UNIVERZITET U NOVOM SADU POLJOPRIVREDNI FAKULTET DEPARTMAN ZA A VETERINARSKU MEDICINU PREDMET: PATOLOŠKA FIZIOLOGIJA IOLOGIJA VEŽBA 6. PATOFIZIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA ZAPALJENJA I IMUNOLOŠKIH POREMEĆAJA Dr vet. Marko R. Cincović
PLAN IZLAGANJA ORGANIZOVANOST IMUNOLOŠKOG SISTEMA PATOFIZIOLOGIJA INFLAMACIJE PODELA I PATOFIZIOLOGIJA IMUNOLOŠKIH POREMEĆAJA OSNOVNE IMUNOLOŠKE METODE RACIONALNA DIJAGNOSTIKA INFLAMACIJE
ORGANIZOVANOST IMUNOLOŠKOG SISTEMA Ne specifican imunitet Odgovor je antigen ne zavistan Skoro trenutni maksimalni odgovor Not-antigen specific Izlaganje antigenu ne ostavlja Nikakav zapamcen trag o Prethodnom susretu Specifican imunitet Odgovor je antigen-zavistan Latentni period izmedju izlaganja I maksimalnog odgovora Antigen specifican Izlaganje antigenu rezultira zapamcivanjee results in immunologic memory
ORGANIZOVANOST IMUNOLOŠKOG SISTEMA Nespecificna imunost (prirodna otpornost) Steceni imunitet (specificna imunost) Epitelijalna barijera Fagociti Komplement NK celije B limfociti. Ab T limfociti.. efektorne T celije S a t i D a n i 0 6 12 1 3 5 Vreme posle infekcije
ORGANIZOVANOST IMUNOLOŠKOG SISTEMA
ORGANIZOVANOST IMUNOLOŠKOG SISTEMA
ORGANIZOVANOST IMUNOLOŠKOG SISTEMA
Patogen Humoralni imuni Odgovor Extracelularni mikrobi Fagocitirani mikrobi u makrofagu Ćelijski imuni odgovor Intracelularni mirobi (virusi..) Limfociti koji se aktiviraju Efektorni mehanizam Funkcija Blokiraju infekciju i eliminisu ekstracelularne mikrobe Aktiviraju makrofage - ubijaju fagocitirane mikrobe Direktno unistavaju inficirane celije i eliminisu rezervoar infekcije
ORGANIZOVANOST IMUNOLOŠKOG SISTEMA ANTITELA
ORGANIZOVANOST IMUNOLOŠKOG SISTEMA
PATOFIZIOLOGIJA INFLAMACIJE OŠTEĆENJE TKIVA VAZODILATACIJA VAZOAKTIVNI FAKTOR Povećanja propustljivost kapilara MARGINACIJA PMN DIJAPEDEZA CRVENILO Rubor TOPLOTA Calor BOL Dolor OTOK Tumor gubitak funkcije (lat.functio laesa)
PATOFIZIOLOGIJA INFLAMACIJE Procena febrilnog stanja Febris continua Febris remittens (dnevne varijacije +/- 1 C) Febris intermittens (smena febrilnog i afebrilnog stanja) Febris recurens
PATOFIZIOLOGIJA INFLAMACIJE SISTEM KOMPLEMENTA HIPOTALAMUS Hiperpireksija Imunološki sistem MIKROORGANIZMI Hagemanov činioc Fletcherov č. KALIKREIN Fitzgeraldov č. - KININOGEN SISTEM FIBRINOLIZE MAKROFAGI FAGOCITI (NEUTROFILI) IL-1 Kostna srž JETRA: Sinteza proteina akutne faze MIŠIĆI: Sinteza PGE Katabolizam proteina
PATOFIZIOLOGIJA INFLAMACIJE 1. Promene u hemodinamici: kratkotrajna lokalna vazokonstrikcija, lokalna vazodilatacija u terminalnom krvotoku: - rana faza, - kasna faza, 2. Povećana propustljivost krvnih sudova, 3. Transendotelna migracija i hemotaksa, 4. Fagocitoza.
PATOFIZIOLOGIJA INFLAMACIJE Hidrostatski pritisak Onkotski pritisak TRANSUDAT EKSUDAT H2O PROTEINI UOBLIČENI ELEMENTI KRVI
PATOFIZIOLOGIJA INFLAMACIJE Hidrostatski pritisak Onkotski pritisak Diapedesis TRANSUDAT EKSUDAT H2O PROTEINI UOBLIČENI ELEMENTI KRVI
Kotrljanje Adhezija zija Transmigracija SELECTINS (E&P) INTEGRINS & Ig-LIKE MOLECULES (ICAM, VCAM) Qualitative and Quantitative Endothelial and PMN Changes
PODELA I PATOFIZIOLOGIJA IMUNOLOŠKIH POREMEĆAJA PRIMARNE IMUNODEFICIJENCIJE nastaju delovanjem unutrašnjih činilaca na urodeni i na stečeni imunski odgovor, a najčešce su naslednog karaktera, To su retki poremećaji, a među sobom se razliku po tome koji je deo imunskog sistema nedovoljno aktivannespecifični ili specifični. SEKUNDARNE IMUNODEFICIJENCIJE nastaju dejstvom činilaca iz okruženja (virusa, bakterija, toksina, grešaka u ishrani i trauma) Kod svih imunodeficijentnih bolesti je povećana sklonost ka infekcijama. Kodživotinja sa deficitom Ig, komponenti komplementa ili fagocita, javljaju se recidivirajuće infekcije bakterijske etiologije. S druge strane, poremećaji u funkciji T ćelija dovode do oportunih infekcija. REAKCIJE IMUNOLOŠKE PREOSETLJIVOSTI AUTOIMUNE BOLESTI (Lupus erutematosus, Reumatoidni artritis)
PODELA I PATOFIZIOLOGIJA IMUNOLOŠKIH POREMEĆAJA PRIMARNE IMUNODEFICIJENCIJE Nedostatak komplementa Poremećaj leukocita i makrofaga Čedijak-Higaši sindrom Deficit leukocitnih adhezivnih molekula Poremećaj funkcije B-ly B i sinteze antitela Urođena agamaglobulinemija kod dece Agamaglobulinemija ždrebadi Nedostatak IgG2 kod goveda Nedostatak Ig kod pasa Kombinovana imunodeficijencija
PODELA I PATOFIZIOLOGIJA IMUNOLOŠKIH POREMEĆAJA SEKUNDARNE IMUNODEFICIJENCIJE
PODELA I PATOFIZIOLOGIJA IMUNOLOŠKIH POREMEĆAJA POSLEDICE IMUNODEFICIJENCIJE RECIDIVIRAJUĆE INFEKCIJE OPORTUNISTIČKE INFEKCIJE SKLONOST KA NEOPLAZMAMA SKLONOST KA AUTOIMUNIM BOLESTIMA
PODELA I PATOFIZIOLOGIJA IMUNOLOŠKIH POREMEĆAJA
PODELA I PATOFIZIOLOGIJA IMUNOLOŠKIH POREMEĆAJA REAKCIJE IMUNOLOŠKE PREOSETLJIVOSTI U reakcijama preosetljivosti I tipa poremecaji nastaju kada se IgE vežu za membranu mastocita, bazofila i eozinofila. Ag Ig E Senzibilisan mastocit Ponovni susret sa Ag i degranulacija
APĆ Ag Ag Obrada i prezentovanje Ag Farmakološki efekti: Krvni i disajni putevi, Infiltracija i akumulacija ćelija Th2 IL-4 IL-13 Mastocit Lučenje medijatora IFN-γ IgE Citokini Klinički efekti: Astma,ekcem, anafilaksa i dr. Bly IL-4, IL-5, IL-6 IL-3, IL-4 Inflamatorna aktivacija Prepoznavanje Ag Lučenje IgE Aktivac mastocita Oslobađanje anje medijatora Biološki efekti
PODELA I PATOFIZIOLOGIJA IMUNOLOŠKIH POREMEĆAJA REAKCIJE IMUNOLOŠKE PREOSETLJIVOSTI U tipu II preosetljivosti oštecenja se javljaju kada se IgG i IgM antitela vežu za membranu celija ili tkiva, aktivirajuci komplement ili efektorske celije. + + C1-C9 C5-C9 C9 Izvestan broj autoimunskih bolesti nastaje aktivacijom hipersenzitivnog mehanizma tipa II. C3b To su: glomerulonefritis, pemfigus vulgaris, miastenija gravis i autoimunske hemolitičke anemije
FAGOCIT FAGOCIT Fosfolipaza A2 Regulacione kianze Arahidonska kiselina Oksidaza kompleks Prostaglandini Leukotrieni Fc receptor C3 recept. H2O2 O2 Antigeni membrane C3 b Vezana At aktiviraju komplement Klasični put C3 d Komplement Litički put MAP CILJNA ĆELIJA
PODELA I PATOFIZIOLOGIJA IMUNOLOŠKIH POREMEĆAJA REAKCIJE IMUNOLOŠKE PREOSETLJIVOSTI Tip III su bolesti imunskih kompleksa, koji se talože u tkivima. + + C1-C9 C9 Bolesti, kod kojih dolazi do formiranja imunskih kompleksa, mogu se podeiti u tri grupe: dugotrajna infekcija, autoimunske bolesti i inha1atorne bolesti. Taloženje Aktivacija granulocita PREDSTAVNICI Artusova reakcija Serumska bolest
PODELA I PATOFIZIOLOGIJA IMUNOLOŠKIH POREMEĆAJA REAKCIJE IMUNOLOŠKE PREOSETLJIVOSTI Tip IV su reakcije kasne preosetljivosti, izazvane senzibilisa-nim limfocitima. Reakcijaja nastaje 24-72h posle kontakta Ag-At. T-ly LIMFOKINI NAKUPLJANJE MONONUKLEARA OŠTEĆENJE TKIVA U hipersenzitivne reakcije tipa IV spadaju: kontaktni dermatitis, tuberkulinska reakcija i granulomatozni tip bolesti.
OSNOVNE IMUNOLOŠKE METODE REAKCIJE U KOJIMA JE IMUNOLOŠKI KOMPLEKS ODMAH VIDLJIV AGLUTINACIJA PRECIPITACIJA U osnovi slične reakcije. Koja će se od njih desiti zavisi od Ag. Ukoliko su Ag molekularno dispergovani Desiće se precipitacija, a ako se nalaze na površini čestice ili ćelije desiće se aglutinacija REAKCIJE U KOJIMA SE IMUNOLOŠKI KOMPLEKS DOKAZUJE POSREDNO REAKCIJA VEZIVANJA KOMPLEMENATA REAKCIJA NEUTRALIZACIJE REAKCIJE U KOJIMA JE VIDLJIVOST KOMPLEKSA MOGUĆA OBELEŽAVANJEM JEDNOG OD UČESNIKA REAKCIJA IMUNOFLUORESCENCIJE IMUNOENZIMSKE REAKCIJE
OSNOVNE IMUNOLOŠKE METODE AGLUTINACIJA Brza Aktivna Brza i spora Spora ER + + Pasivna (Indirektna) Pasivna hemaglutinacija Inhibicija hemaglutinacije Lateks aglutinacija ER ER ER Ag At
Aglutinogeni Er antigeni su membranski glikoproteini (85% ugljeni hidrati i 15% peptidni deo) AB0-sistem I ODREĐIVANJE KRVNIH GRUPA AGLUTINACIJOM
Aglutinini (normoaglutinini) Imunoglobulini M klase koji nastaju tokom života imunizacijom antigenima koji dospevaju hranom ili su bakterijskog porekla
Davaoci i primaoci krvi Krvna grupa Može dati krv Može primiti krv A A, AB O, A B B, AB O, B AB (univerzalni primaoc) O (univerzalni davaoc) AB O, A, B, AB O, A, B, AB O
OSNOVNE IMUNOLOŠKE METODE PRECIPITACIJA Dvovalentno At Ag sa više epitopa Višak At Optimalan odnos Ag-At At Višak Ag
OSNOVNE IMUNOLOŠKE METODE PRECIPITACIJA Efekat prozone
OSNOVNE IMUNOLOŠKE METODE PRECIPITACIJA Dodirna precipitacija Dokazivanje B.antracisa
OSNOVNE IMUNOLOŠKE METODE PRECIPITACIJA Agar-gel imunodifuzija Precipitacijska linija se stvara na mestu ekvivalentne koncentracije Ag i At. Modifikacija - RADIJALNA IMUNODIFUZIJA U gel se stavi poznati At, a u bazenčiće se stavljaju različite koncentracije Ag, pa se može formirati kriva koncentracije.
OSNOVNE IMUNOLOŠKE METODE
OSNOVNE IMUNOLOŠKE METODE Kvantifikacija radioimunodifuzije U RID metodi se koncentracija u ispitivanom serumu može odrediti ili na osnovu dijametra precipitacijskog prstena, ili na osnovi poređenja enja dobijenog prstena sa prstenom poznate koncentracije. U oba slučaja se formira kriva koncentracije k koja se očitava.
OSNOVNE IMUNOLOŠKE METODE Elektroimunodifuzija Elektroimunodifuzija
OSNOVNE IMUNOLOŠKE METODE REAKCIJA VEZIVANJA KOMPLEMENTA Zasnovana je na činjenici da fragmenti komplementa mogu da se vešu za Fc fragmet At. U reakciji postoje dva sistema: Hemolizni sistem Er ovna i At na Er Poznati Ag ili At Tumačenje: ima hemolize negativna r-ja; r nema hemolize pozitivna r-jar Ag Er Ag Er K K At AtH AtH + -
OSNOVNE IMUNOLOŠKE METODE REAKCIJE IMUNOFLUORESCENCIJE
OSNOVNE IMUNOLOŠKE METODE ELISA (Ensime-linked Immunosorbent Assay) Patentirana 1968 Umesto vezivanja fluorescentnih boja vrši se vezvanje enzima VRLO SPECIFIČNA R-JA I LAKA ZA ČITANJE ČESTO SE PRIMENJUJE U PATOFIZIOLOŠKIM MERENJIMA KOMPONENTE Čvrsta površina Ag ili At + i kontrole Konjigat (Ag ili At sa vezanim enzimom) Supstrat (oboji se kada dođe u kontakt sa enzimom) Tečnost za pranje Stop rastvor (jaka kiselina ili baza) Čitač rezultata ZA DOKAZIVANJA At ILI Ag
OSNOVNE IMUNOLOŠKE METODE ELISA (Ensime-linked Immunosorbent Assay) DOKAZIVANJE ANTIGENA Direktna Sendvič Ima boje poz. r-ja Kompetitivna blokirajuća Odsustvo boje poz. r-ja Inhibiciona Odsustvo boje poz. r-ja E Ag E E
OSNOVNE IMUNOLOŠKE METODE ELISA (Ensime-linked Immunosorbent Assay) DOKAZIVANJE ANTITELA DIREKTNA, KOMPETITIVNA, BLOKIRAJUĆA ELISA Bez boje, poz. r-jar INDIREKTNA ELISA Boja, poz. r-jar E E E E
OSNOVNE IMUNOLOŠKE METODE Pomenute imunološke metode nalaze se u osnovni mnogih reakcija u patološkoj fiziologiji i kliničkoj biohemiji, s obzirom da tehnika monoklonskih antitela predstavlja jednu od najvažnijih metoda za dokazivanje različitih hormona, enzima, drugih funkcionalnih elemenata iz biološkog materijala.
RACIONALNA DIJAGNOSTIKA INFLAMACIJE DA LIL U ORGANIZMU POSOTJI PROCES ZAPALJENJA ILI NEKROZE? Ukoliko postoje trebao bi da postoji neki od kardinalnih znakova upale i/ili neka od promena u krvnoj slici, kao i promena u belančevinama ama krvne plazme. DA LI JE ZAPALJENJE AKUTNO ILI HRONIČNO? Ukoliko postoji povećanje koncentracije proteina akutne faze, što o se u elektroforezi ispoljava porastom alfa frakcije globulina, smatramo mo da se radi o akutnom procesu. Na hronično zapaljenje ukazuje povećanje koncentracije svih klasa gama-globulina. globulina. DA LI JE ZAPALJENJE IZAZVANO BAKTERIJAMA, VIRUSIMA ILI JE ASEPTIČNO? Neutrofilija prati bakterijske infekcije, limfocitoza prati virusnu, dok blaga neutrofilija ukazuje na aseptični proces. KAKAV JE ISHOD ZAPALJENJA? Najbolje je pratiti sedimentaciju Er, belu krvnu sliku i fibrinogen, čija normalizacije ukazuje na ozdravljenje.
RACIONALNA DIJAGNOSTIKA INFLAMACIJE DODATNI KRITERIJUMI OZDRAVLJENJA Iščezavanje uzročnika Porast titra At do određene granice i postepeno opadanje Odsustvo kardinalnih znakova upale Ponašanje prema reinfekciji
RACIONALNA DIJAGNOSTIKA INFLAMACIJE SPECIFIČNE METODE Izolovanje uzročnika Biološki ogled Serološke reakcije NESPECIFIČNE METODE Dokazivanje promena proteina plazme ili seruma Dokazivanje povećanja koncentracije fibrinogena Sedimentacija Er Dokazivanje proteina akutne faze i nekih specifičnih belančevina krvne plazme (reumatoidni faktor) Diferencijalna krvna slika Citološki pregled punktata...
RACIONALNA DIJAGNOSTIKA INFLAMACIJE ODREDITI SEDIMENTACIJU Er Odrediti broj leukocita u perifernoj krvi Odrediti diferencijalnu krvnu sliku Odrediti koncentraciju fibrinogena u plazmi Odrediti ukupne serumske proteine Uraditi elektroforezu serumskih proteina Odrediti proteine akutne faze u perifernoj krvi Odrediti pojedinačno IgG,IgM,IgA Odrediti C3 komponentu komplementa
RACIONALNA DIJAGNOSTIKA INFLAMACIJE Određivanje sedimentacije eritrocita Potreban materijal Aparatura za vađenje krvi Pipeta po Westergreenu, promera 2,5mm, sa podeocima od 1 mm Specijalan stalak za pipete. Izvođenje Izvaditi krv pacijentu Krv pomešati sa antikoagulansom, tako da odnos krvi:citrat (antikoagulans) bude 4:1. Uvući krv sa antikoagulansom u pipetu do oznake 0. Pipeta se postavi uspravno u stalak i očitava se za 1 čas i 2 časa Tako se dobije rezultat npr. SE za 1 h 8 mm, za 2h 16 mm... Tumačenje Ubrzana sedimentacija se očekuje kod: infekcije,anemija, hiperholesterolemije, maligniteta; ali i tokom graviditeta, polnog žara, posle obilnog obroka... IZVODITI SEDIMENTACIJU NAŠTE!!!
Faktori od kojih zavisi brzina SE: ERITROCITNI: Broj eritrocita: - oligocitemija - ubrzana SE - policitemija - sporija SE - sadržaj hemoglobina u Er - adhezivnost i aglutinacija Er PLAZMATSKI: Belančevine krvne plazme: - albumini stabilizuju suspenziju Er - fibrinogen i gamaglobulini (imunoglobulini) smanjuju stabilnost suspenzije Er
BRZINA SEDIMENTACIJE ERITROCITA (mm): Vrsta 1sat 2 sata 24 sata Konj 69 71 74 Goveče 1 2 12 Ovca 1-4 3-8 6-15 Koza 1-4 3-10 9-24 Svinja 2-8 5-25 8-50 Pas 0,5-8 1-26 7-54 Čovek - m. 1-3 4-6 - - ž. 3-5 6-8 - 10 -
RACIONALNA DIJAGNOSTIKA INFLAMACIJE DOKAZIVANJE CRP (C-reaktivni protein) CRP je beta-globulin i izdvaja se elektroforezom. Konačno dokazivanje ide pomoću Latex-CRP aglitunacije. Za lateksu su vezana At protiv CRP. To su zapravo At protiv kapsularnog antigena pneumokoka. CRP je izuzetno sličan tom antigenu, po kome je i dobio ime (C-od capslula). U zavisnosti od veličine čestica aglutinacije reakcija se obeležava sa jednim do 4 krstića (+,++,+++,++++). CRP se nalazi u organizmu i u fiziološkim uslovima, ali je njegova koncentraija tako mala da se ovom metodom ne može dokazati. U AKUTNIM BAKTERIJSKIM ZAPALJENJIMA CRP MOŽE BITI POVEĆAN I DO 1000 PUTA!!! Dokazivanje reumatoidnog faktora (RF), takođe lateks r-ja
RACIONALNA DIJAGNOSTIKA INFLAMACIJE ELEKTROFOREZA PROTEINA Često smanjena zbog izlaska transferina u intersticijum Povišena alfa-frakcija zbog porasta koncentracije proteina akutne faze u plazmi
RACIONALNA DIJAGNOSTIKA INFLAMACIJE ELEKTROFOREZA PROTEINA Povišena frakcija gama-globulina u hroničnoj inflamaciji
DA LI DA PITAM NEŠTO?