TEHNIKAVALDKOND Käesolev leiutis käsitleb immunomoduleerivaid polünukleotiidide. See käsitleb ka leiutisekohaste polünukleotiidide manustamist immuunsusreaktsiooni moduleerimiseks. TEHNIKA TASE 1 2 Immuunsusreaktsiooni tüüp, mis on esile kutsutud vastuseks nakkusele või stimulatsioonile teistele antigeenidega, võib tavaliselt olla eristatud T-helperrakkude (Th) alamrühma poolt, mis on kaasatud sellesse vastusesse. Th1 alamrühm vastutab selliste klassikaliste, raku poolt vahendatud funktsioonide eest, nagu peetunud tüüpi ülitundlikkus ja tsütotoksiliste T-lümfotsüütide (CTLs - cytotoxic T lymphocytes) aktivatsioon, samas, kui Th2 alamrühm funktsioneerib efektiivsemalt, kui helper B-raku aktivatsioonil. Immuunsusreaktsiooni tüüp antigeenile on tavaliselt mõjustatud rakkude poolt produtseeritavate tsütokiinidega, mis reageerivad antigeenile. Arvatakse, et erinevused tsütokiinide vahel, mida eritavad Th1 ja Th2 rakud, peegeldavad nende kahe alamrühma erinevaid bioloogilisi funktsioone. Vaata, näiteks, Romagnani (00) Ann. Allergy Asthma Immunol. 8:9-18. Th1 alamrühm võib olla eriti hästi sobivaks reageerimisel viiruslikele nakkustele, rakusisestele patogeenidele ja tuumorirakkudele, kuna need rakud eritavad IL-2 ja IFN-γ, mis aktiveerivad tsütotoksilisi T-lümfotsüüte. Th2 alamrühm võib olla enam sobivaks reageerimisel vabalt elavatele bakteritele ja helmintparasiitidele, ja võib vahendada allergilisi reaktsioone, kuna on teada, et IL-4 ja IL- indutseerivad IgE produktsiooni ja eosinofiilide aktivatsiooni, vastavalt. Tavaliselt, Th1 ja Th2 rakud eritavad erinevaid valikuid tsütokiine ja seega üks reaktsiooni tüüp võib aeglustada teist tüüpi reaktsiooni aktiivsust. Nihe Th1/Th2 tasakaalus võib põhjustada näiteks allergilist reaktsiooni, või alternatiivselt, suurendatud CTL reaktsiooni. Paljude nakkushaiguste puhul, selliste, nagu tuberkuloos ja malaaria, Th2-tüüpi reaktsioonidest on vähe kasu kaitsel nakkuse vastu. Pakutavad vaktsiinid, milles on kasutatud väikseid peptiide, mis on tuletatud märklaudantigeenist ja teistest käesoleval ajal kasutatavatest antigeensetest agensitest, mis hoiavad ära potentsiaalselt infektiivsete intaktsete viirusepartiklite kasutamise, ei kutsu alati esile sellist immuunsusreaktsiooni, mis on vajalik selleks, et saavutada terapeutilist efekti. Valkudel baseeruvad vaktsiinid indutseerivad tüüpiliselt Th2-tüüp immuunseid reaktsioone, mida iseloomustavad kõrged tiitrid neutraliseerivaid antikehi, kuid ilma olulise, raku poolt vahendatud immunsuseta.
2 1 2 Peale selle, mõned tüübid antikehade reaktsioone on sobimatud teatud näidustuste puhul, eelkõige allergia puhul, kus IgE antikehade reaktsioon võib põhjustada anafülaktilise šoki. Tavaliselt, allergilistesse reaktsioonidesse on kaasatud Th2-tüüpi immuunsed reaktsioonid. Allergilisi reaktsioon, kaasaarvatud selliseid, nagu allergiline astma, iseloomustab varajase faasi reaktsioon, mis leiab aset sekundite kuni minutite jooksul allergeeniga kokkupuutumisest, ja mida iseloomustab raku degranulatsioon, ja hilise faasi reaktsioon, 4 kuni 24 tundi hiljem, ja mida iseloomustab eosinofiilide infiltratsioon allergeeniga kokkupuute kohta. Täpsemalt, allergilise reaktsiooni varajase faasi jooksul ristsidestab allergeen IgE antikehad basofiilidel ja nuumrakkudel, mis omakorda vallandab degranulatsiooni ja sellele järgneva histamiini ja teiste põletikuliste mediaatorite eritumise nuumrakkudest ja basofiilidest. Reaktsiooni hilise faasi jooksul infiltreeruvad eosinofiilid kohta, mis puutub kokku allergeeniga (mille tulemusena kude kahjustub ja lakkab funktsioneerimast). Allergiliste häirete antigeenne immunoteraapia sisaldab väikeste, kuid järjest suurenevate koguste antigeeni subkutaanset injektsiooni. Selliste immunisatsiooniravide puhul on risk, et võidakse indutseerida IgE poolt vahendatud anafülaksia ja puudub efektiivne tsütokiini poolt vahendatud sündmuste suunamine allergilise reaktsioon hilise faasi. Senini aga on see lähenemisviis andnud vaid piiratud tulemusi. Teatud DNA järjestuste, mida tavaliselt tuntakse immunostimuleerivate järjestustena, manustamine indutseerib immuunsusreaktsiooni, kallakuga Th1-tüübi suunas, millele osutab Th1-ga seotud tsütokiinide sekretsioon. Immunostimuleeriva polünukleotiidi manustamine koos antigeeniga, põhjustab manustatud antigeeni suhtes Th1-tüüpi immuunsusreaktsiooni. Roman et al. (1997) Nature Med. 3:849-84. Näiteks, hiired, kellele injekteeriti intradermaalselt Escherichia coli (E. coli) β-galaktosidaasi (β-gal) füsioloogilises lahuses või maarjajääadjuvandis, reageerisid sellele produtseerides spetsiifilisi IgG1 ja IgE antikehi, ja CD4 + rakke, mis eritasid tsütokiine IL-4 ja IL-, kuid mitte IFN-γ, mis näitab, et Th2 alamrühmas domineerisid T-rakud. Kuid, hiired, kellele oli injekteeritud nahasiseselt (või kantud nahale Tyne nahakraapimisaplikaatoriga) plasmiidi DNA-d (füsioloogilises lahuses), mis kodeerib β-gal ja mis sisaldab immunostimuleerivat järjestust, vastasid IgG2a antikehade ja CD4 + rakkude produktsiooniga, mis eritasid IFNγ, kuid mitte IL-4 ja IL-, mis näitas, et need T-rakud domineerisid Th1 alamrühmas. Peale selle, spetsiifiline IgE produktsioon hiirtes, kellele oli injekteeritud plasmiidi DNAd, vähenes 66-7%. Raz et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:141-14. Tavaliselt
3 1 2 iseloomustab reaktsiooni immunisatsioonile palja DNA-ga IL-2, TNFα ja IFN-γ produktsioon antigeeniga stimuleeritud CD4 + T-rakkude poolt, mis on indikatiivne Th1- tüüpi reaktsioon. See on eriti tähtis allergia ja astma ravil, nagu näitab vähendatud IgE produktsioon. Immunostimuleerivate polünukleotiidide võime stimuleerida Th1-tüüpi immuunsusreaktsiooni on demonstreeritud bakteriaalsete antigeenide, viiruslike antigeenide ja allergeenidega (vaata, näiteks, WO 98/49). Viidete hulka, milles on kirjeldatud polünukleotiidide immunostimuleerivat aktiivsust kuuluvad: Krug et al. (01) Eur. J. Immunol. 31:26; Bauer et al. (01) J. Immunol. 166:000; Klinman et al. (1999) Vaccine 17:19; Jahn-Schmid et al. (1999) J. Allergy Clin. Immunol. 4:1; Tighe et al. (00) Eur. J. Immunol. :1939; Shirota et al. (00) J. Immunol. 164:7; Klinman et al. (1999) Infect. Immun. 67:68; Sur et al. (1999) J. Immunol. 162:6284; Magone et al. (00) Eur. J. Immunol. :1841; Kawarada et al. (01) J. Immunol. 167:247; Kranzer et al. (00) Immunology 99:170; Krug et al. (01) Eur. J. Immunol. 31:214; Hartmann et al. (00) J. Immunol. 164:944; Bauer et al. (1999) Immunology 97:699; Fujieda et al. (00) Am. J. Respir. Crit. Care Med. 162:232; Krieg (02) Annu. Rev. Immunol. :709; Verthelyi et al. (02) J. Immunol. 168:169; Hornung et al. (02) J. Immunol. 168:431; Yamamoto et al. (00) Springer Semin. Immunopathol. 22:3; Lee et al. (00) J. Immunol. 16:3631; Gursel et al. (02) J. Leukoc. Biol. 71:813; Gursel et al. (02) Eur. J. Immunol. 32:2617; Broide et al. (01) J. Clin. Immunol. 21:17; Zhu et al. (01) Immunology 3:226; Klinman et al. (02) Microbes Infect. 4:897; Hartmann et al. (00) J. Immunol. 164:1617; Krieg (1999) Biochim. Biophys. Acta 1489:7; Dalpke et al. (02) Immunology 6:2; Yu et al. (02) Biochem. Biophys. Res. Commun. 297:83; Hafner et al. (01) Cancer Res. 61:23; Zwaveling et al. (02) J. Immunol. 169:; Davis et al. (00) Vaccine 18:19; Gierynska et al. (02) J. Virol. 76:668; Lipford et al. (00) J. Immunol. 16:1228; Freidag et al. (00) Infect. Immun. 68:2948; Dieudonne et al. (01) J. Allergy Clin. Immunol. 7:S233. Teiste viidete hulka, milles kirjeldatakse immunostimuleerivaid järjestusi, kuuluvad: Krieg et al. (1989) J. Immunol. 143:2448-241; Tokunaga et al. (1992) Microbiol. Immunol. 36:-66; Kataoka et al. (1992) Jpn. J. Cancer Res. 83:244-247; Yamamoto et al. (1992) J. Immunol. 148:4072-4076; Mojcik et al. (1993) Clin. Immuno. ja Immunopathol. 67:1-136; Branda et al. (1993) Biochem. Pharmacol. 4:37-43; Pisetsky et al. (1994) Life Sci. 4(2):1-7; Yamamoto et al. (1994a) Antisense
4 1 2 Research ja Development. 4:119-122; Yamamoto et al. (1994b) Jpn. J. Cancer Res. 8:77-779; Raz et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:919-923; Kimura et al. (1994) J. Biochem. (Tokyo) 116:991-994; Krieg et al. (199) Nature 374:46-49; Pisetsky et al. (199) Ann. N.Y. Acad. Sci. 772:12-163; Pisetsky (1996a) J. Immunol. 16:421-423; Pisetsky (1996b) Immunity :3-3; Zhao et al. (1996) Biochem. Pharmacol. 1:173-182; Yi et al. (1996) J. Immunol. 16:8-64; Krieg (1996) Trends Microbiol. 4(2):73-76; Krieg et al. (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 6:133-139; Klinman et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:2879-2883; Raz et al. (1996); Sato et al. (1996) Science 273:32-34; Stacey et al. (1996) J. Immunol. 17:2116-2122; Ballas et al. (1996) J. Immunol. 17:1840-184; Branda et al. (1996) J. Lab. Clin. Med. 128:329-338; Sonehara et al. (1996) J. Interferon and Cytokine Res. 16:799-803; Klinman et al. (1997) J. Immunol. 18:363-3639; Sparwasser et al. (1997) Eur. J. Immunol. 27:1671-1679; Roman et al. (1997); Carson et al. (1997) J. Exp. Med. 186:1621-1622; Chace et al. (1997) Clin. Immunol. ja Immunopathol. 84:18-193; Chu et al. (1997) J. Exp. Med. 186:1623-1631; Lipford et al. (1997a) Eur. J. Immunol. 27:2340-2344; Lipford et al. (1997b) Eur. J. Immunol. 27:34-3426; Weiner et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:833-837; Macfarlane et al. (1997) Immunology 91:86-93; Schwartz et al. (1997) J. Clin. Invest. 0:68-73; Stein et al. (1997) Antisense Technology, Ch. 11 pp. 241-264, C. Lichtenstein ja W. Nellen, Eds., IRL Press; Wooldridge et al. (1997) Blood 89:2994-2998; Leclerc et al. (1997) Rak. Immunol. 179:97-6; Kline et al. (1997) J. Invest. Med. 4(3):282A; Yi et al. (1998a) J. Immunol. 160:1240-124; Yi et al. (1998b) J. Immunol. 160:47-4761; Yi et al. (1998c) J. Immunol. 160:898-906; Yi et al. (1998d) J. Immunol. 161:4493-4497; Krieg (1998) Applied Antisense Oligonucleotide Technology Ch. 24, pp. 431-448, C.A. Stein ja A.M. Krieg, Eds., Wiley-Liss, Inc.; Krieg et al. (1998a) Trends Microbiol. 6:23-27; Krieg et al. (1998b) J. Immunol. 161:2428-2434; Krieg et al. (1998c) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9:12631-12636; Spiegelberg et al. (1998) Allergy 3(4S):93-97; Homer et al. (1998) Rak Immunol. 190:77-82; Jakob et al. (1998) J. Immunol. 161:42-49; Redford et al. (1998) J. Immunol. 161:39-393; Weeratna et al. (1998) Antisense & Nucleic Acid Drug Development 8:31-36; McCluskie et al. (1998) J. Immunol. 161(9):4463-4466; Gramzinski et al. (1998) Mol. Med. 4:9-118; Liu et al. (1998) Blood 92:37-3736; Moldoveanu et al. (1998) Vaccine 16: 1216-1224; Brazolot Milan et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9:13-18; Briode et al. (1998) J. Immunol. 161:704-7062; Briode et al. (1999) Int. Arch. Allergy Immunol. 118:43-46; Kovarik et al. (1999) J. Immunol. 162:1611-1617; Spiegelberg et
1 al. (1999) Pediatr. Pulmonol. Suppl. 18:118-121; Martin-Orozco et al. (1999) Int. Immunol. 11:1111-1118; EP 468; WO 96/02; WO 97/2829; WO 98/16247; WO 98/188; WO 98/37919; WO 98/400; WO 98/281; WO 98/49; WO 98/609 ja WO 99/1127. Vaata ka Elkins et al. (1999) J. Immunol. 162:2291-2298, WO 98/2962, WO 99/33488, WO 99/33868, WO 99/129 ja WO 99/62923. Vaata ka Zimmermann et al. (1998) J. Immunol. 160:3627-36; Krieg (1999) Trends Microbiol. 7:64-6 ja U.S. Patent 66313, 72333 ja 849719. Vaata ka Liang et al. (1996) J. Clin. Invest. 98:1119-1129; Bohle et al. (1999) Eur. J. Immunol. 29:2344-233 ja WO 99/67. Vaata ka WO 99/66; WO 00/0688; WO 00/16804; WO 00/216; WO 00/4803; WO 00/6111; WO 00/67023; WO 00/67787 ja U.S. Patent No. 6090791. Vaata ka Manzel et al. (1999) Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 9:49-464; Verthelyi et al. (01) J. Immunol. 166:2372-2377; WO 01/1726; WO 01/12223; WO 01/22972; WO 01/22990; WO 01/3991; WO 01/100; WO 01/47; USA patendid, 6174872, 6194388, 67646, 6214806, 6218371, 6239116. Vaata ka, WO 01/12804; WO 01/470; WO 01/341; WO 01/370; WO 01/627; WO 01/68077; WO 01/68078; WO 01/683; WO 01/68116; WO 01/68117; WO 01/68143; WO 01/68144; WO 01/72123; WO 01/76642; WO 01/83; WO 01/93902; WO 02/02677; WO 02/002; WO 02/069369; WO 02/074922; USA patendid 6339068, 640670, 6426334, 6426336, 6429199, 6476000. Immunomoduleerivad polünukleotiidid sisaldavad tavaliselt CG järjestust. Paistab, et nukleotiidid, mis külgnevad IMP-s CG-ga, mängivad samuti mingit rolli selle polünukleotiidi immunomoduleeriv aktiivsuses. Säilib vajadus immunomoduleerivate polünukleotiidide pideva identifikatsiooni järele. LEIUTISE OLEMUS 2 Käesolev leiutis käsitleb immunomoduleerivaid polünukleotiide (IMP) ja immuunsusreaktsioonide moduleerimist indiviididel, kasutades neid polünukleotiide, eriti inimestel. Ühest aspektist esitleb käesolev leiutis immunomoduleerivad polünukleotiide. Teatud teostusviisides hõlmab käesolev leiutis immunomoduleerivaid kompositsioone, mis sisaldavad ükskõik milliseid käesoleva leiutise kohaseid immunomoduleerivaid polünukleotiide. Need kompositsioonid võivad sisaldada ka, näiteks, farmatseutiliselt vastuvõetavat täidisainet või ükskõik millist arvu teisi komponente, näiteks selliseid, nagu antigeen.
6 Konkreetselt esitleb käesolev leiutis immunomoduleerivad polünukleotiide, mis sisaldavad: a) järjestusi -(TCG(N q )) y (X 1 X 2 CGX 2 X 1 (CG) p ) z milles N tähistab nukleosiide, y=1, p=0 või 1, q=0, 1 või 2, ja z=2-, X 1 ja X 1 on omavahel komplementaarsed nukleosiidid, X 2 ja X 2 on omavahel komplementaarsed nukleosiidid, ja milles järjestuse (TCG(N q )) y T on selle polünukleotiidi otsas; ja b) palindroomset järjestust, pikkusega, vähemalt 8 aluspaari, milles see palindroomne järjestus sisaldab järjestustest (X 1 X 2 CGX 2 X 1 (CG) p ) z esimesena (X 1 X 2 CGX 2 X 1 ) järjestust. 1 2 Peale selle on käesolevas dokumendis kirjeldatud immunomoduleerivaid polünukleotiide, mis sisaldavad (a) palindroomset järjestust, milles on vähemalt kaks CG dinukleotiidi, milles need CG dinukleotiidid on on eraldatud teineteisest 0, 1, 2, 3, 4 või alusega, ja milles see palindroomne järjestus on pikkusega vähemalt 8 alust; ja (b) järjestust (TCG) y, milles y on 1 või 2, milles järjestuse (TCG) y T asetseb 0, 1, 2 või 3 aluse kaugusel selle polünukleotiidi otsast, ja milles järjestus (TCG) y on eraldatud palindroomse järjestuse otsast 0, 1, või 2 alusega. Mõningates käesoleva leiutise kohastes immunomoduleerivates polünukleotiidides, mida on kirjeldatud kas selles käesoleva taotluse lõigus või kusagil mujal, selles sisalduva palindroomse järjestuse aluseline kompositsioon koosneb vähem, kui kahest kolmandikust G -dest ja C -dest. Mõningates teostusviisides, selle palindroomse järjestuse aluseline kompositsioon koosneb enam, kui ühest kolmandikust A -dest ja T -dest. Peale selle on käesolevas dokumendis kirjeldatud immunomoduleerivaid polünukleotiide, mis sisaldavad (a) palindroomset järjestust, mis sisaldab vähemalt kahte CG dinukleotiidi, milles CG dinukleotiidid on eraldatud teineteisest 0, 1, 2, 3, 4 või alusega ja milles see palindroomne järjestus on pikkusega vähemalt 8 alust; ja (b) (TCG) y järjestust, milles y on 1 või 2, milles järjestuse (TCG) y T paikneb 0, 1, 2 või 3 aluse kaugusel selle polünukleotiidi otsast, ja edasi, milles see palindroomne järjestus (a) sisaldab kas osa (TCG) y järjestusest, või seda kogunisti, ja milles järjestusse (TCG) y kuuluv CG võib olla üheks palindroomsesse järjestusse (a) kuuluvatest CG dinukleotiididest. Peale selle on käesolevas dokumendis kirjeldatud immunomoduleerivat polünukleotiidi, mis sisaldab (a) järjestust -N x (TCG(N q )) y N w (X 1 X 2 CGX 2 X 1 (CG) p ) z (SEQ ID NO: 16), milles N tähistab nukleosiide, x=0-3, y=1-4, w=-2, -1, 0, 1 või 2, p= 0 või 1, q=0, 1 või 2,
7 1 ja z=1 -, X 1 ja X 1 on omavahel komplementaarsed nukleosiidid, X 2 ja X 2 on omavahel komplementaarsed nukleosiidid, ja milles järjestuse (TCG(N q )) y T on 0-3 aluse kaugusel selle polünukleotiidi -otsast; ja (b) palindroomset järjestust pikkusega vähemalt 8 alust, milles see palindroomne järjestus sisaldab järjestustest (X 1 X 2 CGX 2 X 1 (CG) p ) z esimesena järjestustest (X 1 X 2 CGX 2 X 1 ). Mõningatel juhtudel, X 1 ja X 2 on mõlemad kas A või T. IMP-s, milles w=-1, järjestuse (TCG(N q )) y 3 otsa alus on esimese järjestuse (X 1 X 2 CGX 2 X 1 (CG) p ) X 1. IMP-s, milles w=-2, eelviimane (s.o, tagant otsast teine) ja viimane (s.o, tagant esimene) järjestus (TCG(N q )) y 3 alused on X 1 ja X 2, esimeses järjestuses (X 1 X 2 CGX 2 X 1 (CG) p ) vastavalt. Peale selle on käesolevas dokumendis kirjeldatud immunomoduleerivat polünukleotiidi, mis sisaldab (a) -N x (TCG(N q )) y N w (X 1 X 2 CGX 3 X 3 CGX 2 X 1 (CG) p ) z (SEQ ID NO: 19), milles N tähistab nukleosiidi, x=0-3, y=1-4, w=-2, -1, 01 või 2, p= 0 või 1, q=0, 1 või 2, ja z=1-, X 1 ja X 1 on omavahel komplementaarsed nukleosiidid, X 2 ja X 2 on omavahel komplementaarsed nukleosiidid, X 3 ja X 3 on omavahel komplementaarsed nukleosiidid, ja milles järjestuse (TCG(N q )) y T on 0-3 aluse kaugusel selle polünukleotiidi -otsast; ja (b) palindroomset järjestust, pikkusega vähemalt alust, milles see palindroomne järjestus sisaldab esimest järjestust (X 1 X 2 CGX 3 X 3 CGX 2 X 1 ) (SEQ ID NO:216) järjestustes (X 1 X 2 CGX 3 X 3 CGX 2 X 1 (CG) p ) z (SEQ ID NO:217). Mõningatel juhtudel, kui p=1, siis X 1, X 2, ja X 3 võib igaüks olla kas A või T. Mõningatel juhtudel, kui p=0, nukleosiididest X 1, X 2, ja X 3 vähemalt kaks on kas A või T. Peale selle on käesolevas dokumendis kirjeldatud immunomoduleerivat polünukleotiidi, 2 mis sisaldab (a) järjestust -N x (TCG(N q )) y N w (X 1 X 2 X 3 X 4 X CGX X 4 X 3 X 2 X 1 (CG) p ) z (SEQ ID NO:160), milles N tähistab nukleosiidi, x=0-3, y=1-4, w=-3, -2, -1, 0, 1 või 2, p= 0 või 1, q=0, 1 või 2, ja z=1-, X 1 ja X 1 on omavahel komplementaarsed nukleosiidid, X 2 ja X 2 on omavahel komplementaarsed nukleosiidid, X 3 ja X 3 on omavahel komplementaarsed nukleosiidid, X 4 ja X 4 on omavahel komplementaarsed nukleosiidid, X ja X on omavahel komplementaarsed nukleosiidid, ja milles järjestuse (TCG(N q )) y T on 0-3 aluse kaugusel selle polünukleotiidi -otsast; ja (b)palindroomset järjestust, pikkusega vähemalt 12 alust, milles see palindroomne järjestus sisaldab esimest järjestust (X 1 X 2 X 3 X 4 X CGX X 4 X 3 X 2 X 1 ) (SEQ ID NO:218) järjestuses (X 1 X 2 X 3 X 4 X CGX X 4 X 3 X 2 X 1 (CG) p ) z (SEQ ID NO:219). Mõningatel juhtudel, vähemalt kolm alustest X 1, X 2, X 3, X 4, ja X on kas A või T.
8 1 2 Peale selle on käesolevas dokumendis kirjeldatud immunomoduleerivat polünukleotiidi, mis sisaldab (a) järjestust -N x (TCG(N q )) y N w (CGX 1 X 1 CG(CG) p ) z (SEQ ID NO:161), milles N tähistab nukleosiidi, x=0-3, y=1-4, w=-2, 0, 1 või 2, p= 0 või 1, q=0, 1 või 2, ja z=1-, milles X 1 ja X 1 on omavahel komplementaarsed nukleosiidid ja milles järjestuse (TCG(N q )) y T on 0-3 aluse kaugusel selle polünukleotiidi -otsast; ja (b) palindroomset järjestust pikkusega vähemalt 8 alust, milles see palindroomne järjestus sisaldab esimest järjestust (CGX 1 X 1 CG) järjestustes (CGX 1 X 1 CG(CG) p ) z. Peale selle on käesolevas dokumendis kirjeldatud immunomoduleerivat polünukleotiidi, mis sisaldab (a) järjestust -N x (TCG(N q )) y N w (X 1 CGCGX 1 (CG) p ), (SEQ ID NO:162), milles N tähistab nukleosiidi, x=0-3, y=1-4, w=-1, 0, 1 või 2, p=0 või 1, q=0, 1 või 2, ja z=1-, X 1 ja X 1 on omavahel komplementaarsed nukleosiidid, ja milles järjestuse (TCG(N q )) y T on 0-3 aluse kaugusel selle polünukleotiidi -otsast; ja (b) palindroomset järjestust pikkusega vähemalt 8 alust, milles see palindroomne järjestus sisaldab esimest järjestust (X 1 CGCGX 1 ) järjestustes (X 1 CGCGX 1 (CG) p ) z. Peale selle on käesolevas dokumendis kirjeldatud immunomoduleerivat polünukleotiidi, mis sisaldab (a) järjestust -N x (TCG(N q )) y N w (X 1 X 2 CGCGX 2 X 1 (CG) p ) z (SEQ ID NO:163), milles N tähistab nukleosiidi, x=0-3, y=1-4, w=-2, -1, 0, 1 või 2, p= 0 või 1, q=0, 1 või 2, ja z=1-, X 1 ja X 1 on omavahel komplementaarsed nukleosiidid, X 2 ja X 2 on omavahel komplementaarsed nukleosiidid, ja milles järjestuse (TCG(N q )) y T on 0-3 aluse kaugusel selle polünukleotiidi -otsast; ja (b) palindroomset järjestust pikkusega vähemalt 8 alust, milles see palindroomne järjestus sisaldab esimest järjestust (X 1 X 2 CGCGX 2 X 1 ) järjestustes (X 1 X 2 CGCGX 2 X 1 (CG) p ) z (SEQ ID NO:2). Mõningatel juhtudel, X 1 ja X 2 on kas A või T. Peale selle on käesolevas dokumendis kirjeldatud immunomoduleerivat polünukleotiidi, mis sisaldab (a) järjestust -N x (TCG(N q )) y N w (X 1 X 2 X 3 CGCGX 3 X 2 X 1 (CG) p ) z (SEQ ID NO:164), milles N tähistab nukleosiidi, x=0-3, y=1-4, w=-3, -2, -1, 0, 1 või 2, p= 0 või 1, q=0, 1 või 2, ja z=1-, X 1 ja X 1 on omavahel komplementaarsed nukleosiidid, X 2 ja X 2 on omavahel komplementaarsed nukleosiidid, X 3 ja X 3 on omavahel komplementaarsed nukleosiidid, ja milles järjestuse (TCG(N q )) y T on 0-3 aluse kaugusel selle polünukleotiidi -otsast; ja (b) palindroomset järjestust, pikkusega vähemalt alust, milles see palindroomne järjestus sisaldab esimest järjestust (X 1 X 2 X 3 CGCGX 3 X 2 X 1 ) (SEQ ID NO:221) järjestustest (X 1 X 2 X 3 CGCGX 3 X 2 X 1 (CG) p ) z (SEQ ID NO:222).
9 Mõningatel juhtudel, kui p=1, X 1, X 2, ja X 3 võib igaüks olla kas A või T. Mõningatel juhtudel, kui p=0, vähemalt kaks nukleosiididest X 1, X 2, ja X 3 on kas A või T. 1 2 Peale selle on käesolevas dokumendis kirjeldatud immunomoduleerivat polünukleotiidi, mis sisaldab a) järjestust -N x (TCG(N q )) y N w (CGX 1 X 2 X 2 X 1 CG(CG) p ) z (SEQ ID NO:16), milles N tähistab nukleosiidi, x=0-3, y=1-4, w=-2, 0, 1 või 2, p= 0 või 1, q=0, 1 või 2, ja z=1-, X 1 ja X 1 on omavahel komplementaarsed nukleosiidid, X 2 ja X 2 on omavahel komplementaarsed nukleosiidid, ja milles järjestuse (TCG(N q )) y T on 0-3 aluse kaugusel selle polünukleotiidi -otsast; ja (b) palindroomset järjestust pikkusega vähemalt 8 alust, milles see palindroomne järjestus sisaldab esimest järjestust (CGX 1 X 2 X 2 X 1 CG) järjestustest (CGX 1 X 2 X 2 X 1 CG(CG) p ) z (SEQ ID NO:223). Mõningatel juhtudel on nukleosiididest X 1 ja X 2 kumbki kas A või T. Teisest aspektist esitleb käesolev leiutis käesoleva leiutise kohast immunomoduleerivat polünukleotiidi, mis on ette nähtud kasutamiseks immuunsusreaktsiooni moduleerimisel indiviidis. Käesoleva leiutise kohane immunomoduleeriv polünukleotiid manustatakse indiviidile koguses, mis on piisav selleks, et moduleerida immuunsusreaktsiooni nimetatud indiviidis. Käesoleva leiutise kohane immunomodulatsioon võib olla kasutatud indiviididel, kaasaarvatud isikud, kes kannatavad tervisehäire all, mis on seotud Th2-tüüpi immuunsusreaktsiooniga (näiteks, allergiate, allergia poolt indutseeritud astma, või atoopilise dermatiidiga), indiviididel, kes saavad vaktsiine, näiteks selliseid, nagu terapeutilised vaktsiinid (näiteks, vaktsiinid, mis sisaldavad allergia epitoope, mükobakteriaalseid epitoope või tuumoriga seotud epitoope) või profülaktilisi vaktsiine, indiviididele, kellel on vähk, ja nakkushaigusega indiviididele. Teisest aspektist esitleb käesolev leiutis käesoleva leiutise kohast immunomoduleerivat polünukleotiidi, mis on ette nähtud kasutamiseks interferoon-gamma (IFN-γ) taseme tõstmiseks indiviidis. Nimetatud indiviidile manustatakse efektiivne kogus käesoleva leiutise kohast immunomoduleerivat polünukleotiidi. Käesoleva leiutise kohase immunomoduleeriva polünukleotiidi manustamine tõstab IFN-γ tasemeid indiviidis. Teisest aspektist esitleb käesolev leiutis käesoleva leiutise kohast immunomoduleerivat polünukleotiidi kasutamiseks alfa-interferooni (IFN-α) tasemete tõstmiseks indiviidis. Nimetatud indiviidile manustatakse efektiivne kogus käesoleva leiutise kohast immunomoduleerivat polünukleotiidi. Käesoleva leiutise kohase immunomoduleeriva polünukleotiidi manustamine tõstab IFN-α tasemeid indiviidis.
1 Teisest aspektist esitleb käesolev leiutis käesoleva leiutise kohast immunomoduleerivat polünukleotiidi kasutamiseks ühe või enama nakkushaiguse sümptoomi leevendamisel. Nimetatud indiviidile, kes põeb nakkushaigust, manustatakse efektiivne kogus käesoleva leiutise kohast immunomoduleerivat polünukleotiidi. Käesoleva leiutise kohase immunomoduleeriva polünukleotiidi manustamine leevendab ühte või enamat nakkushaiguse sümptoomi. Teisest aspektist esitleb käesolev leiutis käesoleva leiutise kohast immunomoduleerivat polünukleotiidi, mis on ette nähtud kasutamiseks ühe või enama IgE-ga seotud tervisehäire sümptoomi leevendamisel. Nimetatud indiviidile, kellel on IgE-ga seotud tervisehäire, manustatakse efektiivne kogus käesoleva leiutise kohast immunomoduleerivat polünukleotiidi. Käesoleva leiutise kohase immunomoduleeriva polünukleotiidi manustamine leevendab ühte või enamat IgE-ga seotud tervisehäire sümptoomi. Käesolev leiutis esitleb samuti käesoleva leiutise kohase immunomoduleeriva polünukleotiidi kasutamist ravimi valmistamiseks, mis on ette nähtud astma raviks, ja käesoleva leiutise kohase immunomoduleeriva polünukleotiidi kasutamist astma raviks. Siin on kirjeldatud komplekte, mis on ette nähtud käesoleva leiutise teostuseks. Need komplektid sisaldavad tavaliselt käesoleva leiutise kohast immunomoduleerivat polünukleotiidi (tavaliselt sobivas mahutis), ja võivad lisaks sisaldada instruktsioone immunomoduleeriva polünukleotiidi kasutamiseks indiviidi immunomodulatsioonil. JOONISTE LÜHIKIRJELDUS Joonisel fig 1 on toodud kõverad, mis kirjeldavad IFN-α koguseid (pg/ml), mis on produtseeritud inimese PBMC-de poolt vastuseks nelja erineva IMP-i: SEQ ID NO: 1, 27, 113 ja 172 erinevatele doosidele. 2 Joonisel fig 2 on toodud kõverad, mis kujutavad IMP-de poolt stimuleeritud NK raku lüütilist aktiivsust. KÄESOLEVA LEIUTISE TEOSTAMISE VIISID Me oleme uurinud immunomoduleerivaid polünukleotiide ja meetodeid immuunsusreaktsioonide moduleerimiseks indiviidides, eriti inimeses, kasutades neid immunomoduleerivaid polünukleotiide. Käesoleva leiutise kohased kompositsioonid sisaldavad käesoleva leiutise kohast immunomoduleerivat polünukleotiidi. Leiutisekohased immunomoduleerivad polünukleotiidid sisaldavad:
11 a) järjestusi -(TCG(N q )) y (X 1 X 2 CGX 2 X 1 (CG) p ) z, milles N tähistab nukleosiidi, y=1, p=0 või 1, q=0, 1 või 2, ja z=2-, X 1 ja X 1 on omavahel komplementaarsed nukleosiidid, X 2 ja X 2 on omavahel komplementaarsed nukleosiidid, ja milles järjestuse (TCG(N q )) y T on leiutisekohase polünukleotiidi otsas; ja b) palindroomset järjestust pikkusega vähemalt 8 alust, milles see palindroomne järjestus sisaldab esimest järjestust (X 1 X 2 CGX 2 X 1 ) järjestustes (X 1 X 2 CGX 2 X 1 (CG) p ) z. 1 2 Me oleme leidnud, et käesoleva leiutise kohased immunomoduleerivad polünukleotiidid moduleerivad efektiivselt immunsusrakke, kaasaarvatud inimese rakud; erinevatel viisidel. Me oleme täheldanud, et käesoleva leiutise kohased immunomoduleerivad polünukleotiidid võivad efektiivselt stimuleerida tsütokiini, kaasaarvatud I tüüpi interferoonide, selliste, nagu IFN-α ja IFN-ω, ning IFN-γ, produktsiooni inimese rakkudes. Me oleme täheldanud, et käesoleva leiutise kohased immunomoduleerivad polünukleotiidid võivad efektiivselt stimuleerida B-rakke vohama. Me oleme täheldanud, et käesoleva leiutise kohased immunomoduleerivad polünukleotiidid võivad aktiveerida plasmatsütoidseid dendriitseid rakke küpsema. Me oleme täheldanud ka, et mõningate käesoleva leiutise kohaste immunomoduleerivate polünukleotiidide juuresolek võib tulemusena põjustada plasmatsütoidsete dendriitsete rakkude apoptoosi aeglustumist kultuuris. Käesolev leiutis esitleb samuti käesoleva leiutise kohast immunomoduleerivat polünukleotiidi, mis on ette nähtud kasutamiseks immuunsusreaktsiooni moduleerimisel indiviidis. Käesoleva leiutise kohane immunomoduleeriv polünukleotiid manustatakse indiviidile. Järgnevalt on kirjeldatud komplekte, mis sisaldavad käesoleva leiutise kohaseid IMP-sid. Need komplektid võivad lisaks sisaldada instruktsioone käesoleva leiutise kohaste immunomoduleerivate polünukleotiidide manustamiseks, et esile kutsuda immunomodulatsiooni subjektis, ja immunomoduleerivaid polünukleotiide. Põhilised metoodikad Käesoleva leiutise rakendamisel kasutatakse, kui teisiti ei ole näidatud, traditsioonilisi elle ala spetsialistile teada olevaid molekulaarbioloogia (kaasaarvatud rekombinantse nukleiinhappe metoodikad), mikrobioloogia, rakubioloogia, biokeemia ja immunoloogia metoodikaid. Selliseid metoodikaid on kirjeldatud detailides sellistes allikates, nagu: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989);
12 Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Handbook of Experimental Immunology, (D.M. Weir & C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecularbiology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polümeerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); The Immunoassay Handbook (D. Wild, ed., Stockton Press NY, 1994); Bioconjugate Techniques (Greg T. Hermanson, ed., Academic Press, 1996); ja Methods of Immunological Analysis (R. Masseyeff, W.H. Albert, ja N.A. Staines, eds., Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbh, 1993). Definitsioonid Kasutatuna siin, ainsuse vorm sisaldab viiteid ka mitmuses, kui teisiti näidatud ei ole. Näiteks, üks IMP sisaldab ühte või enamat IMP-d. 1 2 Kasutatuna vahetatavalt siin, terminid polünukleotiid ja oligonukleotiid hõlmavad üheahelalisi DNA-sid (ssdna-single-stranded DNA), kaheahelalisi DNA-sid (dsdnadouble-stranded DNA), üheahelalisi RNA-sid (ssrna) ja kaheahelalisi RNA-sid (dsrna), modifitseeritud oligonukleotiide ja oligonukleosiide või nende kombinatsioone. See oligonukleotiid võib olla mittehargneva või tsirkulaarse konfiguratsiooniga, või see oligonukleotiid võib sisaldada mittehargnevaid ja tsirkulaarseid segmente. Oligonukleotiidid on nukleosiidide polümeerid, mis on ühendatud tavaliselt, fosfodiestersidemetega, kuigi oligonukleotiidides võivad olla kasutatud ka alternatiivsed aheldused, selliseid nagu fosfortioaatestrid. Nukleosiidiks võib olla puriinalus (adeniin (A) või guaniin (G) või nende derivaadid) või pürimidiinalus (tümiin (T), tsütosiin (C) või uratsüül (U), või nende derivaadid), mis on omavahel seotud suhkruga. Neid nelja nukleosiidühikut (või alust) DNA-s nimetatakse deoksüadenosiiniks, deoksüguanosiiniks, deoksütümidiiniks ja deoksütsütidiiniks. Nukleotiidiks on nukleosiidi fosfaatester. Termin immunomoduleeriv polünukleotiid või IMP, kasutatuna siin viitab polünukleotiidile, mis toimib ja/või annab oma panuse mõõdetavasse immuunsesse reaktsiooni, mõõdetuna in vitro, in vivo ja/või ex vivo. Mõõdetavate immuunsusreaktsioonide näidete hulka kuuluvad, kuid ei ole nendega piiratud, antigeenispetsiifiline antikehade produktsioon, tsütokiinide sekretsioon, lümfotsüütide populatsioonide, selliste nagu NK rakud, CD4+ T lümfotsüüdid, CD8+ T lümfotsüüdid, B
13 lümfotsüüdid ja muu taolise aktivatsioon või ekspansioon. Eelistatavalt aktiveerivad leiutisekohased IMP järjestused eelisjärjekorras Th1-tüüpi reaktsiooni. 1 2 Termin immunomoduleeriv või immuunsusreaktsiooni moduleeriv kasutatuna siin hõlmab immunostimuleerivat, aga ka immunosupressiivset efekti. Immunomodulatsioon on primaarselt kvalitatiivne muutus üldises immuunsusreaktsioonis, kuigi, seoses immunomodulatsiooniga võivad aset leida ka kvantitatiivsed muutused. Käesoleva leiutise kohaselt immunomoduleeritud immuunsusreaktsioon on selle nihe kas Th1-tüüpi immuunvastuse suunas, vastandina Th2-tüüpi immuunvastusele. Th1-tüüpi vastuseid vaadeldakse tüüpiliselt tsellulaarse immuse süsteemi (näiteks, tsütotoksiliste lümfotsüütide) reaktsioonidena, samal ajal, kui Th2-tüüpi reaktsioonid on tavaliselt humoraalsed, või antikehadel põhinevad. Th1-tüüp immuunvastus on tavaliselt sellised, mida iseloomustavad aeglustatud tüüpi ülitundlikkuse reaktsioonid antigeeni vastu, ja võivad olla detekteeritud biokeemilisel tasemel kõrgendatud tasemete Th1-ga seotud tsütokiinide, selliseid nagu IFN-γ, IFN-α, IL-2, IL-12, ja TNF-β, aga ka IL-6 põhjal, kuigi IL-6 võib samuti olla seotud ka Th2-tüüpi reaktsioonidega. Th1-tüüpi immuunsusreaktsioonid on tavaliselt seotud tsütotoksiliste lümfotsüütide (CTL) produktsiooniga, ja antikehade madala taseme või nende transienstse produktsiooniga. Th2-tüüpi immuunsusreaktsioonid on tavaliselt seotud antikehade produktsiooni kõrgemate tasemetega, kaasaarvatud IgE produktsioon, CTL produktsiooni puudumise või nende produktsiooni minimaalse tasemega, aga ka selliste Th2-ga seotud tsütokiinide, nagu IL-4 ekspressiooniga. Vastavalt sellele, käesoleva leiutise kohaseks immunomodulatsiooniks võib olla tunnistatud, näiteks, IFN-γ ja/või IFN-α tasemete tõus ja/või IgE produktsiooni langus indiviidis, keda töödeldi vastavalt käesolevale leiutisele võrreldes ravi puudumisega. Termin 3 viitab tavaliselt piirkonnale või asendile polünukleotiidis või oligonukleotiidis 3 (pärisuunas) teisest piirkonnast või asendist samas polünukleotiidis või oligonukleotiidis. Termin 3 ots viitab selle polünukleotiidi 3 otsale. Termin viitab tavaliselt piirkonnale või asendile polünukleotiidis või oligonukleotiidis (vastassuunas) teisest piirkonnast või asendist samas polünukleotiidis või oligonukleotiidis. Termin ots viitab selle polünukleotiidi otsale. Piirkond, osa või järjestus, mis on külgnev teise järjestusega, piirneb selle piirkonna, osa või järjestusega. Näiteks, lisa polünukleotiidjärjestus (näiteks, TCG trinukleotiid), mis
14 1 külgneb immunomoduleeriva polünukleotiidi konkreetse osaga, ehk piirneb selle piirkonnaga. Termin palindroomne järjestus või palindroom viitab nukleiinhappe järjestusele, mis on pööratud korduseks, näiteks, ABCDD C B A, milles selles sisalduvad alused, näiteks, A, ja A, B ja B, C ja C, D ja D, on võimelised moodustama Watson-Cricki aluspaare. Sellised järjestused võivad olla üheahelalised või võivad mõningates tingimustes moodustada kaheahelalisi struktuure, või nad võivad moodustada juuksenõelastruktuure. Näiteks, kasutatuna siin, 8 aluseline palindroom viitab nukleiinhappe järjestusele, milles see palindroomne järjestus on pikkusega 8 alust, näiteks sellisele nagu ABCDD C B A. Palindroomne järjestus võib olla osaks polünukleotiidist, mis sisaldab ka mittepalindroomseid järjestusi. Polünukleotiid võib sisaldada ühte või enamat palindroomse järjestuse osa ja ühte või enamat mittepalindroomset järjestuseosa. Alternatiivselt, polünukleotiidjärjestus võib olla täielikult palindroomne. Polünukleotiidis, mis sisaldab enam, kui ühte palindroomset järjestuseosa, selle palindroomse järjestuse osad võivad kattuda üks teisega, või selle palindroomse järjestuse osad võivad mitte kattuda üks teisega. Termin konjugaat viitab kompleksile, milles IMP ja antigeen on aheldatud. Selliste konjugaadi ahelduste hulka kuuluvad kovalentsed ja/või mittekovalentsed aheldused. 2 Termin antigeen tähendab ainet, mis tuntakse ja seostatakse spetsiifiliselt antikeha või T-raku antigeeni retseptori poolt. Antigeenide hulka võiva kuuluda peptiidid, valgud, glükoproteiinid, polüsahhariidid, keerulised süsivesikud, suhkrud, gangliosiidid, lipiidid ja fosfolipiidid; nende osad ja nende kombinatsioonid. Need antigeenid võivad olla nii looduslikud kui ka sünteetilised. Antigeenide hulka, mis sobivad manustamiseks koos IMP-ga, kuuluvad ükskõik millised molekulid, mis on võimelised esile kutsuma B-raku või T-raku antigeenspetsiifilist reaktsiooni. Eelistatavalt kutsuvad antigeenid antikehavastuse, mis on spetsiifiline antigeeni suhtes. Hapteenid on samuti hõlmatud käesoleva leutisega terminiga antigeen. Hapteen on madalmolekulaarne ühend, mis iseenesest ei ole immunogeenne, kuid muutub immunogeenseks, kui see konjugeerida immunogeense molekuliga, mis sisaldab antigeenseid determinante. Väikesed molekulid võivad vajada nende muutmist hapteenideks, et muuta nad antigeenseteks. Eelistatavalt kuuluvad käesoleva leiutise kohaste antigeenide hulka peptiidid, lipiidid (näiteks, steroolid, rasvhapped ja fosfolipiidid), selliseid polüsahhariidid, nagu need, mida kasutatakse Hemophilus influenza vaktsiinides, gangliosiidid ja glükoproteiinid.
1 Adjuvant viitab ainele, mis, kui seda lisada sellisele immunogeensele agensile, nagu antigeen, võimendab mittespetsiifiliselt retsipientperemehe immuunvastust agensi suhtes, kokkupuutel selle seguga. 1 2 Termin peptiid viitab polüpeptiididele, mis on piisava pikkuse ja koostisega selleks, et esile kutsuda bioloogiline reaktsiooni, näiteks, antikehade produktsiooni või tsütokiini aktiivsusi, ükskõik, kas see peptiid on või ei ole hapteen. Tüüpiliselt, need peptiidid on vähemalt kuue aminohappejäägi pikkusega. Termin peptiid sisaldab lisaks modifitseeritud aminohappeid (ükskõik, kas nad on looduslikud või mittelooduslikud), kus nende modifikatsioonide hulka kuuluvad, kuid ei ole nendega piiratud, fosforüleerimine, glükosüleerimine, pegüleerimine, lipidiseerimine ja metüleerimine. Antigeensete peptiidide hulka kuuluvad puhastatud natiivsed peptiidid, sünteetilised peptiidid, rekombinantsed valgud, toored valguekstraktid, nõrgendatud või inaktiveeritud viirused, rakud, mikroorganismid või selliste peptiidide fragmendid. Antigeenne peptiid või antigeenne polüpeptiid vastavalt tähendavad täit või osa polüpeptiidi, millel on üks või enam antigeenset omadust. Näiteks, Amb a 1 antigeenne polüpeptiid või Amb a 1 polüpeptiidne antigeen on Amb a 1 aminohappejärjestus, kas terve, osa sellest, ja/või selle järjestuse modifikatsioon, millel on antigeensed omadused (s.o, ta seostub spetsiifiliselt antikehaga või T-raku retseptoriga). Kohaletoimetav molekul või kohaletoimetav kandja on keemiline molekuliosa, mis hõlbustab, võimaldab ja/või intensiivistab immunomoduleeriva polünukleotiidi kohaletoimetamist konkreetsesse kohta ja/või konkreetseks ajaks. Kohaletoimetav kandja võib, või ei või täiendavalt stimuleerida immuunsusreaktsiooni. Allergiline reaktsioon antigeenile tähendab immuunsusvastust, mida tavaliselt iseloomustavad eosinofiilid ja/või antigeenispetsiifiliste IgE-de tekitamine, ja nende tulemusena aset leidvad efektid. Nagu sel alal on hästi teada, IgE seostub IgE retseptoritega nuumrakkudel ja basofiilidel. Hilisemal kokkupuutel allergilise antigeeniga, mille IgE ära tunneb, see antigeen ristsidestab IgE nuumrakkudel ja basofiilidel, põhjustades nende rakkude degranulatsiooni, kaasaarvatud histamiini vabanemise, kuid ei ole sellega piiratud. Eelduseks on võetud ja on ette nähtud, et terminid allergiline reaktsioon antigeenile, allergia ja allergiline seisund on võrdselt sobivad rakendamiseks käesolevas leiutises. Edasi, eelduseks on võetud ja on ette nähtud, et
16 käesoleva leiutise kasutuste hulka kuuluvad võrdselt allergilise reaktsiooni vältimine, aga ka eelnevalt juba olemasolevate allergiliste seisundite ravi. Kasutatuna siin, termin allergeen tähendab antigeeni või molekuli antigeenset osa, tavaliselt valgumolekuli osa, mis kutsub esile allergilise reaktsiooni kokkupuutel subjektiga. Tüüpiliselt näitab subjekti allergilisust konkreetse allergeeni suhtes, näiteks, selle allergeeni nahatorketest või ükskõik milline sellel alal tuntud analoogne meetod. Molekul on allergeen, isegi kui ainult väikesel subjektide alamrühmal ilmneb allergiline (näiteks, IgE) immuunsusreaktsioon kokkupuutel selle molekuliga. Senisel tehnika tasemel on teada suur hulk eraldatud allergeene. Nende hulka kuuluvad allergeenid, mis on esitatud siin, tabelis 1, kuid ei ole nendega piiratud. Termin desensitiseerimine viitab protsessile, milles manustatakse kasvavaid doose allergeene, mille vastu subjektil on leitud tundlikkus. Näited allergeeni doosidest, mida kasutatakse desensitiseerimiseks on sellel alal teada, vaata, näiteks, Fornadley (1998) Otolaryngol. Clin. North Am. 31:111-127. 1 2 Antigeenspetsiifiline immunoteraapia viitab ükskõik millisele immunoteraapia vormile, milles kasutatakse antigeeni, ja mis genereerib antigeenispetsiifilist immuunsusreaktsiooni modulatsiooni. Allergia kontekstis, sisaldab antigeenispetsiifiline immunoteraapia desensitiseerimisravi, kuid ei ole sellega piiratud. Termin mikrokandja viitab mikroosakestest kompositsioonile, mis ei ole lahustuvad vees ja milles osakeste suurus on vähem kui ligikaudu 10, 1 või 0 µm, eelistatavalt vähem, kui ligikaudu 0-60 µm, eelistatavalt vähem, kui ligikaudu µm, eelistatavalt vähem, kui ligikaudu, 2,, 2 või 1, µm. Mikrokandjate hulka kuuluvad ka nanokandjad, mis on mikrokandjad, mille suurus on väiksem, kui ligikaudu 1 µm, eelistatavalt väiksem, kui ligikaudu 00 nm. Mikrokandjate hulka kuuluvad selliseid tahkefaasilised osakesed, nagu osakesed, mis on moodustatud biokokkusobivatest looduslikest polümeeridest, sünteetilistest polümeeridest või sünteetilistest kopolümeeridest, kuigi mikrokandjad, mis on moodustatud agaroosist või ristsidestatud agaroosist, võivad olla mikrokandjate defunitsiooni sisse lülitatud või sellest välja lülitatud, samuti, nagu ka teised sellel alal tuntud biodegradeeruvad materjalid. Mikrokandjad, mis on ette nähtud kasutamiseks käesolevas leiutises, võivad olla biodegradeeruvad või mitte biodegradeeruvad. Mitte biodegradeeruvad tahkefaasilised mikrokandjad on moodustatud polümeeridest või teistest materjalidest, mis on mitte-
17 1 2 lagunevad ja/või mittedegradeeruvad imetajate füsioloogilistes tingimustes, selliseid nagu polüstüreen, polüpropüleen, ränioksiid, keraamika, polüakrüülamiid, kuld, lateks, hüdroksüapatiit, dekstraan ja ferromagneetilised ja paramagnetilised materjalid. Biodegradeeruvad tahkefaasilised mikrokandjad võivad olla moodustatud polümeeridest, mis on degradeeruvad (näiteks, polü(piimhape), polü(glükoolhape) ja nende kopolümeerid), või lagunevad (näiteks, polü(ortoestrid), selliseid nagu 3,9-dietülideen- 248-tetraoksaspiro[.]undekaan (DETOSU) või polü(anhüdriidid), selliseid nagu sebatsiilhappe polü(anhüdriidid)) imetaja füsioloogilistes tingimustes. Mikrokandjad võivad olla ka vedelafaasilised (näiteks, õli või lipiidi alusel), sellised liposoomid, ISKOM-id (immunostimuleerivad kompleksid, mis on kolesterooli, fosfolipiidi ja adjuvandi toimega saponiini stabiilsed kompleksid) ilma antigeenita, või tilgad või mitsellid emulsioonides õli-vees või vesi-õlis. Biodegradeeruvad vedelafaasilised mikrokandjad sisaldavad tüüpiliselt biodegradeeruvat õli, milliseid on sellel ala teada suur hulk, kaasaarvatud skvaleen ja taimeõlid. Mikrokandjad on tüüpiliselt sfäärilise kujuga, kuid mikrokandjad, mis ei ole sfäärilise kujuga, on samuti aktsepteeritavad (näiteks, ellipsoidsed, kepikeste kujulised, jne). Et need mikrokandjad on lahustumatud (vee suhtes), siis nad on väljafiltreeritavad veest ja vesilahustest. Termin mittebiodegradeeruv, kasutatuna siin, viitab mikrokandjale, mis ei ole degradeeruv või lagunev normaalsetes imetaja füsioloogilistes tingimustes. Tavaliselt, mikrokandjat peetaskse mittebiodegradeeruvaks, kui see ei degradeeru (s.o, kaotab vähem, kui % oma massist või keskmisest polümeeri pikkusest) pärast 72 tunnist inkubatsiooni 37 C juures normaalses inimese seerumis. Mikrokandjat vaadeldakse kui biodegradeeruvat, kui see on degradeeruv või lagunev normaalsetes imetaja füsioloogilistes tingimustes. Tavaliselt peetakse mikrokandjat biodegradeeruvaks, kui see laguneb (s.o, kaotab vähemalt % oma massist või keskmisest polümeeri pikkusest) pärast 72 tunnist inkubatsiooni 37 C juures normaalses inimese seerumis. Mikrokandja mõõtmed on tavaliselt nominaalsed mõõtmed või tootja poolt kindlaks määratud mõõtmed. Mikrokandja mõõtmed võivad olla otseselt mõõdetavad, selliseid nagu keskmine või maksimaalne diameeter, või võivad olla määratud kaudse testiga, näiteks sellisega, nagu filtratsioonsõelumise analüüsiga (filtration screening assay). Mikrokandja osakeste mõõtmete otsene määramine viiakse läbi tüüpiliselt kasutades mikrosoopiat, tavaliselt valgusmikroskoopiat või skaneerivat elektronmikroskoopiat
18 1 2 (SEM), võttes võrdluseks osakesed, mille suurus on teada, või toetudes mikromeetri näitudele. Tootmisprotsessis tekkivate väikeste variatsioonidega osakeste suurusi peetakse nominaalseteks, kui mõõtmised näitavad, et mikrokandjate osakeste mõõmed moodustavad ligikaudu ±-% äranäidatud mõõtmetest. Mõõtude karakteristikud võivad samuti olla määratud meetoditega, milles mõõdetakse dünaamilist valguse hajumist (dynamic light scattering) või neeldunud kiirgusosa (obscuration). Alternatiivselt võib mikrokandja suurus olla määratud filtratsioonsõelumise testiga. Mikrokandja on suuruselt väiksem, kui kinnitatud, kui vähemalt 97% osakestest läbib kinnitatud mõõtmetega sõela tüüpi filtri (s.o, filter mille puhul kinni peetud osakesed jäävad filtri pinnale, mis on valmistatud sellisest materjalist, nagu polükarbonaat või polüeetersulfoon, erinevalt sügavfiltrist ( depth filter ), milles kinnipeetud osakesed jäävad kinni filtrisse). Mikrokandja on suuremate mõõtmetega, kui kinnitatud, kui vähemalt ligikaudu 97% mikrokandja osakestest peetakse kinni kindlaksmääratud mõõtmetega sõela tüüpi filtril. Seega, vähemalt ligikaudu 97% mikrokandjat mõõtmetega ligikaudu µm kuni ligikaudu nm, läbib µm pooridega sõela tüüpi filtri ja peetakse kinni µm sõela tüüpi filtril. Nagu nähtub eelpoolsest arutelust, viited mõõtmetele või mõõtmete vahemikule mikrokandja puhul, sisaldavad kaudselt ligikaudseid variatsioone ja lähendusi kindlaksmääratud mõõtmetele ja/või mõõtmete diapasoonile. See peegeldub termini ligikaudu kasutamises, kui viidatakse mõõtmetele ja/või mõõtmete ulatusele, ja kui viidatakse mõõtmetele või mõõtmete vahemikule kasutamata terminit ligikaudu, siis see ei tähenda, et mõõtmed ja/või mõõtmete vahemik on täpsed. Termin immunomoduleeriv polünukleotiid/mikrokandja kompleks või IMP/MC kompleks viitab immunomoduleeriva polünukleotiidi ja mikrokandja kompleksile. Selle kompleksi komponendid võivad olla kovalentselt või mittekovalentselt aheldatud. Mittekovalentsed aheldused võivad olla vahendatud ükskõik milliste mittekovalentsete sidemetega, kaasaarvatud hüdrofoobne interaktsioon, ioonsed (elektrostaatiline) sidemed, vesiniksidemed ja/või van der Waalsi jõud. Hüdrofoobse seostumise puhul toimub see seostumine tavaliselt hüdrofoobse molekuliosa kaudu (näiteks, kolesterooli), mis on kovalentselt seotud IMP-ga. Indiviidiks on selgroogne, näiteks selline, nagu lind, ja on eelistatavalt imetaja, enam eelistatavalt inimene. Imetajate hulka kuuluvad, kuid ei ole nendega piiratud, inimesed, primaadid, kariloomad, loomad, kes osalevad spordis, närilised ja lemmikloomad.
19 1 2 Efektiivne kogus või piisav kogus ainet on selline kogus ainet, mis on piisav selleks, et saavutada kasulikud või soovitavad tulemused, kaasaarvatud kliinilised tulemused, ja, kui selline, efektiivne kogus sõltub kontekstist, milles seda kavatsetakse rakendada. Selles kontekstis, kui manustatakse kompositsioon, mis moduleerib immuunsusreaktsiooni koosmanustatud antigeenile, on immunomoduleeriva polünukleotiidi ja antigeeni efektiivseks koguseks selline kogus, mis on piisav selleks, et saavutada selline modulatsioon võrreldes immuunsusreaktsiooniga, mis saadakse, kui see antigeen manustatakse üksinda. Efektiivne kogus võib olla manustatud ühe või enama manustamiskorraga. Termin koosmanustamine kasutatuna siin, viitab vähemalt kahe erineva aine manustamisele piisavalt lühikese aja jooksul, subjektile, et moduleerida immuunsusreaktsiooni. Eelistatavalt, termin koosmanustamine viitab vähemalt kahe erineva aine üheaegsele manustamisele. Reaktsiooni või parameetri stimulatsioon sisaldab selle reaktsiooni või parameetri esilekutsumist ja/või võimendamist. Näiteks, immuunvastuse, näiteks Th1 reaktsiooni stimulatsioon, tähendab selle reaktsiooni tugevnemist, mis võib tekkida reaktsiooni esilekutsumisest ja/või võimendamisest. Analoogselt sellele, tsütokiini või raku tüübi (näiteks CTL-de) stimulatsioon tähendab tsütokiini või raku tüübi koguse või taseme suurenemist. B-raku stimulatsioon hõlmab, näiteks, suurendatud B-raku proliferatsiooni, indutseeritud B-raku aktivatsiooni ja/või produktsioon tsütokiinide, näiteks IL-6 ja/või TNF-α suurendatud produktsiooni stimuleeritud B-rakkude poolt. IgE-ga seotud häire on füsioloogiline seisund, mida iseloomustavad osaliselt kõrgendatud IgE tasemed, mis võivad olla, aga võivad ka mitte olla, persistentsed. IgE-ga seotud tervisehäirete hulka kuuluvad, kuid ei ole nendega piiratud, allergia ja allergilised reaktsioonid, toiduallergiad, allergiaga seotud häired (mida on kirjeldatud allpool), astma, riniit, atoopiline dermatiit, konjunktiviit, urtikaaria, šokk, allergiad Hymenoptera nõelamisest, ja ravimiallergiad ning parasiitnakkused. See termin sisaldab ka nende tervisehäiretega kaasnevaid ilminguid. Tavaliselt on IgE sellistes häiretes antigeenispetsiifiline. Allergiaga seotud häire tähendab tervisehäiret, mille on põhjustanud antigeenispetsiifiline IgE immuunsusreaktsioon. Selliste efektide hulka võivad kuuluda, kuid ei ole nendega piiratud, hüpotensioon ja šokk. Anafülaksia on üks näide allergiaga seotud seotud häiretest, mille käigus vereringlusse vabanev histamiin põhjustab
vasodilatsiooni, aga ka kapillaaride suurendatud permeaablust, mille tulemuseks on suur plasma kadu vereringest. Anafülaksia võib kulgeda süsteemselt, vastavate tagajärgedega kogu organismis, kuid see võib kulgeda ka lokaalselt, mille puhul see reaktsioon on piiratud konkreetse koe või organiga. 1 2 Termin viiruslik haigus, kasutatuna siin, viitab haigusele, mille etioloogiliseks agensiks on viirus. Viiruslike haiguste näidete hulka kuuluvad hepatiit B, hepatiit C, gripp, omandatud immunodefitsiidi sündroom (AIDS-acquired immunodeficiency syndrome) ja vööherpes. Termin ravi, kasutatuna siin, ja hästi tuntud sellel alal, tähendab lähenemisviisi, kasulike või soovitavate tulemuste, kaasaarvatud kliiniliste tulemuste saavutamiseks. Käesoleva leiutise puhul kasulike või soovitavate kliinilised tulemuste hulka kuuluvad, kuid ei ole nendega piiratud, ühe või enama sümptoomi leevendamine või parenemine, haiguse ulatuse vähenemine, haiguse stabiliseerunud (s.o, mitte halveneva) seisundi saavutamine, haiguse levimise vältimine, haiguse arengu edasilükkamine või aeglustumine, haigusseisundi parenemine või palliatsioon, ja remissioon (kas osaline või üldine), kas detekteeritav või mittedetekteeritav. Ravi võib tähendada ka pikendatud ellujäämist võrreldes oletatava elulemusega ravi mittesaamisel. Haiguse või tervisehäire palliatsioon tähendab, et tervisehäire või haigusseisundi ulatus ja/või selle ebasoovitavad kliinilised ilmingud on vähenenud ja/või nende areng on aja jooksul aeglustunud või pikemaks veninud, võrreldes sellega, mis toimub selle tervisehäire mitteravimisel. Eriti allergia kontekstis, nagu seda mõistavad selle ala spetsialistid, palliatsioon võib toimuda allergeeni(de) vastase immuunvastuse modulatsioonil. Edasi, palliatsioon ei pea ilmtingimata aset leidma ühe doosi manustamisel, vaid sageli alles pärast dooside seeria manustamist. Seega, kogus, mis on piisav selleks, et põhjustada reaktsiooni või häire palliatsiooni, võib olla manustatud ühe või enama manustamiskorraga. Terminid antikehade tiiter, või antikehade kogus, mis on esile kutsutud immunomoduleeriva polünukleotiidi ja antigeeni poolt, viitab antud antikehade summaarsele kogusele, mis mõõdeti teatud ajapunktil, pärast immunomoduleeriva polünukleotiidi ja antigeeni manustamist. Termin Th1-ga seotud antikeha tähistab antikeha, mille produktsioon ja/või mille taseme kasv on seotud Th1 immuunsusreaktsiooniga. Näiteks, hiire IgG2a on Th1-ga seotud antikeha. Käesoleva leiutise puhul võib Th1-ga seotud antikehade taseme mõõtmiseks olla