HR P Opisano je da spoj formule (I):

Sadašnji izum odnosi se na nukleozidne analoge i njihovu primjenu u medicini. Specifičnije, izum se odnosi na 1,3 -oksatiolanske nukleozidne analoge, na njihove farmaceutske formulacije i njihovu primjenu u liječenju virusnih infekcija. Opisano je da spoj formule (I): također poznato kao BCH-189 ili NGPB-21 ima antivirusnu aktivnost, naročito protiv virusa humane imunodeficijencije (HIV), uzročnih sredstava AIDS-a (th Anti-Aids Conference, Montreal, Canada th-9th June 1989: Abstracts T.C.0.1 i M.C.P. 63; Europska Patenta Prijava Publikacija No. 038262). Spoj formule (I) je racemska smjesa dva enantiomera formula (I-1) i (I-2): 2 3 i opisano je i testirano u obliku njegovog racemata. Jedino spoj koji je trenutno prihvaćen za liječenje pomoću HIV-a je 3'-azido-31-deoksitimidin (AZT, zidovudin, BW 090). Međutim, ovaj spoj ima značajnu sklonost ka popratnim efektima pa se tako ili ne može koristiti ili, kada se jednom koristi, mora se povući iz terapije kod značajnog broja pacijenata. Posljedica je kontinuirana potreba za osiguranjem spojeva koji su efikasni protiv HIV ali imaju istodobno značajno bolji terapeutski indeks. Mi smo sada neočekivano otkrili da su enantiomeri spojeva formule (I) ekvipotentni protiv HIV ali da jedan enantiomer (-)-enantiomer ima značajno nižu citotoksičnost od drugog enantiomera. Tako se osigurava u prvom aspektu izuma (-) (ili levogiri) enantiomer spoja formule (I) i njegovi farmaceutski prihvatljivi derivati. (-) Enantiomer ima kemijsko ime (-)-4-amino-1-(2-hidroksimetil-1,3-oksatiolan--il)-(1H)-pirimidin-2-on (koji se ovdje kasnije zove spoj (A)). Ima apsolutnu stereokemiju spojeva formule (1-1) koja ima ime (2R, cis))-4-amino-1-(2 -hidroksimetil-1,3-oksatiolan--il)-(1h)-pinmidin-2-on. Poželjni spoj A je osiguran bitno slobodno od odgovarajućeg (+)-enantiomera, to jest, prisutno je ne više od oko % w/w (+)-enantiomera, poželjno ne više od oko 2%, naročito manje od oko 1 % w/w. Pod "farmaceutski prihvatljivim derivatom" podrazumijeva se bilo koja farmaceutski prihvatljiva sol, ester ili sol takvog estera spoja (A) ili nekog drugog spoja koji, poslije davanja pacijentu, može osigurati (direktno ili indirektno) spoj (A) ili njegov antivirusno aktivan metabolit ili ostatak. Stručnjacima će biti jasno da se spoj (A) može modificirati tako da se osiguraju njegovi farmaceutski prihvatljivi derivati, na funkcionalnim skupinama i u baznoj vrsti i na hidroksimetil skupini oksatiolanskog prstena. Modifikacije svih takvih funkcionalnih skupina su uključene u opseg izuma. Međutim, naročito su zanimljivi farmaceutski prihvatljivi derivati koji se dobivaju modifikacijom 2-hidroksimetil skupine oksatiolanskog prstena. Poželjni esteri spoja (A) uključuju spojeve u kojima je vodik 2-hidroksimetil skupine zamijenjen s acil funkcijom R-C=O u kojoj je ne-karbonilna vrsta R estera izabrana od vodika, alkil skupine ravnog ili račvastog niza (npr. metil, 2

etil, n-propil, t-butil), alkoksialkil (npr. mertoksimetil), aralkil (npr. benzil), ariloksialkil (npr. fenoksimetil), aril (npr. fenil koji je opcijski supstituiran s halogenom C 1-4 alkil ili C 1-4 alkoksi); sulfonatnih estera kao što su alkil- ili aralkilsulfonil (npr. metansulfonil); aminokiselinskih estera (npr. L-valil ili L-izoleucil) i mono-di- ili tri-fosfatnih estera. U pogledu gore opisanih estera, ako nije drukčije naznačeno, bilo koja prisutna alkil skupina odgovarajuće sadrži 1 do 16 atoma ugljika, određeno 1 do 4 atoma ugljika. Bilo koja prisutna aril skupina u takvim esterima prikladno obuhvaća fenil skupinu. Esteri određeno mogu biti C 1-16 alkilester, nesupstituirani benzilester ili benzilester koji je supstituiran s najmanje jednim halogenom (brom, klor, fluor ilijod), C 1-6 alkil, C 1-6 alkoksi, nitro ili trifluorometil skupinama. Farmaceutski prihvatljive soli spoja (A) uključuju one koje su izvedene iz farmaceutski prihvatljivih neorganskih i organskih kiselina i baza. Primjeri odgovarajućih kiselina uključuju klorovodičnu, bromovodičnu, sumpornu, dušičnu, perklornu, fumarnu, maleinsku, fosfornu, glikolnu, mliječnu, salicilnu, jantarsku, toluen-p-sulfonsku, vinsku, octenu, limunsku, metansulfonsku, mravlju, benzojevu, malonsku, naftalen-2-sulfonsku i benzensulfonsku kiselinu. Druge kiseline kao što je oksalna, koje premda same po sebi nisu farmaceutski prihvatljive, mogu biti korisne kao intermedijeri za dobivanje spojeva iz izuma i njihovih farmaceutski prihvatljivih soli aditivnog tipa s kiselinama. Soli koje su izvedene iz odgovarajućih baza uključuju alkalnometalne (npr. natrijeve), zemnoalkalnometalne (npr. magnezijeve), amonijeve i NR 4+ (gdje je R C 1-4 alkil). Kasnije referencije na spoj prema izumu uključuju i spoj (A) i njegove farmaceutski prihvatljive derivate. 2 3 4 0 Spojevi iz izuma imaju ili sami po sebi antivirusnu aktivnost i ili se mogu metabolizirati u takve spojeve. Posebno, su i ovi spojevi efikasni za inhibiranje replikacije retrovirusa, uključujući humane retroviruse kao što su virusi humane imunodeficijencije (HIV), uzročna sredstva AIDS-a. Tako je osiguran daljnji aspekt izuma spoja (A) ili njegov farmaceutski prihvatljiv derivat za primjenu kao aktivno terapeutsko sredstvo, posebno kao antivirusno sredstvo, na primjer, za liječenje retrovirusnih infekcija. U daljnjem alternativnom aspektu osiguran je aspekt za liječenje virusne infekcije, naročito infekcije koja je izazvana takvim retrovirusom kao što je HIV, na sisavcu uključujući i čovjeka, koji obuhvaća davanje efikasne količine spoja (A) ili njegovog farmaceutski prihvatljivog derivata. U daljnjem alternativnom aspektu također je osigurana primjena spoja (A) ili njegovog farmaceutski prihvatljivog derivata za proizvodnju lijeka za liječenje virusne infekcije. Spojevi iz izuma su također korisni u liječenju stanja srodnih AIDS-u kao što je kompleks srodan AIDS-u (ARC), progresivna generalizirana limfadenopatija (PGL), neurološke bolesti slične AIDS-u (kao što su demencija ili tropska parapareza), anti-hiv antitijela pozitivna i HIV-pozitivna stanja, Kapoši sarkom, trombocitopenija purpurea i prateće oportunističke infekcije, na primjer, Pneumocistitis karinii. Spojevi iz izuma također su korisni u prevenciji progresije kliničke bolesti pojedinaca koji su anti-hiv antitijela HIV-antigen pozitivni i u profilaksi poslije izlaganja HIV-u. Spojevi (A) ili njihovi farmaceutski prihvatljivi derivati mogu se također koristiti za sprečavanje virusne kontaminacije takvih fizioloških fluida kao što su krv ili sjeme in vitro. Stručnjacima će biti jasno da se ovdje referencija liječenja odnosi i na profilaksu i na liječenje uspostavljenih infekcija ili simptoma. Nadalje će biti jasno da količina spojeva iz izuma koja je potrebna za korištenje u liječenju neće varirati samo u ovisnosti o izabranom spoju već također i o načinu davanja, prirodi stanja koje se liječi i starosti i stanju ispitanika i obvezno će je odrediti dežurni liječnik ili veterinar. Međutim, uglavnom će odgovarajuća doza biti u intervalu od oko 0.1 do oko 70 mg/kg tjelesne težine na dan, poželjno u intervalu 0. do 60 mg/kg/dan, najpoželjnije u intervalu od 1 do mg/kg/dan. Željena doza može odgovarajuće biti formulirana u jednu dozu ili u podijeljene doze koje se daju u odgovarajućim intervalima, na primjer, kao dvije, tri, četiri ili više pod-doza na dan. 3

Spoj se odgovarajuće daje u jediničnom doznom obliku; na primjer, koji sadrži do 00 mg, prikladno do 00 mg, najprikladnije 0 do 700 mg aktivnog sastojka po jediničnom doznom obliku. 2 3 4 0 60 Idealno aktivan sastojak treba se davati tako da se postigne maksimalna koncentracija u plazmi aktivnog spoja od oko 1 do oko 7 µm, poželjno oko 2 do 0 µm, najpoželjnije oko 3 do oko µm. Ovo se može postići, na primjer, intravenoznom injekcijom 0.1 do %-ne otopine aktivnog sastojka, opcijski u slanoj otopini, ili oralnim davanjem bolusa koji sadrži oko 1 do oko 0 mg aktivnog sastojka. Željeni nivoi u krvi mogu se održavati kontinuiranom infuzijom tako da se osigurava oko 0.01 do oko.0 mg/kg/sat ili isprekidanim infuzijama koje sadrže oko 0.4 do oko mg/kg aktivnog sastojka. Iako je moguće da se, za primjenu u terapiji, spoj iz izuma može davati kao sirova kemikalija, poželjno je da se aktivan sastojak formulira kao farmaceutska formulacija. Izum tako nadalje osigurava farmaceutsku formulaciju koja obuhvaća spoj (A) ili njegov farmaceutski prihvatljiv derivat zajedno s jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača za njega, i prema izboru, druge terapeutske i/ili profilaktičke sastojke. Nosač(i) mora(ju) biti "prihvatljiv(i)" u smislu da su kompatibilni s drugim sastojcima formulacije i da nisu štetni za ispitanika. Farmaceutske formulacije uključuju one koje su prikladne za oralno, rektalno, nazalno, lokalno (uključujući bukalno i sub-lingvalno), vaginalno ili parenteralno (uključujući intramuskularno, potkožno i intravenozno) davanje u obliku koji je prikladan za davanje inhalacijom ili insuflacijom. Formulacije se mogu, kada je to potrebno, odgovarajuće formulirati u diskretne dozne jedinice i mogu se napraviti bilo kojim od postupaka koji su dobro poznati u farmaceutskoj tehnici. Svi postupci uključuju fazu dovođenja u zajednicu aktivnog spoja s tekućim nosačima ili fino podijeljenim krutim nosačima ili s obje supstancije, i tada, ako je potrebno, oblikovanje proizvoda u željenu formulaciju. Farmaceutske formulacije koje su prikladne za oralno davanje mogu se formulirati kao diskretne jedinice kao što su kapsule, vrećice ili tablete, pri čemu svaka sadrži predodređenu količinu aktivnog sastojka; kao prašak ili granule; kao otopinu, kao suspenziju ili kao emulziju. Aktivni sastojak se također može formulirati kao bolus, kašica ili pasta. Tablete i kapsule za oralno davanje mogu sadržavati takve konvencionalne sastojke kao što su vezivna sredstva, punila, maziva, sredstva za razlaganje ili sredstva za vlaženje. Tablete se mogu prevući prema dobro poznatim postupcima u tehnici. Oralni tekući preparati mogu biti u obliku, na primjer, vodenih ili uljnih suspenzija, otopina, emulzija, sirupa ili eliksira, ili mogu biti formulirani kao suhi proizvod za konstituiranje s vodom ili drugim prikladnim nosačem prije korištenja. Takvi tekući preparati mogu sadržavati takve konvencionalne aditive kao što su sredstva za suspendiranje, sredstva za emulgiranje, ne-vodeni nosači (koji mogu uključivati jestiva ulja) ili prezervansi. Spojevi prema izumu mogu se također formulirati za parenteralno davanje (npr. pomoću injekcije, na primjer, injekcije bolusa ili kontinuirane infuzije) i mogu se formulirati u jedinični dozni oblik u ampule, prethodno napunjene šprice, infuziju malog obujma ili u više-dozne kontejnere s dodanim prezervansom. Preparati mogu poprimati takve oblike kao što su suspenzije, otopine ili emulzije u uljnim ili vodenim nosačima, i mogu sadržavati sredstva za formuliranje kao što su sredstva za suspendiranje, za stabilizaciju i/ili dispergiranje. Alternativno aktivan oblik može biti u obliku praha, dobiven aseptičnom izolacijom sterilne krute supstancije ili fiofilizacijom iz otopine, za konstituiranje s nekim prikladnim nosačem, npr. sa sterilnom vodom vez pirogena, prije korištenja. Za lokalno davanje na epidermi spojevi prema izumu mogu se formulirati kao masti, kreme ili losioni, ili kao transdermalni flaster. Masti i kreme mogu se, na primjer, formulirati s vodenom ili uljnom osnovom s dodavanjem prikladnih sredstava za zgušnjavanje i/ili geliranje. Losioni se mogu formulirati s vodenom ili uljnom osnovom i također će, uglavnom, sadržavati jedno ili više sredstava za emulgiranje, za stabilizaciju, za dispergiranje, za suspendiranje, za zgušnjavanje ili sredstava za bojanje. Formulacije koje su prikladne za lokalno davanje u usta uključuju lozenge koje obuhvaćaju aktivan sastojak u nekoj mirisnoj osnovi, obično saharozi i akaciji ili tragakantu; pastile koje obuhvaćaju aktivan sastojak u nekoj takvoj inertnoj osnovi kao što su želatina i glicerin ili saharoza i akacija: i tekućine za ispiranje usta koje obuhvaćaju aktivan sastojak u nekom prikladnom tekućem nosaču. Farmaceutske formulacije koje su prikladne za rektalno davanje, u kojima je nosač neka kruta supstancija, su najpoželjnije formulirane kao supozitoriji u obliku doznih jedinica. Prikladni nosači uključuju kakao maslac i druge materijale koji se obično koriste u tehnici, i supozitorije i mogu se prikladno formirati miješanjem aktivnog spoja s omekšanim ili otopljenim nosačima; i poslije toga jakim hlađenjem i oblikovanjem u kalupima. 4

Formulacije koje su prikladne za vaginalno davanje mogu se formulirati kao pesarije, tamponi, kreme, gelovi, paste, pjene ili sprejevi koji sadrže, pored aktivnog sastojka, takve nosače za koje se u tehnici zna da su prikladni. Za intra-nazalno davanje spojevi iz izuma mogu se koristiti kao tekući sprej ili dispergirajući prah ili u obliku kapljica. Kapljice se mogu formulirati s vodenom ili ne-vodenom osnovom koja također obuhvaća jedno ili više sredstava za dispergiranje, sredstava za otapanje ili sredstava za suspendiranje. Tekući sprejevi se odgovarajuće daju iz pakiranja pod pritiskom. Za davanje inhalacijom spojeva prema izumu se prikladno daju iz insuflatora, nebulajzera ili pakiranja pod pritiskom ili nekog drugog pogodnog sredstva za davanje aerosol spreja. Pakiranja pod pritiskom mogu obuhvaćati takav prikladan propelant kao što su diklorodifluorometan, triklorofluorometan, diklorotetrafluoroetan, ugljikov dioksid ili neki drugi prikladan plin. U slučaju aerosola pod pritiskom dozna jedinica se može odrediti osiguravanjem ventila za isporuku odmjerene količine. Alternativno se davanje spoja prema izumu inhalacijom ili insuflacijom može izvoditi u obliku preparata suhog praha, na primjer smjese praha spoja i neke prikladne osnove za prah kao što su laktoza ili škrob. Preparat u prahu se može formulirati u jedinični dozni oblik u, na primjer, kapsule ili čahure, ili npr. želatinska ili blister pakiranja iz kojih se prah može davati pomoću inhalatora ili insuflatora. Kada se to želi, gore opisane formulacije mogu se koristiti za davanje aktivnog sastojka u obliku suzdržanog oslobađanja. 2 3 4 0 Farmaceutski preparati prema izumu mogu također koristiti takve druge aktivne sastojke kao što su antimikrobna sredstva ili prezervansi. Spojevi iz izuma mogu se također koristiti u kombinaciji s drugim terapeutskim sredstvima, na primjer, drugim antiinfektivnim sredstvima. Napose, spojevi iz izuma mogu se koristiti zajedno s poznatim antivirusnim sredstvima. Izum tako osigurava, u daljnjem aspektu, kombinaciju koja obuhvaća spojeve (A) ili njegov fiziološki prihvatljiv derivat zajedno s nekim drugim terapeutski aktivnim sredstvom, određeno antivirusnim sredstvom. Gore navedene kombinacije mogu se prikladno formulirati za korištenje u obliku farmaceutske formulacije i takve farmaceutske formulacije koje obuhvaćaju kombinaciju kao što je definirana gore, zajedno s farmaceutski prihvatljivim nosačem, čine daljnji aspekt izuma. Prikladna terapeutska sredstva za korištenje u takvim kombinacijama uključuju acikličke nukleozide kao što su aciklovir ili ganciklovir, interferone kao što su α, β ili γ-interferon, inhibitore renalnog lučenja kao što je probenecid, inhibitore renalnog lučenja kao što je probenecid, inhibitore transporta nukleozida kao što je dipiridamol, 2', 3'-dideoksinukleozide kao što su AZT, 2', 3'-dideoksicitidin, 2', 3'-dideoksiadenozin, 2', 3'-dideoksitimidin, 2', 3'-dideoksitimidin, 2', 3'-dideoksi-2',3'-didehidrotimidin i 2', 3'-dideoksi-2',3'-didehidrocitidin, imunomodulatore kao štoje interieukin 11 (IL2) i faktor za simulacijugranulocitnemakrofagnekolonije(gm-csf), eritopoetin, ampligen, timomodulin, timopentin, foskarnet, ribavirin i inhibitore vezanja HIV za CD4 receptore, npr. topive CD4, CD4 fragmente, CD4 hibridne molekule, inhibitore glikoziliranja kao što su 2-deoksi-D-glukoza, kastanospermin i 1-deoksinojirimicin. Pojedinačne komponente takvih kombinacija mogu se davati ili sekvencijalno ili istodobno u posebnim ili kombiniranim farmaceutskim formulacijama. Kada se spoj (A) ili njegov farmaceutski prihvatljiv derivat koristi u kombinaciji s drugim terapeutski aktivnim sredstvom protiv istog virusa, doza svakog spoja može biti ista ili se razlikuje od one koja se koristi kada se spoj koristi samostalno. Stručnjaci će lako shvatiti odgovarajuće doze. Spoj (A) i njegovi farmaceutski prihvatljivi derivati mogu se načiniti poznatim postupcima iz tehnike pravljenje spojeva analogne strukture, na primjer, kao što je opisano u Europskoj Prijavi Publikacija No. 038262. Stručnjacima u tehnici će biti jasno da se za određene niže opisane postupke željena sterokemija spoja (A) može dobiti ili započinjanjem sa optički čistim polaznim materijalom ili razgradnjom racemske smjese u bilo kojoj prikladnoj

fazi sinteze. U slučaju svih postupaka optički čist željeni proizvod može se dobiti ponovo razgradnjom krajnjeg proizvoda svake reakcije. U takvom postupku (A) 1,3-oksatilan formule (VIII): u kojem je anomerna skupina L skupina koja se može zamijeniti, reagira s nekom odgovarajućom bazom. Odgovarajuće skupine L uključuju -OR gdje je R alil skupina, npr. C 1-6 alkil skupina kao što je metil ili je R acil skupina, npr. C 1-6 alkil skupina kao što je acetil ili halogen, na primjer, jod, brom ili klor. Spoj formule VIII odgovarajuće reagira s citozinom ili s odgovarajućim prekursorom pirimidinske baze (koji je prethodno sililiran sa sredstvom za sililiranje kao što je heksametildisilazan) u nekom takvom kompatibilnom otapalu kao što je metilenklorid, korištenjem takve Lewis-ove kiseline kao što su titan-tetraklorid, kalaj (IV) spoj kao što je SnCl 4 ili trimetilsililtriflat. 1,3-Oksatiolani formule (VIII) mogu se načiniti, na primjer, reakcijom aldehida formule (VII) s merkaptoacetalom formule (VI) u takvom kompatibilnom organskom otapalu, kao što je toluen, u prisustvu kiselog katalizatora, na primjer, takve Lewis-ove kiseline, kao što je cink-klorid. 2 Merkaptoacetali formule (VI) mogu se načiniti postupcima poznatim iz nauke, na primjer, G. Hesse and I. Jorder, Chem Ber. 8, 924-932 )192). Aldehidi formule (VII) mogu se napraviti poznatim postupcima iz tehnike, na primjer, E.G. Halloquist and H. Hibbert, Can. J. Research, 8, 129-136 (1933). Prikladno se sirovi aldehid (VII) može pročistiti konverzijom u kristalni bisulfitni aditivni adukt i kasnijom rekonverzijom u slobodni aldehid. U drugom postupku (B) spoj (A) se dobiva interkonverzijom pomoću baze spoja formule (IX): 3 gdje je B baza koja se može pretvoriti u citozin. Takva interkonverzija se može ostvariti ili jednostavnom kemijskom transformacijom (npr. konverzijom uracil baze u citozin) ili enzimatskom konverzijom korištenjem deoksiribozil transferaze. Takvi postupci i uvjeti za interkonverziju bazom su dobro poznati u tehnici nukleozidne kemije. U trećem postupku (C) spoj formule (XI): može se pretvoriti u spoj (A) konverzijom NH 2 skupine u citozinsku bazu dobro poznatim postupcima u tehnici nukleozidne kemije. 4 Mnoge reakcije koje su ovdje kasnije opisane objavljene su opširno u kontekstu sinteze nukleozida, na primjer u Nucleoside Analogs - Chemistry, Biology and Medical Applications, R. T. Walker et. al., eds. Plenum Press, New York 6

(1979) na stranicama 16-192; T. Veds in Chemistry of Nucleosides and Nucleotides, Vol. I, L.B. Townsend ed., Plenum Press, New York (1988) na stranicama 16-192, čiji su opisi uneseni ovdje kao referencija. Bit će jasno da gornje reakcije mogu zahtijevati korištenje, ili se konvencionalno mogu primijeniti na polazne materijale koji imaju zaštićene funkcionalne skupine pa tako uklanjanje zaštite može biti potrebno kao intermedijer ili finalna faza za dobivanje željenog spoja. Zaštita i uklanjanje zaštite s funkcionalnih skupina mogu se obavljati korištenjem konvencionalnih sredstava. Tako, na primjer, amino skupine se mogu zaštiti skupinom koja je izabrana od aralkil (npr. benzil), acil, aril (npr. 2,4-dinitrofenil) ili silil; kasnije odvajanje zaštitne skupine vrši se, kada se to želi, hidrolizom ili hidrogenolizom, kao što to odgovara, korištenjem standardnih uvjeta. Hidroksilne skupine mogu se zaštiti korištenjem konvencionalne hidroksilne zaštitne skupine, na primjer, kao što je opisano u "Protective Groups in Organic Chemistry", Ed. J.F.W. McOmie (Plenum Press, 1973) ili "Protective Groups in Organic Synthesis" od Theodora W. Greene (John Wiley and Sons, 1981). Primjeri prikladnih hidroksilnih zaštitnih skupina uključuju grupe koje su izabrane od alkil (npr. metil, t-butil ili metoksimetil), aralkil (npr. benzil, difenilmetil ili trifenilmetil), heterocikličkih skupina kao što su tetrahidropiranil, acil (npr. acetil ili benzoil) i silil skupine kao što je trialkilsilil (npr. t-butildimetilsilil). Hidroksilne zaštitne skupine mogu se odvojiti konvencionalnim tehnikama. Tako, na primjer, alkil, silil, acil i heterocikličke skupine mogu se odvojiti solvolizom, npr. hidrolizom pod kiselim ili baznim uvjetima. Aralkil skupine kao što je trifenilmetil mogu se na sličan način odvojiti solvolizom, npr. hidrolizom pod kiselim uvjetima. Aralkil skupine, kao što je benzil, mogu se raskinuti, na primjer, tretiranjem s BF 3 /eteratom i acetanhidridom i onda, odvajanjem tako oblikovanih acetatnih skupina u odgovarajućoj fazi sinteze. Silil skupine se također mogu odgovarajuće odvojiti korištenjem izvora fluoridnih iona kao što je tetra-n-butilamonijfluorid. U gornjim postupcima spoj (A) se uglavnom dobiva kao smjesa cis i trans izomera od kojih je cis izomer zanimljiv spoj. 2 3 4 0 60 Ovi izomeri se mogu odvojiti fizičkim sredstvima, npr. kromatografijom na silikagelu ili frakcijskom kristalizacijom, ili direktno ili na njegovim prikladnim derivatima, npr. acetatima (načinjenim, na primjer, s acetanhidridom) i zatim, nakon odvajanja, ponovnom konverzijom u roditeljski proizvod (npr. deacetiliranjem s metanolnim amonijakom). Farmaceutski prihvatljive soli spojeva iz izuma mogu se načiniti kao što je opisano u US Patentu No. 4, 383, 114, čiji je opis unesen ovdje kao referencija. Tako, na primjer, kada se želi pravljenje aditivne soli s kiselinom spoja (A) proizvod bilo kojeg od gornjih postupaka može se pretvoriti u sol tretiranjem dobivene slobodne baze s nekom odgovarajućom kiselinom, korištenjem konvencionalnih postupaka. Farmaceutski prihvatljive aditivne soli s kiselinama mogu se načiniti reakcijom slobodne baze s odgovarajućom kiselinom, alternativno u prisustvu nekog takvog odgovarajućeg otapala kao što je neki ester (npr. etilacetat) ili neki alkohol (npr. metanol, etanol ili izopropanol). Soli s neorganskom bazom mogu se načiniti reakcijom roditeljskog spoja s takvom prikladnom bazom kao što je neki alkoksid (npr. natrij-metoksid) alternativno u prisutnosti takvog otapala kao što je neki alkohol (npr. metanol). Farmaceutski prihvatljive soli mogu se također načiniti iz drugih soli, uključujući farmaceutski prihvatljive soli, spoja (A) korištenjem konvencionalnih postupaka. Spoj (A) može se prevesti u farmaceutski prihvatljiv ester ili drugi ester reakcijom sa sredstvom za fosforiranje, kao što je POCl 3, ili neko odgovarajuće sredstvo za esterificiranje, kao što je neki kiselinski halogenid ili anhidrid, već prema potrebi. Ester ili sol spoja (A) može se pretvoriti u osnovni spoj, na primjer, hidrolizom. Razgradnja krajnjeg proizvoda, ili intermedijera ili polaznog materijala za njega može se obavljati bilo kojim odgovarajućim postupkom poznatim u tehnici: vidi, na primjer, " Stereochemistry of Carbon Compounds" od E.L. Eliel (mcgeaw Hill, 1962) i "Tables of Resolving Agents" od S.H. Wilen. Tako se, na primjer, spoj (A) može dobiti pomoću hiralne HPLC korištenjem odgovarajuće stacionarne faze, na primjer, acetiliranog β-ciklodekstrina ili triacetata celuloze i nekog prikladnog otapala, na primjer, takvog alkohola kao što je etanol ili vodena otopina, na primjer, trietilamonijacetata. Alternativni spojevi se mogu razgraditi enantioselektivnim katabolizmom koji je posredovan enzimima s nekim prikladnim enzimom, kao što je citidin deaminaza ili selektivnom enzimatskom degradacijom nekog prikladnog derivata, korištenjem '-nukleotidaze. Kada se razgradnja vrši enzimatski, enzim se može koristiti ili u otapalu ili, prikladnije, u imobiliziranom obliku. Enzimi se mogu imobilizirati bilo kojim poznatim postupkom iz tehnike, na primjer, adsorpcijom na takvu smolu kao što je Eupergit C. Izum će biti dalje opisan pomoću sljedećih primjera koji nisu namijenjeni ograničavanju izuma ni na koji način. Sve temperature su u Celzijevim stupnjevima. INTERMEDIJER 1 7

-Metoksi-1,3-oksatiolan-2-metanlo, benzoat Otopina cink-klorida (1.6 g) u vrućem metanolu ( ml) doda se u miješanu otopinu merkaptoacetaldehida, dimetilacetala (34.2 g) i benzoiloksiacetaldehida (48.3 g) u toluenu (10 ml) koji se tada zagrijava na refluksu pod dušikom tijekom 0 minuta. Ohlađena smjesa se koncentrira, razblaži se s toluenom, tada se filtrira kroz Kieselguhr. Spojeni filtrati i toluen se isperu sa zasićenom vodenom otopinom natrijevog bikarbonata (x2), i s rastvorom soli, suše se (MgSO 4 ), zatim se ispare do ulja koje do ulja koje se podvrgnute kromatografiji na stupcu silicijevog dioksida (2 kg, Merck 938), eluira se s kloroformom tako da se dobiva naslovni proizvod kao ulje (4.1 g), smjesa anomera (ca 1:1); 1H NMR (DMSO-d 6 ) 3.1-3.3 (4H), 3.42 (6H), 4.4-4.6 (4H),.41 (1H),.46 (1H),.4 (1H),.63 (1H), 7.46 (4H), 7.8 (2H), 8,07 (4H); γmaz (CHBr 3 ) 1717 cm -1. INTERMEDIJER 2 2 (+)-cis-1-(2-benzoiloksimetil-1,3-oksatiolan--il)-(1h)-pirimidin-4-dion Smjesa sitno mljevenog uracila (9.62 g) heksametildisilazana (0 ml) i amonijevog sulfata ( mg) zagrijava se na refluksu pod dušikom dok se ne dobije bistra otopina. Ova se ohladi i zatim ispari do bezbojnog ulja, koje se otopi, pod atmosferom dušika, u acetonitrilu (0 ml). Otopina se doda miješanom, ledom ohlađenoj otopini -metoksi-l,3 -oksatiolan-2-metanol, benzoat (intermedijer 1) (19.43 g), u acetonitrilu (600 ml) i doda se trimetilsililtrifluorometansulfonat (14.7 ml). Ledena kupka se odvoji i zagrijava na refluksu pod dušikom tijekom 4 minuta. Poslije hlađenja i isparavanja ostatak se pročisti kromatografijom na stupcu preko 1 kg silikagela (Merck 938) eluiranjem sa kloroform/metanolom 9:1. Odgovarajuće frakcije se spoje i ispare tako da se dobiva sirovi ostatak. Ovaj se frakcijski kristalizira iz minimuma vrućeg metanola (c. 10 ml) tako da se dobiva naslovni spoj (6.32 g) u obliku bijelih kristala. 1H NMR (d 6 MSO) δ 11.36 (1H, šir.s), 7.0-8.00 (6H, m), 6. (1H, t),.46 (2H, m), 4.62 (2H, m), 3.48 (Im, m), 3.2 (1H, m). INTERMEDIJER 3 3 4 (+)-(Cis-4-amino-1-(2-benzoiloksimetil-1,3-oksatilan--il-(1H)-pirimidin-2-on Postupak (a) Suspenzija citozina (.70 g) i amonijevog sulfata (nekoliko mg) u heksametildisilazanu (1 ml) miješa se i zagrijava na refluksu 2. sata pod dušikom. Otopina se odvoji isparavanjem i preostala kruta supstancija se otopi u suhom acetonitrilu ( ml). Ova otopina se prenese korištenjem tehnika s fleksibilnoin iglom u miješanu, ledom ohlađenu otopinu -metoksi-1,3-oksatiolan-2-metanol, benzoata (Intermedijer I) (43.7 g) u acetonitrilu (60 ml) pod dušikom. Doda se trimetilsililtrifluorometansulfonat (33 ml), pusti da se otopina zagrije na običnu temperaturu (1. sat), tada se zagrijava na refluksu tijekom noći. Ostatak smjesa se koncentrira, razblaži se zasićenom vodenom otopinom natrijevog bikarbonata (00 ml), tada se ekstrahira s etilacetatom (3x00 ml). Spojeni ekstrakti se isperu vodom (2x ml) i slanom otopinom ( ml), suše se (MgSO 4 ), tada se ispari do pjene koja se podvrgne kromatografiji na stupcu silicijevog dioksida (600 g, Merck 7734), eluira se sa smjesama etilacetat-metanol tako da se dobiva smjesa anomera (ca 1 : 1 31.9 g). Smjesa se kristalizira iz vode (4 ml) i etanola (9.0 ml) tako da se dobiva kruta supstancija (.23 g) koja se rekristalizira iz etanola (1 ml) i vode ( ml) tako da se dobiva naslovni proizvod kao bijela kruta supstancija (9.26 g); λmax (MeOH) 229.4 mm (E 1% 6); 272.4 mm (E 1% 293); 1 H NMR (DMSO d 6 ) δ 3.14 (1H), 3.0 (1H), 4.07 (2H),.2 (1H),.66 (1H), 6.28 (1H), 7.22 (2H), 7.6 (2H), 7.72 (2H), 8. (2H). Postupak (b) 0 60 Fosforoksiklorid (7.0 ml) se dodaje ukapavanjem u miješanu ledeno-hladnu suspenziju 1,2,4-triazola (11.6 g) u acetonitrilu (1 ml) i tada se, uz održavanje unutarnje temperature ispod C, doda ukapavanjem trietilamin (22.7 ml). Nakon min. doda se polako otopina (±)-cis-1-(2-benzoiloksimetil-1,3-oksatiolan--il)-(1h)-pirimidin-2,4-dioa (Intermedijer 2) (6.27 g) u acetonitrilu (3 ml). Miješanje se tada nastavi na sobnoj temperaturi preko noći. Smjesa se ohladi preko noći pomoću ledene kupke i dodaje se polako trietilamin ( ml) i zatim voda (21 ml). Dobivena otopina se ispari i ostatak se raspodijeli između zasićene otopine natrijevog bikarbonata (0 ml) i kloroforma (3x0 ml). Spojeni kloroformski ekstrakti se suše s magnezijevim sulfatom, filtriraju i ispare tako da se dobiva sirovi ostatak (9.7 g). Ostatak se otopi u 1,4-dioksanu (2 ml) i doda se koncentrirani vodena otopina amonijaka (s.g 0.880, 0 ml). Nakon 1. sata otopina se ispari i ostatak se otopi u metanolu. Ovo je izazvalo taloženje krute supstancije koja se filtrira. Matični lugovi se pročisti kromatografijom na stupcu preko silika gela (Merck 938, 600 g). Odgovarajuće frakcije se prikupe tako da se dobiva naslovni spoj kao kruta supstancija paun boje (2.18 g), identična s onom dobivenom postupkom (a). 8

Primjer 1 (+)-(Cis)-4-amino-1-(2-hidroksimetil)-1.3-oksatiolan--il)-(1-H)-pirimidin-2-on Suspenzija(cis)-4-amino-1-(2-benzoiloksimetil-1,3-oksatiolan--il)-(1H)-pirimidin-2-ona (Intermedijer 3) (8.19 g) i Amberlite IRA-0 (OH) (8.24 g) u metanolu ( ml) miješa se i zagrijava na refluksu 1. sat. Krute supstancije se odvoje filtriranjem i zatim isperu metanolom. Spojeni filtrati se ispare. Ostatak se usitni s etilacetatom (80 ml). Dobivena bijela kruta supstancija prikupi se filtriranjem tako da se dobiva naslovni spoj (.09 g), 1H NMR (DMSO-d 6 ) 3.04 (1H), 3. (1H), 3.73 (2H),.18 (1H),.29 (1H),.73 (1H), 6.21 (1H), 7.19 (2H), 7.81 (1H). Primjer 2 2 3 4 Hiralno HPLC odvajanje enantiomera (+)-(cis)-4-amino-1-(2-hidroksimetil-1,3-oksatiolan--il)-(1h)-pirimidin-2-ona (A) Racemski proizvod iz Primjera 1 (2 mg) podvrgne se preparativnoj HPLC pod sljedećim uvjetima: Stupac: Merck Hibar triacetat celuloze, x mm, µ Eluent: etanol; Protok: 3 ml/min Detekcija: uv, 270 nm; Temperatura: okolinska. Isparavanje odgovarajućih spojenih frakcija dalo je (2R, cis)-4-amino-1-(2-hidroksimetil-1,3-oksatiolan--il)-(1h) -pirimidin-2-on (6.8 mg, tj. oko 0%) i (2S, cis)-4-amino-1-(2-hidroksimetil-1,3-oksatiolan--il)-(1h)-pirimidin-2on (3.6 mg, tj. oko 90%). (B) Racemski proizvod iz Primjera 1 (26 mg) podvrgne se preparativnoj HPLC pod sljedećim uvjetima: Stupac: ASTEC cyclobond I acetyl, x 4.6 mm; Eluent: 0.2% trietilamonijacetat (napravljen dodavanjem glacijalne octene kiseline na 0.2% trietilamina u vodi, do konačnog ph 7.2); Protok: 2 ml/min; Detekcija: uv, 0 nm; Temperatura: okolinska. Isparavanje odgovarajućih frakcija dalo je sirovi (2R, cis)-4-amino-1-(2-hidroksimetil-1,3-oksatiolan--il)-(-h) -pirimidin-2-on (2 mg) i sirovi (2S, cis)-4-amino-1-(2-hidroksimetil-1,3-oksadolan--il)-(1h)-pirimidin-2-on (17 mg). Ove frakcije se posebno podvrgnu daljnjem eksperimentu HPLC pod slijedećim uvjetima: Stupac: ASTEC cyclobond 1 acetyl, 2x4.6 mm Eluent: mm amonijacetat, ph 6.8 Protok: 0. ml/min Detekcija: uv, 0 nm Temperatura:. Isparavanje odgovarajućih prikupljenih frakcija dalo je (2R, cis)-4-amino-1-(2-hidroksimetil-1,3-oksatiolan--il)-(1h) -pirimidin-2-on (.0 mg, tj. ca. 91%) i (2S, cis)-4-amino-1-(2-hidroksimetil-1,3-oksatiolan--il)-(1h)-pirimidin-2-on (7.6 mg, tj. oko 96%). 9

Primjer 3 (-)-Cis-4-amino-4-(2-hidroksimetil-1,3-oksatiolan--il)-(1H)-pirimidin-2-on i (+)-Cis-4-amino-1-(2-hidroksimetil-1,3-oksatiolan--il)-(1H)-pirimidinon, divodikfosfat, amonijeva sol Hladna (0 ), miješana.suspenzija (±)-cis-4-amino-1-(2-hidroksimetil)-1,3-oksatiolan--il)-(1h)-pirimidin-2-ona (1.00 g) (Primjer 1) u suhom trimetilfosfatu ( ml) tretira se s fosforokdikloridom (2.44 ml) i smjesa se miješa na 0 3 min. i zatim gasi u ledenoj vodi (60 g). Hladna smjesa se podesi na ph 2. dodavanjem vodenog N-natrijevog hidroksida, zatim se primjeni na stupac od ugljena ( g, DARCO), koja se eluira s vodom, zatim s etanolom-vodenim amonijakom. Frakcije koje sadrže sirovi monofosfat se spoje i koncentriraju. Dobivena otopina se primijeni na stupac koji sadrži 2 g DEAE Sephadex A-2 (HCO 3 - oblik). Eluiranje se vrši s gradientom vode (1 ml) do 0.1 M-NH 4 HCO 3 (2 ml), zatim s 0.2, 0.3 i 4M NH 4 HCO 3 (2 ml) (1, 2, odnosno 0 ml). Odgovarajuće frakcije se spoje i koncentriraju. Preostala otopina se razblaži vodom ( ml) i zamrzne se do suhog tako da se dobiva naslovni proizvod kao bijela kruta supstancija (1.37 g); λmax (ph6 pufer), 271.0 nm (E 1 % 1, cm 190); 1 H NMR (D) δ3.23 (1H), 3. (1H), 4.0-4.2 (2H),.43 (1H), 6.07 (1H), 6.33 (1H), 8.08 (1H). (ii) 2 3 (2R, Cis)-4-amino-1-(2-hidroksimetil-1,3-oksatiolan--in-(1H)-pirimidin-2-ob i (2S, cis)-4-amino-1-(2-hidroksimetil -1,3-oksatiolan--il)-(1H)-pirimidin-2-on ()-Nukleotidaza (iz zmijskog otrova crotalus atrox) [EC 3.1.3.] (60 mg pri 17 jedinica/mg) doda se u otopinu (±)-cis -4-amino-(2-hidroksimetil-1,3-oksatiolan--il)-pirimidin-2-on, 6 -divodikfosfata, amonijeve soli (1.3 g) u tamponu ml, načinjen iz glicina (26 mg) i magenzijevog klorida (190 mg) u vodi (00 ml) i smjesa se inkubira na 37 2. sata. Doda se još enzima ( mg), i inkubacija se nastavi daljnja 3. sata. Dobivena smjesa se primijeni na stupac DEAE Sephadex A-2 (HCO 3 -oblik). Eluiranje se provodi vodom (160 ml), zatim s 0.1, 0.2, 0.3 i 0.4M NH 4 HCO 3 (s po 0 ml svakog). Odgovarajuće frakcije koje sadržavaju prvu eluiranu komponentu se spoje i ispare, ostatak se podvrgne kromatografiji na stupcu silicijevog dioksida (60 g, Merck 7734), eluira se sa smjesama kloroform-metanol. Isparavanje odgovarajućih frakcija iz metano-etilacetata dalo je (2R, cis)-4-amin-1-(2-hidroksimetil-1,3-oksatiolan--il)-(1h) -pirimidin-2-on kao bijelu krutu supstanciju (0. g) - [α]d 21 + 137 (c. 1.04 MeOH); 1 H (DMSO) δ3.04 (1H), 3. (1H), 3.73 (2H),.18 (1H),.29 (1H),.73 (1H), 6.21 (1H), 7.19 (2H), 7.81 (1H). Odgovarajuće frakcije iz Sephadex skupine, koje sadržavaju drugu eluiranu komponentu, se spoje i ispare. Ostatak se otopi u vodi ( ml), tretira se s alkalnom fosfatazom (iz Escherichia coli) [EC 3.1.3.1] (1. ml na 416 jedinica/ml), tada se inkubira na 37 jedan sat. Otopina se odvoji isparavanjem i ostatak se podvrgne kromatografiji na stupcu na silicijevom dioksidu (60 g, Merck 7734), eluiranjem sa smjesama kloroform-metanol. Isparavnje odgovarajućih frakcija iz metano-etilacetata dalo je (2S, cis)-4-amino-1-(2-hidroksimetil)-1,3-oksatiolan--il)-(1h)-pirimidin-2-on kao bijelu krutu supstanciju (0.32 g); [α]d 21-132 (c. 1.08, MeOH); 1 H NMR (DMSO) δ 3.04 (1H), 3. (1H), 3.73 (2H),.18 (1H),.29 (1H),.73 (1H), 6.21 (1H), 7.19 (2H), 7.81 (1H). Primjer 4 4 0 60 (-)-Cis-4-amino-1-(2-hidroksimetil-1,3-oksatiolan--il)-(1H)-pirimidin-2-on (i) Tri laboratorijske tikvice od 0 ml s hranjivom kašom (Oxoid Ltd.) inokuliraju se s po jednom punom žličicom Escherichia coli (ATCC 23848) sastrugane s agarne ploče. Tikvice se inkubiraju preko noći na 37 C mućkanjem na rev/min i zatim se svaka tikvica koristi za inokulaciju 41 CDD podloge (glutaminska kiselina, 3 g/1; MgSO 4, 0.2 g/1: K 2 SO 4, 2. g/l; NaCl, 2.3 g/l, Na 2 HPO 4 2H 2 O, 1.1 g/l, NaH 2 PO 4 2H 2 O. 0.6 g/l citidin, 1.2 g/1) u fermentoru od sedam litara. Kulture se fermentiraju na 70 okretaja/minuta, na 37 o C s aeracijom na 41/min. Nakon rasta tijekom 24 sata stanice se prikupe centrifugiranjem (000 g, minuta) tako da se dobiva 72 g mokre mase. Stanična pilula se resuspendira u 0 ml mm Tris HCl tampona (ph 7.) i poremeti se sonikacijom (4 x 4 sekundi). Stanični otpaci se odvoje centrifugiranjem (,000 g, minuta) i protein u supematantu se taloži dodavanjem amonijevog sulfata do 7%- nog zasićenja. Talog se prikupi centrifugiranjem (,000 g, minuta) i pilula se resuspendira u 2 ml HEPES tampona (0 mm, ph 7.0) koji sadrži amonijev sulfat (7% zasićenje). Enzimska otopina se pripravi centrifugiranjem na 12,000 rpm tijekom minuta. Supernatant se odbaci i pilula se otopi u Tris HCl tamponu (ph 7.0: 0 mm) do originalnog volumena. (ii) Proizvod iz Primjera i (1 mg) se otopi u vodi (0 ml) i miješa se. Doda se enzimska otopina (0. ml) i smjesa se održava na konstantom ph kontinuiranim dodavanjem HCl (2 mm). Konverzija se prati hiralnom HPLC, koja je

pokazala daje (+) enantiomer supstrata bio preferencijalno deaminiran. Nakon 2 sati (+) enantiomer supstrata (RT 12. min.) bio je potpuno odvojen, i otopina je prilagođena na ph. dodavanjem konc. natrijevog hidroksida. 2 Otopina proizvedena gore eluirana je kroz stupac QAE Sephadex (A2; Pharmacia; X 1.6 cm), pre-ekvilibriran na ph 11). Stupac se ispere vodom (0 ml) i zatim s HCl (0.1 M). Frakcije ( ml) se prikupe i analiziraju pomoću HPLC s reversnom fazom. Frakcije -13, koje sadrže neizreagirani (-) enantiomer supstrata, se spoje i prilagode na ph 7. s HCl. Frakcija 47, koja sadrži deaminirani proizvod se prilagodi na ph 7. s razbl. NaOH. Analiza pomoću hiralne HPLC pokazala je da je ovaj materijal bio smjesa, koja se sastoji od jednog enantiomera (TR.2 min.) kao glavne komponente s drugim enantiomerom (RT 8. min.) kao minornom komponentom (oko 90%). (iii) Faza (ii) gore se ponovi u većim razmjerima. Spoj iz Primjera 1 (363 mg) u ml vode se inkubira s enzimskom otopinom (0. ml), načinjenom kao u Fazi (i). Dodaju se daljnji alikvoti (0. ml) enzima nakon 18 i 47 sati. Reakcijska smjesa se miješa 70 sati, zatim se ostavi stajati daljnjih 64 sata. Analiza pomoću hiralne hplc pokazala je da je (+) enantiomer supstrata bio kompletno deaminiran, i dobivena otopina se prilagodi na ph. s NaOH. Gornja otopina se napuni na isti QAE stupac i eluira se kao u fazi (i) pri čemu se prikupe Frakcije 2-6, koje sadržavaju smjesu rezidualnog supstrata i deaminiranog proizvoda. Frakcije 7-13, koje sadržavaju rezidualni supstrat ((-) enantiomer) se prikupe i prilagode na ph 7.. Frakcije 2-26, koje sadržavaju deaminirani proizvod, se prikupe i neutraliziraju. Frakcije 2-6 gore se re-eluiraju kroz isti QAE stupac. Frakcije 3-11 iz ovog drugog stupca sadržavale su neizreagirani supstrat ((-) enantiomer). Frakcija 70 sadržavala je deaminirani proizvod. (iv) Razlučene frakcije supstrata iz faze (ii) i (iii) se kombiniraju i prilagode se na ph 7.. Ova otopina se eluira kroz stupac XAD-16 (x2.4 cm), pakiran u vodi. Stupac se ispire vodom, i zatim eluira sa smjesom aceton: voda (1 : 4 v/v). Frakcije koje sadržavaju (-) enantiomer BCH 189 se prikupe i zamrznu do suhog tako da se dobiva bijeli prah (190 mg). Gore korišteni HPLC postupci bili su kako slijedi: - 1. Analitička HPLC s reversnom fazom Stupac Eluent Protok Detekcija Retenciona vremena Capital Cartrige Spherisorb ODS-2 (µm) 0x4.6 mm Amonijev divodik fosfat (0 mm) + % MeCN 1. ml/min UV, 270 nm BCH 189. min; deaminirani BCH-189 8.1 min. 1. Hiralna analitička HPLC 3 Stupac Eluent Protok Detekcija Retenciona vremena Cyxlobond I Acetyl x 4.6 mm 0.2% Trietilamonijacetat (ph 7.2) 1.0 ml/min UV, 270 nm BCH 189 11.0 i 12. min. deaminirani-189 8. i.2 min. (Biokonverzija je popraćena registriranjem gubljenja pika na 12. min. i akumuliranog proizvoda na.2 min.). 11

Primjer (4-)-Cis-4-amino-1-(2-hidroksimetil-1,3-oksatiolan--il)-(1H)-pirimidin-2-on Puna mjerica E. coli B stanica (ATCC 32848) sastruganih s pločice za kultiviranje s hranjivim agarom koja je korištena za inokulaciju dvije Florentinske tikvice pri čemu svaka sadrži ml hranjive kaše. Kultura se inkubira na 37 C mućkanjem ( okretaja/min. odbacivana od cm) tijekom 18 sati. Ova se tada koristi za inokulaciju litara CDD-podloge, s citidinom, u fermentoru od 70 litara. Uvjeti za fermentaciju bili su kako slijedi: litara/min. aeracija, brzina miješanja 70 rpm/min. na temperaturi 37 C. Tri Rushton propelera stave se u fermentor. Fermentacija se vrši 18 sati prije žetve korištenjem Sharples kontinuirane centrifuge. Stanična pasta (0 g neto mase) se zamrzne na - C prije kidanja stanica. COD podloga g/l L-Glutaminska 3 kiselina MgSO 4 0.2 K 2 SO 4 2. NaCl 2.3 Na 2 HPO 4 1.1 NaH 2 PO 4 0.6 Napravljena s destiliranom vodom. Sterilizirana na 121 C tijekom minuta. Citidin (1.2 g/litra) je steriliziran na filtru i doda se prije inolukacije. 2 3 4 0 Zamrznuta stanična smjesa (0 g) se odmrzne i suspendira u 70 ml 0 mm Hepes (N-1Š2-hidroksietil]piperazin- N'-[2-etansulfonska kiselina]) tampona (ph 7.) koji sadržava 1 mm etilendiamintetraoctene kiseline (natrijeve soli) i 1 MM ditiotreitola (tampon za poremećivanje). Stanice se poremete propuštanjem suspenzije kroz Manton-Gaulin homogenizator koji radi na 1712. kpa. Ovo se vrši tri puta hlađenjem suspenzije na približno o C nakon svakog prolaženja kroz homogenizator. Homogenat se bistri centrifugiranjem (10 g; 60 min). Aktivnost citidin deaminaze adsorbiranaje na stupcu Q-sefaroze (490 mg volumen sloja) koja je pre-ekvilibrirana s 0 mm natrijevog klorida. Prikupljene aktivne frakcije (2 ml) se prikupe na fenil-sefaroznom stupcu (490 ml sloj volumena) koji je pre-ekvilibriran s uzorkom tampona koji sadržava 3.2M amonijevog sulfata. Vezani enzim se eluirra pomoću gradienta smanjivanjem koncentracije amonijevog sulfata. Frakcije koje sadržavaju aktivnost citidin deaminaze se prikupe (69 ml) i djelomično pročišćeni enzim se tada staloži s 80%-nim amonijevim sulfatom. Nakon centrifugiranja (10 g; 60 min) pilula se resuspendira iz gornjeg i lagerira na 4 C. 6.2 ml ove otopine se centrifugira (18000 g, 90 min.) i pilula se otopi u 24 ml 0.M kalij-fosfatnog tampona (ph 7.). Suspenzija se dijalizira preko noći prema 1M kalij-fosfatnom tamponu (ph 7.). Retentat ( ml) se zatim razblaži s jednakim volumenom destilirane vode. Na 3 ml ove otopine dodaju se Eupergit C perle (1 g) i pusti se da smjesa stoji na sobnoj temperaturi 0-0 sati (određeno mjerenjem rezidualne aktivnosti citidin deaminaze u otopini). Imobilizirani enzim se ispere s 0 mm Tris/HCl tampona (ph 7.0) koji sadržava 1 mm EDTA, 1mM DTT, 0.M NaCl i 00 ppm etilestera p-hidroksibenzoeve kiseline (tampon za lageriranje). Imobilizirani enzim (2.7 g mokre mase) se lagerira u ovom tamponu na 4 C dok ne bude potreban za biotransformaciju. Proizvod iz Primjera 1 (3 g) se otopi u 00 ml destilirane vode u magnetno miješanoj tikvici. Biokonverzija se vrši na 32 C u ph-statu. ph se održava konstantnim na 7.0 dodavanjem 1M octene kiseline. 1 g vlažne mase zrnaca s imobiliziranim enzimom se ispere destiliranom vodom prije započinjanja reakcije. Konverzija se prati pomoću hiralne HPLC koja je pokazala daje (+)-enantiomer supstrata poželjno deaminiran. Na kraju reakcije (72 sata), zrnca s enzimom se filtriraju i filtrat se koristi za izoliranje željenog (-)-enantiomera. ph reakcijske smjese se podesi na ph. korištenjem amonijske otopine (1M) i otopina se primijeni na Duolite A113 sup-smolu u CH ciklusu (0 ml; 0.4 volumena sloja na sat). Uridinski analog koji je adsorbiran na smoli i (-)- enantiomer prolaze ravno kroz stupac. Bilo kakav (-)-enantiomer koji još uvijek ostaje na smoli odvaja se ispiranjem s 0.04%-nom amonijskom otopinom (2 volumena sloja; brzina protoka 0.8 slojeva/sat). ph potrošenih otopina i tekućina od ispiranja (600 ml) se uskladi na ph 7.0 s koncentriranom sumpornom kiselinom i otopina se primijeni na XAD16 smolu (0 ml); brzina protoka 1.4 volumena sloja na sat). Stupac se ispere destiliranom 12

vodom (2. volumena sloja, brzina protoka 2 volumena sloja na sat) i (-)-enantiomer se ekuira sa smjesom aceton:voda 1:3 (brzina protoka 1. volumena sloja na sat). Frakcija koja sadržava masu (-)-enantiomera (4 volumena sloja) se koncentrira na Buchi na mali obujam prije filtriranja kroz No. 3 stakleni sinter. Sinterirana otopina se zamrzne do suha tako da se dobiva 1.2 naslovnog proizvoda koji je identičan s onim dobivenim u Primjeru 4. Primjer 6 Formulacija tablete A. Sljedeća formulacija napravljena je vlažnom granulacijom sastojaka s otopinom providona u vodi, sušenjem i sijanjem i poslije toga dodavanjem magnezijevog stearata i kompresijom. mg/tableta (a) Aktivni sastojak (b) Laktoza B.P. 2 (c) Providon B.P. (d) Natrijev škrob glikolat (e) Magnezijev stearat 00 B. Sljedeća formulacija napravljena je direktnom kompresijom, pri čemu je laktoza za kompresiju direktnog tipa. mg/tableta (a) Aktivni sastojak (b) Laktoza 14 (c) Avicel 0 (d) Magnezijev stearat 00 C. (Formulacija s kontroliranim oslobađanjem). Formulacija se obavlja vlažnom granulacijom sastojaka (dolje) s otopinom providona u vodi, sušenjem i sijanjem i zatim dodavanjem magnezijvevog stearata i kompresijom. mg/tablet a (a) Aktivni sastojak 00 (b) Hidroksipropilmetilceluloza 112 (Methocel K4M Premium) (c) Laktoza B.P. 3 (d) Providon B.P. 28 (e) Magnezijev stearat 7 700 Primjer 7 2 Formulacija kapsule Formulacija kapsule se čini miješanjem dole navedenih sastojaka i punjenjem u dvodijelnu tvrdu želatinsku kapsulu. mg/tableta (a) Aktivni sastojak 12 (b) Laktoza 72. (c) Avicel 0 (d) Magnezijev stearat 2.2 Primjer 8 13

Formulacija za injekcije Aktivni sastojak 0.0 g Otopina natrijevog hidroksida, 0.1M q.s. do ph oko 11. Sterilna voda q.s. do ml Aktivni sastojak se suspendira u malo vode (koja može biti zagrijana) i ph se prilagodi na oko 11 s otopinom natrijevog hidroksida. Količina se tada dopuni do potrebnog obujma i filtrira kroz filtar s membranom sterilizirajuće kvalitete u sterilnu staklenu fijalu od ml i zatvori se sterilnim zatvaračem i zatvori se. Primjer 9 mg/supozitorij Aktivni sastojak Tvrda masa, B.P. 1770 Jedna prtina tvrde masti stopi se u posudici s parnim plaštom na maksimum 4 o C. Aktivni sastojak se sifonira kroz sito od 0 µm i doda se na otopljenu osnovu miješanjem, korištenjem miješalice s velikom smicajnom silom, dok se ne postigne glatka disperzija. Održavanjem smjese na 4 C, preostala tvrda mast se doda u suspenziju i miješa se da se osigura homogeni miks. Cijela suspenzija se propusti kroz sito od nehrđajućeg čelika od µm i, kontinuiranim miješanjem, pusti se da se ohladi na C. Na temperaturi 38 C do C, 2.02 g smjese napuni se u prikladne plastične kalupe od 2 ml. Pusti se da se supozitoriji hlade na sobnu temperaturu. Primjer 2 Biološka aktivnost Antivirusna aktivnost Antivirusna aktivnost spoja iz Primjera 2 određenaje protiv tri osebujnosti HIV-2 u sljedećim staničnim linijama. 3 JM stanice, poluzrela T-stanična linija izvedena iz pacijenta s limfoblastnom leukemijom, inficiranom s HIV-1 svojstvom GBβ. C8166 stanice, humana T-limfoblastoidna stanična linija, inficirane HIV-1 i svojstvom RF. MT-4 stanice, stanična linija humane leukemije T-stanice, inficirane HIV-1 svojstvom RF. CEM stanice, humana T limfoblastoidna stanična linija, inficirana HIV-1 svojstvima RF i U4, ili HIV-2 svojstvom ROD. Antivirusne aktivnosti u C8166, JM i CEM stanicama određene su inhibiranjem oblikovanja sincitija (Tochikura et al Virology, 164. 42-46) a u MT-4 stanicama inhibiranjem konverzije formazana (Baba et al; (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun, 142. 128-134: Mossan(1983)J. Immun. Meth: 6, -7). Antivirusne aktivnosti su također određene analiziranjem količine HIV p24 antigena koji je sintetiziran u prisutnosti i odsutnosti enantiomera. Rezultati su prikazani u doljnjiin Tablicama 1 i 2: Tablica 1 0%Antivirusna aktivnost (µg/ml) Test Formazan Inhibiranje formiranja sincitija Stanice MT-4 CEM CEM CEM JM CB166 Virus (HIV-1 HIV-1RF HIV-2-ROD HIV-1RF HIV-1U4 HIV-1GB8 HIV-1RF (+)-enantiomer 0.28 0.04 0.007 0.006 0.03 0.0 (-)-enantiomer 0. 0.0 0.04 0.008 0.0 0.01 14

Tablica 2 Inhibiranje sinteze HIV p24 0% Inhibiranje sinteze HIV p24 (µg/ml) Stanice CB166 JM MT-4 Virus RF GB8 RF (+)-enantiomer 0.021 0.033 0.0008 (-)-enantiomer 0.016 0.016 0.0004 B. Citotoksičnost Citotoksičnost spojeva iz Primjera 2, racemskog spoja (BCH-189; Primjer 1) i 0/0 smjese dva enantiomera određene su u pet CD4 staničnih linija: H9, JM, CEM, C8166 i U937. Spojevi za testiranje se serijski razblaže od 0 µg/ml na 0.3 µg/ml (završne koncentracije) u mikrotitarskim pločicama s 96 rupica. 3.6 x 4 stanica inkubira se u svaku rupicu ploča uključujući kontrole bez lijeka. Nakon inkubacije na 37 C tijekom dana, izvršeno je prebrojavanje životno sposobnih stanica odvajanjem uzorka stanične suspenzije i prebrojavanjem u hemocitometru isključivanjem Trypan Blue stanica. Tablica 3 Citotoksičnost 0% Citotoksičnost (µg/ml) Spoj CEN stan. JM stan. H9 stan. U937 stan. C8166 stan. (+)-enantiomer 1 1. 2 4 3 (-)-enantiomer >0 >0 >0 >0 BCH-189 3 3. 8 90 1:1 Miks 2. ND* ND ND ND ND = nije određena 2 3 PATENTNI ZAHTJEVI 1. Farmaceutski pripravak za antivirusnu upotrebu, naznačen time, da sadrži spoj koji je (-)-(2R,cis)-4-amino-1-(2 -hidroksimetil-1,3-oksatiolan--il)-(1h)-pirimidin-2 on ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol, drugi terapeutski agens, i, opcionalno, farmaceutski prihvatljiv nosač. 2. Pripravak prema zahtjevu 1, naznačen time, da je drugi terapijski agens aciklički nukleozid, interferon, inhibitor renalnog lučenja, inhibitor nukleozidnog transporta, 2',3'-dideoksinukleozid, imunomodulator, eritropoetin, ampligen, tiomodulin, timopentin, foskarnet, ribavirin ili topivi CD4, CD4 fragmenti, CD4 hibridne molekule kao inhibitori HIV vezanja na CD4 i 2-deoksi-D-glukozu. 3. Farmaceutski pripravak prema zahtjevu 2, naznačen time, da je terapeutski agens odabran iz skupine koja sadrži aciklovir, ganciklovir, alfa-interferon, beta-interferon, gama-interferon, AZT, 2',3'-dideoksicitidin, 2',3'-dideoksi- 2',3'-didehidrotimidin, 2',3'-dideoksi-2',3'-didehidrocitidin, foskarnet, ribavirin. 4. Farmaceutski pripravak prema zahtjevu 3, naznačen time, da je drugi terapeutski agens AZT, 2',3'-dideoksicitidin, 2',3'-dideoksiadenozin, 2',3'-dideoksiinozin, 2',3'-dideoksitimidin, 2',3'-dideoksitimidin, 2',3'-dideoksi- 2',3'didehidrotimidin, ili 2',3'-dideoksi-2',3'-didehidrocitidin.

2 3 4. Farmaceutski pripravak prema zahtjevu 4, naznačen time, da je drugi terapeutski agens AZT. 6. Farmaceutski pripravak prema zahtjevu 4, naznačen time, da je drugi terapeutski agens 2',3'-dideoksicitidin. 7. Farmaceutski pripravak prema zahtjevu 4, naznačen time, da je drugi terapeutski agens 2',3'-dideoksiadenozin. 8. Farmaceutski pripravak prema zahtjevu 4, naznačen time, da je drugi terapeutski agens 2',3'-dideoksiinozin. 9. Farmaceutski pripravak prema zahtjevu 4, naznačen time, da je drugi terapeutski agens 2'3'-dideoksitimidin.. Farmaceutski pripravak prema zahtjevu 4, naznačen time, da je drugi terapeutski agens 2'3'-dideoksi-2',3' -didehidrotimidin. 11. Farmaceutski pripravak prema zahtjevu 4, naznačen time, da je drugi terapeutski agens 2'3'-dideoksi-2',3' -didehidrocitidin. 12. Pripravak prema bilo kojem od zahtjeva 1-11, naznačen time, da isti sadrži -00 mg spomenutog spoja ili farmaceutski prihvatljive soli. 13. Pripravak prema zahtjevu 12, naznačen time, da isti sadrži -00 mg spomenutog spoja ili farmaceutski prihvatljive soli. 14. Pripravak prema zahtjevu 13, naznačen time, da isti sadrži 0-700 mg spomenutog spoja ili farmaceutski prihvatljive soli.. Pripravak prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 14, naznačen time, da je spominjani spoj (-)-(2R,cis)-4-amino-1-(2 -hidroksimetil-1,3-oksatiolan--il)-(1h)-pirimidin-2 on. 16. Pripravak prema bilo kojem od zahtjeva 1 do, naznačen time, da isti sadrži količinu korespondirajućeg (+) -enantiomera spoja koja nije veća od % tež./tež. 17. Pripravak prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 16, naznačen time, da isti sadrži količinu korespondirajućeg (+) -enantiomera spoja koja nije veća od 2% tež./tež. 18. Pripravak prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 17, naznačen time, da isti sadrži količinu korespondirajućeg (+) -enantiomera spoja koja nije veća od 1% tež./tež. 19. Upotreba farmaceutske kombinacije, naznačena time, da sadrži spoj koji je (-)-(2R,cis)-4-amino-1-(2 -hidroksimetil-1,3-oksatiolan--il)-(1h)-pirimidin-2 on ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol, drugi terapeutski agens, te da se kao takva koristi za tretman virusnih infekcija.. Upotreba prema zahtjevu 19, naznačena time, da je drugi terapijski agens aciklički nukleozid, interferon, inhibitor renalnog lučenja, inhibitor nukleozidnog transporta, 2',3'-dideoksinukleozid, imunomodulator, eritropoetin, ampligen, tiomodulin, timopentin, foskarnet, ribavirin ili topivi CD4, CD4 fragmenti, CD4 hibridne molekule kao inhibitori HIV vezanja na CD4 i 2-deoksi-D-glukozu.. 21. Upotreba prema zahtjevu, naznačena time, da je terapeutski agens odabran iz skupine koja sadrži aciklovir, ganciklovir, alfa-interferon, beta-interferon, gama-interferon, AZT, 2',3'-dideoksicitidin, 2',3'-dideoksiadenozin, 2',3' -dideoksiinosin, 2',3' -dideoksitimidin, 2',3' -dideoksi-2',3' -dideoksi-2', 3' -didehidrotimidin, 2',3'-dideoksi -2',3'-didehidrocitidin, foskarnet, ribavirin. 22. Upotreba prema zahtjevu 21, naznačena time, da je drugi terapeutski agens AZT, 2',3'-dideoksicitidin, 2',3' -dideoksiadenozin, 2',3'-dideoksiinozin, 2',3'-dideoksicitidin, 2',3'-dideoksiadenozin, 2',3'-dideoksiinozin, 2',3' -dideoksitimidin, 2',3'-dideoksi-2',3'-didehidrotimidin i 2',3'-dideoksi-2',3'-didehidrocitidin. 23. Upotreba prema zahtjevu 22, naznačena time, da je drugi terapeutski agens AZT. 24. Upotreba prema zahtjevu 22, naznačena time, da je drugi terapeutski agens 2',3'-dideoksicitidin. 2. Upotreba prema zahtjevu 22, naznačena time, da je drugi terapeutski agens 2',3'-dideoksiadenozin. 26. Upotreba prema zahtjevu 22, naznačena time, da je drugi terapeutski agens 2',3'-dideoksiinozin. 27. Upotreba prema zahtjevu 22, naznačena time, da je drugi terapeutski agens 2'3'-dideoksitimidin. 28. Upotreba prema zahtjevu 22, naznačena time, da je drugi terapeutski agens 2',3'-didehidrotimidin. 29. Upotreba prema zahtjevu 21, naznačena time, da je drugi terapeutski agens 2'3'-dideoksi-2',3'-didehidrocitidin.. Upotreba prema bilo kojem od zahtjeva 19-29, naznačena time, da je spomenuta virusna infekcija HIV infekcija. 31. Upotreba prema bilo kojem od zahtjeva 19-, naznačena time, da se spomenuti spoj i agens koriste u kombiniranom pripravku. 16