrov sa z experimentálnych údajov (diferenciálnych alebo integrálnych) môžu zistiť buď graficky alebo lineárnou resp. nelineárnou regresiou. Keďže Michealis Mentenovej rovnice je nelineárna funkcia, kinetické parametre zistené lineárnou regresiou sú nepresné a linearizácia MM rovnice sa používa iba na prvotný odhad hodnôt kinetických parametrov alebo na identifikáciu typu inhibície enzýmovej reakcie. 4
Presnejšou metódou na vyhodnotenie parametrov matematického modelu je nelineárna regresia. CIEĽ PRÁCE 1. Uskutočniť merania rýchlosti enzýmovej reakcie metódou začiatočných rýchlostí v systéme invertáza-sacharóza. 2. Z experimentálnych údajov metódou lineárnej regresie vypočítať približné hodnoty parametrov V Max a K M (graf1). 3. Presnosť parametrov vypočítaných lineárnou regresiou (VMax a K M ) overiť ich výpočtom metódou nelineárnej regresie ( matlab, excel ). 4. Hodnovernosť výpočtu kinetických parametrov overiť porovnaním vypočítaných a fitovaných závislostí v0 = f(cs0) pričom rozhodujúcim testom vhodnosti bude priliehavosť nameraných a vypočítaných rýchlostí reakcie(graf2) a suma štvorcov odchýlok. 5. Pracujete s rovnakým katalyzátorom ako v experimente. Ak budete mať začiatočnú koncentráciu substrátu v reakčnej zmesi cs =?? mmol/l a znížite koncentráciu katalyzátora v reakčnej zmesi?? krát v porovnaní s tou ktorú používate v experimente, vypočítajte ako sa zmení konverzia po?? minútach reakcie oproti pôvodným podmienkam? Vplyv nižšej koncentrácie katalyzátora vysvetlite na porovnaní simulácií priebehov reakcie- priebehové krivky(cs=f(t))(graf3). 6. Ak by ste ako technológ mali k dispozícii katalyzátor ktorý má?? krát nižšiu afinitu voči substrátu, ako by to ovplyvnilo priebeh reakcie? Vysvetli na simulácii cp=f (t) (graf 4) Vypočítaj ako to ovplyvní čas za ktorý sa dosiahne??? konverzia substrátu. 7. Vypočítajte číslo premeny pre enzým vo vašich experimentálnych podmienkach a katalytickú účinnosť Vášho enzýmu. Dosahuje enzým vo vašich podmienkach tzv. kinetickú dokonalosť. Svoju odpoveď ano-nie dokáž výpočtom, vysvetli. 8. Ako ovplyvňuje teplota rýchlosť reakcie? Čo je teplotný kvocient Q? Vysvetli na porovnaní diferenciálnych údajov pre Vaše experimentálne podmienky a pre reakciu prebiehajúcu pri teplote??? C (graf 5). 5
EXPERIMENTÁLNA ČASŤ 3.1 Materiály 3.1.1 Použitý enzým Ako experimentálny systém používame enzým kvasničnú invertázu (E.C 3.2.1.26) ktorá katalyzuje hydrolýzu sacharózy za vzniku glukózy a fruktózy podľa nasledujúcej reakcie: C 12 Η 22 Ο 11 + Η 2 Ο C 6 Η 12 Ο 6 + C 6 Η 12 Ο 6 (7) 3.1.2 Použité roztoky 1. acetátový pufor ph = 4.8 s koncentráciou 0,1 mol/l 2. zásobný roztok enzýmu približne 4 mg/ml vo vode (kvasničná invertáza, Frakcia V, aktivita 44 U/mg, Sigma, presnú koncentráciu enzýmu zadá učiteľ) 3. 50 ml zásobné roztoky sacharózy s koncentráciou v rozsahu približne 0-0,250 mol/l v 0,1 mol/l acetátovom pufri ph = 4.8 ( presné koncentrácie substrátov zadá učiteľ) 4. Vodný roztok NaOH s koncentráciou 2 mol/l. 3.2 Enzýmová reakcia 1. Enzýmová reakcia prebieha v uzavretých 1,5 ml Ependorfových skúmavkách. 750µl sacharózového roztoku s presnou koncentráciou (Tabuľka 2, vzorky č. 1-16 ) sa v termostate temperujú 15 minút na teplotu reakcie 35 C. 2. Po vytemperovaní naštartujeme enzýmovú reakciu tak, že pridáme do každej vzorky po 50 µl zásobného roztoku enzýmu podľa časového rozpisu uvedeného v Tabuľke 3, skúmavku tesne uzavrieme, zmes ihneď premiešame na vortexe a vrátime do termostatu. (časový rozpis v Tabuľke č. 3, presný štart reakcie pre každú reakčnú zmes aktivujeme stopkami-funkcia split). Dĺžku reakcie zadá učiteľ podľa konkrétneho zadania. 3. Reakciu v Ependorfových skúmavkách zastavíme prídavkom 200µl roztoku NaOH s koncentráciou 1 mol/l a zmes zhomogenizujeme na vortexe (časový rozpis v Tabuľke č. 6
2, presný koniec reakcie pre každú reakčnú zmes aktivujeme stopkami - funkcia split). Presný čas zastavenia reakcie závisí od množstva katalyzátora v reakcii ( potrebný čas zadá učiteľ pre jednotlivé zadania) 4. Množstvo uvoľneného produktu enzýmovej reakcie (glukózy) stanovíme glukózovým testom spektrofotometricky. 3.3 Stanovenie glukózy glukózovým testom 3.3.1 Princíp Na stanovenie produktu enzýmovej reakcie glukózy sa používa glukózový test GLU GOD 6 x 250. Základom stanovenia glukózy je vytvorenie farebného komplexu ktorého absorbancia sa meria spektrofotometricky. Tento komplex vzniká pri selektívnej oxidácii glukózy na peroxid vodíka a glukonát pomocou glukózooxidázy. Vzniknutý peroxid vodíka sa stanovuje oxidačnou reakciou so substituovaným fenolom a 4-aminoantipyrínom katalyzovanom peroxidázou, pričom vzniká červeno sfarbený produkt. Princíp stanovenia uvoľnenej glukózy: β D glukóza+ H (20) glukóza oxidáza 2O2 + O2 D glukonát+ H2O2 peroxidáza H2 O2 + farbivoredukované farbivooxidáza + H2O (21) 3.3.2 Postup 1. Roztok glukózového testu predhrejeme na 30 C. Do ependorfiek pipetujeme po 1 ml tohto roztoku. Do glukózového testu pridáme kvantitatívne po10 µl dobre zhomogenizovaných vzoriek z reakcie a obsah skúmavky ihneď premiešame na na vortexe. 2. Stojan s ependorfkami odložíme na tmavé miesto a necháme 30 min inkubovať. 3. Po ukončení inkubácie vzorky premiešame na vortexe a v každej zmeriame absorbanciu pri absorpčnom maxime produktu stanovenia (500 nm) oproti vode. Vzorka č.1 je slepým pokusom. 4. Jedna z dvojí v rámci cvičenia pripraví kalibračnú čiaru. Na zostrojenie kalibračnej čiary použijeme už vopred pripravené štandardné roztoky glukózy s koncentráciou: 0-0.03 mol/l. Koncentrácia glukózy sa v štandardoch zisťuje rovnakým spôsobom ako vo 7
vzorkách (po10 µl dobre zhomogenizovaného štandardu+1 ml glukózového testu, inkubácia v tme 30 minút. Do jednej eppendorfky ktorá slúži ako slepý pokus sa miesto vzorky pridá redestilovaná voda). 1. VYHODNOTENIE NAMERANÝCH ÚDAJOV 1. Z meraní absorbancie štandardných roztokov glukózy zhotovíme kalibračnú závislosť ( ) Abs= f. c GL 2. Vypočítame koncentráciu uvoľnenej glukózy vo vzorkách pomocou kalibračnej čiary. 3. Rýchlosť vzniku produktu pre jednotlivé začiatočné koncentrácie sacharózy vypočítame podľa vzťahu: c V GL Celk r p = (22) t VRZ kde r p je rýchlosť enzýmovej reakcie (rýchlosť vzniku produktu), c GL koncentrácia produktu-glukózy (mmol/l), t reakčný čas, V Celk je celkový objem po zastavení reakcie, V RZ je objem reakčnej zmesi (Vsach+Venzýmu). 4. Metódou lineárnej regresie vypočítame parametre K M a V MAX a ich hodnoty použijeme ako odhad do nelineárnej regresie (Matlab,excel). 5. Správnosť vypočítaných parametrov overíme graficky porovnaním experimentálnych a vypočítaných hodnôt závislostí r p = f cs ). ( 0 Ďalšie body úloh spracujte podľa konkrétneho zadania. 8
5. ZOZNAM POUŽITÝCH SYMBOLOV Symbol Abs Názov veličiny absorbancia pri 500 nm c koncentrácia produktu - glukózy GL cs 0 dc s dcp K M r p t začiatočná koncentrácia substrátu zmena koncentrácie substrátu zmena koncentrácie produktu konštanta Michealis-Mentenovej rýchlosť enzýmovej reakcie reakčný čas V celkový objem po zastavení reakcie Celk V MAX maximálna rýchlosť enzýmovej reakcie V objem reakčnej zmesi RZ 9
6. PRÍLOHY TABUĽKA 2 Príprava roztokov substrátu vzorka č. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 zás. roztok 0 0.05 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 0.9 1 1.2 1.6 1.8 2 sacharózy (ml) pufor (ml) 2 1.95 1.9 1.8 1.6 1.4 1.2 1.1 1 0.8 0.4 0.2 0 zás. roztok sacharózy presná hmotnosť (g) pufor, presná hmotnosť (g) riedenie výsledná koncentrácia substrátu (mmol/l) TABUĽKA 3 Časový rozpis merania priebehu enzýmovej reakcie vzorka č. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Cs mol/l 10
štart reakcie čas/min 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 presný štart presný stop presný čas reakcie /min 11