TRANSLACIJA Doc. dr Snežana Marković Institut za biologiju i ekologiju Prirodno-matematički fakultet Univerzitet u Kragujevcu
BIOSINTEZA PROTEINA - TRANSLACIJA U toku translacije dolazi do specifičnog prepoznavanja irnk-trnk irnk-rrnk trnk-rrnk RNK-proteini Proteini-proteini
AKTIVACIJA AMINOKISELINA (AK) Aminoacil-tRNK sintetaze specifične za AK Izoakceptorske trnk 2 faze Aminoacil-tRNK sintetaza vezuje COOH grupu AK za AMP Oslobađa se AMP; aktivirana COOH grupa se vezuje za OH grupu riboze adeninskog nukleotida na 3 kraju odgovarajuće trnk nastaje aminoacil-trnk
AMP
OPŠTI PREGLED TRANSLACIJE Sinteza polipeptidnog lanca formiranje peptidne veze između COOH grupe na kraju rastućeg lanca i NH 2 grupe aktivirane aminokiseline Energetski zavisan proces (peptidil-trnk molekul nova peptidna veza)
Sparivanje kodon antikodon Ribozomi; poliribozomi P (peptidil-trnk), A (aminoacil-trnk) i E mesto (trnk koja napušta ribozom) Ribozomalni ciklus
INICIJACIJA TRANSLACIJE Proces udruživanja ribozomskih subjedinica, trnk i irnk kompleks koji otpočinje elongaciju polipeptidnog lanca sa određenog mesta na irnk (okvir čitanja) Faktori inicijacije translacije
INICIJACIJA TRANSLACIJE KOD PROKARIOTA Dve trnk za metionin (inicijatorska i elongacijska) Inicijatorska trnk za metionin NH 2 grupa Met se formiluje (N 10 -formil-tetrahidrofolat) N-formilmetionil-tRNK (fmet- trnk Met f ) fmet-trnk f Met prepoznaje start kodone (AUG, GUG) Nakon sintetisanog polipeptidnog lanca od 15-30 AK, deformilaza uklanja formil grupu startnog Met, a aminopeptidaza uklanja i Met (ne uvek)
30S INICIJACIONI KOMPLEKS: mala subjedinica ribozoma, GTP, irnk, inicijacioni faktor 2 (IF-2) i fmet-trnk f Met Binarni (IF-2 i fmet-trnk f Met ) ili ternarni kompleks (irnk, GTP, IF- 2 i fmet-trnk f Met ) Na čeonom nizu irnk sa Šajn- Dalgarnovim (ŠD) nizom (na 5 kraju), komplementaran 3 kraju 16S rrnk (invertovani ponovci) hibrid irnk-rrnk Nekompletno P mesto sa AUG (GUG) kodonom vezuje inicijatorsku trnk Više ŠD nizova na policistronskoj irnk
Sledeća faza: 30S kompleksu se pridružuje velika subjedinica (50S) ribozoma 70S Dolazi do hidrolize GTP i oslobađanje IF Inicijatorska trnk u kompletnom P mestu Prazno kompletno A mesto za vezivanje drugih trnk Prva peptidna veza između formilmetionina i sledeće AK
INICIJACIONI FAKTORI PROKARIOTA IF-1 vezuje se za malu subjed. ribozoma u budućem A mestu; pomaže delovanje IF-3 i oslobađanje IF-2 IF-2 vezuje inicijatorsku trnk za nekompletno P mesto na 30S; izaziva hidrolizu GTP IF-3 za vezivanje male subjedinice na irnk; disocijacija ribozoma na subjedinice; vezuje se za 30S i stabilizuje je (E mesto)
INICIJACIJA TRANSLACIJE KOD EUKARIOTA Start signal je AUG Metionin u inicijatorskoj trnk (Met-tRNK i Met ) nije formilovan Prvo se vezuje inicijatorska trnk za malu subjedinicu ribozoma, pa zatim irnk uz pomoć kompleksa eif4 Inicijacioni kompleks Binarni kompleks (eif-2 i GTP) Ternarni kompleks (eif-2, GTP, Met-tRNK i Met ) Mala subjedinica ribozoma (40S) sa eif-3 irnk, eif-4, uz hidrolizu ATP
Mala (40S) subjedinica se vezuje pomoću eif-4 za irnk (za 5 kapu) pomera se duž čeonog niza do prvog start kodona Prepoznavanje AUG kodona omogućeno je sparivanjem sa antikodonom inicijatorske trnk Velika subjedinica se vezuje kada se oslobode eif-2 i eif-3 uz pomoć eif-5 Stvaranje kompletnog ribozoma (80S) u blizini start kodona i inicijatorska trnk se vezuje za kompletno P mesto, uz hidrolizu GTP
INICIJACIONI FAKTORI EUKARIOTA eif-1, eif-2, eif-3, eif-4a, eif-4b učestvuju u formiranju 40S inicijacionog kompleksa eif-5 - uklanja prethodne faktore eif4c povezuje ribozomske subjedinice eif-3 stimuliše disocijaciju ribozoma eif-6 vezivanjem za 60S sprečava reasocijaciju ribozoma
ELONGACIJA TRANSLACIJE Ribozom je formiran na inicijacionom kodonu, A mesto je kompletno, a na P mestu je inicijatorska trnk sa Met, odnosno formilmet Tri faze elongacije I faza: Aminoacil-tRNK se vezuje za A mesto (P mesto zauzeto) EF-T (prokarioti) termostabilna (EF-Ts) i termolabilna komponenta (EF- Tu) Aminoacil-tRNK EF-Tu GTP vezuje se za A mesto oslobađa se EF-Tu GDP EF-Ts EF-Tu EF-Tu GTP EF-1 (eukarioti), dve subjedinice
II faza transpeptidacija Veza između COOH i trnk u P mestu se raskida, a stvara se peptidna veza sa NH 2 grupom AK vezane za trnk u A mestu Peptidil transferaza deo velike subjedinice ribozoma (nekoliko r-proteina, 5S i deo 23S rrnk; ribozim) P mesto sa deacilovanom trnk, A mesto sa rastućim polipeptidom (peptidiltrnk)
III faza translokacija Nova peptidil-trnk se pomera iz A u P mesto, a ribozom se pomera za tri nukleotida duž irnk Deacilovana trnk iz A mesta prelazi u E mesto Prva podfaza: Hibridno A/P mesto (akceptorski krak nove peptidil-trnk prelazi u P mesto, a antikodon je u A mestu) na velikoj subjedinici Hibridno P/E mesto (akceptorski kraj deacilovane trnk prelazi u E mesto, a antikodon ostaje u P mestu) na velikoj subjedinici Druga podfaza: EF-G GTP antikodonski krajevi ovih trnk se pomeraju sa irnk u odnosu na malu subjedinicu ribozoma (peptidil-trnk u P/P mestu) Oslobađanje trnk iz E mesta, vezivanje nove aminoacil-trnk za A mesto EF-G (kod prokariota) sa GTPom se vezuje za ribozom, hidrolizu GTPa vrši jedan od r-proteina EF-T i EF-G se vezuju alternativno za ribozom EF-2 kod eukariota Energetski skup proces; 1 peptidna veza = 4 fosfodiestarske veze GTP (2 veze za formiranje 2 aminoacil-trnk, 1 za vezivanje aminoacil-trnk za A mesto i 1 za translokaciju ribozoma)
TERMINACIJA TRANSLACIJE Stop kodon (UAA, UAG, UGA) se nađe u A mestu, za koje se vezuje terminacioni faktor Prokarioti: RF-1, RF-2, RF-3 RF-1 prepoznaje stop kodone UAA i UAG RF-2 prepoznaje stop kodone UAA i UGA RF-3 vezuje GTP i stimuliše aktivnost prva dva faktora Eukarioti: erf1 (analog RF1 i 2 prokariota) i erf3 (analog RF3 prokariota) Pri vezivanju terminacionih faktora stimulisana je hidrolitička aktivnost peptidil transferaze (hidroliza veze između trnk i sintetisanog polipeptidnog lanca) Hidrolizom GTP dobija se energija za oslobađanje terminacionih faktora Izbacivanje dezacilovanih trnk sa P i E mesta pomoću faktora za recikliranje ribozoma (RRF) Disocijacija irnk sa ribozoma pomoću IF3 Recikliranje ribozoma
TAČNOST TRANSLACIJE Prosečna učestalost grešaka je 10-4 po kodonu Greške usled: 1. Aktivacije aminokiselina; sprečeno korekcionim mehanizmom u vezi aminoacil-trnk sintetaze, trnk i odgovarajuće AK 2. Interakcija kodon-antikodon; Strukturne komponente ribozoma u okviru A mesta; promena geometrije A mesta omogućena S4, S5 i S12 proteinima Brzina elongacije; brzina stvaranja peptidne veze pravilno popunjavanje A mesta; S12 protein Delovanje kodona kao alosteričnog efektora; pravilno sparivanje kodon-antikodon konformaciona promena aminoacil-trnk interakcije ostalih petlji trnk sa r- proteinima
REGULACIJA BRZINE SINTEZE PROTEINA U ĆELIJI Prokarioti: ekspresija gena regulisana na nivou transkripcije Eukarioti: regulacija translacije ključan faktor eif-2 eif-2 od α, β i γ subjedinice, vezuje GTP i Met-tRNK Met i, vezivanje za P mesto Fosforilacija/defosforilacija α subjedinice posredstvom kinaza (agensi koji stimulišu rast i proliferaciju inhibiraju aktivnost kinaze i obrnuto) Nakon inicijacije translacije neophodna je regeneracija eif-2 GDP Zamenu GDP sa GTP vrši eif-2b (manje količine u odnosu na eif-2) Fosforilisan eif-2 čvršće vezuje eif-2b nedostatak slobodnog eif-2b usporavanje translacije
INHIBITORI SINTEZE PROTEINA Antibiotici, toksini se vezuju za različite proteine ribozoma Antibiotici koji inhibiraju sintezu proteina samo kod prokariota: Tetraciklin blokira vezivanje aminoacil-trnk za A mesto Streptomicin sprečava prelazak inicijacionog kompleksa u kompletan ribozom (visoke koncentracije) ili povećava greške u prevođenju genetičke šifre (niske koncentracije) Hloramfenikol inhibira peptidil transferazu Eritromicin blokira translokaciju Antibiotici koji inhibiraju sintezu proteina prokariota i eukariota: Puromicin anologon 3 kraju trnk, ugrađuje se na A mesto Cikloheksamid inhibira eukariotsku peptidil transferazu Sinteza proteina u mitohondrijama i hloroplastima je osetljiva na inhibitore koji deluju na prokariote