Ukupni proteini Proteini se u rutinskim laboratorijama odreñuju u krvi, urinu, likvoru, amnionskoj tečnosti, salivi, fecesu i peritonealnoj i pleuralnoj tečnosti. Metode za odreñivanje proteina u telesnim tečnostima su podeljene na: -kvantitativno merenje ukupnih proteina i albumina -razdvajanje elektroforezom, pri čemu se omogućava semikvantitativno odreñivanje glavnih klasa proteina -imunohemijsko odreñivanje specifičnih proteina korišćenjem specifičnih antiseruma pri čemu se meri Ag-At kompleks: nefelometrijski, turbidimetrijski, radijalnom imunodifuzijom (RID), ili elektro imunodifuzijom (EID), ili ako su prisutni u veoma maloj koncentraciji radio imunoesejom (RIA) ili enzimskim imunoesejom (EIA). Na ovaj način se detektuju i identifikuju abnormalni proteini RID, imunoelektroforezom (IEP), i imunofiksacionom elekroforezom (IFE). Odreñivanje ukupnih proteina u serumu i plazmi Koncentracija ukupnih proteina u serumu odraslih osoba kreće se od 60-78 g/l, i ona prvenstveno zavisi od sinteze u jetri i gubitka putem bubrega. Hiperproteinemija je posledica: -hemkoncentracije (smanjenja volumena plazmatske vode) što dovodi do relativne hiperproteinemije; koncentracija svih individualnih proteina plazme biće podjednako povišena. dehidratacije zbog povećanog gubitka tečnosti ili smanjenog unosa u stanjima kao što su diareja, Addison-ova bolest, dijabetična acidoza. -povećane koncentracije specifičnih proteina koji su obično prisutni u niskim koncentracijama, npr. povećanje proteina akutne faze, poliklonalnih imunoglobulina, kao rezultat infekcije. -povišene koncentracije monoklonalnih imunoglobulina koje stvaraju multipli mijelom i druge maligne paraproteinemije. Hipoproteinemija je posledica: -hemodilucije (povećanja volumena plazmatke vode) što dovodi do relativne hipoproteinemije, koncentracije svih plazmatskih proteina smanjiće se u istom stepenu. -hemodilucije koja se javlja kod intoksikacije vodom, kod povećane retencije soli, pri masivnoj intravenoznoj infuziji. -od svih serumskih proteina albumin je prisutan u najvišoj koncentraciji tako da sniženje njegove koncentracije može da dovede do hipoproteinemije. -bolesti jetre mogu da dovedu do smanjenja nivoa proteina, kao i renalne bolesti (glomerulo nefritis, nefrotski sindrom, proksimalne tubularne bolesti) kada je povećano izlučivanje proteina. Ukoliko se koncentracija proteina spusti ispod 40g/L dolazi do stvaranja edema. Kod odreñivanja ukupnih proteina u serumu treba obratiti pažnju na dve činjenice: 1. svi proteini su sastavljeni od čistih polipeptidnih lanaca koji u svom sastavu sadrže oko 16% N u odnosu na ukupnu masu
2. svaki od nekoliko hiljada različitih proteina prisutnih u serumu reaguje hemijski slično kao svaki drugi protein. 1. Najstariji način za odreñivanje proteina je Kjeldahl-ova metoda u kojoj se dejstvom kiselina oslobaña azot u vidu NH 4 + jona i u baznoj sredini prevodi u NH 3. NH 3 se dalje odreñuje titracijom ili neslerizacijom. Ovde je neophodno izvršiti korekciju za azot prisutan u neproteinskim komponentama, tako što se dobijena vrednost za N iz amonijaka pomnoži sa faktorom 6,25 (od 100% prisutnog azota 16% se nalazi u proteinima, 100/16=6,25). Metoda je dobro definisana, reproducibilna, ali je zametna i nije praktična za rutinske analize. Ona se obično koristi kao referentna metoda. 2. Najčešće korišćena metoda u rutinskim laboratorijama je Biuret-ska metoda. Ona zavisi od prisustva peptidne veze u proteinima. Kada se rastvor proteina tretira sa Cu(II) jonima u alkalnoj sredini, stvara se obojeni helat izmeñu Cu(II) jona i kiseonika karbonil grupe (CO) i azota iz amidske grupe (=NH) peptidne veze. Slična reakcija se ostvaruje i izmeñu Cu(II) jona i organske komponente biureta, pa je metoda dobila ime po ovoj reakciji. Reakcija se ostvaruje ukoliko jedinjenje ima bar dve peptidne veze. Jedan Cu(II) jon se vezuje koordinativnim vezama sa šest susednih peptidnih veza. Amino kiseline i dipeptidi ne reaguju, ali tri-, oligo- i polipeptidi daju od purpurne do tamno ljubičaste boje. Intezitet boje je proporcionalan broju peptidnih veza koje reaguju, a samim tim i broju molekula proteina u reakcionom sistemu. Sasatav najčešće korišćena dva biuretska reagensa je: 1. 0,1-0,2mol/L NaOH, 10-30mmol/L CuCO 4 2. 0,5-0,5mol/L NaOH, 4-6mmol/L CuCO 4 Da bi reagens bio stabilan dodaje se K,Na tartarat jer bi se u supprotnom Cu(II) jon u baznoj sredini istaložio u vidu Cu(OH) 2. Takoñe u sastav reagensa ulazi i KJ koji sprečava autoredukciju alkalnog Cu tartarata i stvaranje Cu 2 O. Metoda je jednostavna, može da se primeni na automatima i dovoljno je precizna za kliničku upoterbu. Linearnost je u osegu od 10-120g/L. Hiperbilirubinemija, lipemija i blaga hemoliza se koriguju upotrebom slepe probe analize sa belim biuretom. Inače hemoliza izaziva povećanje vrednosti proteina za 3% na svakih 1g/L hemoglobina u uzorku. Amonijum jon interferira, ali ne u koncentraciji koja je prisutna u serumu. Kao uzorak se koriste serum, eskudati, plazma. Nivo proteina u plazmi, zbog prisustva fibrinogena je viši za 2-4g/L u odnosu na serum. Proteini u serumu i plazmi su stabilni jednu nedelju na sobnoj temperaturi, jedan mesec u frižideru i dva meseca na -20 C. Za kalibraciju biuret-ske metode obično se koristi goveñi ili humani albumin. Lako se dobija albumin velike čistoće, on se sastoji samo iz amino kiselina, sastav N je konstantan u odnosu na molekulsku masu, i broj peptidnih veza u molekulu je poznat. Kao standardi mogu da se koriste humani serumski albumin i goveñi serumski albumin. Pošto humani serumski albumin ima nižu reakcionu brzinu sa biuretskim reagensom od goveñeg, tehnike koje mere inicijalnu brzinu moraju biti standardizovane humanim albuminom. Zbog toga što je jeftiniji češće je u upotrebi goveñi serumski albumin. 3. Lowry metoda se zasniva na pretretmanu uzorka alkalnim rastvorom bakra, a zatim na dodatku Folin and Ciocalteu fenolnog reagensa. Boja nastaje redukcijom fosfovolframove i fosfomolibdenske kiseline pod dejstvom kompleksa bakar-peptidna veza iz tirozina i triptofana proteina. Cistin, cistein i histidin su takoñe reaktivni u
ovim uslovima, ali u manjoj meri. Osetljivija je oko 100 puta više u odnosu na biuretsku metodu, ali se ne koristi u rutinskim laboratorijama. Karakteriše je slaba specifičnost i brojne interferencije. Pošto sastav tirozina varira od proteina do proteina i intezitet boje će biti drugačiji za različite proteine. Takoñe ovaj postupak je spoj dve metode, a oba reagensa su nestabilna i sa kratkim rokom upotrebe. 4. Odreñivanje proteina apsorpcijom u UV oblasti. Proteinski rastvor apsorbuje u oblasti od 270-290nm i u oblasti od 200-225 nm. Apsorbanca na višoj talasnoj dužini potiče od aromatičnih prstenova tirozina, triptofana i fenilalanina. Pošto sastav tirozina i fenilalanina varira u zavisnosti od proteina, tako će i apsorbanca na ovoj talasnoj dužini varirati u zavisnosti od vrste proteina u uzorku. Iz tog razloga ova metoda se ne koristi za merenje ukupnih proteina u serumu. Apsorbanca na nižoj talasnoj dužini je intezivnija i potiče od peptidnih veza i različiti serumski proteini pokazuju sličnu apsorbancu. Meñutim ova metoda se retko koristi u rutinskim laboratorijama. 5. Merenje indeksa refrakcije je istorijska metoda sa brojnim interferencijama. Zasniva se na merenju indeksa refrakcije supstanci koje su rastvorene u serumu. Pored proteina prisutni su elektroliti, glukoza, pa refrektometer mora da se kalibriše serumom sa poznatom koncentracijom proteina. Albumin Albumin je globularni protein sa osnovnim karakteristikama: -rastvorljiv je u 2,05mol/L (NH 4 ) 2 S0 4 na 25 C pri ph većoj od 6 i kada se dijalizuje nasuprot destilovanoj vodi -MM je oko 66000D -glavna je proteinska komponenta humanog seruma Ima ulogu u održanju koloido-osmotskog pritiska, u transportu različitih jona, kiselina, hormona. Može da veže hidrofobne supstance kao što su bilirubin, masne kiseline i brojne lekove tako da učestvuje u njihovom transportu. Hiperalbuminemija je posledica hemokoncentracije ili dehidratacije, hipoalbuminemija je posledica hemodilucije koja može biti izazvana disbalansom elektrolita, ukoliko je sinteza manja od gubitka u slučajevima malnutricije i malapsorpcije i u bolestima kada je veliki gubitak albumina. Metode za odreñivanje albumina 1. Precipitacija je najstarija metoda i zasniva se na taloženju albumina solima ili kiselinama. Albumin se rastvara u rastvoru (NH 4 ) 2 S0 4 (2,05 mol/l) na 25 C. Nakon centrifugiranja uzorka on ostaje u supernatantu u kome će se odrediti Kjeldahl ili Biuret-skom metodom. Nedostaci su: potrebno je više koraka za njegovo odreñivanje, nije specifična zbog interakcije sa drugim proteinima, ne može da se primeni na automatima. Metoda je istorijska. 2. Preko odreñivanja globulina. Zasniva se na velikoj razlici u sadržaju triptofana izmeñu albumina (ima ga oko 7-10%) i globulina (većinom se sastoji iz triptofana). Glioksilna kiselina u prisustvu Ca +2 u kiseloj sredini, reaguje sa triptofanom iz globulina pri čemu nastaje purpurna boja čiji se intezitet meri na 540 nm. Koncentracija albumina se dobija iz razlike koncentracija ukupnih proteina i globulina.
Reagens je stabilan i do godinu dana ukoliko stoji u frižideru. Nedostaci su: potrebna je standardizacija sa serumom kako bi se izbegla interferencija albumina, dok slobodan triptofan ne interferira. Potrebno je prethodno odrediti ukupnu koncentraciju proteina. 3. Glavne klase serumskih proteina mogu da se razdvoje elektroforezom na celulozo acetatu ili agarozi. Razdvojene frakcije se boje a procenat svake od njih u uzorku se odreñuje denzitometrijskom analizom. Koncentracija albumina se dobija množenjem ukupne koncentracije proteina sa dobijenim procentom albumina. Nedostaci su: nepostoji boja koja podjednako vezuje sve serumske proteine, niti ima vezujući karakter koji je linearan sa koncentracijom svih serumskih proteina. Zato ova metoda daje nešto više vrednosti za albumin, jer on ima veliki kapacitet za vezivanje boje. Ukoliko se albumin eluira sa gela i odredi standardnom metodom za proteine, metoda postaje tačnija. 4. Imunološke metode -radijalna imuno difuzija (RID) u kojoj albumin pasivno difunduje -elektroimunodifuzija (EID) u kojoj albumin difunduje u električnom polju U oba slučaja najčešće kao stacionarna faza koristi se agaraoza sa antitelima za albumin -turbidimetrija -nefelometrija 5. Albumin ima sposobnost da vezuje veliki broj organskih anjona, uključujući i molekule različitih boja. Ova metoda se zasniva na skretanju apsorpcionog maksimuma boje kada se za nju veže albumin. Ovo skretanje apsorpcionog maksimuma omogućava da nastali intezitet boje može da se meri u prisustvu viška neizreagovane boje koji je neophodan da bi se vezao sav albumin. Najčešće su u upoterebi: metil oranž 2-(4 -hidroksiazobenzen)benzojeva kiselina HABA brom krezol zeleno (BKG) brom krezol purpurno (BKP) a) Metoda sa metil oranžom je nespecifična, interferiraju β lipoproteini i α 1 i α 2 globulini tako da se dobijaju lažno povišene vrednosti za albumin kada je on prisutan u niskoj koncentraciji. Ipak ova metoda pokazuje slabije interferencije sa bilirubinom i drugim proteinima u odnosu na HABA. b) HABA boja je specifična za albumin ali ima malu osetljivost. Salicilati, sulfonamidi, penicilini konjugovani bilirubin interferiraju sa albuminom za vezivanje na boju. Heparin izaziva pozitivnu interferenciju, pošto je odgovoran za turbiditet. Kao standard se koristi humani serumski albumin ili humani merkapto albumin, zato što se hemjski tretiran ili hemijski stabilizovan albumin ne vezuje isto kao humani. Korelacija HABA sa elektroforezom je slaba, naročito kod novoreoñenčadi sa hemolitičkom bolešću i kod pacijenata sa bolešću jetre. Takoñe ova metoda daje nešto više vrednosti kod pacijenata sa renalnim bolestima. c) Metoda sa BKG izvodi se pri ph 4,2-4,5 koju obezbeñuje sukcinatni pufer, a nastala boja se meri na 620-630 nm (628 nm). Nejonski deterdžent, Brij 35, se dodaje da bi se smanjila apsorbanca slepe probe, sprečio turbiditet i obezbedila linearnost. Kao standardi mogu da se koriste humani serumski albumin ili goveñi serumski albumin. Specifičnost BKG je dobra kada se analizira serum zdravih osoba. Bilirubin, slaba do umerena lipemija i salicilati ne pokazuju interferenciju sa ovom metodom. Hemoglobin smanjuje vrednost albumina za 1g/L na svakih dodatih 100g/L. Slepa proba ne koriguje ovu interferenciju. Koeficijent varijacije je oko 2% za koncentracije
od 45 g/l. Ova metoda pokazuje slabu korelaciju sa elektroforezom, EID i RID. U opsegu od 35-50 g/l rezultati su slični, a za koncentracije niže od 35 g/l BKG daje više vrednosti u odnosu na elektroforezu. Modifikacije 1. α globulini stvaraju za oko 1/3, β globulini za oko 1/9 i fibrinogen za oko 1/5 intezivniju boju, a hemoglobin isti intezitet boje kao i ekvivalentna težina produkta humanog serumskog albumina. Da bi se eliminisala ova interferencija dodaje se NaCl u koncentraciju od 0,8mol/L, smanjuje se reakciona temperatura sa 45 C na sobnu temperaturu, i smanjuje se koncentracija deterdženta. 2. Merenje inteziteta boje odmah nakon reakcije povećava specifičnost eseja. Albumin pomera apsorpcioni maksimim BKG na talasnu dužinu od 629 nm u roku od jednog minuta, a proteini akutne faze, kao što su ceruloplazmin i orosomukoid, to isto rade nakon 5 min. Zato se preporučuje merenje nakon 10-30 sekundi. d) U metodi sa BKP boja reaguje sa albuminom na ph 5,2, a skretanje apsorbance boje meri se na 603nm. Prednost u odnosu na BKG je što ne vezuje nealbuminske proteine kao što su ceruloplazmin i orosomukoid, tako da merenje ne mora da se izvrši u kratkom vremenskom roku. Kao standard mora da se koristi humani serumski albumin, jer goveñi serumski albumin sa bojom gradi kompleks koji slabo apsorbuje na talasnoj dužini od 603 nm. Heparin pokazuje pozitivnu interferenciju i sa BKP i BKG. Serum je uzorak izbora, a može da se koristi i heparinizirana plazma, ali tada treba obratiti pažnju na interferencije. Uputstvo za odreñivanje ukupnih proteina sa belim i plavim biuretom Beli biuret se pravi isto kao i plavi, ali se ne dodaje CuCO 4 Nula aparata se podešava sa belim biuretom SpR St SpSt A SpA beli biuret 2,5mL 2,5mL 2,5mL plavi biuret 2,5 ml 2,5mL H 2 O 50µL standard 50µL 50µL serum 50µL 50µL A A A SpA A SpR * C St = C A A St A SpSt A SpR