Käesolev leiutis käsitleb Streptococcus pneumoniae ehk pneumokoki täiustatud vaktsiini.

EE EP1968631 B1 Vaktsiin LEIUTISE VALDKOND Käesolev leiutis käsitleb Streptococcus pneumoniae ehk pneumokoki täiustatud vaktsiini. TEHNIKA TASE 1 2 Alla kaheaastastel lastel ei teki immuunvastust enamikule polüsahhariidi vaktsiinidele, mistõttu on vaja polüsahhariidid teha immuunseks selle keemilisel konjugeerimisel valgukandjaks. Polüsahhariidi, mis on T-sõltumatu antigeen, sidumine valgule, mis on T-sõltuv antigeen, võimaldab polüsahhariidile T-sõltuvuse omadusi, sealhulgas isotüübi lülitamine, afiinsusküpsemine ja mälu esilekutsumine. Ent multivalentsete vaktsiinide moodustamiseks polüsahhariid-valgu konjugaatide või polüsahhariid-valgu konjugaatide kombinatsiooni korduva manustamisega võib esineda probleeme. Näiteks on teatatud, et valgukandjana kasutati teetanustoksoidi (TT), Haemophilus influenzae tüübi b polüsahhariidi (PRP) vaktsiini testiti doseerimisvahemikus samaaegse immuniseerimisega (vaba) TT-ga ja pneumokoki polüsahhariid-tt konjugaadi vaktsiiniga vastavalt imikute standardsele kavale. Kui pneumokoki vaktsiini doseeringut tõsteti, immuunvastust Hib konjugaadi vaktsiini PRP polüsahhariidi osale vähendati, mis viitas polüsahhariidi immuunsekkumisele tõenäoliselt sama kandjavalgu kasutamise kaudu (Dagan et al, Infect Immun. (1998); 66: 93-98). Kandjavalgu doseerimise mõju valgule humoraalselt reageerimisel on samuti tõestatult mitmekülgne. Inimimikute puhul teatati, et tetravalentse teetanustoksoidi konjugaadi doseeringu suurendamise tulemuseks oli alanenud reaktsioon teetanuskandjale (Dagan et al, eespool). Kombineeritud vaktsiinide antud efekte on klassikalistes analüüsides kirjeldatud kandja poolt esilekutsutud epitoopse supressioonina, mida veel täielikult ei mõisteta, kuid mis usutavasti tuleneb kandjavalgu üleliigsest kogusest (Fattom, Vaccine 17: 126 (1999 )). Selle tulemuseks paistab olevat konkureerimine Th-rakkude osas B-rakkude poolt kandjavalgule ning B-rakkude poolt polüsahhariidile. Kui kandjavalgule mõeldud B-

2 EE EP1968631 B1 rakud jäävad valdavaks, ei ole piisavalt Th-rakke, et polüsahhariidide suhtes spetsiifilistele B-rakkudele vajalikku abi võimaldada. Ent märgatud immunoloogilised efektid on olnud vastuolulised, kus kandjavalgu terve kogus mõnel juhul suurendab ning teistel juhtudel alandab immuunvastust. 1 Järelikult on endiselt tehnilised probleemid mitme polüsahhariidi konjugaatide üheks tõhusaks vaktsiini koostiseks kombineerimisel. Pneumokokk on grammpositiivne bakter, mis tekitab arvestatavat haigestuvust ja suremust (eriti noorte ja eakamate seas), põhjustades invasiivseid haiguseid, nagu pneumoonia, bakterveresus ja meningiit, ning haiguseid, mida seostatakse kolonisatsiooniga, nagu akuutne keskkõrvapõletik. Pneumokokist põhjustatud pneumoonia hulk on USA-s üle 60-aastate seas hinnanguliselt 3 kuni 8 0 000 kohta. % juhtudest põhjustab see bakterveresust ning teisi ilminguid, nagu meningiit, kus suremuse tase isegi antibiootikumi raviga on peaaegu 30%. Pneumokokk on kapseldunud keemiliselt ühendatud polüsahhariidiga, mis tekitab serotüüpset spetsiifilisust. Tuntud on 90 pneumokoki serotüüpi ning kapsel on põhiline virulentsi determinant pneumokokkide puhul, kuna kapsel ei kaitse ainult bakteri sisepinda komplemendi eest, vaid on ka ise kehva immunogeensusega. Polüsahhariidid on T-sõltumatud antigeenid ning neid ei saa MHC molekulidel töödelda ega esitleda, et need T-rakkude koos toimiks. Ent need saavad stimuleerida immuunsüsteemi alternatiivse mehhanismi kaudu, mis hõlmab pinnaretseptorite ristsidumist B-rakkudel. Mitmes katses näidati, et kaitse invasiivse pneumokoki haiguse vastu korreleerub kõige tugevamalt antikeha spetsiifilisusega kapsli suhtes ning kaitse on serotüübispetsiifiline. 2 Streptococcus pneumoniae on kõige tuntum invasiivse bakteriaalse haiguse ja keskkõrvapõletiku põhjus imikutel ja väikelastel. Samamoodi omastavad vanurid kehva reaktsiooni pneumokoki vaktsiinidele [Roghmann et al, (1987), J. Gerontol. 42:26-270], millest tuleneb ka bakteriaalse pneumoonia suurem esinemine antud populatsiooni seas [Verghese and Berk, (1983) Medicine (Baltimore) 62:271-28].

3 EE EP1968631 B1 1 S. pneumoniae põhjustatud peamised kliinilised sündroomid on laialdaselt tuntud ja neid on kõikides standardsetes meditsiini käsiraamatutes käsitletud (Fedson DS, Muscher DM.: Plotkin SA, Orenstein WA, toim.-d, Vaccines. 4. trükk. PhiladelphiaWB Saunders Co, 04a: 29-88). Näiteks invasiivset pneumokoki haigust (IPD) tähistab mis tahes nakkus, milles S. pneumoniae on verest või muust tavaliselt steriilsest kohast eraldatud (Musher DM. Streptococcus pneumoniae. Mandell GL, Bennett JE, Dolin R ( toim.-d). Principles and Practice of Infectious diseases (. trükk). New York, Churchill Livingstone, 01, lk 2128-2147). Krooniline obstruktiivne kopsuhaigus (KOK) hõlmab teadaolevalt mitut seisundit (hingamisteede obstruktsioon, krooniline bronhiit, bronhioliit või väikeste hingamisteede haigus ja emfüseem), mis sageli eksisteerivad koos. Patsiendid kogevad oma seisundi halvenemist, mis on tavaliselt seotud suurenenud õhupuudusega, ning tihti on neil suurem köha, mis toodab lima ja mädast röga (Wilson, Eur Respir J 01 17:99-07). KOK-d iseloomustab füsioloogiliselt pöördumatu või osaliselt pöörduva hingamisteede obstruktsiooni esinemine kroonilise bronhiidi ja/või emfüseemi patsientidel ( Standards for the diagnosis and care of patients with chronic obstructive pulmonary disease. American Thoracic Society. Am J Respir Crit Care Med. 199 nov; 12( Pt 2):S77-121). KOK-d halvenemist põhjustab sageli bakteriaalne (nt pneumoko kk) nakkus (Sethi S, Murphy TF. Bacterial infection in chronic obstructive pulmonary disease in 00: a state-of-the-art review. Clin Microbiol Rev. 01 Apr;14(2):336-63). Järelikult on käesoleva leiutise eesmärgiks töötada välja mitme serotüübi Streptococcus pneumoniae polüsahhariidi konjugaadi vaktsiini täiustatud koostis. JOONISTE LÜHIKIRJELDUS 2 30 Joonis Fig 1: tulpdiagrammil on näidatud 11-valentse konjugaadi immunogeensus vanematel reesusahvidel. Heledad tulbad tähistavad GMC-d pärast kahte inokuleerimist 11-valentse konjugaadiga alumiiniumfosfaadi adjuvandis. Tumedamad tulbad tähistavad GMC pärast kahte inokuleerimist 11-valentse konjugaadiga adjuvandis C. Joonis Fig 2: tulpdiagrammil on näidatud mälu B-rakud PS3-le pärast inokuleerimist 11-valentse konjugaadiga adjuvandis C või alumiiniumfosfaadi adjuvandis.

4 EE EP1968631 B1 Joonis Fig 3: tulpdiagrammil on näidatud anti-polüsahhariidi 19F immunogeensus Balb/C hiirtel 4-valentsele puhastele polüsahhariididele ja 4-valentsetele dply konjugaatidele. Joonis Fig 4: tulpdiagrammil on näidatud anti-polüsahhariid 22F immunogeensus Balb/C hiirtel 4-valentsetele puhastele polüsahhariididele ja 4-valentsetele PhtD konjugaatidele. Joonis Fig : tulpdiagrammil on näidatud anti-22f IgG reaktsioon Balb/c hiirtel. Joonis Fig 6: tulpdiagrammil on näidatud anti-22f opsono-fagotsütoosi tiitrid Balb/c hiirtel. Joonis Fig 7: tulpdiagrammil on võrreldud IgG reaktsioone, mis tekitati noortel C7B1 hiirtel pärast immuniseerimist 13-valentse konjugaadi vaktsiiniga, mis moodustati erinevates adjuvantides. Joonis Fig 8: tulpdiagrammil on näidatud erinevate vaktsiinikombinatsioonide kaitsetõhusus ahvi pneumoonia mudelis. 1 Joonis Fig 9: tulpdiagrammil on näidatud anti PhtD IgG reaktsioon Balb/c hiirtel pärast 22F-PhtD või 22F-AHPhtD konjugaatidega immuniseerimist. Joonis Fig : kaitse tüübi 4 pneumokoki haiguse vastu hiirtel pärast 22F-PhtD või 22F-AHPhtD-ga immuniseerimist. LEIUTISE KIRJELDUS 2 Käesolev leiutis pakub imikutele mõeldud immunogeenset koostist, mis sisaldab multivalentset Streptococcus pneumoniae vaktsiini, hõlmates erineva serotüübiga kapslikujulisi sahhariidikonjugaate, kusjuures koostis sisaldab 22F sahhariidikonjugaati, kusjuures immunogeenses koostises olevad kapslikujulised sahhariidid on konjugeeritud kandjavalgule, mis on sõltumatuna valitud rühmast, kuhu kuuluvad teetanustoksoid (TT), difteeriatoksoid (DT), CRM197, TT fragment C, PhtD, PhtDE fusioonid, mürgitustatud pneumolüsiin ja D-valk, kusjuures koostis sisaldab veel S. pneumoniae kapslikujuliste sahhariidide 1, 4,, 6B, 7F, 9V, 14, 18C

EE EP1968631 B1 ja 23F konjugaate ning kusjuures immunogeenne koostis sisaldab vähemalt ühte S. pneumoniae kapslikujulist sahhariidi, mis on linkeri kaudu PhtD-le konjugeeritud. 1 2 30 Kuigi lapseeas ei ole pneumokoki serotüüpi 22F nakatumine väga tavaline, usuvad leiutajad, et 22F olemasolu lapseea pneumokoki vaktsiinis on kasulik ühisimmuunsuse esilekutsumisel populatsioonis, nii et eakate raske haiguse algust, mis on selle serotüübi poolt põhjustatud (nagu pneumoonia ja/või invasiivne pneumokoki haigus (IPD) ja/või kroonilise obstruktiivse kopsuhaiguse (KOK) halvenemine) võib ennetada või selle raskust vähendada. Antud leiutise eesmärgil tähendab inimesest hosti immuniseerimine KOK halvenemise vastu või KOK halvenemise ravi või ennetamine või KOK halvenemise raskusastme vähendamine alanemist KOK halvenemise määra või esinemise alanemist (näiteks vähenemise määr 0,1, 0,, 1, 2,,, % või rohkem) või KOK halvenemise raskusastme alanemist, nagu eespool määratleti, näiteks patsientide rühmas, keda immuniseeriti leiutise koostiste või vaktsiinidega. Järelikult pakutakse ühes variandis meetodit eakatel inimhostidel Streptococcus pneumoniae serotüübi 22F infektsiooni põhjustatud pneumokoki haiguse esinemise ennetamist (või selle raskusastme vähendamist), hõlmates inimimiku hostile (või inimimikute populatsioonile) leiutise immunogeense koostise või vaktsiini immunokaitsva doosi manustamist. Leiutise immunogeense koostise või vaktsiini kasutamine, et toota ravim eakatel inimpatsientidel serotüübi 22F Streptococcus pneumoniae nakkuse põhjustatud haiguse ennetamiseks või vähendamiseks, kusjuures koostise või vaktsiini immunokaitsev doos manustatakse inimimikule (või imikute populatsioonile). Ühes variandis sisaldab immunogeenne koostis Streptococcus pneumoniae kapslikujulisi sahhariidikonjugaate serogruppidest 19A ja 19F, kusjuures soovi korral 19A on esimesele bakteriaalsele toksoidile konjugeeritud ja 19F on teisele bakteriaalsele toksoidile konjugeeritud. Termin kapslikujuline sahhariid hõlmab kapslikujulisi polüsahhariide ja oligosahhariidi, mis on saadavad kapslikujulisest polüsahhariidist. Oligosahhariid sisaldab vähemalt 4 suhkrujääki.

6 EE EP1968631 B1 1 2 30 Termin bakteriaalne toksoid hõlmab bakteriaalseid toksiine, mis on inaktiveeritud kas geneetilise mutatsiooni, keemilise töötlemise või konjugeerimise teel. Sobivate bakteriaalsete toksoidide seas on teetanustoksoid, difteeriatoksoid, pertussistoksoid, bakteriaalsed tsütolüsiinid või pneumolüsiin. Kirjeldatud on pneumolüsiini (Ply) mutatsioone, mis alandavad pneumolüsiini toksilisust (WO 90/0691, WO 99/03884). Samamoodi on teada difteeriatoksiini geneetilised mutatsioonid, mis selle toksilisust alandavad (vaata allpool). Difteeriatoksiini geneetiliselt mürgitustatud analoogide seas on CRM197 ja teised mutandid, mida on kirjeldatud patentides US 4,709,017, US,843,711, US,601,827 ja US,917,017. CRM197 on difteeriatoksiini mürgitu vorm, kuid see on difteeriatoksiinist immunoloogiliselt eristumatu. CRM197 toodab C. diphtheriae, mis on infekteeritud mittetoksigeense faasi β197 tox poolt, mis loodi toksigeense karünefaagi b (carynephage b) nitrosoguanidiini mutageneesiga (Uchida et al, Nature New Biology (1971) 233; 8-11). CRM197 valgul on sama molekulmass nagu difteeriatoksiinil, kuid erineb sellest üksiku aluse muutusega strukturaalses geenis. See põhjustab aminohappe glütsiini muutust glutamiiniks positsioonil 2, mis muudab fragmendi A NAD sidumise võimetuks ja järelikult mürgituks (Pappenheimer 1977, Ann Rev, Biochem. 46; 69-94, Rappuoli Applied and Environmental Microbiology, sept 1983 lk 60-64). Esimene ja teine bakteriaalne toksoid võivad olla samasugused või erinevad. Kui esimene ja teine bakteriaalne toksoid on erinevad, tähendab see, et neil on erinev aminohappe järjestus. Näiteks 19A ja 19F võib konjugeerida vastavalt teetanustoksidiks ja teetanustoksidiks; difteeriatoksoidiks ja difteeriatoksoidiks; Crm197-ks ja CRM197- ks, pneumolüsiiniks ja pneumolüsiiniks, teetanustoksoidiks ja difteeriatoksoidiks; teetanustoksoidiks ja CRM197-ks; teetanustoksoidiks ja pneumolüsiiniks; difteeriatoksoidiks ja teetanustoksoidiks; difteeriatoksoidiks ja CRM197-ks, difteeriatoksoidiks ja pneumolüsiiniks; CRM197-ks ja teetanustoksoidiks, CRM197- ks ja difteeriatoksoidiks; CRM197-ks ja pneumolüsiiniks; pneumolüsiiniks ja teetanustoksoidiks; pneumolüsiiniks ja difteeriatoksoidiks; või pneumolüsiiniks ja CRM197-ks.

7 EE EP1968631 B1 Lisaks 22F (ning soovi korral 19A ja 19F) S. pneumoniae sahhariidkonjugaadile sisaldab immunogeenne koostis veel S. pneumoniae kapslikujuliste sahhariidide 1, 4,, 6B, 7F, 9V, 14, 18C ja 23F konjugaate. Teatud variandis sisaldab immunogeenne koostis lisaks 22F (ning soovi korral 19A ja 19F) S. pneumoniae sahhariidkonjugaadile veel S. pneumoniae kapslikujuliste sahhariidide 1, 4,, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 22F ja 23F konjugaate. Teatud variandis sisaldab immunogeenne koostis veel lisaks 22F (ning soovi korral 19A ja 19F) S. pneumoniae sahhariidkonjugaadile veel S. pneumoniae kapslikujuliste sahhariidide 1, 3, 4,, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 22F ja 23F konjugaate. 1 2 30 Teatud variandis sisaldab immunogeenne koostis lisaks 22F (ning soovi korral 19A ja 19F) S. pneumoniae sahhariidkonjugaadile veel S. pneumoniae kapslikujuliste sahhariidide 1, 3, 4,, 6A, 6B, 7F, 9V, 14,18C, 22F ja 23F konjugaate. Käesoleva leiutise pneumokoki vaktsiin sisaldab konjugeeritud kapslikujuliste sahhariidide antigeene, kusjuures sahhariidid on tuletatud S. pneumoniae vähemalt kümnest serotüübist. S. pneumoniae kapslikujuliste sahhariidide arv võib olla vahemikus erinevat serotüüpi (ehk V, valetsid) kuni 23 erinevat serotüüpi (23V). Ühes variandis on, 11, 12, 13, 14 või 1 erinevat serotüüpi. Leiutise järgmises variandis võib vaktsiin sisaldada konjugeeritud S. pneumoniae sahhariide ja konjugeerimata S. pneumoniae sahhariide. Soovitatavalt on sahhariidi serotüüpide koguarv vähem kui või 23. Näiteks võib leiutis sisaldada konjugeeritud serotüüpi ja 13 konjugeerimata sahhariidi. Samamoodi võib vaktsiin sisaldada vastavalt 11, 12, 13, 14 või 16 konjugeeritud sahhariidi ning 12, 11,, 9 või 7 konjugeerimata sahhariidi. Ühes variandis valitakse leiutise multivalentne pneumokoki vaktsiin järgnevatest serotüüpidest: 1, 2, 3, 4,, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, A, 11A, 12F, 14, 1B, 17F, 18C, 19A, 19F,, 22F, 23F ja 33F, kuigi on mõistetav, et ühe või kaks muud serotüüpi võib asendada, sõltuvalt retsipiendi, kes vaktsiini saab, vanusest ja geograafilisest asukohast, kus vaktsiini manustatakse. Näiteks võib väljaande - valentne vaktsiin sisaldada polüsahhariide serotüüpidest 1, 4,, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F ja 23F. Väljaande 11-valentne vaktsiin võib ka sisaldada sahhariide

8 EE EP1968631 B1 1 2 30 serotüübist 3. 12- või 13-valentne pediaatriline (laste-) vaktsiin võib ka sisaldada - või 11-valentset koostist, millele on lisatud serotüübid 6A ja 22F või 19A ja 22F või 22F ja 1B, kusjuures 13-valentne eakamate vaktsiin võib sisaldada 11-valentset koostist, millele on lisatud serotüübid 19A ja 22F või 8 ja 22F või 12F ja 22F või 1B ja 22F. 14-valentne pediaatriline vaktsiin võib sisaldada eespool kirjeldatud - valentset koostist, millele on lisatud serotüübid 3, 6A, 19A ja 22F; serotüübid 6A, 8, 19A ja 22F; serotüübid 6A, 12F, 19A ja 22F; serotüübid 6A, 1B, 19A ja 22F; serotüübid 3, 8, 19A ja 22F; serotüübid 3, 12F, 19A ja 22F; serotüübid 3, 1B, 19A ja 22F; serotüübid 3, 6A, 8 ja 22F; serotüübid 3, 6A, 12F ja 22F või serotüübid 3, 6A, 1B ja 22F. Ühes variandis sisaldab koostis kapslikujulisi sahhariide, mis on saadud serotüüpidest 1, 4,, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F, 22F ja 23F ( soovitatavalt konjugeeritud). Väljaande järgmises variandis on kaasatud vähemalt 11 sahhariidi antigeeni (soovitatavalt konjugeeritud), näiteks kapslikujulised sahhariidid, mis on saadud serotüüpidest 1, 3, 4,, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F ja 23F. Leiutise järgmises variandis on kaasatud vähemalt 12 või 13 sahhariidi antigeeni, näiteks võib vaktsiin sisaldada kapslikujulisi sahhariide, mis on saadud serotüüpidest 1, 3, 4,, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F ja 23F, kuigi täiendavaid sahhariidi antigeene, näiteks 23-valentsed (nagu serotüübid 1, 2, 3, 4,, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, A, 11A, 12F, 14, 1B, 17F, 18C, 19A, 19F,, 22F, 23F ja 33F), on samuti leiutises arvesse võetud. Käesoleva leiutise vaktsiin võib sisaldada Haemophilus influenzaelt saadud D-valku (PD) (vaata nt EP 0946). Haemophilus influenzae on põhiline keskkõrvapõletikku esilekutsuv organism ning käesolevad leiutajad on näidanud, et antud valgu kaasamine pneumokoki vaktsiini võimaldab kaitsetaset Haemophilus influenzaega seotud keskkõrvapõletiku vastu (viide POET publikatsioon). Teatud variandis sisaldab vaktsiini koostis D-valku. Ühes aspektis esineb PD kandjavalguna ühele või mitmele sahhariidile. Järgmises aspektis võib D-valk esineda vaktsiini koostises vaba valguna. Lisaaspektis esineb D-valk nii kandjavalgu kui ka vaba valguna. D-valku võib kasutada täispikkuses valgu või fragmendina (WO006360). Täiendavas aspektis esineb D-valk kandjavalguna enamikule sahhariididele, näiteks 6, 7, 8, 9 või enam sahhariidi võib olla D-valguks konjugeeritud. Selles aspektis võib D-valk ka vaba valguna esineda.

9 EE EP1968631 B1 1 2 30 Käesoleva leiutise vaktsiin sisaldab ühte, kahte või enam erinevat tüüpi kandjavalku. Iga kandjavalgu tüüp võib kandjana toimida enam kui ühele sahhariidile, kus sahhariidid võivad olla samasugused või erinevad. Näiteks serotüübid 3 ja 4 võivad olla konjugeeritud samale kandjavalgule, kas kandjavalgu samale molekulile või sama kandjavalgu erinevatele molekulidele. Ühes variandis võib kaks või enam erinevat sahhariidi olla konjugeeritud samale kandjavalgule, kas kandjavalgu samale molekulile või sama kandjavalgu erinevatele molekulidele. Streptococcus pneumoniae kapslikujulised sahhariidid, mis esinevad leiutise immunogeenses koostises, on konjugeeritud kandjavalgule, mis valitakse sõltumatult rühmast, kuhu kuuluvad TT, DT, CRM197, TT fragment C, PhtD, PhtDE fusioonid (eriti need, mida on kirjeldatud patentides WO 01/98334 ja WO 03/4007), mürgitustatud pneumolüsiin ja D-valk. Kandjavalk, mis on ühele või mitmele leiutise immunogeensetes koostistes olevatele S. pneumoniae kapslikujulisele sahhariidile konjugeeritud, on soovi korral PhtD või PhtDE fusioon. PhtA, PhtB, PhtD või PhtE valkudel on aminohappe järjestus, millel on 80%, 8%, 90%, 9%, 98%, 99% või 0%-line identsus järjestusega, mis on avaldatud patendis WO 00/37 või WO 00/39299 (nt patendi WO 00/37 SEQ ID nr: 4 aminohappe järjestusega 1-838 või 21-838 PhtD puhul). Näiteks sulandvalgud koosnevad täispikast PhtA, PhtB, PhtD, PhtE-st või nende 2, 3 või 4 fragmendist. Sulandvalkude näideteks on PhtA/B, PhtA/D, PhtA/E, PhtB/A, PhtB/D, PhtB/E, PhtD/A, PhtD/B, PhtD/E, PhtE/A, PhtE/B ja PhtE/D, kusjuures valgud on esimesena mainituga ühendatud N-otsas (vaata näiteks WO01/98334). Kui kasutatakse Pht valkude fragmente (eraldi või sulandvalgu osana), sisaldab iga fragment soovi korral ühte või mitu histidiin triaadi motiivi ja/või taoliste polüpeptiidide teiseste heeliksite piirkondi. Histidiini triaadi motiiv on polüpeptiidi osa, mis on järjestusega HxxHxH, kus H on histidiin ja x on histidiinist erinev aminohape. Teisese heeliksi piirkond on piirkond, mida prognoositakse Coils algoritmiga. Lupus, A et al (1991) Science 22; 1162-1164. Teatud variandis sisaldab antud või iga fragment ühte või mitut histidiini triaadi motiivi ning vähemalt ühte teisese heeliksi piirkonda. Järgmises variandis sisaldab antud või iga fragment täpselt või vähemalt 2, 3, 4 või histidiini triaadi motiivi (soovi korral loodusliku Pht järjestusega 2 või enama triaadi vahel või triaadisisese järjestusega, mis on enam

EE EP1968631 B1 1 2 30 kui 0, 60, 70, 80, 90 või 0%-lise identsusega loodusliku pneumokoki triaadisisese Pht järjestuse suhtes nt triaadisisene järjestus, mis on esitatud patendis WO 00/37 SEQ ID nr-ga: 4 PhtD jaoks). Teatud variandis sisaldab antud või iga fragment täpselt või vähemalt 2, 3 või 4 teisese heeliksi piirkonda. Teatud variandis sisaldab siin avaldatud Pht valk signaalijärjestusega kinnitatud täispikkuses valku, küpset täispikkuses valku, kus singaalipeptiidi (näiteks aminohapet N-otsal) on eemaldatud, Pht valgu looduslikult esinevaid variante ja Pht valgu immunogeenseid fragmente (nt eespool kirjeldatud fragmendid või polüpeptiidid, mis sisaldavad vähemalt 1 või omavahel ühendatud aminohapet aminohappe järjestusest patendis WO00/37 või WO00/39299, kusjuures nimetatud polüpeptiid suudab kutsuda esile immuunvastuse, mis on patendis WO00/37 või WO00/39299 nimetatud aminohappe järjestuse suhtes spetsiifiline). Täpsemalt hõlmab siin kasutatud termin PhtD täispikka valku kinnitatud signaalijärjestusega, küpset täispikka valku, millel signaalipeptiid (näiteks aminohapet N-otsal) on eemaldatud, PhtD looduslikult esinevaid variante ja PhtD immunogeenseid fragmente (nt eespool kirjeldatud fragmendid või polüpeptiidid, mis sisaldavad vähemalt 1 või omavahel ühendatud aminohapet PhtD aminohappe järjestusest patendis WO00/37 või WO00/39299, kusjuures nimetatud polüpeptiid suudab kutsuda esile immuunvastuse, mis on nimetatud PhtD aminohappe järjestuse patendis WO00/37 või WO00/39299 suhtes spetsiifiline (nt patendi WO 00/37 SEQ ID nr: 4 PhtD jaoks). Kui valgukandja on 2 või enama sahhariidi jaoks koostises sama, võib sahhariidid valgukandja samale molekulile konjugeerida (kandjamolekulidele on 2 või enam erinevat sahhariidi konjugeeritud) [vaata näiteks WO 04/08321]. Teisel juhul võivad sahhariidid olla kõik valgukandja erinevatele molekulidele eraldi konjugeeritud (igale valgukandja molekulile on ainult ühte tüüpi sahhariid konjugeeritud). Väljaande kandjavalkude näideteks on DT (difteeriatoksoid), TT (teetanustoksoid) või TT fragment C, DT CRM197 ( DT mutant) teised DT punktmutanid, nagu CRM176, CRM228, CRM 4 (Uchida et al J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973); CRM 9, CRM 4, CRM2, CRM 3 ja CRM7 ning teised mutatsioonid, mida on

11 EE EP1968631 B1 1 2 30 kirjeldanud Nicholls and Youle raamatus Genetically Engineered Toxins, toim.: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992; Glu-148 deletsioon või mutatsioon Asp-ks, Glniks või Ser-iks ja/või Ala 18 Gly-ks ning muud mutatsioonid, mis on avaldatud patendis US 4709017 või US 490740; vähemalt ühe või mitme jääk Lys 16, Lys 26, Phe 30 ja/või Lys 34 mutatsioon ning teised mutatsioonid, mis on avaldatud patendis US 917017 või US 64673; või fragment, mis on avaldatud patendis US 843711, pneumokoki pneumolüsiin (Kuo et al (199) Infect Immun, 63; 2706-13), sealhulgas mõnel moel mürgitustatud ply, näiteks dply-gmbs (WO 040811, PCT/EP0/028) või dply-formool, PhtX, sealhulgas PhtA, PhtB, PhtD, PhtE ning Pht valkude fusioonid, näiteks PhtDE fusioonid, PhtBE fusioonid (WO 01/98334 ja WO 03/4007), (Pht A -E on üksikasjalikumalt kirjeldatud allpool) OMPC (meningokoki välismembraani valk see on tavaliselt eraldatud N. meningitidissero rühmast B EP 0371), PorB (N. meningitidiselt), PD (Haemophilus influenzae D-valk vaata nt EP 0946 B) või nende immunoloogiliselt funktsionaalsed ekvivalendid, sünteetilised peptiidid (EP0378881, EP0427347), kuumašoki valgud (WO 93/17712, WO 94/038), pertussise valgud (WO 98/8668, EP0471177), tsütokiinid, lümfokiinid, kasvufaktorid või -hormoonid, (WO 91/01146), tehisvalgud, mis sisaldavad mitut inimese CD4+ T-raku epitoopi erinevatest patogeenidest saadud antigeenidest (Falugi et al (01) Eur J Immunol, 31; 3816-3824), nagu N19 valk (Baraldoi et al (04) Infect Immun, 72; 4884-7) pneumokoki pindvalk PspA (WO 02/091998), raua imendumise valgud (WO 01/72337), C. difficile toksiin A või B (WO 00/61761). Nurkka et al poolt kirjeldati ajakirjas Pediatric Infectious Disease Journal, 23(11):08-14, 04 nov, 11-valentset pneumokoki vaktsiini, kus kõik serotüübid olid PD-le konjugeeritud. Ent käesolevad leiutajad on näidanud, et opsonofagotsüütiline aktiivsus paranes antikehadel, mis kutsuti esile konjugaatidega, millel 19F oli DT-le konjugeeritud, võrreldes 19F-ga, mis oli PD-le konjugeeritud. Lisaks on käesolevad leiutajad näidanud, et suuremat ristreaktiivsust 19A-le on näha 19Fga, mis on DT-le konjugeeritud. Järelikult on käesoleva leiutise koostise omaduseks fakt, et serotüüp 19F on konjugeeritud bakteriaalsele toksoidile, näiteks TT, pneumolüsiin, DT või CRM 197. Ühes aspektis on serotüüp 19F konjugeeritud DTle. Samuti on leiutise omaduseks fakt, et serotüüp 19A on konjugeeritud bakteriaalsele toksoidile, näiteks TT, pneumolüsiin, DT või CRM 197.

12 EE EP1968631 B1 1 2 30 Immunogeense koostise ülejäänud sahhariidi serotüübid võivad kõik olla konjugeeritud ühele või mitmele kandjavalgule, mis ei ole DT (st ainult 19F on DTle konjugeeritud), või olla jaotatud ühe või mitme kandjavalgu vahel, mis ise ei ole DT ega DT. Ühes variandis on 19F konjugeeritud DT-le või CRM 197-le ning kõik ülejäänud serotüübid on PD-le konjugeeritud. Järgmises variandis on 19F konjugeeritud DT-le või CRM 197-le ning ülejäänud serotüübid on jaotatud PD ning TT või DT või CRM 197 vahel. Lisavariandis on 19F konjugeeritud DT-le või CRM 197-le ning mitte rohkem kui üks sahhariid on TT-le konjugeeritud. Antud variandi ühes aspektis on nimetatud üks sahhariid 18C või 12F. Järgmises variandis on 19F konjugeeritud DT-le või CRM 197-le ning mitte rohkem kui kaks sahhariidi on TT-le konjugeeritud. Järgmises variandis on 19F konjugeeritud DT-le või CRM 197-le ning ülejäänud serotüübid on jaotatud PD, TT ja DT või CRM 197 vahel. Lisavariandis on 19F konjugeeritud DT-le või CRM 197-le ning ülejäänud serotüübid on jaotatud PD, TT ja pneumolüsiini vahel. Järgmises variandis on 19F konjugeeritud DT-le või CRM 197-le ning ülejäänud serotüübid on jaotatud PD, TT ja CRM 197 vahel. Lisavariandis on 19F konjugeeritud DT-le või CRM197-le ning ülejäänud serotüübid on jaotatud PD, TT, pneumolüsiini ja soovi korral PhtD või PhtD/E sulandvalgu vahel. Täiendavas variandis on 19F konjugeeritud DT-le või CRM197-le, 19A on konjugeeritud pneumolüsiinile või TT-le ning ülejäänud serotüübid on jaotatud PD, TT, pneumolüsiini ja soovi korral PhtD või PhtD/E sulandvalgu vahel. Järgmises variandis on 19F konjugeeritud DT-le või CRM197-le, 19A on konjugeeritud pneumolüsiinile või TT-le, üks täiendav sahhariid on konjugeeritud TT-le, üks lisasahhariid on konjugeeritud PhtD-le või PhtD/E-le ning kõik täiendavad sahhariidid on konjugeeritud PD-le. Lisavariandis on 19F konjugeeritud DT-le või CRM197-le, 19A on konjugeeritud pneumolüsiinile, üks lisasahhariid on konjugeeritud TT-le, üks täiendav sahhariid on konjugeeritud pneumolüsiinile, 2 lisasahhariidi on konjugeeritud PhtD-le või PhtD/E-le ning kõik täiendavad sahhariidid on konjugeeritud PD-le. Teatud variandis sisaldab leiutise immunogeenne koostis Haemophilus influenzaest pärit D-valku. Kui selles variandis PD ei ole kandjavalkudest üks, mida kasutati 19Fst erinevate mis tahes sahhariidide konjugeerimiseks, näiteks 19F on DT-le konjugeeritud, samas kui teised serotüübid on konjugeeritud ühele või mitmele erinevale kandjavalgule, mis ei ole PD, siis PD esineb vaktsiinis vaba valguna. Kui

13 EE EP1968631 B1 PD on üks kandjavalkudest, mida kasutati 19F-st erinevate sahhariidide konjugeerimiseks, siis PD võib soovi korral vaktsiini koostises vaba valguna esineda. 1 2 30 Termin sahhariid võib antud spetsifikatsioonis läbivalt tähistada polüsahhariidi või oligosahhariidi ning hõlmab mõlemat. Polüsahhariidid on bakteritest eraldatud ning olla teatud määral kalibreeritud vastavalt tuntud meetoditele (vaata näiteks EP49724 ja EP4972) ja soovitatavalt mikrofluidisatsiooni teel. Polüsahhariidid võivad olla kalibreeritud, et vähendada viskoossust polüsahhariidi proovides ja/või parandada filtreeritavust konjugeeritud toodetele. Oligosahhariididel on vähe korduvaid ühikuid (tavaliselt -30 korduvat ühikut) ning need on tavaliselt hüdrolüüsitud polüsahhariidid. Pneumokoki kapslikujulised polüsahhariidid sisaldavad korduvaid oligosahhariidi ühikuid, mis võivad sisaldada kuni 8 suhkrujääki. Oligosahhariidi ühikute kokkuvõtet pneumokoki põhilistele stereotüüpidele vaata publikatsioonist JONES, Christopher. Vaccines based on the cell surface carbohydrates of pathogenic bacteria. An. Acad. Bras. Ciênc., juuni 0, kd. 77, nr. 2, lk 293-324. ISSN 0001-376. Teatud variandis võib kapslikujuline sahhariidi antigeen olla täispikk polüsahhariid, ent teistes võib see olla üks oligosahhariidi üksus või lühem kui korduvate oligosahhariidi üksuste loodusliku pikkusega sahhariidi ahel. Teatud variandis on kõik vaktsiinis olevad sahhariidid polüsahhariidid. Täispikad polüsahhariidid võivad olla kalibreeritud, st nende suurus võib olla erinevate meetoditega vähendatud, nagu happe hüdrolüüsiga töötlemine, vesiniperoksiidiga töötlemine, kalibreerimine seadmega Emulsiflex, millele järgneb vesinikperoksiidiga töötlemine, et anda oligosahhariidi fragmendid, või mikrofluidisatsioon. Leiutajad on ka märkinud, et valdkonna fookuseks on olnud oligosahhariidide kasutamine, et konjugaadi tootmist lihtsustada. Leiutajad leidsid, et looduslike või kergelt kalibreeritud polüsahhariidi konjugaatide kasutamisega on võimalik realiseerida üks või mitu järgnevat eelist: 1) kõrge immunogeensusega konjugaat, mis on filtreeritav, 2) polüsahhariidi ja valgu suhet konjugaadis saab muuta nii, et polüsahhariidi ja valgu suhet (w/w) konjugaadis võib tõsta (mis võib kandja supressiooni toimet mõjutada), 3) hüdrolüüsi suhtes vastuvõtlikud immunogeensed konjugaadid võib stabiliseerida konjugeerimiseks suuremate sahhariidide

14 EE EP1968631 B1 1 2 kasutamisega. Suuremate polüsahhariidide kasutamise tulemuseks võib olla suurem ristsidumine konjugaadist kandjaga ning see võib vähendada vaba sahhariidi vabanemist konjugaadist. Varasemas tehnikas kirjeldatud konjugaatvaktsiinid kalduvad polüsahhariide enne konjugeerimist depolümeriseerima, et konjugeerimist parandada. Käesolevad leiutajad on avastanud, et sahhariidkonjugaadi vaktsiinid, mis säilitavad sahhariidi suurema suuruse, võimaldavad head immuunvastust pneumokoki haiguse vastu. Leiutise immunogeenne koostis võib järelikult sisaldada ühte või mitut sahhariidkonjugaati, kusjuures iga sahhariidi keskmine suurus (nt mass keskmine molekulmass, Mr) enne konjugeerimist on üle 80 kda, 0 kda, 0 kda, 300 kda, 400 kda, 00 kda või 00 kda. Teatud variandis peaks leiutise ühel või mitmel sahhariidkonjugaadil olema sahhariidi konjugeerimiseelne keskmine suurus 0-1600, 80-1400, 0-00, -00 või 0-400 kda (panna tähele, et kui keskmine suurus on Mr, peaks kda ühikud siin olema asendatud x 3 -ga). Teatud variandis peaks konjugaat pärast konjugeerimist olema filtreeritav läbi 0,2 mikronilise filtri, nii et pärast filtreerimist on saadus enam kui 0, 60, 70, 80, 90 või 9%, võrreldes filtreerimiseelse prooviga. Leiutise eesmärgil tähendab looduslik polüsahhariid sahhariidi, mida ei ole edastatud töötlemisse (nt puhastamisjärgselt), mille eesmärgiks on sahhariidi suuruse vähendamine. Polüsahhariidi suurus võib normaalsete puhastamisprotseduuride käigus pisut väheneda. Taoline sahhariid on endiselt looduslik. Ainult kui polüsahhariid on kalibreerimisse edastatud, ei peetaks polüsahhariidi looduslikuks. Leiutise eesmärgil tähendab faktori kuni x2 võrra kalibreeritud, et sahhariid peab läbima protseduuri, mille eesmärgiks on sahhariidi suuruse vähendamine, kuid säilitada suurus, mis on enam kui pool loodusliku polüsahhariidi suurusest. X3, x4 jne on tõlgendatud samal viisil, st sahhariid peab läbima protseduuri, mille eesmärgiks on polüsahhariidi suuruse vähendamine, kuid säilitada enam kui kolmandik, neljandik jne loodusliku polüsahhariidi suurusest.

1 EE EP1968631 B1 Leiutise teatud aspektis sisaldab immunogeenne koostis pneumokoki sahhariide vähemalt serotüübist, mis on kandjavalgule konjugeeritud, kusjuures vähemalt 1, 2, 3, 4,, 6, 7, 8, 9 või iga S. pneumonia sahhariid on looduslik polüsahhariid. 1 2 30 Leiutise teatud aspektis sisaldab immunogeenne koostis pneumokoki sahhariide vähemalt serotüübist, mis on kandjavalgule konjugeeritud, kusjuures vähemalt 1, 2, 3, 4,, 6, 7, 8, 9 või iga S. pneumonia sahhariid on kalibreeritud faktoriga kuni x2, x3, x4, x, x6, x7, x8, x9 või x. Antud aspekti ühes variandis on enamik sahhariididest, näiteks 6, 7, 8 või enam sahhariidi, kalibreeritud faktoriga kuni x2, x3, x4, x, x6, x7, x8, x9 või x. Sahhariidi molekulmass või keskmine molekulmass (või suurus) tähendab siin sahhariidi massi keskmist molekulmassi (Mr), mis mõõdeti enne konjugeerimist ja mõõdetakse MALLSi võttega. MALLSi võte on valdkonnas tuntud ning seda teostatakse tavaliselt nii, nagu on kirjeldatud näites 2. Pneumokoki sahhariidide MALLSi analüüsiks võib kasutada kahte tulpa (TSKG6000 ja 000PWxl) koos ning sahhariide elueeriti vees. Sahhariidid tuvastatakse valgust hajutava detektoriga (näiteks Wyatt Dawn DSP, millele on lisatud mw argoonilaser lainepikkusel 488 nm) ning interferomeeterrefraktomeetriga (näiteks Wyatt Otilab DSP, millele on lisatud P0 andur ja punane filter lainepikkusel 498 nm). Teatud variandis on S. pneumoniae sahhariidid looduslikud polüsahhariidid või looduslikud polüsahhariidid, mille suurust on tavalise ekstraktsiooni protseduuri käigus vähendatud. Ühes variandis on S. pneumoniae sahhariidid kalibreeritud mehaanilise lõhestamisega, näiteks mikrofluidisatsiooni või kõrgsagedusheliga töötlemise teel. Mikrofluidisatsiooni ja kõrgsagedusheliga töötlemise eeliseks on suuremate looduslike polüsahhariide suuruse vähendamine piisavalt, et filtreeritavat konjugaati võimaldada. Kalibreerimine tehakse faktoriga, mis ei ole rohkem kui x, x, x8, x6, x, x4, x3 või x2. Ühes variandis sisaldab immunogeenne koostis S. pneumoniae konjugaate, mis on valmistatud loodulike polüsahhariidide ja sahhariidide segust, mis on kalibreeritud

16 EE EP1968631 B1 faktoriga mitte üle x. Selle variandi ühes aspektis on enamik sahhariididest, näiteks 6, 7, 8 või enam sahhariide, kalibreeritud faktoriga kuni x2, x3, x4, x või x6. 1 2 30 Teatud variandis on pneumokoki sahhariid kandjavalgule linkeri, näiteks bifunktsionaalne linker, kaudu konjugeeritud. Linker on soovi korral heterobifunktsionaalne või homobifunktsionaalne, millel on näiteks reaktiivne aminohrühm ja reaktiivne karboksüülhappe rühm, 2 reaktiivset aminorühma või kaks reaktiivset karboksüülhappe rühma. Linkeril on näiteks vahemikus 4 ja, 4 ja 12, ja süsiniku aatomit. Võimalikuks linkeriks on ADH. Teiste linkerite seas on B-propioonamido (WO 00/99), nitrofenüül-etüülamiin (Gever et al (1979) Med. Microbiol. Immunol. 16; 171-288), haloalküülhaliidid (US40768), glükosiidsidemed (US467374, US4808700), heksaandiamiin ja 6-aminokapronhape (US449286). Teatud variandis kasutatakse ADH-d linkerina, et sahhariidi serotüübist 18C konjugeerida. Teatud variandis kasutatakse ADH-d linkerina, et sahhariidi serotüübist 22F konjugeerida. Leiutise immunogeensetes koostistes olevaid sahhariidkonjugaate võib valmistada mis tahes tuntud sidumisvõttega. Konjugeerimise meetod võib tugineda sahhariidi aktiveerimisel 1-tsüano-4-dimetüülamino püridiinium tetrafluoroboraadiga (CDAP), et tsüanaatestrit moodustada. Aktiveeritud sahhariidi võib seejärel otse või speisseri (linkeri) rühma kaudu kandjavalgul aminorühmale siduda. Näiteks võib speisser olla tsüstamiin või tsüsteamiin, et anda tioolitud polüsahhariid, mille võib kandjale siduda tioeetri sidemega, mis saadi pärast reaktsiooni maleimiid-aktiveeritud kandjavalguga (näiteks GMBS-i kasutades) või haloatsetüülitud kandjavalguga (näiteks jodoatseetimiidi [nt etüül jodoatseetimiid HCl] või N-suktsiinimidüülbromoatsetaati või SIAB-d või SIA-d või SBAP-d kasutades). Soovitatavalt seotakse tsüanaatester (soovi korral valmistatud CDAP keemiaga) heksaandiamiini või ADHga ning amino-derivatiseeritud sahhariid konjugeeritakse kandjavalgule karbodiimiidi (nt EDAC või EDC) keemia abil karboksüülrühma kaudu valgukandjal. Taolisi konjugaate on kirjeldatud PCT avaldatud taotluses WO 93/1760, Uniformed Services University, ning patentides WO 9/08348 ja WO 96/29094.

17 EE EP1968631 B1 Teised sobivad võtted rakendavad karbodiimiide, hüdrasiide, aktiivseid estreid, norboraani, p-nitrobensoehapet, N-hüdroksüsuktsiinimiidi, S-NHS-i, EDC-d, TSTUd. Paljusid on kirjeldatud patendis WO 98/42721. Konjugeerimine võib hõlmata karbonüüllinkerit, mille võib moodustada sahhariidi vaba hüdroksüülrühma reageerimisel CDI-ga (Bethell et al, J. Biol. Chem. 1979, 24; 272-4, Hearn et al, J. Chromatogr. 1981. 218; 09-18), millele järgneb reaktsioon valguga, et karbamaatsidet moodustada. See võib hõlmata anomeerse otsa redutseerimist primaarseks hüdroksüülrühmaks, primaarse hüdroksüülrühma valikulist kaitsmist/kaitse eemaldamist, primaarse hüdroksüülrühma reaktsiooni CDI-ga, et moodustada CDI karbamaadi vahesaadus ning CDI karbamaadi vahesaaduse sidumist aminorühmaga valgul. Konjugaate võib ka valmistada otse redutseeriva amineerimise meetoditega, nagu on kirjeldatud patentides US 436170 (Jennings) ja US 467374 (Anderson). Teisi meetodeid on kirjeldatud patentides EP-0-161-188, EP-837 ja EP-0-47708. 1 2 30 Täiendav meetod hõlmab tsüanogeenbromiidi (või CDAP) aktiveeritud sahhariidi, mis on derivatiseeritud adipiinhappe dihüdrasiidiga (ADH), sidumist valgukandjale karbodiimiidi kondensatsiooni teel (Chu C. et al, Infect. Immunity, 1983 24 26), kasutades näiteks EDAC-d. Teatud variandis ühendatakse hüdroksüülrühm (soovitatavalt aktiveeritud hüdroksüülrühm, näiteks hüdroksüülrühm, mis aktiveeriti tsüanaatestri valmistamiseks [nt CDAP-ga]) sahhariidil amino- või karboksüülrühmaga valgul kas otse või kaudselt (linkeri kaudu). Kui linker on olemas, on sahhariidil olev hüdroksüülrühm soovitatavalt ühendatud aminorühmale linkeril, kasutades näiteks CDAP konjugeerimist. Täiendava aminorühma linkeris (näiteks ADH) võib konjugeerida valgul olevale karboksüülrühmale, kasutades näiteks karbodiimiidi keemiat, kasutades näiteks EDAC-d. Teatud variandis konjugeeritakse pneumokoki kapslikujuli(sed)ne sahhariid(id) linkerile enne, kui linker kandjavalgule konjugeeritakse. Teisel juhul võib linkeri kandjale konjugeerida enne sahhariidile konjugeerimist. Kasutada võib ka võtete kombinatsiooni, kus osa sahhariid-valgu konjugaate valmistatakse CDAP abil ja mõned redutseeriva amineerimisega.

18 EE EP1968631 B1 Üldiselt võib sidumiseks/konjugeerimiseks kasutada keemiliste rühmade järgnevaid tüüpe: 1 A) karboksüül (näiteks aspartaamhappe või glutamiinhappe kaudu). Teatud variandis ühendatakse see rühm sahhariidil olevatele aminorühmadele otse või linkeril olevale aminorühmale karbodiimiidi keemiaga, nt EDAC-ga. B) Aminorühm (näiteks lüsiini kaudu). Teatud variandis ühendatakse see rühm sahhariidil olevatele karboksüülrühmadele otse või linkeril olevale karboksüülrühmale karbodiimiidi keemiaga, nt EDAC-ga. Järgmises variandis ühendatakse see rühm sahhariidil olevatele hüdroksüülrühmadele, mis on aktiveeritud CDAP või CNBr-ga, otse või linkeril olevatele taolistele rühmadele; sahhariididele või linkeritele, millel on aldehüüdirühm; sahhariididele või linkeritele, millel on suktsiinimiidestri rühm. C) Sulfhüdrüül (näiteks tsüsteiini kaudu). Teatud variandis on see rühm broom- või kloor-atsetüleeritud sahhariidile või linkerile ühendatud maleimiidi keemiaga. Ühes variandis on see rühm aktiveeritud/modifitseeritud bisdiasobensidiiniga. D) Hüdroksüülrühm (näiteks türosiini kaudu). Teatud variandis on see rühm aktiveeritud/modifitseeritud bis-diasobensidiiniga. E) Imidasolüülrühm (näiteks histidiini kaudu). Ühes variandis on see rühm aktiveeritud/modifitseeritud bis-diasobensidiiniga. F) Guanidüülrühm (näiteks arginiini kaudu). G) Indolüülrühm (näiteks trüptofaani kaudu). 2 Sahhariidil võib sidumiseks üldiselt kasutada järgnevaid rühmasid: OH, COOH või NH2. Aldehüüdrühmad võib toota pärast valdkonnas tuntud erinevaid töötlemisi, nagu: perjodaat, happe hüdrolüüs, vesinikperoksiid jne. Otsese sidumise võtted: Sahhariid-OH + CNBr või CDAP ----> tsüanaatester + NH2-Prot ----> konjugaat

19 EE EP1968631 B1 Sahhariid-aldehüüd + NH2-Prot ----> Schiffi alus+ NaCNBH3 ----> konjugaat Sahhariid-COOH + NH2-Prot + EDAC ----> konjugaat Sahhariid-NH2 + COOH-Prot + EDAC ----> konjugaat Speisseri (linkeri) kaudu kaudse sidumise võtted: Sahhariid-OH + CNBr või CDAP ----> tsüanaatester + NH2---NH2 ----> sahhariid----nh2 + COOHProt + EDAC ----> konjugaat Sahhariid-OH + CNBr või CDAP ----> tsüanaatester + NH2----SH -----> sahhariid----sh + SH-Prot (looduslik valk avatud tüsteiiniga või saadi pärast valgu aminorühmade modifitseerimist näiteks SPDP-ga) ----> sahhariid-s-s-prot Sahhariid-OH + CNBr või CDAP ----> tsüanaatester + NH2----SH -----> sahhariid----sh + maleimiidprot ( aminorühmade modifitseerimine) ----> konjugaat 1 Sahhariid-OH + CNBr või CDAP ----> tsüanaatester + NH2-----SH ----> Sahhariid-SH + haloatsetüleeritud-prot ----> konjugaat Sahhariid-COOH + EDAC + NH2-----NH2 ----> sahhariid------nh2 + EDAC + COOH-Prot ----> konjugaat Sahhariid-COOH + EDAC+ NH2----SH ----> sahhariid----sh + SH-Prot (looduslik valk avatud tsüsteiiniga või saadi pärast valgu aminorühmade modifitseerimist näiteks SPDP-ga) -----> sahhariidid-s-prot Sahhariid-COOH + EDAC+ NH2----SH -----> sahhariid----sh + maleimiid-prot (aminorühmade modifitseerimine) ----> konjugaat Sahhariid-COOH + EDAC + NH2----SH ----> Sahhariid-SH + haloatsetüleeritud-prot ----> konjugaat 2 Sahhariid-aldehüüd + NH2-----NH2 ----> sahhariid---nh2 + EDAC + COOH- Prot ----> konjugaat

EE EP1968631 B1 Märkus: eespool toodud EDAC asemel võib kasutada mis tahes sobivat karbodiimiidi. 1 2 Kokkuvõtvalt on valgukandja keemilise rühma tüüpideks, mida võib üldiselt sahhariidi sidumiseks kasutada, aminorühmad, ( näiteks lüsiini jääkidel), COOH rühmad (näiteks aspartaam- ja glutamiinhappe jäägid) ja SH rühmad (kättesaadavusel) (näiteks tsüsteiini jääkidel). Soovitatavalt on kandjavalgu ja S. pneumoniae sahhariidi suhe vahemikus 1: ja :1; nt vahemikus 1:0,-4:1, 1:1-3,:1, 1,2:1-3:1, 1,:1-2,:1; nt vahemikus 1:2 ja 2,:1; 1:1 ning 2:1 (w/w). Teatud variandis on enamik konjugaatidest, näiteks 6, 7, 8, 9 või enam konjugaati, kandjavalgu ja sahhariidi suhtega, mis on suurem kui 1:1, näiteks 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,4:1, 1,:1 või 1,6:1. Ühes variandis on vähemalt üks S. pneumoniae sahhariid kandjavalgule linkeri kaudu konjugeeritud, kasutades CDAP-d ja EDAC-d. Näiteks 18C või 22F võib olla konjugeeritud valgule linkeri kaudu (näiteks need, millel on selle otstes kaks hüdrasiinrühma, nagu ADH), kasutades CDAP-d ja EDAC-d, nagu eespool kirjeldati. Kui kasutatakse linkerit, võib kasutada CDAP-d sahhariidi linkerile konjugeerimiseks ning seejärel võib kasutada EDAC-d linkeri valgule konjugeerimiseks või teisel juhul võib EDAC-d kasutada enne, et linkerit valgule konjugeerida, mille järel võib kasutada CDAP-d, et linkerit sahhariidile konjugeerida. Üldiselt võib leiutise immunogeenne koostis sisaldada iga sahhariidkonjugaadi doosi vahemikus 0,1 ja μg, 1 ja μg või 1 ja 3 μg sahhariidi. Teatud variandis sisaldab leiutise immunogeenne koostis igat S. pneumoniae kapslikujulist sahhariidi doosiga vahemikus 0,1- μg; 0,- μg; 0,- μg või 1-3 μg sahhariidi. Teatud variandis võivad kapslikujulised sahhariidid olla erinevatel annustel, näiteks osa kapslikujulisi sahhariide võib esineda doosiga täpselt 1 μg või osa kapslikujulisi sahhariide võib esineda doosiga täpselt 3 μg. Ühes variandis esinevad serotüüpidest 3, 18C ja 19F (või 4, 18C ja 19F) pärit sahhariidid esineda kõrgemal doosil kui teised sahhariidid. Antud variandi teatud aspektis esinevad serotüübid 3, 18C ja 19F (või 4, 18C ja 19F) doosiga umbes või täpselt 3 μg, samas

21 EE EP1968631 B1 kui immunogeenses koostises olevad teised sahhariidid esinevad doosiga umbes või täpselt 1 μg. Umbes või ligikaudu on leiutise eesmärgil määratletud kui vahemikus % rohkem või vähem esitatud arvust. 1 2 30 Ühes variandis on vähemalt üks S. pneumoniae kapslikujuline sahhariid kandjavalgule otse konjugeeritud (nt kasutades ühte eespool kirjeldatud keemiat); soovitatavalt on see vähemalt üks S. pneumoniae kapslikujuline sahhariid otse konjugeeritud CDAP abil. Ühes variandis on enamik kapslikujulistest sahhariididest, näiteks, 6, 7, 8, 9 või rohkem, otse kandjavalgule ühendatud CDAP abil (vaata WO 9/08348 ja WO 96/29094). Immunogeenne koostis võib sisaldada pneumokoki valku, mis siin on nimetatud leiutise pneumokoki valkudeks. Taolisi valke võib kasutada kandjavalkudena või võivad need esineda vabade valkudena või olla nii kandjavalgud kui ka vabad valgud. Leiutise pneumokoki valgud on kas pind-mõjutatavad vähemalt pneumokoki osalise elutsükli käigus või valgud, mida pneumokokk eritab või vabastab. Soovitatavalt valitakse leiutise valgud järgnevatest kategooriatest, nagu valgud, millel on LXXC II tüüpi signaaljärjestuse motiiv (kus X on mis tahes aminohape, nt polühistidiini triaadi perekond (PhtX)), koliini siduvad valgud (CbpX), valgud, millel on I tüüpi signaaljärjestuse motiiv (nt Sp1), valgud, millel on LPXTG motiiv (kus X on mis tahes aminohape, nt Sp128, Sp130), ning toksiinid (nt Ply). Eelistatud näited nende kategooriate (või motiivide) seas on järgnevad valgud või nende immunoloogiliselt funktsionaalsed ekvivalendid. Teatud variandis sisaldab leiutise immunogeenne koostis vähemalt 1 valku, mis valitakse rühmast, kuhu kuuluvad polühistidiini triaadi perekond (PhtX), koliini siduva valgu perekond (CbpX), CbpX trunkaadid, LytX perekond, LytX trunkaadid, CbpX trunkaat-lytx trunkaadi kimäärsed valgud (või fusioonid), pneumolüsiin (Ply), PspA, PsaA, Sp128, Sp1, Sp130, Sp12 ja Sp133. Lisavariandis sisaldab immunogeenne koostis 2 või enam valku, mis valitakse rühmast, kuhu kuuluvad polühistidiini triaadi perekond (PhtX), koliini siduva valgu perekond (CbpX), CbpX trunkaadid, LytX perekond, LytX trunkaadid, CbpX trunkaat-lytx trunkaadi kimäärsed valgud (või fusioonid), pneumolüsiin (Ply), PspA, PsaA ja Sp128. Ühes

22 EE EP1968631 B1 1 2 30 järgnevas variandis sisaldab immunogeenne koostis 2 või enam valku, mis valitakse rühmast, kuhu kuuluvad polühistidiini triaadi perekond (PhtX), koliini siduva valgu perekond (CbpX), CbpX trunkaadid, LytX perekond, LytX trunkaadid, CbpX trunkaat-lytx trunkaadi kimäärsed valgud (või fusioonid ), pneumolüsiin (Ply) ja Sp128. Pht ( polühistidiini triaad) perekond sisaldab valke PhtA, PhtB, PhtD ja PhtE. Perekonnale on iseloomulik lipiidimise järjestus, proliinirikka piirkonnaga eraldatud kaks domeeni ja mitu histidiini triaadi, mis võib-olla osalevad metalli või nukleosiidi sidumises või ensümaatilises aktiivsuses, (3 -) teisese heeliksi piirkonnad, konserveerunud N-ots ja heterogeenne C-ots. See on olemas kõikides testitud pneumokoki tüvedes. Homoloogseid valke on ka teistes streptokokkides ja Neisserias leitud. Leiutise ühes variandis on leiutise Pht valk PhtD. Ent on mõistetav, et terminid Pht A, B, D ja E tähistavad valke, millel on allpool avaldatud viidete järjestused, ning nende looduslikke (ja tehislikke) variante, mille järjestuse homoloogia on võrdlusvalkudega vähemalt 90%-liselt identne. Soovitatavalt on see vähemalt 9%-liselt identne ja kõige soovitatavamalt 97%-liselt identne. PhtX valkudega seoses on PhtA avaldatud patendis WO 98/18930 ning sellele on ka viidatud terminiga Sp36. Nagu eespool märgiti, see on polühistidiini triaadi perekonnast pärit valk ja sellel on LXXC II tüüpi signaalimotiiv. PhtD on avaldatud patendis WO 00/37 ja sellele on ka viidatud terminiga Sp036D. Nagu eespool märgiti, see on polühistidiini triaadi perekonnast pärit valk ja sellel on II tüüpi LXXC signaalimotiiv. PhtB on avaldatud patendis WO 00/37 ning sellele on ka viidatud terminiga Sp036B. PhtB perekonna järgmine liige on C3-degradeeruv polüpeptiid, nagu avaldati patendis WO 00/17370. Ka see valk pärineb polühistidiini triaadi perekonnast ja sellel on II tüüpi LXXC signaalimotiiv. Eelistatud immunoloogiliselt funktsionaalne ekvivalent on valk Sp42, mis avaldati patendis WO 98/18930. PhtB trunkaat (ligikaudu 79 kd) on avaldatud patendis WO 99/167, mida peetakse ka PhtX perekonna liikmeks. PhtE on avaldatud patendis WO 00/39299 ja sellele on ka viidatud terminiga BVH-3. Kui siin on viidatud mis tahes Pht valgule, on sellega mõeldud, et kasutada võib Pht valgu immunogeenseid fragmente või nende fusioone. Näiteks viide PhtX-le hõlmab selle immunogeenseid fragmente või

23 EE EP1968631 B1 fusioone mis tahes Pht valgust. Viide PhtD või PhtB-le on ka viide PhtDE või PhtBE fusioonidele, nagu leidub näiteks patendis WO0198334. 1 2 Pneumolüsiin on multifunktsionaalne toksiin, millel on eristuv tsütolüütiline (hemolüütiline) ja komplemendi aktiveerimise toime (Rubins et al, Am. Respi. Cit Care Med, 13:1339-1346 (1996)). Pneumokokk toksiini ei erita, kuid seda vabastatakse pneumokoki lüüsi käigus autolüsiini mõjul. Selle toimete seas on nt põletikuliste tsütokiinide tootmise stimuleerimine inimese monotsüütide poolt, inimese hingamisteede epiteelkoel olevate ripsmete tukslemise inhibeerimine ning neutrofiilide bakteritsiidse aktiivsuse ja migratsiooni alanemine. Pneumolüsiini kõige ilmsem toime on punaliblede lüüs, mis hõlmab kolesterooli sidumist. Kuna see on toksiin, tuleb see enne in vivo manustamist mürgitustada (st inimesele mürgitu, kui seda anda doosil, mis sobib kaitseks). Metsiktüüpi või loodusliku pneumolüsiini ekspressioon ja kloonimine on valdkonnas tuntud. Vaata näiteks Walker et al (Infect Immun, :1184-1189 (1987)), Mitchell et al (Biochim Biophys Acta, 07:67-72 (1989) ja Mitchell et al (NAR, 18:40 (1990)). Ply mürgitustamist saab teostada keemilisel viisil, nt edastamine formaliini või glutaaraldehüüdiga töötlemisse või mõlema kombinatsiooni (WO 040811, PCT/EP0/028). Taolised meetodid on erinevate toksiinide jaoks valdkonnas tuntud. Teisel juhul võib Ply geneetiliselt mürgitustada. Järelikult hõlmab leiutis pneumokoki valkude derivaate, mis võivad olla näiteks muteeritud valgud. Terminit muteeritud on siin kasutatud molekulide jaoks, mis on läbinud ühe või mitme aminohappe deletsiooni, lisamise või asenduse, kasutades tuntud võtteid saidile suunatud mutageneesiks või mis tahes tavapärast meetodit. Nagu näiteks eespool kirjeldati, mutantset ply valku võib muuta nii, et see on bioloogiliselt inaktiivne, säilitades samas oma immunogeensed epitoobid, vaata näiteks WO90/0691, Berry et al (Infect Immun, 67:981-98 (1999)) ja WO99/03884. Siin kasutatuna on mõistetav, et termin Ply viitab muteeritud või mürgitustatud pneumolüsiinile, mis sobib meditsiiniliseks kasutuseks (st mürgitu). 30 Koliini siduva valgu perekonnaga (CbpX) seoses tuvastati selle perekonna liikmed algselt pneumokoki valkudena, mida saab koliiniafiinsuse kromatograafiaga puhastada. Kõik koliini siduvad valgud on mittekovalentselt rakuseina teihohappe (teichoic acid) ja membraanseotud lipoteihohappe fosforüülkoliini osadele seotud.

24 EE EP1968631 B1 1 2 30 Strukturaalselt on neil terve perekonna ulatuses mitu ühesugust piirkonda, kuigi valkude täpne iseloom (aminohappe järjestus, pikkus jne) võib varieeruda. Üldiselt sisaldavad koliini siduvad valgud N-otsa piirkonda (N), konserveerunud korduvaid piirkondi (R1 ja/või R2), proliinirikast piirkonda (P) ja konserveerunud koliini siduvat piirkonda (C), mis koosnevad mitmest kordusest, sisaldades ligikaudu valgu ühte poolt. Siin taotluses kasutatud termin koliini siduva valgu perekond (CbpX) valitakse rühmast, kuhu kuuluvad koliini siduvad valgud, nagu määratleti patendis WO 97/4111, PbcA, SpsA, PspC, CbpA, CbpD ja CbpG. CbpA on avaldatud patendis WO 97/4111. CbpD ja CbpG on avaldatud patendis WO 00/29434. PspC on avaldatud patendis WO 97/09994. PbcA on avaldatud patendis WO 98/21337. SpsA on koliini siduv valk, mis on avaldatud patendis WO 98/3940. Soovitatavalt valitakse koliini siduvad valgud rühmast, kuhu kuuluvad CbpA, PbcA, SpsA ja PspC. Järgmine eelistatud variant on CbpX trunkaadid, kusjuures CbpX on määratletud eespool ning trunkaadid viitab CbpX valkudele, millel 0% või rohkem koliini siduvat piirkonda (C) on puudu. Soovitatavalt puudub taolistel valkudel kogu koliini siduv piirkond. Veel soovitatavalt puudub taolistel valgu trunkaatidel (i) koliini siduv piirkond ja (ii) valgu N-otsa poole osa, kuid püsib vähemalt üks korduv piirkond (R1 või R2). Ent veel soovitatavamalt on trunkaadil 2 korduvat piirkonda (R1 ja R2). Taoliste eelistatud variantide näideteks on NR1xR2 ja R1xR2, nagu on patendis WO 99/1266 või WO 99/1188 näidatud, ent teisi koliini siduvaid valke, millel puudub sarnane koliini siduv piirkond, on samuti antud leiutise ulatuses kaalutletud. LytX perekond on membraaniga seotud valgud, mis on rakulüüsiga seotud. N-otsa domeen sisaldab koliini siduva(id)t domeeni(e), ent LytX perekonnal ei ole kõiki omadusi, mis eespool märgitud CbpA perekonnas leiduvad, ning järelikult peetakse käesoleva leiutise jaoks LytX perekonda CbpX perekonnast erinevaks. Vastupidiselt CbpX perekonnale sisaldab C-otsa domeen LytX valgu perekonna katalüütilist domeeni. Perekond sisaldab LytA-d, B-d ja C-d. LytX perekonnaga seoses on LytA avaldanud Ronda et al, Eur J Biochem, 164:621-624 (1987). LytB on avaldatud patendis WO 98/18930 ning sellele on ka viidatud terminiga Sp46. LytC on samuti avaldatud patendis WO 98/18930 ning sellele on ka viidatud terminiga Sp91. Selle perekonna eelistatud liige on LytC.

2 EE EP1968631 B1 1 2 30 Järgmiseks eelistatud variandiks LytX trunkaadid, kusjuures LytX on määratletud eespool ning trunkaadid tähendab LytX valke, millel 0% või rohkem koliini siduvat piirkonda on puudu. Soovitatavalt puudub taolistel valkudel terve koliini siduv piirkond. Ent antud leiutise järgmine eelistatud variant on CbpX trunkaat-lytx trunkaadi kimäärsed valgud (või fusioonid). Soovitatavalt sisaldab see CbpX NR1xR2 (või R1xR2) ning LytX (nt LytCC-ots või Sp91 C-ots) C-otsa osa (C-ots, st puuduvad koliini siduvad domeenid). Veel soovitatavamalt valitakse CbpX rühmast, kuhu kuuluvad CbpA, PbcA, SpsA ja PspC. Ent veel soovitatavamalt on see CbpA. LytX on soovitatavalt LytC (ka nimega Sp91). Käesoleva leiutise järgmine variant on PspA või PsaA trunkaadid, millel puudub koliini siduv domeen (C) ja mida ekspresseeritakse sulandvalguna LytX-ga. LytX on soovitatavalt LytC. PsaA ja PspA-ga seoses on mõlemad valdkonnas tuntud. Näiteks PsaA-d ja selle transmembraani deletsiooni variante on kirjeldanud Berry & Paton, Infect Immun 1996 dets; 64(12):2-62. PspA ja selle transmembraani deletsiooni variandid on avaldatud näiteks patentides US 804193, WO 92/14488 ja WO 99/3940. Sp128 ja Sp130 on avaldatud patendis WO 00/7640. Sp12 on pneumokoki pinnavalgu näiteks, millel on LPXTG rakuseinal kinnitunud motiiv (kus X on mis tahes aminohape). Pneumokoki pinnavalgu antud klassis selle motiiviga mis tahes valk oli antud leiutise kontekstis kasulik ning järelikult peetakse seda leiutise lisavalguks. Sp12 on ise avaldatud patendis WO 98/18930 ning see on ka tuntud kui ZmpB tsink-metalloproteinaas. Sp1 on avaldatud patendis WO 98/06734 (kus see on viitega # y8993). Sellele on iseloomulik I tüüpi signaalijärjestus. Sp133 on avaldatud patendis WO 98/06734 ( kus see on viitega # y8992). Sellele on samuti iseloomulik I tüüpi signaalijärjestus. Eelistatud Moraxella catarrhalise valgu antigeenide näited, mida saab kombineeritud vaktsiini (eriti keskkõrvapõletiku ennetamiseks) kaasata, on : OMP6 [WO 97/41731 (Antex) ja WO 96/34960 (PMC)]; OMP21 või selle fragmendid (WO 00189); LbpA ja/või LbpB [WO 98/606 (PMC)]; TbpA ja/või TbpB [WO 97/1378 ja WO 97/32980 (PMC)]; CopB [Helminen ME, et al (1993) Infect. Immun. 61:03-]; UspA1 ja/või UspA2 [WO 93/03761 (University of Texas)]; OmpCD; HasR (PCT/EP99/03824); PilQ (P CT/EP99/03823); OMP8 (PCT/EP00/01468); lipo06 (GB 9917977,2); lipo (GB 99188.1); lipo11 (GB

26 EE EP1968631 B1 1 2 30 9918302.2); lipo18 (GB 9918038.2); P6 (PCT/EP99/03038); D1 (PCT/EP99/03822); OmplA1 (PCT/EP99/06781); Hly3 (PCT/EP99/0327); ning OmpE. Mitte-klassifitseeritavate Haemophilus influenzae antigeenide või nende fragmentide näidete, mida saab kombineeritud vaktsiini (eriti keskkõrvapõletiku ennetamiseks) kasutada, seas on: Fimbrini valk [(US 766608 - Ohio State Research Foundation)] ja fusioonid, mis sisaldavad nende peptiide, [nt LB1(f) peptiidifusioond; US 843464 (OSU) või WO 99/64067]; OMP26 [WO 97/01638 (Cortecs)]; P6 [EP 281673 (State University of New York)]; TbpA ja/või TbpB; Hia; Hsf; Hin47; Hif; Hmw1; Hmw2; Hmw3; Hmw4; Hap; D1 (WO 94/12641); P2; ning P (WO 94/26304). Leiutise valke võib ka kasulikult kombineerida. Kombineeritud all on mõeldud seda, et immunogeenne koostis sisaldab kõiki valke järgnevatest kombinatsioonidest kas kandjavalkude või vabade valkudena või nende kahe seguna. Näiteks kahe valgu kombinatsioonis, nagu on siin esitatud, võib mõlemaid valke kasutada kandjavalkudena või võib mõlemaid valke esitada vabade valkudena või mõlemad võivad esineda kandja ja vaba valguna või võib üks esineda kandjavalguna ja vaba valguna, samas kui teine esineb ainult kandjavalgu või ainult vaba valguna või võib üks olla kandjavalk ja teine vaba valk. Kui on esitatud kolme valgu kombinatsioon, on olemas samasugused võimalused. Eelistatud kombinatsioonide seas on muuhulgas PhtD + NR1xR2, PhtD + NR1xR2-Sp91C-otsa kimäärsed või sulandvalgud, PhtD + Ply, PhtD + Sp128, PhtD + PsaA, PhtD + PspA, PhtA + NR1xR2, PhtA + NR1xR2-Sp91C-otsa kimäärsed või sulandvalgud, PhtA + Ply, PhtA + Sp128, PhtA + PsaA, PhtA + PspA, NR1xR2 + LytC, NR1xR2 + PspA, NR1xR2 + PsaA, NR1xR2 + Sp128, R1xR2 + LytC, R1xR2 + PspA, R1xR2 + PsaA, R1xR2 + Sp128, R1xR2 + PhtD, R1xR2 + PhtA. Soovitatavalt pärineb NR1xR2 (või R1xR2) CbpA-st või PspC-st. Veel soovitatavamalt pärineb see CbpA-st. Teiste kombinatsioonide seas on 3 valgu kombinatsioonid, nagu PhtD + NR1xR2 + Ply ja PhtA + NR1xR2 + PhtD. Ühes variandis sisaldab vaktsiini koostis mürgitustatud pneumolüsiini ja PhtD-d või PhtDE-d kandjavalkudena. Järgmises variandis sisaldab vaktsiini koostis mürgitustatud pneumolüsiini ja PhtD-d või PhtDE-d vabade valkudena.

27 EE EP1968631 B1 1 2 Väljaande sõltumatus aspektis pakub käesolev leiutis immunogeenset koostist, mis sisaldab vähemalt nelja S. pneumoniae kapslikujulist sahhariidikonjugaati, mis sisaldavad erinevatest S. pneumonia serotüüpidest pärit sahhariide, kusjuures vähemalt üks sahhariid on PhtD-le või selle sulandvalgule konjugeeritud ning immunogeenne koostis suudab PhtD vastu tõhusa immuunvastuse esile kutsuda. Tõhusat immuunvastust PhtD või selle sulandvalgu vastu mõõdetakse näiteks kaitse analüüsiga, nagu on kirjeldatud näites 1. Tõhus immuunvastus pakub vähemalt 40%, 0%, 60%, 70%, 80% või 90%-list ellujäämist 7 päeva pärast heteroloogse tüvega haigestumist. Tingimusel, et haiguse tüvi on heteroloogne, tuleneb võimaldatud kaitse immuunvastusest PhtD või selle sulandvalgu vastu. Teisel juhul mõõdetakse tõhusat immuunvastust PhtD vastu ELISA analüüsiga, nagu on kirjeldatud näites 14. Tõhus immuunvastus annab anti-phtd IgG vastuse vähemalt, 300, 30, 400, 00, 0 või 600 μg/ml GMC. Näiteks sisaldab immunogeenne koostis vähemalt 2, 3, 4,, 6, 7, 8, 9 või S. pneumoniae kapslikujulist sahhariidi erinevatest serotüüpidest, mis on PhtD-le konjugeeritud. Näiteks serotüübid 22F ja 1, 2, 3, 4,, 6 või 7, mis on täiendavalt valitud serotüüpidest 1, 2, 3, 4,, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, A, 11A, 12F, 14, 1B, 17F, 18C, 19A, 19F,, 23F ja 33F, on PhtD-le konjugeeritud. Teatud variandis on serotüüpidest 3, 6A ja 22F kaks või kolm PhtD-le konjugeeritud. Leiutise immunogeenne koostis sisaldab vähemalt ühte S. pneumoniae kapslikujulist sahhariidi, mis on linkeri, näiteks ADH, kaudu PhtD-le konjugeeritud. Ühes variandis kasutatakse ühte allpool loetletud konjugeerimise keemiat. Teatud variandis sisaldab leiutise immunogeenne koostis vähemalt ühte S. pneumoniae kapslikujulist sahhariidi, mis on PhtD-le konjugeeritud, kusjuures PhtD ja sahhariidi suhe konjugaadis on vahemikus 6:1 ja 1:, 6:1 ja 2:1, 6:1 ja 2,:1, 6:1 ja 3:1, 6:1 ning 3,:1 (w/w) või suurem kui (st sisaldab PhtD suuremat osa) 2,0:1, 2,:1, 3,0:1, 3,:1 või 4,0:1 (w/w). Teatud variandis sisaldab leiutise immunogeenne koostis pneumolüsiini. 30 Käesolev leiutis pakub veel vaktsiini, mis sisaldab leiutise immunogeenseid koostiseid ja farmatseutiliselt sobivat ekstsipienti.

28 EE EP1968631 B1 1 2 30 Käesoleva leiutise vaktsiinid võivad olla adjuvandiga, eriti siis, kui need on mõeldud kasutamiseks eakama populatsiooni, kuid ka imikute populatsioonide seas. Sobivate adjuvantide seas on alumiiniumsoolad, nagu alumiiniumhüdroksiidi geel või alumiiniumfosfaat või alum, kuid nendeks võivad olla ka teised metallisoolad, nagu kaltsiumi-, magneesiumi-, raua- või tsingisoolad, või võib selleks olla atsetüleeritud türosiini või atsetüleeritud suhkrute, katiooniliselt või anioonselt derivatiseeritud sahhariidide või polüfosfaseenide lahustumatu suspensioon. Eelistatakse, et valitav adjuvant oleks TH1 tüüpi vastuse eelistatav tekitaja. Th1- tüüpi tsütokiinide taolised kõrged tasemed kipuvad eelistama raku vahendatud immuunvastuste tekitamist teatud antigeenile, samas kui Th2-tüüpi tsütokiinide kõrged tasemed kipuvad eelistama humoraalsete immuuvastuste tekitamist antigeenile. Th1 ja Th2-tüüpi immuunvastuse eristus ei ole absoluutne. Tegelikkuses toetab isik immuunvastust, millele on iseloomulik peamiselt Th1 või peamiselt Th2. Ent sageli on mugav arvestada tsütokiinide perekondi selle suhtes, mida hiire CD4 +ve T-raku kloonides on kirjeldanud Mosmann and Coffman (Mosmann, T.R. and Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. (Annual Review of Immunology, 7, lk 14-173). Traditsiooniliselt seostatakse Th1-tüüpi vastuseid INF-γ ja IL-2 tsütokiinide tootmisega T-lümfotsüütide poolt. Teisi tsütokiine, mida sageli seostatakse otse Th1-tüüpi immuunvastuste esilekutsumisega, T-rakud ei tooda, nagu IL-12. Vastupidisena aga seostatakse Th2-tüüpi vastuseid II-4, IL-, IL-6, IL- eritamisega. Sobivate adjuvandisüsteemide, mis soodustavad peamiselt Th1 vastust, seas on: monofosforüüllipiid A või selle derivaat (või üldiselt mürgitustatud lipiid A vaata näiteks WO07798), eriti 3-de-O-atsüülitud monofosforüüllipiid A (3D -MPL) ( selle valmistamist vaata patendist GB 22211 A); ning monofosforüüllipiid A, soovitatavalt 3-de-O-atüülitud monofosforüüllipiid A, kombinatsioon kas alumiiniumsoola (näi teks alumiiniumfosfaat või alumiiniumhüdroksiid) või õli-vees emulsiooniga. Taolistes kombinatsioonides hoitakse antigeeni ja 3D-MPL sama mikroosakese struktuurides, võimaldades antigeensete ja immunostimuleerivate signaalide tõhusamat transporti. Uuringud on

29 EE EP1968631 B1 näidanud, et 3D-MPL suudab alum-adsorbeerunud antigeeni immunogeensust täiendavalt parandada [Thoelen et al. Vaccine (1998) 16:708-14; EP 68944-B1]. 1 2 30 Täiustatud süsteem hõlmab monofosforüüllipiidi A ja saponiini derivaadi kombinatsiooni, eriti patendis WO 94/0013 kirjeldatud QS21 ja 3D-MPL kombinatsiooni või vähem reaktogeenset koostist, kus QS21 on karastatud kolesterooliga, nagu on avaldatud patendis WO 96/33739. Eriti eelistatud tõhusat adjuvandi koostist, mis hõlmab QS21, 3D-MPL ja tokoferooli õli-vees emulsioonis, on kirjeldatud patendis WO 9/172. Ühes variandis sisaldab immunogeenne koostis veel saponiini, milleks võib olla QS21. Koostis võib ka sisaldada õli-vees emulsiooni ja tokoferooli (WO 9/172). Metüleerimata CpG, mis sisaldab oligonukleotiide (WO 96/02) ja teisi immunomoduleerivaid oligonukleotiide (WO022677 ja WO0307822), on samuti TH1 vastuse eelistatud tekitaja ja sobib käesolevas leiutises kasutamiseks. Konkreetsed adjuvandid on need, mis valitakse metallisoolade, õli-vees emulsioonide, Tolli-sarnaste retseptorite agonisti, ( eriti Tolli-sarnase retseptori 2 agonist, Tolli-sarnase retseptori 3 agonist, Tolli-sarnase retseptori 4 agonist, Tollisarnase retseptori 7 agonist, Tolli-sarnase retseptori 8 agonist ja Tolli-sarnase retseptori 9 agonist), saponiinide või nende kombinatsioonide rühmast. Adjuvant, mida saab leiutise vaktsiini koostistega kasutada, on pärit vill- või välismembraani vesiikuli preparaadid grammnegatiivsetest bakteritüvedest, nagu need, mida on käsitletud patendis WO 02/09746 - eriti N. meningitidise villid. Villide adjuvandi omadusi saab parandada LOS-i (lipooligosahhariid) hoidmisel selle pinnal (nt ekstraktimisel detergendi madalate kontsentratsioonidega [näiteks 0-0,1% deoksükolaat]). LOS-i saab mürgitustada msbb(-) või htrb(-) mutatsioonidega, mida käsitleti patendis WO 02/09746. Adjuvandi omadusi saab ka täiustada PorB omandamisel (ja soovi korral PorA eemaldamisel) meningokoki villidest. Adjuvandi omadusi saab ka täiustada LOS-i välistuuma sahhariidi struktuuri kärpimisel meningokoki villidel, näiteks IgtB(-) mutatsiooni kaudu, mida käsitleti patendis WO 04/014417. Teisel juhul saab eespool mainitud LOS-i (nt msbb(-) ja/või IgtB(-) tüvest eraldatud) puhastada ja seda leiutise koostises adjuvandina kasutada.

30 EE EP1968631 B1 1 2 30 Täiendava adjuvandi, mida saab leiutise koostistega kasutada, võib valida rühmast: saponiin, lipiid A või selle derivaat, immunostimuleeriv oligonukleotiid, alküülglükosaminiid-fosfaat, õli-vees emulsioon või nende kombinatsioonid. Täiendav eelistatud adjuvant on metallisool koos teise adjuvandiga. Eelistatakse, et adjuvant oleks Tolli-sarnase retseptori agonist, eriti Tolli-sarnase retseptori 2, 3, 4, 7, 8 või 9 agonist või saponiin, eriti Qs21. Veel eelistatakse, et adjuvandi süsteem sisaldaks eespool toodud loetelust kahte või enam adjuvanti. Eeskätt sisaldavad koostised soovitatavalt saponiini (täpsemalt Qs21) adjuvanti ja/või a Tolli-sarnase retseptori 9 agonisti, nagu CpG-d sisaldav immunostimuleeriv oligonukleotiid. Teised eelistatud kombinatsioonid sisaldavad saponiini (täpsemalt QS21) ja Tollisarnase retseptori 4 agonisti, nagu monofosforüüllipiid A või selle 3 deatsüülitud derivaat 3D-MPL, või saponiini (täpsemalt QS21) ja Tolli-sarnase retseptori 4 ligandit, nagu alküülglükosaminiid-fosfaat. Eriti eelistatud adjuvandid on 3D-MPL ja QS21 kombinatsioonid (EP 0671948 B1), õli-vees emulsioonid, mis sisaldavad 3D-MPL ja QS21 (WO 9/172, WO 98/6414), või teiste kandjatega moodustatud 3D-MPL (EP 068944 B1). Muud eelistatud adjuvandisüsteemid sisaldavad 3D-MPL, QS21 ja CpG oligonukleotiidi kombinatsiooni, nagu on kirjeldatud patentides US 68670 ja US 64418. Teatud variandis on (või sisaldab) adjuvant Tolli-sarnase retseptori (TLR) 4 ligand, soovitatavalt agonist, nagu lipiidi A derivaat, eriti monofosforüüllipiid A või veel soovitatavamalt 3-deatsüülitud monofosforüüllipiid A (3D-MPL). 3D-MPL on saadav firmalt GlaxoSmithKline Biologicals, Põhja-Ameerika, ning soodustab peamiselt IFN-g (Th1) fenotüübiga CD4+ T-raku vastuseid. Seda saab toota vastavalt patendis GB 2 2 211 A kirjeldatud meetoditele. Keemiliselt on see 3-deatsüülitud monofosforüüllipiidi A segu 3, 4, või 6 atsüülitud ahelaga. Soovitatavalt kasutatakse käesoleva leiutise koostistes väikeste osakestega 3D- MPL. Väikeste osakestega 3D-MPL osakeste suurus on selline, et seda saab läbi 0,22 μm filtri steriilselt filtreerida. Taolisi preparaate on kirjeldatud rahvusvahelises patenditaotluses nr WO 94/21292. Lipiidi A sünteetilised derivaadid on tuntud ja neid peetakse TLR 4 agonistideks, mille seas on muuhulgas:

31 EE EP1968631 B1 OM174 (2 -deoksü-6-o-[2-deoksü-2-[(r)-3-dodekanoüüloksütetra- dekanoüülamino]-4-o-fosfono-β-d-glükopüranosüül]-2-[(r)-3- hüdroksütetradekanoüülamino]-α-d-glükopüranosüüldivesinikfosfaat) (WO 9/14026); 1 2 30 OM 294 DP (3S, 9R)-3--[(R)-dodekanoüüloksütetradekanoüülamino]-4-okso- -asa-9(r)-[(r)-3-hüdroksütetradekanoüülamino]dekaan-1,-diool,1,- bis(divesinikfosfaat) (WO99 /64301 ja WO 00/0462); OM 197 MP-Ac DP (3S-,9R) -3-[(R)-dodekanoüüloksütetradekanoüülamino]- 4-okso--asa-9-[(R)-3-hüdroksütetradekanoüülamino]dekaan-1,-diool,1- divesinikfosfaat -(6-aminoheksanoaat) (WO 01/46127). Teised TLR4 ligandid, mis võivad kasulikuks osutuda, on alküülglükosaminiidfosfaadid (AGP-d), nagu need, mis on avaldatud patendis WO 980399 või US 6303347 (AGP-de valmistusprotseduurid on samuti avaldatud), või AGP-de farmatseutiliselt sobivad soolad, nagu on avaldatud patendis US 6764840. Mõned AGP-d on TLR4 agonistid ning mõned on TLR4 antagonistid. Mõlemaid peetakse kasulikeks adjuvantideks. Järgmine eelistatud immunostimulant käesolevas leiutises kasutamiseks on Quil A ja selle derivaadid. Quil A on saponiini preparaat, mis on eraldatud Lõuna-Ameerika tšiili seebikoorepuul ning sellele omistasid esmalt adjuvandi toimet Dalsgaard et al, 1974 ( Saponin adjuvants, Archiv. für die gesamte Virusforschung, kd. 44, Springer Verlag, Berliin, lk 243-24). Quil A puhastatud fragmendid on eraldatud HPLC abil, mis säilitavad adjuvandi toime ilma toksilisuseta, mida Quil A-ga seostatakse (EP 0362278), näiteks QS7 ja QS21 (tuntud ka kui QA7 ja QA21). QS-21 on looduslik saponiin, mis on saadud tšiili seebikoorepuu koorest, mis kutsub esile CD8+ tsütotoksilisi T-rakke (CTL-d), Th1 rakke ja domineeriva IgG2a antikeha vastust ning käesoleva leiutise kontekstis on see eelistatud saponiin. Kirjeldatud on QS21 konkreetseid koostiseid, mis on eriti eelistatud, need koostised sisaldavad veel sterooli (WO 96/33739). Käesoleva leiutise saponiine moodustava osa võib eraldada mitsellide, segatud mitsellide (eelistatud, kuid mitte ainult sapisooladega) kujul või olla ISCOM matriitside (EP 09942 B1), liposoomide või

32 EE EP1968631 B1 1 2 seotud kolloidstruktuuride kujul, nagu ussisarnased või ringisarnased multimeersed kompleksid või lipiidsed/kihilised struktuurid ja lamellid, kui neid moodustada kolesterooli ja lipiidiga, või õli-vees emulsiooni kujul (nagu näiteks patendis WO 9/172). Saponiinid võivad soovitatavalt olla seotud metallisoolaga, nagu alumiiniumhüdroksiid või alumiiniumfosfaat (WO 98/1287). Soovitatavalt on saponiin liposoomi, ISCOM või õli-vees emulsiooni kujul. Täiusatud süsteem hõlmab monofosforüüllipiidi A ( või mürgitustatud lipiid A) ja saponiini derivaadi kombinatsiooni, eriti QS21 ja 3D-MPL kombinatsiooni, nagu avaldati patendis WO 94/0013, või vähem reaktogeenset koostist, kus QS21 on karastatud kolesterooliga, nagu on avaldatud patendis WO 96/33739. Eriti eelistatud tõhus adjuvandi koostis, mis hõlmab tokoferooli QS21-ga ja/või 3D-MPLga või ilma õli-vees emulsioonis, mida on kirjeldatud patendis WO 9/172. Ühes variandis sisaldab immunogeenne koostis veel saponiini, mis võib olla QS21. Kasutada võib ka immunostimuleerivaid oligonukleotiide või mis tahes muud Tollisarnase retseptori (TLR) 9 agonisti. Käesoleva leiutise adjuvantides või vaktsiinides kasutamiseks mõeldud eelistatud oligonukleotiidid on CpG-d sisaldavad oligonukleotiidid, sisaldades soovitatavalt kahte või enam dinukleotiidi CpG motiivi, mis on vähemalt kolme, veel soovitatavamalt vähemalt kuue või enama nukleotiidiga eraldatud. CpG motiiv on tsüsteiini nukleotiid, millele järgneb guaniini nukleotiid. Käesoleva leiutise CpG oligonukleotiidid on tavaliselt deoksünukleotiidid. Eelistatud variandis on oligonukleotiidis olev internukleotiid fosforoditioaat või veel soovitatavamalt fosforotioaadi side, kuigi fosfodiester ja teised internukleotiidi sidemed kuuluvad leiutise ulatusse. Samuti on leiutise ulatusse kaasatud segatud internukleotiidi sidemetega oligonukleotiidid. Fosforotioaadi oligonukleotiidide või fosforoditioaadi valmistamiseks mõeldud meetodeid on kirjeldatud patentides US,666,13, US,278,302 ja WO 9/264. Eelistatud oligonukleotiidide näidetel on järgnevad järjestused. Järjestused sisaldavad soovitatavalt fosforotioaadi modifitseeritud internukleotiidi sidemeid.

33 EE EP1968631 B1 1 2 Alternatiivsed CpG oligonukleotiidid võivad sisaldada eespool esitatud eelistatud järjestusi selles mõttes, et neile on tehtud ebaolulisi deletsioone või lisamisi. Käesolevas leiutises rakendatud CpG oligonukleotiide võib sünteesida valdkonnas tuntud mis tahes meetodiga (vaata näiteks EP 468). Tavaliselt võib taolisi oligonukleotiide sünteesida automatiseeritud sünteesiseadet kasutades. Adjuvant võib olla õli-vees emulsioon või sisaldada õli-vees emulsiooni koos teiste adjuvantidega. Emulsioonisüsteemi õlifaas sisaldab soovitatavalt metaboliseeritavat õli. Termini metaboliseeritav õli tähendus on valdkonnas tuntud. Metaboliseeritava võib määratleda kui võimalik metabolismi teel muuta (Dorland s Illustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders Company, 2. trükk (1974)). Õli võib olla mis tahes taimne õli, kalaõli, loomne või sünteetiline õli, mis ei ole retsipiendile mürgine ning mida saab metabolismi teel muuta. Pähklid, seemned ja terad on taimsete õlide tuntud allikad. Sünteetilised õlid on samuti antud leiutise osaks ning võivad hõlmata kommertsiaalselt kättesaadavaid õlisid, nagu NEOBEE ja muud. Skvaleen (2,6,,1,19,23-heksametüül-2,6,,14,18,22-tetrakosaheksaan) on küllastumata rasv, mida leidub suurtes kogustes hai maksa õlis ning väiksemates kogustes oliiviõlis, nisuidu õlis, riisiklii õlis ja pärmis, ning eriti eelistatud õli antud leiutises kasutamiseks. Skvaleen on metaboliseeritav õli tänu faktile, et see on kolesterooli biosünteesi vahesaadus (Mercki indeks,. trükk, sissekande nr 8619). Tokoole (nt E-vitamiin) kasutatakse samuti sageli õliemulsioonide adjuvantides (EP 0382271 B1; US 667784; WO 9/172). Leiutise õliemulsioonides (soovitatavalt õli-vees emulsioonid) kasutatavaid tokoole võib moodustada, nagu on kirjeldatud patendis EP 0382271 B1, nii et tokoolid võivad olla tokooli tilkade dispersioonid, sisaldades soovi korral emulgaatorit või olles vähem kui 1-mikronilise diameetriga. Teisel juhul võib tokoole kasutada koos teise õliga, et õliemulsiooni õlifaasi moodustada. Õliemulsioonide, mida võib koos tokooliga kasutada, näiteid on siin kirjeldatud, nagu eespool kirjeldatud metaboliseeritavad õlid.

34 EE EP1968631 B1 1 2 30 Õli-vees emulsiooni adjuvandid on iseenesest väidetavalt kasulikud adjuvandi koostised (EP 0399843B), samuti on õli-vees emulsioonide ja teiste aktiivsete ainete kombinatsioone kirjeldatud vaktsiinide adjuvantidena (WO 9/172; WO 98/6414; WO 99/126; WO 99/11241). Kirjeldatud on teisi õliemulsiooni adjuvante, nagu vesi-õlis emulsioonid (US,422,9; EP 0480982 B2) ja vesi-õlis-vees emulsioonid (US,424,067; EP 0480981 B). Kõik need moodustavad eelistatud õliemulsiooni süsteemid (eriti tokoolide kaasamisel), et käesoleva leiutise adjuvante ja koostiseid moodustada. Kõige soovitatavamalt sisaldab õliemulsioon (näiteks õli-vees emulsioonid) veel emulgaatorit, nagu TWEEN 80, ja/või sterooli, nagu kolesterool. Eelistatud õliemulsioon (soovitatavalt õli-vees emulsioon) sisaldab metaboliseeritavat mürgitut õli, nagu skvalaan, skvaleen, või tokoferooli, nagu alfa-tokoferool (ja soovitatavalt nii skvaleeni kui ka alfa-tokoferooli), ja soovi korral emulgaatorit (või surfaktanti), nagu Tween 80. Kaasata võib ka sterooli (soovitatavalt kolesterool). Õ li-vees emulsioonide tootmismeetod on valdkonnas pädevatele isikutele teada. Tavapäraselt hõlmab meetod tokooli sisaldava õlifaasi segamist surfaktandiga, nagu PBS/TWEEN80 lahus, millele järgneb homogeniseerimine homogenisaatoriga; antud valdkonnas pädevale isikule on selge, et meetod, mis hõlmab segu kaks korda edastamist läbi süstlanõela, sobiks väikestes kogustes vedeliku homogeniseerimiseks. Samamoodi võib emulgeerimise protseduuri mikrofluidisaatoris (M1S Microfluidicsi seade, maksimaalset 0 läbimist 2 minuti jooksul maksimaalsel rõhul 6 baari (väljundrõhk umbes 80 baari)) antud valdkonnas pädev isik kohandada, et väiksemates või suuremates kogustes emulsiooni toota. Kohandamist võib saavutada tavapärase katsetamisega, hõlmates saadud emulsiooni mõõtmist, kuni saadakse vajaliku diameetriga õlitilkadega preparaat. Õli-vees emulsioonis peaks õli ja emulgaator olema veekandjas. Veekandja võib olla näiteks fosfaatpuhverdatud soolalahus. Stabiilses õli-vees emulsioonis leiduvate õlitilkade suurus on soovitatavalt vähem kui 1 mikron, võib olla vahemikus peamiselt diameetriga 30-600 nm, soovitatavalt peamiselt umbes 30-00 nm ning kõige soovitatavamalt peamiselt diameetriga - 00 nm ning täpsemalt diameetriga umbes nm, nagu mõõdeti footonite korrelatsiooni spektroskoopiaga. Sellega seoses peaks 80% õlitilkadest arvu järgi

3 EE EP1968631 B1 1 2 30 eelistatud vahemikes olema, veel soovitatavalt enam kui 90% ja kõige soovitatavamalt enam kui 9% õlitilkadest peaks arvu järgi määratletud suurusvahemikes olema. Käesoleva leiutise õliemulsioonides olevate komponentide kogused on tavapäraselt vahemikus 0,-% või 2 kuni % õli (kogu doosi mahust), nagu skvaleen; ning olemasolu korral 2 kuni % alfa-tokoferooli; ja alates 0,3 kuni 3% surfaktanti, nagu polüoksüetüleensorbitaan monooleaat. Õli (soovitatavalt skvaleen): tokooli (soovitatavalt α-tokoferool) suhe on 1 või vähem, kuna see annab stabiilsema emulsiooni. Emulgaator, nagu Tween80 või Span 8, võib samuti esineda tasemel umbes 1%. Mõnel juhul võib olla kasulik, et käesoleva leiutise vaktsiinid sisaldavad veel stabilisaatorit. Eelistatud emulsioonisüsteemide näiteid on kirjeldatud patentides WO 9/172, WO 99/11241 ja WO 99/126, milles on avaldatud emulsiooni adjuvandid, mis põhinevad skvaleenil, α-tokoferoolil ja TWEEN 80-l, mis on soovi korral moodustatud immunostimulantidega QS21 ja/või 3D-MPL. Järelikult võib käesoleva leiutise eriti eelistatud variandis leiutise adjuvant sisaldada veel täiendavaid immunostimulante, nagu LPS või selle derivaadid, ja/või saponiine. Täiendavate immunostimulantide näiteid on kirjeldatud siin ning raamatus Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach, 199, Pharmaceutical Biotechnology, 6. köide, toim.-d Powell, M.F., and Newman, M.J., Plenum Press, New York and London, ISBN 0-306-44867-X. Eelistatud aspektis sisaldavad adjuvant ja immunogeensed koostised vastavalt leiutisele saponiini (soovitatavalt QS21) ja/või LPS derivaati (soovitatavalt 3D-MPL) eespool kirjeldatud õliemulsioonis soovi korral sterooliga (soovitatavalt kolesterool). Täiendavalt võib õliemulsioon (soovitatavalt õli-vees emulsioon) sisaldada Span 8- t ja/või letsitiini ja/või trikaprüliini. Õli-vees emulsiooni, sterooli ja saponiini sisaldavaid adjuvante on kirjeldatud patendis WO 99/126. Tavaliselt esineb inimestele manustamiseks saponiin (soovitatavalt QS21) ja/või LPS derivaat (soovitatavalt 3D-MPL) immunogeense koostise inimese doosis vahemikus 1 μg 0 μg, nagu -0 μg, soovitatavalt μg 0 μg doosi kohta. Tavaliselt sisaldab õliemulsioon (soovitatavalt õli-vees emulsioon) 2 kuni % metaboliseeritavat õli. Soovitatavalt sisaldab see 2 kuni % skvaleeni, 2 kuni % alfa-tokoferooli ja 0,3 kuni 3% ( soovitatavalt 0,4-2%) emulgaatorit (soovitatavalt

36 EE EP1968631 B1 1 2 30 Tween 80 [polüoksüetüleensorbitaan monooleaat]). Kui on olemas nii skvaleen kui ka alfa-tokoferool, on skvaleen: alfa-tokoferooli suhe soovitatavalt 1 või vähem, kuna see annab stabiilsema emulsiooni. Span 8 (sorbitaantrioleaat) võib leiutises kasutatud emulsioonides esineda samuti tasemel 0, kuni 1%. Mõnel juhul võib olla kasulik, et käesoleva leiutise immunogeensed koostised ja vaktsiinid sisaldavad veel stabilisaatorit, näiteks teised emulgaatorid/surfaktandid, sealhulgas kaprüülhape (Mercki indeks,. trükk, sissekande nr 1739), kus trikaprüliin on eriti eelistatud. Kus on kaasatud skvaleen ja saponiin (soovitatavalt QS21), on kasulik kaasata koostisesse ka sterool (soovitatavalt kolesterool), kuna see võimaldab õli kogutaseme vähenemist emulsioonis. See võimaldab väiksemaid tootmiskulusid, vaktsineerimise üleüldise mugavuse paranemist ning ka saadavate immuunvastuste kvalitatiivseid ja kvantitatiivseid paranemisi, nagu parem IFN-γ tootmine. Järelikult sisaldab käesoleva leiutise adjuvandisüsteem tavaliselt metaboliseeritava õli: saponiini suhet (w/w) vahemikus 0:1 kuni 300:1, samuti saab käesolevat leiutist kasutada madala õli kujul, mille eelistatud vahemik on 1:1 kuni 0:1, soovitatavalt :1 kuni 0:1 ning kõige soovitatavamalt peamiselt 48:1, antud vaktsiinil püsivad kõikide komponentide kasulikud adjuvandi omadused palju väiksema reaktogeensuse profiiliga. Järelikult on eriti eelistatud variantidel skvaleen:qs21 (w/w) suhe vahemikus 1:1 kuni :1, samuti eelistatud vahemik on :1 kuni 0:1, soovitatavalt :1 kuni 0:1 ning kõige soovitatavamalt peamiselt 48:1. Soovitatavalt on ka kaasatud sterool ( kõige soovitatavamalt kolesterool), esinedes siin kirjeldatud saponiin:sterooli suhtega. Käesoleva leiutise emulsioonisüsteemidel on soovitatavalt väike õlitilga suurus submikroni ulatuses. Kõige soovitatavamalt on õlitilkade diameetri suurus vahemikus 1 kuni 70 nm ning kõige soovitatavamalt 1-600 nm. Eriti tõhus adjuvandi koostis (kõige paremaks kombinatsiooniks AIPO4-ga leiutise immunogeensetes koostistes) sisaldab saponiini (soovitatavalt QS21), LPS derivaati (soovitatavalt 3D-MPL) ja õliemulsiooni (soovitatavalt skvaleen ja alfatokoferool õli-vees emulsioonis), nagu kirjeldati patendis WO 9/172 või WO 99/126 (konkreetses adjuvandi formulatsioonis näites 2, tabel 1). TLR 2 agonisti näidete seas on peptidoglükaan või lipoproteiin. Imidasokinoliinid, nagu imikimood

37 EE EP1968631 B1 1 2 30 ja resikimood, on tuntud TLR7 agonistid. Üheahelaline RNA on samuti tuntud TLR agonist (TLR8 inimestel ja TLR7 hiirtel), kusjuures kaheahelaline RNA ja polü-ic (polüinosiin-polütsütidüülhape viirusliku RNA kommertsiaalne sünteetiline mimeetikuma) on TLR 3 agonistide näited. 3D-MPL on TLR4 agonisti näide, samas kui CPG on TLR9 agonisti näide. Immunogeenne koostis võib sisaldada antigeeni ja immunostimulanti, mis on metallisoolale imendunud. Alumiiniumipõhiseid vaktsiinikoostiseid, kus antigeen ja immunostimulant 3-de-O-atsüülitud monofosforüüllipiid A (3DMPL) on samale osakesele imendunud, on kirjeldatud patentides EP 076478 B1, EP 068944 B1 ja EP 0633784 B1. Nendel juhtudel on antigeen imendunud esmalt alumiiniumsoolale, millele järgneb immunostimulandi 3D-MPL adsorptsioon alumiiniumsoola samadele osakestele. Taolised protseduurid hõlmavad esmalt 3D-MPL suspensiooni kõrgsagedusheliga töötlemist veevannis, kuni osakesed saavutavad suuruse vahemikus 80 ja 00 nm. Antigeeni adsorbeeritakse tavaliselt alumiiniumsoolal üks tund toatemperatuuril loksutamisel. Seejärel lisati imendunud antigeenile 3D-MPL suspensiooni ning koostist inkubeeritakse 1 tund toatemperatuuril ning hoitakse seejärel kasutamiseni temperatuuril 4 ºC. Järgmises protseduuris on immunostimulant ja antigeen eraldi metalliosakestel, nagu kirjeldati patendis EP 1126876. Antud täiustatud protseduur hõlmab immunostimulandi adsorptsiooni metallisoola osakesele, millele järgneb antigeeni adsorptsioon järgmisele metallisoola osakesele, millele järgneb eraldi metalliosakeste segamine, et vaktsiini moodustada. Käesolevas leiutises kasutamiseks mõeldud adjuvant võib olla adjuvandi koostis, mis sisaldab immunostimulanti, mis on adsorbeerunud metallisoola osakesele, millele on iseloomulik fakt, et metallisoola osake on muust antigeenist põhimõtteliselt vaba. Lisaks pakub käesolev leiutis vaktsiine ja neile on iseloomulik, et immunostimulant adsorbeeritakse metallisoola osakestele, mis on muust antigeenist põhimõtteliselt vabad, ning et metallisoola osakesed, mis on antigeenile adsorbeerunud, on muust immunostimulandist põhimõtteliselt vabad. Järelikult pakub käesolev leiutis adjuvandi koostist, mis sisaldab immunostimulanti, mis on adsorbeerunud metallisoola osakesele, millele on iseloomulik, et koostis on muust antigeenist põhimõtteliselt vaba. Lisaks võib adjuvandi koostis olla vahesaadus, mida taolise adjuvandi kasutamisel on vaktsiini tootmiseks vaja. Järelikult pakutakse protseduuri vaktsiini valmistamiseks, hõlmates adjuvandi koostise, milleks on metalliosakesele

38 EE EP1968631 B1 1 2 30 adsorbeerunud üks või mitu immunostimulanti, segamist antigeeniga. Soovitatavalt on antigeen eelnevalt metallisoolale adsorbeerunud. Nimetatud metallisool võib olla identne või sarnane metallisoolaga, mis on immunostimulandile imendunud. Soovitatavalt on metallisool alumiiniumisool, näiteks alumiiniumfosfaat või alumiiniumhüdroksiid. Käesolev leiutis pakub veel vaktsiini koostist, mis sisaldab metallisoola esimesele osakesele adsorbeerunud immunostimulanti ning metallisoolale adsorbeerunud antigeeni, millele on iseloomulik, et metallisoola esimene ja teine osake on eraldi osakesed. Siin kirjeldatud LPS või LOS derivaadid või mutatsioonid või lipiidi A derivaadid on loodud vähem mürgisena (nt 3D-MPL) kui looduslikud lipopolüsahhariidid ning samaväärsed ekvivalendid, võrreldes siin kirjeldatud nende osakeste mis tahes kasutustega. Need võivad olla eespool kirjeldatud TLR4 ligandid. Teisi taolisi derivaate on kirjeldatud patentides WO 0786737, WO 980399, WO 0134617, WO 021228, WO 0306806. Ühes variandis sisaldab leiutise koostisteks kasutatud adjuvant liposoomi kandjat (valmistatud tuntud võtetega fosfolipiididest (nagu dioleoüülfosfatidüülkoliin [DOPC]) ja soovi korral steroolist [nagu kolesterool]). Taolised liposoomi kandjad võivad kanda lipiidi A derivaate [nagu 3D-MPL vaata eespool] ja/või saponiine (nagu QS21 vaata eespool). Ühes variandis sisaldab adjuvant (0, ml-lise doosi kohta) 0,1- mg, 0,2-7, 0,3-, 0,4-2 või 0,-1 mg (nt 0,4-0,6, 0,9-1,1, 0, või 1 mg) fosfolipiidi (näiteks DOPC), 0,02-2,, 0,0-1,, 0,07-0,7, 0,1-0,3 või 0,12-0,2 mg (nt 0,2-0,3, 0,1-0,1, 0,2 või 0,12 mg) sterooli (näiteks kolesterool), -60, - 0 või -30 μg (nt -1, 40-0,,, 30, 40 või 0 μg) lipiidi A derivaati (näiteks 3D-MPL) ning -60, -0 või -30 μg (nt -1, 40-0,,, 30, 40 või 0 μg) saponiini (näiteks QS21). Antud adjuvant on eriti sobilik eakamate vaktsiini koostisteks. Teatud variandis sisaldab väljaande vaktsiini koostis, mis sisaldab adjuvanti, sahhariidikonjugaate, mis on saadud vähemalt kõigist järgnevatest serotüüpidest: 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1,, 7F (ja võib ka sisaldada serotüüpidest 3, 6A, 19A, ja 22F ühte või mitut), kusjuures GMC antikeha tiiter, mis kutsuti esile ühe või mitme (või kõigi) vaktsiini komponentide 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F ja 23F vastu, ei ole märkimisväärselt parem kui see, mis kutsuti inimestel esile Prevnar vaktsiiniga.

39 EE EP1968631 B1 1 2 30 Ühes variandis sisaldab leiutise koostiste jaoks kasutatud adjuvant õli-vees emulsiooni, mis valmistati metaboliseeritavast õlist (nagu skvaleen), emulgaatorist (nagu Tween 80) ja soovi korral tokoolist (nagu alfa-tokoferool). Teatud variandis sisaldab adjuvant (0, ml-lise doosi kohta) 0,-1, 1-13, 2-11, 4-8 või -6 mg (nt 2-3, -6 või -11 mg) metaboliseeritavat õli (nagu skvaleen), 0,1-, 0,3-8, 0,6-6, 0,9-, 1-4 või 2-3 mg (nt 0,9-1,1, 2-3 või 4- mg) emulgaatorit (nagu Tween 80) ja soovi korral 0,-, 1-1, 2-12, 4-, -7 mg (nt 11-13, -6 või 2-3 mg) tokooli (nagu alfa-tokoferool). Antud adjuvant võib soovi korral sisaldada veel -60, -0 või -30 μg (nt -1, 40-0,,, 30, 40 või 0 μg) lipiidi A derivaati (näiteks 3D-MPL). Need adjuvandid sobivad eriti imikute või eakate vaktsiini koostisteks. Teatud variandis sisaldab väljaande vaktsiini koostis, mis sisaldab seda adjuvanti, sahhariidikonjugaate, mis on saadud vähemalt kõigist järgnevatest serotüüpidest: 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1,, 7F (ja võib ka serotüüpidest 3, 6A, 19A ja 22F ühte või mitut sisaldada), kusjuures GMC antikeha tiiter, mis kutsuti esile ühe või mitme (või kõigi) vaktsiini komponentide 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F ja 23F vastu, ei ole märkimisväärselt parem kui see, mis saadi Prevnar vaktsiiniga inimestest vaktsineeritavatel. Antud adjuvant võib veel sisaldada 0,02-2,, 0,0-1,, 0,07-0,7, 0,1-0,3 või 0,12-0,2 mg (nt 0,2-0,3, 0,1-0,1, 0,2 või 0,12 mg) sterooli (näiteks kolesterool), -60, -0 või -30 μg (nt -1, 40-0,,, 30, 40 või 0 μg) lipiidi A derivaati (näiteks 3D-MPL) ja -60, -0 või -30 μg (nt -1, 40-0,,, 30, 40 või 0 μg) saponiini (näiteks QS21). Antud adjuvant sobib eriti eakatele mõeldud vaktsiini koostisteks. Ühes variandis sisaldab antud adjuvanti sisaldav vaktsiini koostis sahhariidikonjugaate, mis on saadud vähemalt kõigist järgnevatest serotüüpidest: 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1,, 7F ( ja võib ka 3, 6A, 19A ja 22F ühte või mitut sisaldada), kusjuures GMC antikeha tiiter, mis kutsuti esile ühe või mitme (või kõigi) vaktsiini komponentide 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F ja 23F vastu, ei ole märkimisväärselt parem kui see, mis saadi Prevnar vaktsiiniga inimestest vaktsineeritavatel.

40 EE EP1968631 B1 1 2 30 Ühes variandis sisaldab leiutise koostisteks kasutatud adjuvant alumiiniumfosfaati ja lipiidi A derivaati (nagu 3D-MPL). Antud adjuvant võib sisaldada (0, ml-lise doosi kohta) 0-70, 0-00 või 300-400 μg Al alumiiniumfosfaadina ning -60, -0 või -30 μg (nt -1, 40-0,,, 30, 40 või 0 μg) lipiidi A derivaati (näiteks 3D- MPL). Antud adjuvant sobib eriti eakamate või imikute vaktsiini koostisteks. Ühes variandis sisaldab vaktsiini koostis, mis seda adjuvanti sisaldab, sahhariidikonjugaate, mis on saadud vähemalt kõigist järgnevatest serotüüpidest: 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1,, 7F ( ja võib ka serotüüpidest 3, 6A, 19A ja 22F ühte või mitut sisaldada), kusjuures GMC antikeha tiiter, mis kutsuti esile ühe või mitme (või kõigi) vaktsiini komponentide 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F ja 23F vastu, ei ole märkimisväärselt parem kui see, mis saadi Prevnar vaktsiiniga inimestest vaktsineeritavatel. Käesoleva leiutise immunogeenseid koostiseid sisaldavaid vaktsiini preparaate võib kasutada nakkusele vastuvõtliku imetaja kaitsmiseks või ravimiseks, manustades nimetatud vaktsiini süsteemselt või limaskesta kaudu. Nende manustamiste seas võib olla süstimine intramuskulaarsel, intraperitoneaalsel, intradermaalsel või subkutaansel teel; või limaskesta kaudu manustamine suukaudselt/seedetrakti, hingamisteede või kuse-suguelundite kaudu. Eelistatud on vaktsiinide intranasaalne manustamine, et ravida pneumooniat või keskkõrvapõletikku (kuna pneumokoki ninaneelu kandumist saab tõhusamalt ennetada, nõrgestades nakkust selle varajaseimas staadiumis). Kuigi leiutise vaktsiini võib manustada üksiku doosina, võib selle komponente manustada koos samaaegselt või erinevatel aegadel (näiteks pneumokoki sahhariidikonjugaate võib manustada eraldi, samaaegselt või 1-2 nädalat pärast vaktsiini mis tahes bakteriaalse valgukomponendi manustamist immuunvastuse optimaalseks koordineerimiseks üksteise suhtes). Koos manustamiseks võib valikuline Th1 adjuvant esineda mis tahes või kõigis erinevates manustamisviisides. Lisaks üksikule manustamisviisile võib kasutada kahte erinevat manustamisviisi. Näiteks sahhariide või sahhariidikonjugaate võib manustada IM (või ID) ja bakteriaalseid valke võib manustada IN ( või ID). Lisaks võib leiutise vaktsiine manustada IM ettevalmistavate doosidena ja IN lisaannustena.

41 EE EP1968631 B1 Valgu antigeenide sisaldus vaktsiinis on üldiselt vahemikus 1-0 μg, soovitatavalt -0 μg, kõige tavalisemalt vahemikus -2 μg. Pärast algset vaktsineerimist võivad subjektid adekvaatse vahega ühe või mitu lisaimmuniseerimist saada. 1 2 30 Vaktsiini valmistamist on üldiselt kirjutatud raamatus Vaccine Design ( The subunit and adjuvant approach (toim.-d Powell M.F. & Newman M.J.) (199) Plenum Press New York). Liposoomidega kapseldamist on kirjeldanud Fullerton, US patent 4,23,877. Käesoleva leiutise vaktsiine võib säilitada lahuses või lüofiliseerida. Soovitatavalt on lahus lüofiliseeritud suhkru, nagu sahharoos või laktoos, juuresolekul. Ent veel soovitatakse, et need on lüofiliseeritud ja taastatakse vahetult enne kasutamist. Lüofiliseerimise tulemuseks võib olla stabiilsem koostis (vaktsiin) ning see võib 3D- MPL juuresolekul ja alumiiniumipõhise adjuvandi puudumisel kõrgemad antikeha tiitrid anda. Leiutise ühes aspektis pakutakse vaktsiini komplekti, mis sisaldab viaali leiutise immunogeense koostisega, mis on soovi korral lüofiliseeritud kujul, ning veel viaali siin kirjeldatud adjuvandiga. On eeldatud, et leiutise selles aspektis kasutatakse adjuvanti lüofiliseeritud immunogeense koostise taastamiseks. Kuigi käesoleva leiutise vaktsiine võib manustada mis tahes viisil, moodustab kirjeldatud vaktsiinide manustamine nahka (ID) käesoleva leiutise ühe variandi. Inimnahk sisaldab välist sarvjat nahandit, mida nimetatakse sarvkihiks ja mis katab marrasnahka. Marrasnaha all on kiht, mida nimetatakse dermiseks ja mis omakorda katab subkutaanset kudet. Teadlased on näidanud, et vaktsiini süstimine nahka ja eriti dermisesse stimuleerib immuunvastust, mida võib ka seostada hulga lisaeelistega. Intradermaalne vaktsineerimine siin kirjeldatud vaktsiinidega moodustab käesoleva leiutise eelistatud omaduse. Intradermaalse süstimise tavapärase võtte, Mantoux protseduur, etappideks on naha puhastamine, seejärel ühe käega venitamine ning ülespoole suunatud peenikese mõõdiksüstla (mõõdik 26-31) kaldservaga nõel sisestatakse nurga all vahemikus -1. Kui nõela kaldserv on sisestatud, süstlatoru alandatakse ja lükatakse veel edasi, lisades õrnalt survet, et seda naha all tõsta. Seejärel

42 EE EP1968631 B1 süstitakse vedelik väga aeglaselt sisse, moodustades naha pinnal seeläbi villi või muhu, millele järgneb nõela aeglane eemaldamine. 1 Hiljuti kirjeldati seadmeid, mis on spetsiaalselt loodud vedelate ainete manustamiseks nahale, näiteks seadmed, mida on kirjeldatud patentides WO 99/3480 ja EP 92444, ka on kirjeldatud pihustamisega süstimisseadmeid, näiteks patentides WO 01/13977; US,480,381, US,99,302, US,334,144, US,993,412, US,649,912, US,69,189, US,704,911, US,383,81, US,893,397, US,466,2, US,339,163, US,312,33, US,03,627, US,064,413, US,, 639, US 4,96,6, US 4,790,824, US 4,941,880, US 4,940,460, WO 97/3770 ja WO 97/1337. Vaktsiini preparaatide intradermaalse manustamise alternatiivsete meetodite seas võivad olla tavapärased süstlad ja nõelad või seadmed, mis on loodud tahkete vaktsiinide ballistiliseks transpordiks (WO 99/27961), või transdermaalsed plaastrid (WO 97/48440; WO 98/28037); või nahapinnal kasutamine (transdermaalne või transkutaanne kasutus WO 98/734; WO 98/28037). Kui käesoleva leiutise vaktsiine manustatakse nahale või täpsemalt dermisesse, on vaktsiin madala vedeliku mahuga, eriti mahuga vahemikus umbes 0,0 ml ja 0,2 ml. 2 30 Antigeenide sisaldus käesoleva leiutise naha või intradermaalsetes vaktsiinides võib olla sarnane tavapärastele doosidele, mis leiduvad intramuskulaarsetes vaktsiinides (vaata eespool). Ent naha või intradermaalsete vaktsiinide omaduseks on fakt, et koostised võivad olla madala doosiga. Seetõttu esinevad valgu antigeenid madala doosi vaktsiinides kogusega 0,1 kuni μg, soovitatavalt 0,1 kuni μg doosi kohta; ning sahhariidi (soovitatavalt konjugeeritud) antigeenid võivad esineda vahemikus 0,01-1 μg ning soovitatavalt vahemikus 0,01 kuni 0, μg sahhariidi doosi kohta. Siin kasutatud intradermaalne transport tähendab vaktsiini toimetamist dermise piirkonda nahas. Ent vaktsiin ei pea tingimata dermises asuma. Dermis on kiht nahas, mis asub umbes 1,0 ja umbes 2,0 mm kaugusel inimnaha pinnast, kuid indiviidide ning keha erinevate osade vahel esineb teatud määral varieerumist. Üldiselt jõuab see eeldatavasti dermiseni, kui liikuda 1, mm allapoole nahapinda. Dermis asub sarvkihi ja pinna epidermise vahel subkutaansel kihil allpool.

43 EE EP1968631 B1 Manustamisviisist sõltuvalt asub vaktsiin lõpuks ainult või peamiselt dermises või võib selle lõpuks epidermisesse ja dermisesse jaotada. 1 2 30 Käesolev leiutis pakub veel täiustatud vaktsiini Haemophilus influenzae põhjustatud keskkõrvapõletiku ennetamiseks või leevendamiseks, lisades Haemophilus influenzae valke, näiteks D-valke vabal või konjugeeritud kujul. Lisaks pakub käesolev leiutis täiustatud vaktsiini pneumokoki nakkuse ennetamiseks või leevendamiseks imikutel (nt keskkõrvapõletik), mis põhineb ühe või mitme pneumokoki valgu lisamisel vaba või konjugeeritud valguna leiutise S. pneumoniae konjugaadi koostistele. Nimetatud pneumokoki vabad valgud võivad mis tahes S. pneumoniae valkude, mida kandjavalkudena kasutati, suhtes olla samad või erinevad. Kombineeritud vaktsiini võib kaasata ühe või mitu Moraxella catarrhalise valgu antigeeni vabal või konjugeeritud kujul. Järelikult on käesolev leiutis täiustatud meetod imikutel keskkõrvapõletiku vastu (kaitsva) immuunvastuse tekitamiseks. Järgmises variandis moodustab käesolev leiutis täiustatud meetodi imikutel (määratletult 0-2 aastased käesoleva leiutise kontekstis) (kaitsva) immuunvastuse tekitamiseks, manustades ohutu ja tõhusa koguse leiutise vaktsiini [pediaatriline vaktsiin]. Käesoleva leiutise täiendavate variantide seas on meditsiinis kasutamiseks mõeldud leiutise antigeensete S. pneumoniae konjugaadi koostiste ning leiutise S. pneumoniae konjugaatide kasutamise pakkumine, et toota ravim pneumokoki haiguse ennetamiseks (või ravimiseks). Ent järgmises variandis on käesolev leiutis täiustatud meetod eakamas populatsioonis (käesoleva leiutise kon tekstis peetakse patsienti eakaks, kui ta on 0-aastane või vanem, tavaliselt aastane ja vanem ning üldisemalt üle 60- aastane) (kaitsva) immuunvastuse tekitamiseks, manustades ohutu ja tõhusa koguse leiutise vaktsiini soovitatavalt koos ühe või kahe S. pneumoniae valguga, mis esinevad vaba või konjugeeritud valguna, kus vabad S. pneumoniae valgud võivad olla samad või erinevad, nagu mis tahes S. pneumoniae valgud, mida kasutati kandjavalkudena. Leiutise järgmine aspekt on inimhosti immuniseerimismeetod haiguse vastu, mille põhjustajaks on S. pneumoniae ja soovi korral Haemophilus influenzae nakkus,

44 EE EP1968631 B1 hõlmates hostile leiutise immunogeense koostise või vaktsiini või komplekti immunokaitsva doosi manustamist. Leiutise järgmine aspekt on leiutise immunogeenne koostis, et S. pneumoniae ja soovi korral Haemophilus influenzae nakkuse põhjustatud haigust ravida või ennetada. Leiutise järgmine aspekt on leiutise immunogeense koostise või vaktsiini või komplekti kasutamine, et toota ravim S. pneumoniae ja soovi korral Haemophilus influenzae nakkuse põhjustatud haiguste ravimiseks või ennetamiseks. Siinsed terminid sisaldades, sisaldavad ja sisaldab on leiutajate poolt mõeldud, et neid saab soovi korral igal juhul asendada terminitega vastavalt koosnedes, koosnevad ja koosneb. Leiutise vaktsiini koostistega seotud variandid on ka rakendatavad variantidega, mis on seotud leiutise immunogeensete koostistega ja vastupidi. 1 Et leiutist oleks parem mõista, on esitatud järgnevad näited. Antud näited on antud ainult illustreerimise eesmärgil ning neid ei tohiks kuidagi leiutise ulatust piiravana tõlgendada. NÄITED Näide 1. D-VALGU EKSPRESSIOON Haemophilus influenzae D-valk Geneetiline konstruktsioon D-valgu ekspressiooniks Lähtematerjalid D-valku kodeeriv DNA 2 D-valk on kõigi serotüübiga H. Influenzae ja mitte-klassifitseeritavate tüvede seas ülimalt konserveerunud. Vektor phic348, mis sisaldab kogu D-valgu geeni kodeerivat DNA-d, saadi dr A. Forsgrenilt, Department of Medical Microbiology,

4 EE EP1968631 B1 University of Lund, Malmö General Hospital, Malmö, Rootsi. D-valgu DNA avaldasid Janson et al, (1991) Infect. Immun. 9: 119-12. Ekspressioonivektor pmg1 Ekspressioonivektor pmg1 on pbr322 derivaat (Gross et al, 198), millesse väliselt sisestatud geenide transkriptsiooniks ja translatsiooniks lisati bakteriofaagist A tuletatud kontrollelemente (Shatzman et al, 1983). Lisaks vahetati ampitsilliini resistentsusgeen kanamütsiini resistentsusgeeni vastu välja. E. coli tüvi AR8 E. coli tüvi AR8 loodi N99 teisendusel P1 faagivaruga, mida oli eelnevalt SA00 derivaadil kasvatatud (gale::tn, lambdakilcl87 ΔH1). N99 ja SA00 on E. coli K12 tüved, mis on saadud dr Martin Rosenbergi laboratooriumist instituudist National Institute of Health. Ekspressioonivektor pmg 1 1 2 D-valgu tootmiseks klooniti valku kodeeriv DNA ekspressioonivektorisse pmg 1. Antud plasmiid rakendab signaale lambdafaagi DNA-st, et sisestatud võõrgeenide transkriptsiooni ja translatsiooni juhtida. Vektor sisaldab promootorit PL, operaatorit OL ja kahte kasutussaiti (NutL ja NutR), et transkriptsionaalseid polaarsusefekte leevendada, kui N-valk on olemas (Gross et al, 198). PL promootorit sisaldavad vektorid sisestatakse E. coli lüsogeensesse hosti, et plasmiidi DNA-d stabiliseerida. Lüsogeense hosti tüved sisaldavad replikatsiooni defektset lambdafaagi DNA-d, mis on genoomi integreeritud (Shatzman et al, 1983). Kromosomaalne lambdafaagi DNA suunab cl repressorvalgu sünteesi, mis seondub vektori OL repressorile, ning takistab RNA polümeraasi seondumist PL promootorile ja seeläbi sisestatud geeni transkriptsiooni. Ekspressioonitüve AR8 cl geen sisaldab temperatuuritundlikku mutanti, nii et PL suunatud transkriptsiooni saab temperatuurinihkega reguleerida, st kasv kultuuri temperatuuris inaktiveerib repressori ning käivitub võõrvalgu süntees. Antud ekspressioonisüsteem võimaldab võõrvalkude, eriti nende, mis võivad raku suhtes toksilised olla, reguleeritud sünteesi (Shimataka & Rosenberg, 1981).

46 EE EP1968631 B1 E. coli tüvi AR8 D-valgu kandja tootmiseks kasutatud AR8 lüsogeenne E. coli tüvi on standardse NIH E. coli K12 tüve N99 derivaat (F - su - galk2, laczthr - ). See sisaldab defektset lüsogeenset lambdafaagi (gale::tn, lambdakil cl87 ΔH1). Kil - fenotüüp takistab hosti makromolekulaarse sünteesi seiskumist. cl87 mutatsioon võimaldab temperatuuritundlikku kollet cl repressorile. ΔH1 deletsioon eemaldab lambdafaagi parempoolse operoni ja hosti bio, uvr3 ja chla lookused. AR8 tüvi loodi N99 teisendusel P1 faagivaruga, mida oli eelnevalt SA00 derivaadil kasvatatud (gale::tn, lambdakil - cl87 ΔH1). Defektse lüsogeeni sisestamine N99-sse valiti tetratsükliiniga tänu TN transposooni olemasolule, mis kodeerib tetratsükliini resistentsusele kõrvalasuvas gale geenis. Vektori pmgmdpprd struktuur 1 2 pmg 1 vektorit, mis sisaldab influentsa viiruse (pmgnsi) mittestrukturaalset S1 valku kodeerivat geeni, kasutati pmgmdpprd loomiseks. D-valgu geeni amplifitseeriti PCR abil phic348 vektorist (Janson et al, 1991 Infect. Immun. 9:119-12) PCR praimeritega, mis sisaldasid Ncol ja Xbal restriktsioonisaite vastavalt ja 3 otsal. NcoI/XbaI fragment sisestati seejärel pmgns1-sse Ncol ja Xbal vahel, luues seeläbi sulandvalgu, mis sisaldas NS1 valgu N-otsa 81 aminohappeid, millele järgnes PD valk. Vektori tähistuseks sai pmgns1 PrD. Eespool kirjeldatud struktuuri põhjal loodi D-valgu ekspressiooniks lõplik struktuur. BamHI/BamHI fragment eemaldati pmgns1prd-st. Antud DNA hüdrolüüs eemaldas NS1 kodeerimispiirkonna, välja arvatud esimesed kolm N-otsa jääki. Pärast vektori uuesti ligeerimist loodi järgneva N-otsa aminohappe järjestusega geen, mis kodeerib sulandvalku: -----MDP SSHSSNMANT---- NS1 D-valk D-valk ei sisalda juhtpeptiidi ega N-otsa tsüsteiini, millele lipiidiahelad on tavaliselt kinnitunud. Järelikult valku ei eritata periplasmi ega lipideerita ning see püsib tsütoplasmas lahustuval kujul.

47 EE EP1968631 B1 Lõplik struktuur pmg-mdpprd sisestati AR8 hosti tüvesse kuumašokiga temperatuuril 37 C. Plasmiidi sisaldavad bakterid valiti kanamütsiini juuresolekul. DNA lisandit kodeeriva D-valgu olemasolu näidati eraldatud plasmiidi DNA lagundamisel selekteeritud endonukleaasidega. Rekombinantset E. coli tüve nimetatakse ECD4-ks. D-valgu ekspressioon on lambda PL promootori/ OL operaatori kontrolli all. Hosti tüvi AR8 sisaldab genoomis temperatuuritundlikku cl geeni, mis blokeerib ekspressiooni lambda PL-st madalal temperatuuril, seondudes OL-ile. Kui temperatuur on tõusnud, vabaneb cl OL-st ja ekspresseeritakse D-valku. Väheulatuslik valmistamine Fermentatsiooni lõpus rakud kontsentreeriti ja külmutati. 1 Kogutud rakkude ekstraktimine ja D-valgu puhastamine teostati järgnevalt. Külmutatud rakukultuuri graanul sulatati üles ja seda resuspendeeriti raku segamise lahuses (tsitraatpuhver ph-ga 6,0) lõplikule OD60-le = 60. Suspensioon lasti kaks korda läbi kõrgsurvel homogenisaatori rõhul P = 00 baari. Rakukultuuri homogenaat puhastati tsentrifuugimisel ja rakujäätmed eemaldati filtreerimisel. Esimeses puhastusetapis lisati filtreeritud lüsaat katioonvahetuskromatograafia kolonnile (SP sefaroosi kiire vool). PD seondus geelmaatriksile ioonse interaktsiooniga ning seda elueeriti elueerimispuhvri ioonse tugevuse etapiviisilise kasvuga. Teises puhastusetapis saadi lisandid anioonvahetuse maatriksile (Q sefaroosi kiire vool). PD ei seondunud geelile ja selle sai läbivoolu koguda. 2 Mõlemas kolonnkromatograafia etapis jälgiti fraktsiooni kogumist OD abil. Anioonvahetuse kolonnkromatograafia läbivool, mis sisaldas puhastatud D-valku, kontsentreeriti ultrafiltratsioonil. D-valku sisaldav ultrafiltratsiooni kogum lasti lõpuks läbi 0,2 μm-lise membraani.

48 EE EP1968631 B1 Laiaulatuslik valmistamine Kogutud rakkude ekstraktimine ja D-valgu puhastamine teostati järgnevalt. Kogutud leem jahutati maha ja lasti kaks korda otse läbi kõrgsurvel homogenisaatori rõhul umbes 800 baari. Esimeses puhastusetapis lahjendati rakukultuuri homogenaati ja lisati katioonvahetuskromatograafia kolonnile (SP sefaroosi suured pärlid). PD seondus geelmaatriksile ioonse interaktsiooniga ja seda elueeriti elueerimispuhvri ioontugevuse etapiviisilise kasvuga ja filtreeriti. Teises puhastusetapis hoiti lisandeid anioonvahetuse maatriksil (Q sefaroosi kiire vool). PD ei seondunud geelile ja selle sai läbivoolu koguda. Mõlemas kolonnkromatograafia etapis jälgiti fraktsiooni kogumist OD abil. Anioonvahetuse kolonnkromatograafia läbivool, mis sisaldas puhastatud D-valku, kontsentreeriti ja diafiltreeriti ultrafiltratsioonil. D-valku sisaldav ultrafiltratsiooni kogum lasti lõpuks läbi 0,2 μm-lise membraani. 1 Näide 1b. PhtD EKSPRESSIOON PhtD valk on pneumokoki histidiin-triaadi (Pht) valguperekonna liige, millel on iseloomulik histidiin-triaadide olemasolu (HXXHXH motiiv). PhtD on 838 aa-molekul ja kannab histidiini triaadi (vaata MedImmune WO 00/37, SEQ ID nr-t: 4 aminohape järjestuse jaoks ja SEQ ID nr-t: DNA järjestuse jaoks). PhtD sisaldab keskel ka proliinirikast piirkonda (aminohappe positsioon 348-380). PhtD-l on LXXC motiiviga aa-n-otsa signaalijärjestus. Geneetiline struktuur 2 Küpse MedImmune PhtD valgu (aa 21-st aa 838-ni) geenijärjestus edastati rekombinantselt E. colile, kasutades majasisest ptcmp14 vektorit, mis kandis pλ promootorit. E. coli hosti tüvi on AR8, mis kandis ci87 termotundlikku repressorit, võimaldades promootori soojusinduktsiooni. Polümeraasi ahelreaktsioon teostati selleks, et phtd geeni Medlmmune plasmiidist amplifitseerida (mis kannab phtd geeni pneumokoki tüvest Norway 4 (serotüüp 4) -

49 EE EP1968631 B1 SEQ ID nr:, nagu on kirjeldatud patendis WO 00/37). Ainult phtd geeni suhtes spetsiifilisi praimereid kasutati phtd geeni amplifitseerimiseks kahes fragmendis. Praimerid kannavad kas NdeI ja KpnI või KpnI ja XbaI restriktsioonisaite. Need praimerid ei hübridiseeru ühegi vektorist pärit nukleotiidiga, vaid ainult phtdspetsiifiliste geenijärjestustega. Kunstlik ATG startkoodon sisestati esimese praimeri abil, mis kandis NdeI restriktsioonisaiti. Loodud PCR tooted sisestati seejärel pgem-t kloonimisvektorisse (Promega) ning DNA järjestus kinnitati. Seejärel teostati fragmentide subkloonimine TCMP 14 ekspressioonivektoris, kasutades standardvõtteid ning vektor muudeti AR8 E. coliks. PhtD puhastamine PhtD puhastamine saavutati järgnevalt: - E. coli rakkude kasv kanamütsiini juuresolekul: kasv 30 tundi temperatuuril 30 C, seejärel induktsioon 18 tundi temperatuuril 39, C. 1 - E. coli rakkude lõhkumine tervest kultuurist OD-l ±11 EDTA mm ja PMSF 2 mm juuresolekul proteaasi inhibiitoritena: Rannie, 2 ümberkülvi, 00 baari. - Antigeeni haaramine ja rakujääkide eemaldamine laiendatud kihi moodusel Streamline Q XL kromatograafiaga toatemperatuuril ( C); kolonni pesti NaCl-ga mm + Empigeniga 0,2% ph-l 6, ja elueeriti NaCl-ga 400 mm + Empigeniga 0,2% 2 mm kaaliumfosfaadi puhvris ph-l 7,4. - Filtreerimine Sartobran kassetil (0,4 + 0,2 μm) - Antigeeni sidumine Zn++ kelaatival sefaroosi FF IMAC kromatograafial ph-l 7,4 mm imidasooli juuresolekul temperatuuril 4 C; kolonni pesti imidasooliga mm ja Empigeniga 1% ning elueeriti 0 mm imidasooliga, kumbagi 2 mm kaaliumfosfaatpuhvris ph-l 8,0. 2 - Nõrk anioonvahetuskromatograafia positiivsel režiimil Fractogel EMD DEAEl ph-l 8,0 (2 mm kaaliumfosfaat) temperatuuril 4 C; kolonni pesti 140 mm NaCl-ga ja elueeriti 0 mm NaCl-ga, samas kui kontaminandid (valgud ja DNA) püsisid vahetil adsorbeerituna.

0 EE EP1968631 B1 - Kontsentreerimine ja ultrafiltratsioon 2 mm Na/K fosfaadiga ph-l 7,1 0 kda membraanil. - Puhastatud massi steriliseeriv filtreerimine Millipak- 0,2 μm filterkassetil. Näide 1c. PNEUMOLÜSIINI EKSPRESSIOON Pneumokoki pneumolüsiin valmistati ja mürgitustati, nagu on kirjeldatud patentides WO 04/0811 ja WO 06/032499. Näide 2. Konjugaatide valmistamine 1 2 Valdkonnas teatakse, kuidas puhastatud pneumokoki polüsahhariide valmistada. Nende näidete eesmärgil valmistati polüsahhariidid põhimõtteliselt, nagu on kirjeldatud patendis EP 07213 või lähedalt seotud meetoditega. Enne konjugeerimist võib polüsahhariidid kalibreerida mikrofluidisatsiooniga, nagu on allpool kirjeldatud. Aktiveerimis- ja sidumistingimused on iga polüsahhariidi puhul spetsiifilised. Need on esitatud tabelis 1. Kalibreeritud polüsahhariid (välja arvatud PS, 6B ja 23F) lahustati NaCl-s 2M, NaCl-s 0,2M või süstevees (WFI). Optimaalne polüsahhariidi kontsentratsioon hinnati kõikidele serotüüpidele. Kõik serotüübid peale serotüübi 18C konjugeeriti otse kandjavalgule, nagu on allpool täpsemalt kirjeldatud. Valmistati kaks alternatiivset serotüübi 22F konjugaati; üks konjugeeriti otse, teine ADH linkeri kaudu. 0 μg/ml lähtelahusest atsetonitriilis või atsetonitriili/vee 0%/0% lahuses lisati CDAP-d (CDAP/PS suhe 0,-1, mg/mg PS) polüsahhariidi lahusele. 1, minutit hiljem lisati 0,2M-0,3M NaOH-d, et spetsiifilise aktiveerimise ph-d saavutada. Polüsahhariidi aktiveerimine teostati antud ph-l 3 minuti jooksul temperatuuril 2 C. Aktiveeritud polüsahhariidile lisati puhastatud valku (D-valk, PhtD, pneumolüsiin või DT) (kogus sõltus algsest PS/kandjavalgu suhtest) ning sidumisreaktsioon teostati spetsiifilisel ph-l kuni 2 tunni jooksul (sõltuvalt serotüübist) ph reguleerimisel. Reageerimata tsüanaatestri rühmade karastamiseks lisati mikstuurile seejärel 2M glütsiinilahust. ph kohandati karastavale ph-le (ph 9,0). Lahust segati 30 minutit

1 EE EP1968631 B1 temperatuuril 2 C ning seejärel öö jooksul temperatuuril 2-8 C pideval aeglasel segamisel. 18C valmistamine: 18C ühendati kandjavalgule linkeri adipiinhappe dihüdrasiid (ADH) kaudu. Polüsahhariidi serotüüp 18C mikrofluidiseeriti enne konjugeerimist. Teetanustoksoidi derivatiseerimine EDAC-ga 1 Teetanustoksoidi derivatiseerimiseks lahjendati TT-d 2 μg/ml juures 0,2M NaCl-s ning lisati ADH speisserit, et saavutada lõppkontsentratsioon 0,2M. Kui speisseri lahustumine oli lõppenud, kohandati ph 6,2 peale. Seejärel lisati EDAC-d (1-etüül- 3-(3-dimetüül-aminopropüül)karbodiimiidi), et saavutada lõppkontsentratsioon 0,02M, ning mikstuuri segati 1 tund ph reguleerimisel. Kondenseerimise reaktsioon peatati ph tõstmisel kuni 9,0-le vähemalt 30 minuti jooksul temperatuuril 2 C. Seejärel derivatiseeritud TT diafiltreeriti ( kda CO membraan), et ülejäänud ADH ja EDAC reagent eemaldada. TTAH mass filtreeriti lõpuks steriilselt sidumisetapini ja seda säilitati temperatuuril -70 C. TTAH keemiline sidumine PS 18C-le 2 Konjugeerimisparameetrite üksikasjad leiab tabelist 1. 2 grammi mikrofluidiseeritud PS lahjendati määratletud kontsentratsioonil vees ja kohandati NaCl pulbri lisamisel 2M NaCl-le. Lisati CDAP lahust (0 μg/ml värskelt valmistatud 0/0 v/v atsetonitriilis/wfi-s), et saavutada sobiv CDAP/PS suhe. ph tõsteti 0,3M NaOH lisamise abil aktiveerimise ph-le 9,0 ja stabiliseeriti antud ph-l TTAH lisamiseni. 3 minuti pärast lisati derivatiseeritud TTAH ( μg/ml 0,2M NaCl-s), et saavutada TTAH/PS suhe 2; ph kohandati sidumise ph-le ph 9,0. Lahus jäeti üheks tunniks ph reguleerimisele. Karastamiseks lisati PS/TTAH/CDAP segule 2M glütsiinilahust. ph kohandati karastamise ph-le (ph 9,0). Lahust segati 30 min temperatuuril 2 C ning jäeti seejärel ööseks pideval aeglasel segamisel temperatuurile 2-8 C. PS22FAH-PhtD konjugaat Teises konjugeerimise meetodis ühendati 22F selle sahhariidi jaoks (esimene oli otsene PS22-PhtD konjugeerimise meetod, mis näidatud tabelis 1) kandjavalgule

2 EE EP1968631 B1 linkeri adipiinhappe dihüdrasiid (ADH) kaudu. Polüsahhariidi serotüüp 22F mikrofluidiseeriti enne konjugeerimist. PS 22F derivatiseerimine Aktiveerimine ja sidumine teostati temperatuuril 2 C pideval segamisel reguleeritava temperatuuriga veevannis. Mikrofluidiseeritud PS22F lahjendati, et saada lõplik PS kontsentratsioon 6 μg/ml 0,2M NaCl-s ja lahus kohandati 0,1N HClga ph-le 6,0 ±0,2. Lisati CDAP lahust (0 μg/ml valmistati värskelt atsetonitriilis/wfi-s, 0/0), et saada sobiv CDAP/PS suhe (1,/1 ww). ph tõsteti aktiveerimise ph-le ph 9,00 ±0,0, lisades 0,M NaOH-d ja stabiliseeriti antud ph-l ADH lisamiseni. 3 minuti pärast lisati ADH-d, et saavutada sobiv ADH/PS suhe (8,9/1 w/w); ph kohandati sidumise ph-le ph 9,0. Lahus jäeti 1 tunniks ph reguleerimisele. PSAH derivaat kontsentreeriti ja diafiltreeriti. Sidumine 1 0,2M NaCl-s PhtD-d μg/ml juures lisati PS22FAH derivaadile, et saavutada PhtD/PS22FAH suhe 4/1 (w/w). ph kohandati HCl-ga,0 ±0,0 peale. EDAC lahust ( μg/ml 0,1 M Tris-HCl-s ph-l 7,) lisati manuaalselt min jooksul ( μl / min), et saavutada 1 mg EDAC/mg PS22FAH. Saadud lahust inkubeeriti min ( kuigi kasutati ka 60 min) temperatuuril 2 C segamisel ja ph reguleerimisel. Lahus neutraliseeriti 1M Tris-HCl lisamisel ph-l 7, (1/ lõppkogusest) ja jäeti 30 min temperatuurile 2 C. Enne elueerimist Sephacryl S400HR-l puhastati konjugaat μm Minisart filtri abil. Saadud konjugaadi lõplik PhtD/PS suhe oli 4,1 (w/w), vaba PS sisaldus alla 1% ja antigeensus (α-ps/α-ps) 36,3% ning anti-phtd antigeensus 7,4%. Konjugaatide puhastamine: 2 Konjugaate puhastati geelfiltratsioonil, kasutades Sephacryl S400HR geelfiltratsiooni kolonni, mis oli tasakaalustatud 0,1M NaCl-ga (S00HR 18C jaoks), et väikseid molekule (sealhulgas DMAP) ning konjugeerimata PS ja valku eemaldada. Reaktsioonikomponentide erinevate molekulaarsuuruste põhjal elueeriti esmalt PS-PD, PS-TT, PS-PhtD, PS-pneumolüsiin või PS-DT konjugaadid,

3 EE EP1968631 B1 millele järgnesid vaba PS, seejärel vaba PD või vaba DT ning lõpuks DMAP ja muud soolad (NaCl, glütsiin). Konjugaate sisaldavad fraktsioonid tuvastati UV280 nm abil. Fraktsioonid puuliti nende Kd järgi, filtreeriti steriilselt (0,22 μm) ja säilitati temperatuuril +2-8 C. Tuvastati PS/valgu suhted konjugaadi preparaatides. PS S. pneumoniae-d-valk/tt/dt/phtd/ply konjugaatide spetsiifilised aktiveerimis-/sidumis-/karastamistingimused Kui rea päises esineb μvedelik, tähendab see, et sahhariid kalibreeriti mikrofluidisatsiooniga enne konjugeerimist. Sahhariidide suurused pärast mikrofluidisatsiooni on esitatud tabelis 2. Tabel 1 PS S. pneumoniae-d-valk TT/DT/PhtD/Ply konjugaatide spetsiifilised aktiveerimis-/sidumis-/karastamistingimused Serotüüp 1 μvedelik 4 μvedelik μvedelik 6A μvedelik 6B μvedelik 7F μvedelik PS konts. 2, 2, 7,1,0,0,0 (μg/ml) PS WFI WFI WFI NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M lahustumine PD konts.,0,0,0,0,0,0 (μg/ml) Algne PD/PS 1,/1 1,/1 1/1 1/1 1,1/1 1,2/1 suhe (w/w) CDAP konts. 0,0 0,0 0,79 0,83 0,83 0,7 (mg/mg PS) pha=phc=phq 9,0/9,0/9,0 9,/9,/9,0 9,0/9,0/9,0 9,/9,/9,0 9,/9,/9,0 9,/9,/9,0

4 EE EP1968631 B1 Serotüüp 9V μvedelik 14 μvedelik 18C μvedelik 19A μvedelik 19F μvedelik 22F μvedelik 23F μvedelik PS konts.,0,0 4, 1,0 9,0 6,0 2,38 (μg/ml) PS NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl 0,2M NaCl 2M lahustumine Kandjavalgu,0,0,0 (TT),0 (Ply),0 (DT),0,0 konts. (μg/ml) (PhtD) Algse 1,2/1 1,2/1 2/1 2,/1 1,/1 3/1 1/1 kandjavalgu/ PS suhe (w/w) CDAP konts. 0,0 0,7 0,7 1, 1, 1, 0,79 (mg/mg PS) ph a=ph c=ph q 9,/9,/9,0 9,/9,/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,/9,/9,0 Märkus: ph a,c,q vastab vastavalt aktiveerimiseks, sidumiseks ja karastamiseks mõeldud ph-le Iseloomustus: Iga konjugaati iseloomustati ja see vastas tabelis 2 kirjeldatud spetsifikatsioonidele. Polüsahhariidi sisaldust (μ g/ml) mõõdeti resortsinooli testiga ning valgu sisaldust (μg/ml) Lowry testiga. Lõplik PS/PD suhe (w/w) tuvastati kontsentratsioonide suhtega. Vaba polüsahhariidi sisaldus (%): 1 Temperatuuril 4 C või 7 päeva temperatuuril 37 C säilitatud konjugaatide vaba polüsahhariidi sisaldus tuvastati supernatandil, mis saadi pärast α-kandjavalgu antikehade ja küllastunud amooniumsulfaadiga inkubeerimist, millele järgnes tsentrifuugimine. α-ps/α-ps ELISA analüüsi kasutati vaba polüsahhariidi kvantifitseerimiseks supernatandis. Ka konjugaadi puudumist kontrolliti α-kandjavalk/α-ps ELISA analüüsiga.

EE EP1968631 B1 Antigeensus: Samade konjugaatide antigeensust analüüsiti kihttehnikal põhineva ELISA analüüsiga, kusjuures antikehade haaramine ja tuvastamine olid vastavalt α-ps ja α-valk. Vaba valgu sisaldus (%): Konjugeerimata kandjavalgu saab konjugaadist eraldada puhastamisetapi käigus. Vaba jääkvalgu sisaldus tuvastati suuruseraldus kromatograafiaga (TSK 000 - PWXL), millele järgnes UV tuvastus (214 nm). Elueerimise tingimused võimaldasid vaba kandjavalgu ja konjugaadi eraldamist. Seejärel tuvastati vaba valgu sisaldus konjugaadi massides kalibreerimiskõveraga võrreldes (0 kuni 0 μg/ml kandjavalku). Vaba kandjavalgu % saadi järgnevalt: % vaba kandja = (vaba kandja (μg/ml)/ (vastava kandjavalgu kogukontsentratsioon, mis mõõdeti Lowry abil (μg/ml) * 0%). Stabiilsus: 1 Molekulmassi jaotust (Kav) ja stabiilsust mõõdeti HPLC-SEC geelfiltratsioonil (TSK 000-PWXL) konjugaatidele, mida hoiti temperatuuril 4 C ja säilitati 7 päeva temperatuuril 37 C. /11/13/14-valentne iseloomustus on esitatud tabelis 2 ( vaata märkust selle allosas). Valgu konjugaadid võib alumiiniumfosfaadile adsorbeerida ja puulida, et lõplikku vaktsiini moodustada. Kokkuvõte: 2 Toodeti immunogeensed konjugaadid, mis on sealtpeale näidanud, et need on paljutõotava vaktsiini komponendid.

6 EE EP1968631 B1 Tabel 2: konjugaatide omadused Konjugaadid PS suurus Kandja/PS Vaba PS Vaba PS Konj. (Dax 3 ) suhe (Elisa) kandja antigeensus (Elisa) suurus (kda) PS1-PD 349-382* 1,-1,6 1,0%- 3,9%-4,8% 87%-9% 1499-171 1,2% PS4-PD 93-0* 1,-1,6 4,7-6,% 3,2%-4,0% 90%-96% 1303-1606 PS-PD*** 367-443 0,80 8,7-2,2%-3,8% 93%-8% 1998-232 11,2% PS6A-PD 10-140 0,61 4,% Tegemata 4,9% Tegemata PS6B-PD*** 69-1391 0,7-0,8 1,3-1,6% <2,0% 68%-7% 4778-23 PS7F-PD 2-264* 1,1-1,2 <1% <1,4% 8% 3907-442 PS9V-PD 28-280* 1,3-1, <1% <1,3% 67%-69% 9073-972 PS14-PD 232-241* 1,4 <1% <1,% 70% 3430-3779 PS18C-TT 89-97* 2,2-2,4 1,-2,2% <4% 46%-6% 464-6133 PS19A-Ply* 11 3,2 <1% 29% PS19F-DT 133-143* 1,4-1, 4,1%- <1,2%- 82%-88% 9-233,9% <1,3% PS22F-PhtD* 19-167 2,17,8 Tegemata 37% Tegemata PS22F- 19-167 3,66-4,34 <1% Tegemata 28-31% Tegemata AHPhtD* PS23F-PD*** 914-980 0, 1,4-1,9% 3,7%-4,9% 137%-14% 2933-312 * PS suurus pärast loodusliku PS-i mikrofluidisatsiooni -valentne vaktsiin valmistati serotüübi 1, 4,, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F ja 23F konjugaatide segamisel (nt doosil 1, 3, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 3, 1 μg sahhariidi vastavalt inimese doosi kohta). 11-valentne vaktsiin valmistati veel serotüübi 3 konjugaadi lisamisel tabelist (nt 1 μg sahhariidiga inimese doosi kohta). 13-valentne vaktsiin valmistati veel eespoolt serotüüpide 19A ja 22F konjugaatide lisamisel (22F-ga kas otse PhtD-le ühendatuna või alternatiivselt ADH linkeri kaudu) [nt doosil 3 μg igat sahhariidi inimese doosi kohta]. 14-valentse vaktsiini võib valmistada veel eespoolt serotüübi 6A konjugaadi lisamisel [nt doosil 1 μg sahhariidi inimese doosi kohta].

7 EE EP1968631 B1 Näide 3. Tõendid, et Haemphilus influenzae D-valgu kaasamine leiutise immunogeensesse koostisesse võib pakkuda täiustatud kaitset ägeda keskkõrvapõletiku (AOM) vastu. Uuringu ülesehitus. 1 2 Uuringus kasutati 11Pn-PD vaktsiini, mis sisaldas serotüüpe 1, 3, 4,, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F ja 23F, kus igaüks oli H. Influenzaest pärit D-valgule konjugeeritud (vaata tabelit näites 4). Subjektid randomiseeriti kahte rühma, et need ligikaudu 3, 4, ja 12-1 kuu vanuselt saaksid neli doosi kas 11Pn-PD vaktsiini või Havrix. Kõik subjektid said firma GSK Biologicals Infanrix Hexa (DTPa-HBV-IPV/Hib) vaktsiini üheaegselt 3, 4 ja kuu vanuselt. Infanrix Hexa on Pediarixi ja Hib segu, mis segati enne manustamist. Tõhususe järeluuring vastavalt eeskirjadele analüüsiks algas 2 nädalat pärast kolmanda vaktsiini annuse manustamist ning jätkus 24-27 kuu vanuseni. S. pneumoniae ja H. Influenzae ninaneelus kandmist hinnati subjektide selekteeritud alamhulgas. Vanematel soovitati konsulteerida teadlasega, kui laps oli haige, tal oli kõrvavalu, trummikile spontaanne perforatsioon või kõrvast vedeliku spontaanne väljavool. Kui teadlane kahtlustas AOM-i episoodi, saadeti laps kohe kõrva-nina-kurgu (KNK) spetsialistile diagnoosi kinnitamiseks. AOM-i kliiniline diagnoos põhines kas trummikile visuaalsel vaatlusel (nt punetus, paistetus, valgusrefleksi kadu) või keskkõrvast vedeliku voolu olemasolul (nagu näidati lihtsa või pneumaatilise otoskoopia või mikroskoopiaga). Lisaks pidi esinema vähemalt kaks täiendavat ilmingut või sümptomit: kõrvavalu, kõrvast vedeliku eraldumine, kuulmiskadu, palavik, letargia, ärrituvus, anoreksia, oksendamine või diarröa. Kui KNK spetsialist kinnitas diagnoosi, võeti bakteriaalseks testimiseks paratsenteesi abil keskkõrva vedeliku proov. Korduvate haigusvisiitidega subjektidel loeti uut AOM-i episoodi algavaks, kui eelmise episoodi algusest oli möödas rohkem kui 30 päeva. Lisaks peeti AOM-i episoodi uueks bakteriaalseks episoodiks, kui eraldatud bakter/serotüüp erines eelmisest isolaadist, sõltumata intervallist kahe järjestikuse episoodi vahel. Katse tulemused 30 Kokku kaasati 4968 imikut, 2489 11Pn-PD rühma ja 2479 kontrollrühma. Olulisi erinevusi demograafilistes omadustes ega riskifaktorites kahe rühma vahel ei olnud.

Kliinilised episoodid ja AOM juhtumi määratlus 8 EE EP1968631 B1 1 2 30 Eeskirjade järeluuringu perioodi käigus märgiti kokku üles 11PnPD rühmas 333 kliinilise AOM-i episoodi ja kontrollrühmas 499. Tabelis 3 on näidatud 11Pn-PD vaktsiini ning mõlema 7-valentse vaktsiini kaitsetõhusus, mida testiti eelnevalt Soomes (Eskola et al, N Engl J Med, 01; 344: 403-409 ning Kilpi et al, Clin Infect Dis, 03 37:11-64) mis tahes AOM ja erinevate pneumokoki serotüüpide, H. influenzae, NTHi ja M. catarrhalise põhjustatud AOM episoodi vastu. Üleüldise AOM-i haiguskoorma statistiliselt märkimisväärne ja kliiniliselt oluline vähenemine 33,6% võrra saavutati 11Pn-PD-ga etioloogiast olenemata (tabel 3). Üleüldine tõhusus mis tahes 11 pneumokoki serotüübist, mis 11Pn-PD vaktsiinis sisaldusid, tulenevate AOM-i episoodide vastu oli 7,6% (tabel 3). Järgmine oluline leid käesolevas uuringus oli 3,6%-line kaitse, mida võimaldas 11Pn-PD vaktsiin H. Influenzae põhjustatud AOM-i vastu (ja eriti 3,3%-line kaitse, mida võimaldas NTHi). Antud leid on olulise kliinilise tähtsusega, kuna H. Influenzae kasvanud olulisus on AOM-i peamine põhjustaja pneumokoki konjugaadi vaktsiini ajastus. Ühes kaitsega, mida võimaldati AOM vastu, vähendas 11Pn-PD vaktsiin ka H. Influenzae ninaneelus kandmist pärast lisaannust teisel eluaastal. Need leiud on vastuolus eelnevate tähelepanekutega Soomes, kus kummagi 7-valentse pneumokoki konjugaadi vaktsiini jaoks täheldati tõusu H. Influenzaest tuleneva AOM episoodides (Eskola et al and Kilpi et al), mis on etioloogilise asenduse tõenduseks. Selget korrelatsiooni Hi-st tuleneva AOM-i episoodide vastase kaitse ja antikeha tasemete kandjavalgu D vastu ei olnud võimalik sätestada, kuna primaarse anti-pd IgG antikeha järgsed kontsentratsioonid 11Pn-PD vaktsineeritavates, kes püsisid Hi AOM episoodide vabana, olid põhimõtteliselt samad nagu primaarse anti-pd IgG antikeha järgsed tasemed, mis mõõdeti 11 Pn-PD vaktsineeritavates, kellel kujunes vähemalt üks Hi AOM episood tõhususe järeluuringu perioodi käigus. Ent kuigi korrelatsiooni ei olnud võimalik vaktsiini bioloogilise mõju ja primaarse IgG anti-pd immunogeensuse järel sätestada, on mõistlik eeldada, et PD kandjavalk, mis on H. Influenza tüvede seas ülimalt konserveerunud, on suurel määral Hi-vastase kaitse esilekutsumisse panustanud.

9 EE EP1968631 B1 1 Toimega AOM haigusele kaasnes toime ninaneelus kandmisele, mis oli sarnase ulatusega vaktsiini serotüübi pneumokoki ja H. Influenzae puhul (joonis Fig 1). H. Influenzae ninaneelus kandmise vähenemine PD-konjugaadi vaktsineeritavates toetab PD-konjugaadi vaktsiini otsese kaitsetoime hüpoteesi H. Influenzae vastu isegi, kui kaitsetoimet ei saanud anti-pd IgG immuunvastusega korreleerida, nagu ELISA analüüsiga mõõdeti. Järgnevas katses kasutati tšintšilja keskkõrvapõletiku mudelit imikutelt, keda oli immuniseeritud antud näite 11-valentse koostisega või näite 2 -valentse vaktsiiniga (vaata ka tabeleid 1 ja 2 ning nende all olevaid märkuseid), saadud seerumipuulidega. Mõlemad puulid kutsusid esile keskkõrvapõletikuga loomadel protsentuaalselt märkimisväärse vähenemise, võrreldes preimmuunse seerumipuuliga. Puudub märkimisväärne erinevus - ja 11-valentsete immuunpuulide vahel. See näitab, et mõlemal vaktsiinil on antud mudelis sarnane potentsiaal mitte-klassifitseeritava H. Influenzae põhjustatud keskkõrvapõletiku vastu kaitse esilekutsumiseks.

60 EE EP1968631 B1

61 EE EP1968631 B1 Näide 4. Kandjavalgu selekteerimine serotüübile 19F Kasutatud ELISA analüüs 1 2 22F inhibeerimise ELISA meetod põhines peamiselt analüüsil, mille esitasid 01. aastal Concepcion ja Frasch ning Henckaerts et al, 06, Clinical and Vaccine Immunology 13:36-360. Lühidalt, puhastatud pneumokoki polüsahhariidid segati metüleeritud inimese seerumialbumiiniga ja adsorbeeriti öö jooksul temperatuuril 4 C Nunc Maxisorp (Roskilde, DK) kõrge seondumisega mikrotiitri plaatidele. Plaate blokeeriti % veiselooteseerumiga (FBS) PBS-s 1 tund toatemperatuuril loksutamisel. Seerumiproove lahjendati PBS-sis, mis sisaldas % FBS, μg/ml rakuseina polüsahhariidi (SSI) ja 2 μg/ml pneumokoki polüsahhariidi serotüüpi 22F (ATCC), ning lahjendati veel mikrotiitri plaatidel sama puhvriga. Sisevõrdlus, mis oli kalibreeritud standardse seerumi 89-SF suhtes, kasutades serotüübi spetsiifilisi IgG kontsentratsioone 89-SF-s, töödeldi samal viisil ning kaasati igale plaadile. Pärast pesemist tuvastati seondunud antikehad peroksidaas-konjugeeritud anti-inimese IgG monoklonaalse antikehaga (Stratech Scientific Ltd., Soham, ÜK), mida oli lahjendatud %-lises FBS-s (PBS-s), ja inkubeeriti 1 tund toatemperatuuril loksutamisel. Värv ilmutati kasutusvalmis üksiku komponendi tetrametüülbensiid peroksidaasensüümi immunoanalüüsi substraadi komplektiga (BioRad, Hercules, CA, USA) toatemperatuuril pimedas. Reaktsioon peatati H2SO4-ga 0,18M ning optilist tihedust loeti lainepikkusel 40 nm. Serotüübi spetsiifilise IgG kontsentratsioonid (ühikutes μg/ml) proovides arvutati määratletud piirides olevate optilise tiheduse punktide võrdlemisel sisevõrdluse seerumi kõveraga, mis tehti mudeliks 4-parameetrilise logistilise log-võrrandiga, mis arvutati SoftMax Pro (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) tarkvaraga. Väljavõte ELISA analüüsile oli 0,0 μg/ml IgG kõikidele serotüüpidele, arvestades tuvastamise limiiti ja kvantifitseerimise limiiti. Opsono-fagotsütoosi analüüs 30 WHO nõupidamiskohtumisel 03. aasta juunis soovitati kasutada OPA analüüsi, nagu on esitanud Romero-Steiner et al, Clin Diagn Lab Immunol, 03 (6): lk

62 EE EP1968631 B1 19-24. Antud protokolli kasutati serotüüpide OPA aktiivsuse testimiseks järgnevates katsetes. Konjugaatide valmistamine 1 2 Uuringutesse 11Pn-PD&Di-001 ja 11Pn-PD&Di-007 kaasati kolm 11-valentset vaktsiini koostist (tabel 4), milles D-valgule konjugeeritud 1 μg polüsahhariidi (19F- PD) asemel konjugeeriti 3 μg 19F polüsahhariid difteeriatoksoidile (19F-DT). Konjugeerimise parameetrid uuringutele 11Pn-PD, 11 Pn-PD&Di-001 ja 11 PnPD&Di-007 on esitatud vastavalt tabelites, 6 ja 7. Anti-pneumokoki antikeha vastused ja OPA aktiivsus serotüübi 19F vastu üks kuu pärast primaarset vaktsineerimist nende 19F-DT koostistega on näidatud vastavalt tabelites 8 ja 9. Tabelis on näidatud 22F-ELISA antikeha kontsentratsioonid ja subjektide protsendimäärad, kes saavutasid 0,2 μg/ml künnise enne ja pärast 23-valentse puhta polüsahhariidi lisavaktsineerimist. Opsono-fagotsüütiline aktiivsus oli selgelt paranenud antikehadele, mis nende 19F-DT koostistega esile kutsuti, nagu näitasid kõrgemad seropositiivsuse tasemed ( opsono-fagotsüütilised tiitrid 1:8) ja OPA GMT-d üks kuu pärast primaarset vaktsineerimist (tabel 9). Üks kuu pärast 23- valentset puhast polüsahhariidi lisavaktsineerimist jäi 19F antikehade opsonofagotsüütiline aktiivsus märkimisväärselt paremaks lastel, keda praimiti 19F-DT koostistega (tabel 11). Tabelis 12 on esitatud immunogeensuse andmed pärast 11Pn-PD lisaannust väikelastel, keda oli eelnevalt praimitud 19F-DT või 19F-PD konjugaatidega, võrreldes Prevnar 4. järjestikuse annusega. Arvestades läbimurdvaid juhtumeid, millest teatati pärast Prevnar kaasamist USA-s, võib täiustatud opsonofagotsüütiline aktiivsus serotüübi 19F vastu, kui see on DT kandjavalgule konjugeeritud, kandidaatvaktsiini jaoks kasulik olla. Tabelis 13 on esitatud ELISA ja OPA andmed 19F-DT konjugaadile seoses ristreaktiivse serotüübiga 19A. Leiti, et 19F-DT kutsub 19A vastu esile madala, kuid olulise OPA aktiivsuse.

63 EE EP1968631 B1 Tabel 4: pneumokoki konjugaatvaktsiin, mida kasutati kliinilistes uuringutes. Koostis Pneumokoki serotüüp μg/kandjavalk Al3 + 1 3 4 6B 7F 9V 14 18C 19F 23F mg 11Pn- 1/PD 1/PD 1/PD 1/PD 1/PD 1/PD 1/PD 1/PD 1/PD 1/PD 1/PD <0,8 PD 19F-DT 3/PD 3/PD 3/PD 3/PD /DT 3/PD 3/PD 3/PD 3/PD 3/PD /DT 0,3 kuju 1 19F-DT 3/PD 2/PD 2/PD 3/PD /DT 3/PD 2/PD 2/PD 2/PD 3/DT /DT 0,3 kuju 2 19F-DT kuju 3 3/PD 3/PD 3/PD 3/PD 3/PD 3/PD 3/PD 3/PD 3/PD 3/PD 3/PD = 0, Tabel : PS S. pneumoniae-d-valk/tt/dt konjugaatide spetsiifilised aktiveerimis-/sidumis-/karastamistingimused Serotüüp 1 looduslik 3 μvedelik 4 looduslik looduslik 6B looduslik 7F looduslik PS 1, 2 2,0 7,, 3,0 konts.(μg/ml) PS lahustumine NaCl mm NaCl 2M WFI WFI NaCl 2M NaCl 2M PD konts.,0,0,0,0,0,0 (μg/ml) Algne PS/PD 1/0,7 1/1 1/1 1/1 1/1 1/1 suhe (w/w) CDAP konts. 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 (mg/mg PS) pha=phc=phq 9,0/9,0/9,0 9,/9,/9,0 8,8/8,8/9,0 9,0/9,0/9,0 9,/9,/9,0 9,0/9,0/9,0 Sidumisaeg 60 min 60 min 4 min 40 min 60 min 60 min

64 EE EP1968631 B1 Serotüüp 9V looduslik 14 looduslik 18C looduslik 19F looduslik 23F looduslik PS konts. 1,7 2, 1,7 4,0 2, (μg/ml) PS NaCl 2M NaCl 2M WFI NaCl 2M NaCl 2M lahustumine PD konts.,0,0,0,0,0 (μg/ml) Algne PS/PD 1/0,7 1/0,7 1/1,2 1/1 1/1 suhe (w/w) CDAP konts. 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 (mg/mg PS) pha=phc=phq 8,/8,/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,/9,/9,0 9,/9,/9,0 Sidumisaeg 60 min 60 min 4 min 30 min 60 min Tabel 6: PS S. pneumoniae-d-valk/dt konjugaatide spetsiifilised aktiveerimis- /sidumis-/karastamistingimused 11Pn-PD&Di-001 uuringuks Serotüüp 1 μvedelik 3 μvedelik 4 μvedelik μvedelik 6B μvedelik 7F looduslik PS 4 2,0 2, 7, 3,0 konts.(μg/ml) PS lahustumine NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M PD konts.,0,0,0,0 (DT),0 (μg/ml) NaCl 2M NaCl 2M Algne PS/PD 1,2/1 1/1 1/1 1/1 1,/1 1/1 suhe (w/w) CDAP konts. 1,0 0,7 1, 2 1, 0,7 (mg/mg PS) pha=phc=phq 9,0/9,0/9,0 9,/9,/9,0 9,/9,/9,0 9,0/9,0/9,0 9,/9,/9,0 9/9/9 Sidumisaeg 60 min 60 min 60 min 60 min 60 min 60 min

6 EE EP1968631 B1 Serotüüp 9V looduslik 14 looduslik 18C μvedelik 19F μvedelik 23F μvedelik PS 1,7 2,,0 9,0 konts.(μg/ml) PS lahustumine NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M PD konts.,0,0,0 (DT) (DT) (μg/ml) Algne PS/PD 0,7/1 0,7/1 1,2/1 1,/1 1,/1 suhe (w/w) CDAP konts. 0,7 0,7 1, 1, 0,7 (mg/mg PS) pha=phc=phq 8,/8,/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,/9,/9,0 9,/9,/9,0 Sidumisaeg 60 min 60 min 30 min 60 min 60 min Tabel 7: PS S. pneumoniae-d-valk/dt konjugaatide spetsiifilised aktiveerimis- /sidumis-/karastamistingimused 11PN-PD&Di-007 uuringuks Serotüüp 1 looduslik 3 μvedelik 4 looduslik looduslik 6B looduslik 7F μvedelik PS 1, 2,0 2 7,,,0 konts.(μg/ml) PS lahustumine NaCl mm NaCl 2M WFI WFI NaCl 2M NaCl 2M PD konts.,0,0,0,0 (μg/ml) Algne PS/PD 0,7/1 1/1 1 1/1 1/1 1,2/1 suhe (w/w) CDAP konts. 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 (mg/mg PS) pha=phc=phq 9,0/9,0/9,0 9,/9,/9,0 8,8/8,8/9,0 9,0/9,0/9,0 9,/9,/9,0 9,/9,/9 Sidumisaeg 60 min 60 min 4 min 40 min 60 min 60 min

Serotüüp PS (μg/ml) konts. 9V μvedelik 14 μvedelik 66 EE EP1968631 B1 18C looduslik 19F μvedelik 19F μvedelik,0,0 1,7 9,0,0 9, 23F μvedelik PS lahustumine NaCl 2M NaCl 2M WFI NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M Kandjavalgu konts. (μg/ml) Algse kandjavalgu/ps suhe (w/w) CDAP (mg/mg PS) konts.,0,0 (DT),0 (PD) 1,2/1 1,2/1 1,2/1 1,/1 1,2/1 1/1 0, 0,7 0,7 1, 0,7 0,7 pha=phc=phq 9,/9,/9,0 9,/9,/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,/9,/9,0 Sidumisaeg 60 min 60 min 4 min 1 min 1 min 60 min Tabel 8: subjektide protsendimäär 19F antikeha kontsentratsiooniga 0, μg/ml ja 19F antikeha geomeetrilise keskmise antikeha kontsentratsioonidega (GMC-d 9% Cl-ga; μg/ml) üks kuu pärast 1 μg 19F-PD, 3 μg 19F-DT või Prevnariga (2 μg 19F-CRM) primaarset vaktsineerimist (kogukohort) Rühm 11Pn-PD&Di-001 (22F-ELISA) 11Pn-PD&Di-007 (22F-ELISA) N % 0, μg/ml (9% Cl) GMC (μg/ml) (9% CI) 11PnPD 12 98,7 (9,3-99,8) 1,93 (1,67-2,22) 19F-DT 146 99,3 (96,2-0) 2,88 (2,4 - kuju 1 Γ 3,38) 19F-DT 96,0 (91,-98,) 2,43 (2,01 - kuju 2 Γ 2,94) N % 0, μg/ml (9% Cl) 0 0 (92,9-0) - - - - - - 19F-DT - - - 0 96,0 (86,3 - kuju 3 Γ 99,) Prevnar 148 98,6 (9,2-99,8) 2,98 (2,60-3,41) Γ erinevate formulatsioonide koostis on esitatud tabelis 4. 41 97,6 (87,1-99,9) GMC (μg/ml) (9% Cl) 2,78 (2,31-3,36) 3,70 (2,8 -,30) 2,91 (2,1-3,94)

67 EE EP1968631 B1 Tabel 9: subjektide protsent 19F OPA tiitriga 1:8 ja 19F OPA GMT-d üks kuu pärast primaarset vaktsineerimist 1 μg 19F-PD, 3 μg 19F-DT või Prevnariga (2 μg 19F-CRM) (kogukohort) Rühm 11Pn-PDBDi-001 11Pn-PD&Di-007 N 1:8 (9% Cl) GMT (9% 11PnPD 136 84,6 (77,4-90,2) 19F-DT 137 9,6 (90,7 - kuju 1 Γ 98,4) 19F-DT 139 92,1(86,3- kuju 2 Γ 96,0) Cl) 77,8 (8,1-4,4) 263,2 (118,1- (9,4-330,7) 218,9 287,9) N 1:8 (9% Cl) GMT (9% 46 9,7 (8,2-99,) - - - - - - 19F-DT - - - 49 91,8 (80,4 - kuju 3 Γ 97,7) Prevnar 131 86,3 (79,2-91,6) 82,6 (61,1-111,6) Γ erinevate formulatsioonide koostis on esitatud tabelis 4. 38 81,6 (6,7-92,3) Cl) 167,8 238,6) 403,1 (166,- (22,7-719,9) 6,0 (37,7-112,2)

68 EE EP1968631 B1 Tabel : subjektide protsent 19F antikeha kontsentratsiooniga 0, μg/ml ja 19F antikehaga GMCs ( μg/ml) üks kuu enne ja pärast 23-valentse puhta polüsahhariidi lisaannust lastel, keda praimiti 1 μg 19F-PD, 3 μg 19F-DT või Prevnariga (2 μg 19F-CRM) (kogukohort) Primaarne rühm 11Pn-PD&Di-002 (22F ELISA) Enne lisavaktsineerimist Üks kuu pärast 23-valentset PS lisaannust N % 0, μg/ml (9% Cl) GMC (μg/ml) (9% Cl) N % 0, μg/ml (9% Cl) GMC (μg/ml) (9% Cl) 11Pn-PD 70 77,1 (6,6-86,3) 0,67 (0,4-0,98) 67 94,0 (8,4-98,3) 11,0 (7,76-17,03) 19F-DT kuju 1 Γ 68 91,2 (81,8-96,7) 0,71 (0,4-0,94) 69 98,6 (92,2-0) 14,0 (,47-,07) 19F-DT kuju 2 Γ 74 81,1 (70,3-89,3) 0,9 (0,43-0,80) 72 9,8 (88,3-99,1) 9,90 (6,74-14,4) Prevnar 6 64,6 (1,8-76,1) 0,40 (0,27-0,60) 67 0 (94,6-0) 9,40 (6,9-12,71) Γ erinevate formulatsioonide koostis on esitatud tabelis 4.

69 EE EP1968631 B1 Tabel 11: subjektide protsent 19F OPA tiitriga 1:8 ja 19F OPA GMT-dega üks kuu enne ja pärast 23-valentse puhta polüsahhariidi lisaannust lastel, keda praimiti 1 μg 19F-PD, 3 μg 19F-DT või Prevnariga (2 g 19FCRM) (kogukohort) Primaarne rühm 11Pn-PD&Di-002 Enne lisavaktsineerimist Üks kuu pärast 23-valentset PS lisaannust GMT (9% Cl) N % 1:8 (9% Cl) GMT (9% Cl),9 28 82,1 408,0 (,0- (63,1- (17,3-23,7) 93,9) 8,3) 18,1 18 94,4 63,8 (7,2- (72,7- (386,6-4,7) 99,9) 2927,) 8, (4,7-28 0 97,6 1,3) (87,7- (2,8-0) 169,0) 8,1 (3,4-23 82,6 380,9 19,6) (61,2- (133,2-9,0) 89,) 19 47,4 N % 1:8 (9% Cl) 11Pn-PD 29 27,6 (12,7-47,2) 19F-DT kuju 1 Γ (24,4-71,1) 27 33,3 19F-DT kuju 2 Γ (16,- 4,0) Prevnar 24 12, (2,7-32,4) Γ erinevate formulatsioonide koostis on esitatud tabelis 4.

70 EE EP1968631 B1 Tabel 12: subjektide protsent antikeha kontsentratsioonidega 0,2 μg/ml, OPA-ga 1:8 ja GMC-de/GMT-dega 19F pneumokoki vastu üks kuu pärast 11Pn-PD või Prevnari lisaannust lastel, keda praimiti 1 μg 19F-PD, 3 μg 19F- DT või Prevnariga (2 μg 19F-CRM) (kogukohort) Primaarne rühm 11Pn-PD&Di,002 22F-ELISA analüüs OPA analüüs N % 0, GMC N % 1:8 GMT μg/ml (μg/ml) (9% Cl) (9% Cl) (9% Cl) (9%Cl) 11Pn-PD 70 0 (94,9-0) 4,2 (3,7-,) 21 0 (83,9-0) 2,6 (13,- 481,9) 19F-DT kuju 1 Γ 66 98, (91,8-0) 3,4 (2,8-4,3) 23 9,7 (78,1-99,9) 374,0 (192,6-726,2) 19F-DT kuju 2 Γ 70 98,6 (92,3-0) 3,80 (2,9-4,9) 29 96,6 (82,2-99,9) 249,1 (144,7-428,7) Prevnar 69 97,1 (89,9-99,6) 2,6 (2,0-3,3) 31 96,8 (83,3-99,9) 28,7 (319,4-87,2) Γ erinevate formulatsioonide koostis on esitatud tabelis 4.

71 EE EP1968631 B1 Tabel 13: subjektide protsent antikeha kontsentratsioonidega 0,2 μg/ml, OPA-ga 1:8 ja GMC-de/GMT-dega 19F pneumokoki vastu üks kuu pärast vaktsineerimist 1 μg 19F-PD, 3 μg 19F-DT või Prevnariga (2 μg 19F-CRM) (kogukohort) Rühm 11Pn-PD&Di-001 22F-ELISA analüüs N % 0, μg/ml (9% Cl) 11Pn-PD 4 28,9 44,3) 43,8) Prevnar 18,2 30,9) GMC (μg/ml) (9%Cl) 0,09 0,11) 0,11 0,16) 0, (7,6- (9,1- (0,08-0,12) OPA analüüs Γ erinevate formulatsioonide koostis on esitatud tabelis 4. N % 1:8 (9% Cl) 2 7,7 (2,1-18,) 9 27,1 40,3) 61 3,3 (0,4-11,3) GMT (9% Cl),2 (4,0-6,8) 12,4 (16,4- (0,07-19F-DT kuju 1 29,4 2 Γ (17,- (0,08- (16,4-,3) 4,6 (3,8 -,6) Näide. Adjuvandi katsed eelkliinilistel mudelitel: pneumokoki 11-valentse polüsahhariidi konjugaatide immunogeensuse mõju eakatele reesusahvidele Konjugaadi pneumokoki vaktsiinidel esilekutsutud reaktsiooni optimeerimiseks eakamal populatsioonil moodustas GSK 11-valentse polüsahhariidi (PS) konjugaadi vaktsiini uue adjuvandiga adjuvant C vaata allpool. 1 eakama reesusahviga rühmad (14 kuni 28 aasta vanused) immuniseeriti intramuskulaarselt (IM) 0- ja 28. päeval 00 μl 11-valentsete PS konjugaatidega, mis olid 31 μg AlPO4-le adsorbeerunud, või 11-valentsete PS konjugaatidega, mis olid adjuvandiga C kokku segatud. Mõlema vaktsiini koostises koosnes iga 11-valentne PS konjugaat järgnevatest konjugaatidest: PS1-PD, PS3-PD, PS4-PD, PS-PD, PS7F-PD, PS9V-PD, PS14- PD, PS18C-PD, PS19F-PD, PS23F-DT ja PS6BDT. Kasutatud vaktsiin moodustas

72 EE EP1968631 B1 1/ doosi vaktsiini inimese doosist ( μg igat sahhariidi inimese doosi kohta, välja arvatud 6B puhul [ μg]), mis oli konjugeeritud vastavalt tabeli 6 tingimustele (näide 4), kuid 19F valmistati vastavalt järgnevatele CDAP protseduuri tingimustele: kalibreeritud sahhariid 9 mg/ml, PD μg/ml, algne PD/PS suhe 1,2/1, CDAP kontsentratsioon 0,7 mg/mg PS, pha=phc=phq 9,0/9,0/9,0 ning sidumisaeg 60 min. Anti-PS ELISA IgG tasemed ja opsono-fagotsütoosi tiitrid doseeriti seerumitesse, mis koguti 42. päeval. Anti-PS3 mälu B-raku sagedusi mõõdeti Elispoti abil perifeerse vere rakkudest, mis koguti 42. päeval. 1 Vastavalt siin allpool toodud tulemustele parandas adjuvant C eakatel ahvidel oluliselt 11-valentse PS konjugaatide immunogeensust, võrreldes AlPO4-ga konjugaatidega. Uus adjuvant täiustas IgG vastuseid PS-le (joonis Fig 1) ning opsono-fagotsütoosi tiitreid (tabal 14). Leidus ka toetavaid tõendeid, et PS3- spetsiifilise mälu B-rakkude sagedus paranes adjuvandi C kasutamisel (joonis Fig 2).

73 EE EP1968631 B1