Elekroforeza serumskih proteina

Elekroforeza serumskih proteina Elektroforeza (EF) predstavlja kretanje naelektrisanih čestica u električnom polju. Kada se električno polje primeni na medijum koje sadrži naelektrisane čestice-jone, negativno naelektrisane čestice kretaće se ka pozitivnoj elektrodi (anodi) a pozitivno naelektrisane čestice kretaće se ka negativnoj elektrodi (katodi). Ovaj princip je našao primenu u razdvajanju pojedinih frakcija proteina. Proteini se sastoje od velikog broja različitih aminokiselina (AK) koje su vezane peptidnim vezama. Neke od tih AK imaju u svojim bočnim lancima pozitivno ili negativno naelektrisane grupe. U zavisnosti od sastava i sekvence AK, tip i količina naelektrisanih grupa veoma varira od proteina do proteina. Negativno naelektrisane grupe mogu da potiču od karboksilne grupe, npr. asparaginske i glutaminske kiseline. U alkalnoj sredini karboksilna grupa biće negativno naelektrisana: R-COOH + OH - -------------- R-COO - + H 2 O Karboksilna grupa nije naelektrisana u kiseloj sredini, zbog toga što vezuje jedan proton: R-COO - + H + --------------- R-COOH Pozitivno naelektrisane grupe u proteinskom molekulu potiču uglavnom od ostataka arginina, histidina i lizina. Ove AK imaju slobodnu amino grupu, koja u kiseloj sredini vezuje proton i postaje pozitivno naelektrisana: R-NH 2 + H + ---------------- R-NH 3 U alkalnoj sredini ova grupa gubi proton a time i svoje naelektrisanje: R-NH 3 + OH - -------------- R-NH 2 + H 2 O Ukupno naelektrisanje proteina je zbir svih pozitivnih i negativnih naelektrisanja u molekulu proteina. Ona ph vrednost pri kojoj je ukupno naelektrisanje proteina ravno nuli, je izoelektrična tačka (IT). Ukoliko je razlika izmeñu ph sredine u kojoj se protein nalazi i IT veća, veće je i ukupno naelektrisanje proteina, a samim tim i brzina kretanja u električnom polju. Kretanje proteina prvenstveno će zavisiti od predznaka naelektrisanja. U elektroforetskom sistemu ph se obezbeñuje pomoću pufera, pri čemu se obično koristi jedan (kontinuirani sistem), a može se koristiti i više različitih pufera (diskontinuirani puferski sistem). U zavisnosti od IT proteina koji se razdvaja, bira se odreñeni pufer za EF razdvajanje. Obično je to barbituratni (veronalni) pufer. Ovaj pufer ne precipitira niti denaturiše proteine i u njemu su proteini uglavnom negativno naelektrisani pri ph 8.6. U električnom polju pri ovoj ph, negativno naelektrisani molekuli kreću se ka anodi. Osim barbituratnog pufera koristi se i TRIS-barbituratni pufer sa Ca-laktatom. Jonska jačina pufera obično iznosi 0.05-0.15. Po pravilu koncentrovaniji puferi daju oštrije frakcije. Meñutim ako je njihova provodljivost veća, veća je i jačina struje pa mora da se radi pri nižem naponu da ne bi došlo do pregrevanja. Usled toga vreme razdvajanja je duže nego sa puferima manje koncentracije. Provodljivost pufera zavisi od njegove jonske jačine. EF se izvodi na različitim inertnim medijumima. Meñutim većina tih materijala ima negativno naelektrisanje usled zeta potencijala koji postoji na dodirnoj površini izmeñu medijuma i pufera. Takoñe neki od medijuma sadrže jonizovane grupe, koje su negativno naelektrisane u alkalnim puferima. Npr. papir sadrži izvestan broj karboksilnih grupa, a agar sulfatne grupe. Negativni joni imaju tendenciju da putuju prema anodi, ali je to u ovom slučaju nemoguće posto se nalaze u čvrstom stacionarnom potpornom medijumu. Da bi se uravnotežila sila stvorena na ovaj način, pozitivno naelektrisani molekuli vode (H 3 O + ) putuju katodno. Ova pojava se nazive elektroendoosmoza. Posledica katodnog kretanja vode je ta da se i elektroneutralni molekuli u izvesnoj meri pomeraju katodno, a svi anjoni su nešto usporeni u svom kretanju prema anodi. 1

Potporni medijumi dele se u dve grupe. Prva grupa obuhvata: papir, celuloza acetat i agarozni gel, a druga grupa: skrobni i poliakrilamidni gel. Potporni medijumi prve grupe omogućavaju separaciju molekula samo na osnovu naelektrisanja, a potporni medijumi druge grupe osim razdvajanja na osnovu naelektrisanja pokazuju i efekat molekularnog prosejavanja za komponente koje treba razdvojiti. Gel je porozni medijum čija je veličina pora istog reda veličine kao i veličina molekula proteina. Moć razdvajanja ovih potpornih medijuma je mnogo veća tako da se sa prvom grupom dobija pet frakcija, a sa drugom 25 ili više traka serumskih proteina. Papir kao potporni medijum je od istorijskog značaja, iako je ranije često korišćen za razdvajanje serumskih proteina i enzima. Danas se retko koristi i uglavnom se zamenjuje sa celuloza acetatom, zbog niza loših osobina. Papir nije potpuno homogen medijum u pogledu veličine pora, a zbog izvesne količine karboksilnih grupa poseduje izražen efekat elektroendoosmoze. Osim toga papir apsorbuje razne supstance, pre svega proteine, što dovodi do razvlačenja razdvojenih frakcija. Celuloza acetat je najbolji medijum za jednostavno i brzo, svakodnevno ispitivanje uzoraka koji sadrže proteine, npr. serum. Metoda je brza i osetljiva. Koristi se acetilovana celuloza, koja je homogena u pogledu veličine pora. Adsorpcija proteina je minimalna pa ne dolazi do razvlačenja zona. Agar gel je bolji od papira, ali nije tako dobar kao skrobni gel ili poliakrilamidni gel. Agar je polisaharid koji se dobija iz morskih algi, a sastoji se od ostataka D i l galaktoze koji su vezani 1.3 glikozidnim vezama i sadrže sulfatne i karboksilne grupe. prirodni agar se sastoji od dve vrste polisaharida: agaroze koja je skoro neutralna i amilopektina koji je naelektrisan. Usled prisustva negativno naelektrisanih grupa, u gelu agara je veoma izražen efekat elektroendoosmoze a ponekad dolazi i do izvesne adsorpcije proteina. Zato se danas koristi prečišćena agaroza koja sadrži znatno manji broj jonizovanih grupa, što zavisi od stepena čistoće. Na ovaj način se elektroendoosmoza znatno smanjuje. Gel agara ili agaroze ima relativno velike pore, ali je mehanički čvrst. Zbog jednostavne aparature i izvoñenja, ova metoda je pogodna za svakodnevni rad. Celuloza acetat i agaroza obično se koriste u kliničko-biohemijskim laboratorijama i oba ova medijuma se proizvode komercijalno. Daju slične rezultate, ali se agaroza više koristi zbog konstantnosti uslova izvoñenja i jednostavnosti. Gelovi sadrže 10 g/l agaroze u barbituratnom puferu, ph 8.6, a debljina agarozne ploče je obično 0.05 mm. Skrob se sastoji od granula, koje su izgrañene od dva polimera: amiloze i amilopektina. EF na skrobnom gelu radi se sa tzv. parcijalno hidrolizovanim skrobom. Posebnom obradom granula, postiže se razdvajanje amiloze od amilopektina. Kada se suspenzija preparata u puferu zagreje do ključanja i ohladi, formira se relativno čvrst gel. Proteini se kreću kroz trodimenzionalnu mrežu amilopektina. Kako su dimenzije pora skrobnog gela iste veličine kao i proteinski molekuli dolazi do efekta tzv. molekularnog prosejavanja, pa se kod ove tehnike proteini ne razdvajaju samo na osnovu naelektrisanja već i na osnovu veličine i oblika molekula. Kao rezultat toga, razdvajanje je mnogo efikasnije pa se EF na skrobnom gelu dobija veći broj frakcija. Kako je skrob prirodni proizvod, njegov sastav može znatno da varira, pa se zato za svaku seriju hidrolizovanog skroba mora odrediti i optimalna koncentracija. EF na skrobnom gelu našla je najveću primenu u istraživanjima polimorfizma proteina i izoenzima. Poliakrilamid gel nastaje polimerizacijom monomera akrilamida i komonomera metilenbisakrilamida (BIS) koji stvara ukrštene veze. Različite pore gela dobijaju se menjanjem koncentracija akrilamida (dužina lanaca) ili menjanjem odnosa BIS i akrilamida (broj ukrštenih veza). Polimerizacija akrilamida odvija se u prisustvu slobodnih radikala koji mogu da se stvaraju hemijskom ili fotohemijskom metodom. Kod hemijske polimerizacije, kao katalizator koristi se amonijum persulfat u prisustvu TEMED kao akceleratora. Fotohemijska polimerizacija izvodi se pomoću riboflavina, koji prilikom osvetljavanja UV 2

lampom stvara slobodne radikale potrebne za početak polimerizacije. Jedna od važnih prednosti poliakrilamida kao sintetičkog polimera, nad prirodnim proizvodom (skrob, agar itd) je mogućnost reproducibilnog pripremanja gela iz čistih hemikalija, koje se neće razlikovati od serije do serije, kao što se dešava sa skrobom. Kako poliakrilamid praktično nema naelektrisanih grupa u svojoj strukturi, efekat elektroendoosmoze je takoreći zanemarljiv. S obzirom da se EF razdvajanjem na poliakrilamidnom gelu dobija veliki broj frakcija koje je teško protumačiti, ova tehnika se ne koristi za rutinske analize. Ona je našla primenu u izučavanje specifičnih proteina. EF razdvajanje može da se izvodi pri konstantnom naponu ili konstantnoj jačini struje. Optimalna jačina struje i napon ne mogu teoretski da se predvide, već ih je potrebno empirijski utvrditi. Kod različitih tehnika napon se kreće od 100 1000V, a struja od 1mA do 1A. Za rutinsku EF na agaroznom gelu koristi se konstantan napon. Pošto se EF izvodi 30 min na 90 ili 100 V, promene u struji i temperaturi nisu ozbiljan problem. U praksi je poželjno da imamo brzu separaciju proteina kako bi razdvojene trake bile što oštrije. Što EF traje duže utoliko je veća radijalna difuzija i frakcije su razvučene. Vreme se može smanjiti skraćenjem potpornog medijuma ili povišenjem napona. Sa povišenjem napona, povećava se i jačina struje, ali u tom slučaju zagrevanje je limitirajući faktor koji dovodi do denaturacije proteina, jedan od načina da se spreči zagrevanje je da se snizi jonska jačina pufera. Bojenje proteina posle EF razdvajanja, a nakon toga denzitometriranje uobičajeni je postupak kvantitativnog odreñivanja individualnih proteina. Razdvojene proteinske frakcije se detektuju na tri načina: bojenjem organskim bojama, fluorogenom detekcijom i bojenjem srebrom. Od organskih boja u upotrebi su: amido crno, brom fenol plavo, Poceau S, Coomasie Brilliant Blue, itd. Amido crno se koristi za agarozni gel, a Ponceau S za celuloza acetat. Najosetljivije su Coomassie boje pošto pomoću njih može da se detektuje 0,5 µg/cm proteina. Za bojenje elektroforegrama na poliakrilamidu najčešće se koristi boja Coomassie brilliant (CB)plavo R-250, koja zahteva kiselu sredinu za elektrostatsku reakciju izmeñu molekula boje i amino grupe proteina. Relativno visok intenzitet bojenja proteina CB bojama u odnosu na druge organske boje posledica je i stvaranja sekundarnih veza izmeñu molekula boje. Višak boje vezuje se za boju koja je već vezana za proteine. Pored CB plavog R-250 koristi se i CB plavo G-250 koji je manje rastvoran i primenjuje se u vidu koloidne disperzije. Prednost ove boje je što se vezuje samo za protein, a ne i pozadinu gela. Ovim je olakšan i ubrzan postupak bojenja. Bojenje srebrom je 20-200 pura osetljivije od bojenja organskim bojama tako da otkriva 0.05-0.1 ng proteina. Najveću primenu ovo bojenje je našlo kod EF proteina likvora. EF serumskih proteina na agarozi ili celuloza acetatu dobija se 5 frakcija: albumin, α1, α2, β i γ globulini, pri čemu se njihova EF pokretljivost smanjuje od albumina ka gama frakciji. EF je osnovna tehnika screening-a koja ukazuje na kvalitativne i kvantitativne promene u profilu serumskih proteina. Denzitometriranje služi za grubo kvantitativno odreñivanje proteina, a patološke promene u elektroforegramu vide se i vizuelno, tako da je uz svaku ploču potrebno postaviti i jedan normalan uzorak seruma radi poreñenja. Poremećaj u odnosu pojedinih proteinskih frakcija ili pojava neke patološke frakcije na elektroferogramu, zahteva dalje tumačenje ovih promena, primenom imunohemijskih metoda kvalitativnog ili kvantitativnog odreñivanja specifičnih proteina. Za kvantitativno odreñivanje specifičnih proteina koriste se: nefelometrijski i turbidimetrijski postupak kao i tehnika radijalne imunodifuzije (RID). Kvalitativno odreñivanje podrazumeva primenu imunoelektroforeze. Na slici 1 prikazan je elektroferogram serumskih proteina zdrave osobe, na kojoj se vidi 5 frakcija, a ukoliko je serum svež i pufer sadrži Ca +2, može se videti i šesta traka (β2) koja potiče od C3 komplementa. Pojedini proteini ne mogu se videti jasno na elektroforegramu, jer imaju suviše nisku koncentraciju ili su maskirani sa proteinima veće 3

koncentracije. Tako je npr. ceruloplazmin maskiran sa α2-makroglobulinom i haptoglobinom. Neki proteini se nevide dobro jer slabije vezuju boju zbog velikog procenta lipoproteina ili ugljenih hidrata (npr. α1-kiseli glikoprotein). Slika 1. Elektroferogram serumskih proteina i izgled nakon dezitometriranja EF razdvajanje dobija se 5 frakcija serumskih proteina koji imaju odreñenu proteinsku strukturu, molekulsku masu i fiziološku ulogu. Shodno ulozi koju imaju u organizmu njihova koncentracija se menja u raznim patološkim stanjima. Albumin je serumski protein koji se nalazi u najvećoj koncentraciji u poreñenju sa ostalim proteinima (od ukupne mase proteina pola otpada na albumin). Stvara se u jetri a poluživot mu je 5 do 19 dana. Klinički značaj albumina 1. Hiperalbuminemija je retka i bez kliničkog značaja. 2. Hipoalbuminemija je posledica povećanog gubitka albumina (nefrotski sindrom) i smanjene sinteze (malnutricija, malresorpcija, oštećenje jetre). 3. Analbuminemija je retko genetsko oboljenje a manifestuje se izostankom albuminske frakcije. 4. Bisalbuminemija je genetsko oboljenje (postoje dva gena koja sintetišu dve vrste albumina), pa se nakon EF javljaju dve trake istog intenziteta (slika 2). α1 frakcija sadrži: 1. α1 lipoprotein HDL 2. α1 antitripsin (α1 AT). α1 AT je inhibitor koji se vezuje i inaktivira tripsin. Deficijencija u α1- AT dovodi do destrukcije zida alveola i ukazuje na 4

deficijenciju pluća. To je protein akutne faze i povećava se u akutnim infekcijama i kod oštećenja tkiva. 3. α1- kiseli glikoprotein (orosomukoid) protein akutne faze 4. α1-anti-hromotripsin protein akutne 5. α1-fetoprotein (AFP). AFP je fetalni protein i obično se koristi za skrining abnormalnosti kod fetusa (defekat neuralne tube) i kao tumor marker kod malignih promena na jetri. α2-frakcija sadrži: 1. α1-makroglobulin, protein velike molekulske mase (729 kda). Sintetiše se u jetri a povećana mu je koncentracija u nefrozi jer je veliki protein i teško prelazi u urin. S obzirom da je tada povećano izlučivanje drugih manjih proteina (npr. albumina) on preuzima njihovu ulogu pa mu je povećana sinteza u jetri. On nije protein akutne faze. 2. α1-haptoglobin sintetiše se u jetri, a ima ulogu u vezivanju i čuvanju hemoglobina. Niske su mu vrednosti kod intravaskularne hemolize, a povišene u akutnoj fazi. β-frakcija sadrži: 1. transferin sa molekulskom masom od 77 kda. To je protein koji transportuje Fe i može da veže bakar. Povišene vrednosti su kod nedostatka Fe, u trudnoći i u terapiji estrogenima. On je negativan reaktant akutne faze pa je snižen u akutnoj inflamaciji. 2. β1-lipoprotein LDL. Zbog velike molekulske mase (2750 kda) povišen je u nefrozi i u tipu II hiperholesterolemije. 3. C3 i C4 takoñe migriraju u beta frakciji. Oni su sniženi kod genetske deficijencije, a povišeni u inflamaciji. C3 je kasni protein akutne faze, a ukoliko se uzorak čuva na sobnoj temperaturi razlaže se i tada se ne detektuje. 4. IgA γ-frakcija sadrži: imunoglobuline (IgG, IgA, IgM, IgD and IgE). Pojava jednog oštrog pika ukazuje na prisustvo paraproteina i vezana je za monoklonalnu gamapatiju. 1. IgG migriraju u γ i β regionima i povišeni su u infekcijama, autoimunim bolestima i bolestima jetre. 2. IgM migriraju u γ regionu 3. IgA migriraju u α2, β i γ regionu. 4. CRP je najosetljiviji indikator reakcije akutne faze. Kvalitativne promene elektroforegrama ispoljavaju se u više različitih slučajeva, a one su posledica genetskih varijacija ili patoloških promena: 1. Na elektroforegramu mogu se javiti intenzivno obojene trake u predelu od α do γ oblasti koje se lako uočavaju i golim okom. To su monoklonalni imunoglobuloni (Ig), paraproteini ili M proteini koji su posledica malignog bujanja imunocita. Monoklonalna reakcija tj. paraproteini javljaju se kod multiplog mijeloma ili plazmocitoma, makroglobulinemija, bolesti teških lanaca, kod pojave Bence Jones proteina. 2. Na elektoforegramu uočavaju se multiple trake, različita mobilnost traka ili potpuno odsustvo pojedinih frakcija. Ove pojave posledica su genetskih varijacija jer je poznato da neki od serumskih proteina pokazuju genetski polimorfizam kao što su: haptoglobin, α1-antitripsin, transferin i albumin koji pokazuje bisalbuminemiju (slika 2). Neke od ovih promena nemaju klinički značaj, ali zato su kod nekih znak teškog poremećaja (npr. pojava Z 5

homozigota α1-antitripsina što ukazuje na pulmonalno oboljenje i cirozu jetre). Slika 2. Izgled elektroferograma nakon denzitometriranja kod osobe sa bisalbuminemijom 3. Drugi uzroci promene pokretljivosti pojedinih traka, kao što je anodno pomeranje albumina nastaje usled vezivanja lekova kao sto su salicilati i penicilin ili veće koncentracije bilirubina i masnih kiselina. Smanjena mobilnost se javlja kod α1-antitripsina usled vezivanja tiol grupe ili Bence- Jones-ovih proteina. 4. Pojava traka koje se normalno ne vide kao što je slučaj kod: a. povišenih vrednost α fetoproteina tako da se javlja traka izmeñu albumina i α regije b. u slučaju povećanja c-reaktivnog proteina javlja se nova traka u predelu γ regije što je slučaj u akutnoj fazi c. pojava lizozima u monocitnoj leukemiji što se manifestuje post γ trakom. Kvantitativne promene na elektroforegramu kod pojedinih bolesti manifestuju se promenjenim odnosom pojedinih proteinskih frakcija. Tako se nefrotski sindrom odlikuje povećanom koncentracijom proteina veće molekulske mase jer se proteini male molekulske mase kao što su prealbumin, albumin, α1-glikoprotein, α1-antitripsin, i transferin izlučuju urinom. Jasno se vidi smanjenje albuminske i γ frakcije dok se α2 globulini povećavaju (α2- makroglobulin, haptoglobin, β lipoprotein, IgM) i ovo je slika selektivne proteinurije. U zapaljenskim procesima dolazi do povećanja proteina akutne faze u koje spadaju: α1-antitripsin, α1-kiseli glikoprotein, haptoglobin, C-reaktivni protein što se odražava na elektroforegramu u vidu povišenja α1 i α2 frakcije. Vrednost β-1 frakcije se povećava u slučaju nedostatka Fe, jer se tada povećava koncentracija transferina. α1 frakcija se povećava kod hroničnog hepatitisa, terapije estrogenima, u trudnoći. α2 frakcija je povećana kod reumatoidnog artritisa i bolesti imunih kompleksa Fuzija β i γ frakcija javlja se kod povećanih vrednosti IgA koja se javlja kod ciroze, respiratorne i kožne infekcije i reumatoidnog artritisa. Povećana γ frakcija može se javiti usled poliklonalnog γ globulinskog rasta vezanog za imunoreakciju, hronična inflamatorna oboljenja, oboljenja jetre i neoplazme. Povećana γ frakcija može se javiti i u vidu oligoklonalnih traka koje se javljaju kod hroničnog hepatitisa i hroničnih virusnih infekcija. Nedostatak γ frakcije javlja se kod imunodeficijencije koja je kongenitalna ili stečena. Na slici 3 prikazani su elektroferogrami nakon denzitometriranja seruma osoba sa različitim patološkim poremećajima. 6

Slika 3. Elektroferogrami nakon denzitometriranja seruma osoba sa različitim patološkim poremećajima. 7