SADRŽAJ TRANSLACIJA... TRANSPORTNE RNK

Transcript

1 Translacija SADRŽAJ TRASLACIJA... 1 TRASPORTE RK... 2 Primarna struktura trk... 2 Sekundarna struktura trk... 3 Tercijarna struktura trk... 5 Aktivacija aminokiselina... 5 Interakcija kodon antikodon... 8 RIBOZOMI... 9 Komponente ribozoma... 9 Ribozomske RK Ribozomski proteini Funkcionalni centri ribozoma Biogeneza ribozoma MEHAIZAM TRASLACIJE Opšti pregled translacije Inicijacija translacije kod prokariota Inicijacija translacije kod eukariota Elongacija translacije Terminacija translacije SAVIJAJE PROTEIA U ATIVU KOFORMACIJU POSTTRASLACIOE MODIFIKACIJE PROTEIA REGULACIJA EKSPRESIJE GEA A IVOU TRASLACIJE Regulacija brzine translacije Kontrola degradacije irk IHIBITORI SITEZE PROTEIA TAČOST TRASLACIJE Translacija je proces u kome se genetička informacija sadržana u redosledu nukleotida u irk prevodi u linearni redosled aminokiselina u polipeptidnom lancu. Translacija ili sinteza proteina u ćeliji je kompleksan proces koji se odvija u nekoliko faza, uz učešće složenog ćelijskog aparata za translaciju čije su komponente: trk, ribozomi, irk i veliki broj enzima. Kada se uzme u obzir da su proteini realizatori genetičkih informacija od čije strukture i funkcije zavisi odvijanje svih vitalnih procesa u ćeliji, jasno je da je upoznavanje molekulske osnove njihove biosinteze jedan od najvažnijih zadataka biohemije i molekularne biologije. Kada se kaže molekulska osnova biosinteze proteina, misli se na mehanizme svih reakcija koje su u taj proces uključene, na strukturu i ulogu svih makromolekula koji u njima učestvuju, kao i na brojne interakcije makromolekula koje imaju izuzetan funkcionalni značaj. aime, u toku translacije dolazi do specifičnog prepoznavanja izmeñu irk i trk, irk i rrk, trk i rrk, RK i proteina, kao i izmeñu različitih molekula proteina. Detaljno upoznavanje molekulske osnove procesa biosinteze proteina, kao jednog od vitalnih procesa koji su konzervisani u toku evolucije, doprineće da se rasvetle mnogi biološki fenomeni, a pored ostalog i najraniji dogañaji koji su doveli do pojave života na Zemlji, kao i najranije faze 1

2 biološke evolucije. U ovom poglavlju počećemo od upoznavanja trk i ribozoma kao komponenti ćelijske translacione mašinerije, da bismo na kraju razmotrili mehanizam ovog složenog procesa. Transportne RK U toku procesa translacije nikada ne dolazi do direktne interakcije izmeñu kodona u irk i odgovarajućih aminokiselina. Prepoznavanje kodona od strane odgovarajuće aminokiseline ostvaruje se posredstvom adapterskog molekula koji se jednim krajem vezuje za kodon, a drugim za odgovarajuću aminokiselinu. Ulogu adapterskih molekula imaju transportne RK (trk). One su uključene u niz interakcija u toku procesa translacije: intereaguju sa odreñenim mestima na ribozomu, sa aminokiselinama, enzimima aminoaciltrk sintetazama, irk, kao i sa faktorima inicijacije i elongacije translacije. Sve trk odlikuju se zajedničkom, specifičnom trodimenzionalnom strukturom koja je takva da im omogućuje da ostvare sve ove funkcije. Iako su sve trk prostorno organizovane na vrlo sličan način, izmeñu pojedinih trk ipak postoje male, ali značajne razlike u strukturi koje odreñuju specifičnost pojedinih trk prema odreñenim aminokiselinama. Sve trk koje pokazuju specifičnost prema jednoj aminokiselini nazivaju se izoakceptorske trk. Vezivanje aminokiselina za odgovarajuće trk katalizuju enzimi aminoacil-trk sintetaze. Kompletan set trk u ćeliji može se podeliti u 20 izoakceptorskih grupa i za svaku od njih postoji specifična aminoacil-trk sintetaza. Primarna struktura trk Transportne RK sadrže nukleotida, a njihov sedimentacioni koeficijent iznosi 4S 1. Kada je ispitana primarna struktura većeg broja trk konstatovano je da se na nekim mestima u polinukleotidnom lancu u 90 95% slučajeva nalazi ista baza. Te pozicije su označene kao nepromenljive. añeno je, takoñe, da se na nekim položajima, koji su označeni kao polupromenljivi, uvek nalazi purinski, odnosno pirimidinski nukleotid. Transportne RK su jedinstvene meñu ostalim RK i po tome što sadrže tzv. neobične tj. modifikovane baze. One nastaju enzimskom modifikacijom uobičajenih baza (A, G, U, C) posle njihovog ugrañivanja u polinukleotidni lanac. Modifikovane baze nalaze se i u drugim RK, posebno rrk, ali se modifikacije baza u njima najčešće sastoje od metilacije. U slučaju trk postoji čitav niz različitih modifikacija, od metilacije pa do potpunog restrukturiranja purinskog prstena (slika 1). Pored modifikovanih baza, u trk se često mogu naći i metil grupe na 2 -O atomu riboza. Smatra se da ove promene u primarnoj strukturi obezbeñuju strukturnu raznolikost trk i mogu biti važne za njihove funkcije. 1 Sedimentacioni koeficijent (s) je veličina proporcionalna brzini sedimentacije molekula u gustinskom gradijentu, te se uzima kao mera za veličinu molekula. Jedinica kojom se ova veličina izražava je 1 Svedberg (S) koji iznosi sec. Radi poreñenja, sedimentacioni koeficijenti se obično preračunavaju na vrednost koja bi se dobila na temperaturi od 20 C i u rastvaraču čija gustina i viskozitet odgovaraju vodi. Tada se sedimentacioni koeficijent označava sa s 20,w. 2

3 O H O CH 3 O H O H H H H O H O H O H S riboza riboza riboza riboza Ribotimidin Dihidrouridin Pseudouridin Tiouridin H H 2 CH 3 CH 3 O O riboza 3-metilcitidin riboza 5-metilcitidin H O H CH 3 H CH 2 CH C CH 3 CH 3 riboza riboza O riboza Inozin 6-Metiladenozin 6-Izopenteniladenozin OH H COOCH 3 - O CH + 3 H O H CH 2 OH CH 3 CH CH 2 CH 2 COOCH 3 O H 2 riboza H 2 riboza riboza CH 3 7-Metilguanozin Kjuozin Viozin Slika 1. Modifikovane baze u trk Do sada je nañeno preko 50 različito modifikovanih nukleotida u raznim trk. Reakcije modifikacija baza katalizuju specifični enzimi, a dogañaju se u različitim fazama sazrevanja trk. Prisustvo nekih modifikovanih baza na odreñenim pozicijama u lancu trk je nepromenljiva karakteristika njihove primarne strukture. pr. kod svih trk se na odreñenom mestu nalazi triplet TψC (ψ = pseudouridin, pseudou), a na 3 -kraju antikodona modifikovani purin. eke modifikovane baze karakteristične su, meñutim, samo za neke trk ili pojedine izoakceptorske grupe. 3

4 Sekundarna struktura trk a osnovu redosleda nukleotida u većem broju ispitanih trk moglo se zaključiti da sve trk imaju istu sekundarnu strukturu koja se može prikazati modelom trolisne deteline (slika 2). Sekundarna struktura trk održava se H-vezama izmeñu komplementarnih baza koje pripadaju istom polinukleotidnom lancu. a osnovu primarne strukture većeg broja različitih trk, i podataka o evolutivnoj očuvanosti pojedinih pozicija, bilo je moguće pretpostaviti koji se nukleotidi u lancu trk meñusobno sparuju, pa se došlo do toga da je raspored H-veza u svim ispitanim trk takav da molekul podseća na list deteline. Četiri kratka segmenta molekula imaju oblik dvolančane A-zavojnice, tako da molekul sadrži četiri kraka, a u okviru tri od njih po jedan dvolančani segment (tzv. stablo) i jednolančanu petlju. Slika 2. Sekundarna struktura trk Akceptorski krak je jedini krak koji ne sadrži petlju. Sastoji se od 6 komplementarnih parova baza i nesparenog, jednolančanog niza od 4 nukleotida na samom 3 -kraju lanca. a ovom kraju svake trk nalazi se triplet 5 -CCA-3 za koji se vezuje aminokiselina. Triplet CCA dodaje se na 3 -kraj posle transkripcije tj. sinteze trk, delovanjem enzima nukleotidil transferaze. 4

5 T krak (ili TψC krak) sadrži spiralizovani deo od 5 bp i petlju od 7 nukleotida, meñu kojima se nalazi triplet TψC po kome je ovaj krak i dobio ime. Antikodonski krak sadrži stablo od 5 parova nukleotida i petlju od 7 nukleotida u čijoj se sredini nalazi antikodon, tj. triplet nukleotida komplementaran kodonu u irk. D krak (ili dihidrouridinski krak) sadrži dvolančani segment od 3 4 bp i petlju od 8 12 nukleotida meñu kojima se nalazi dihidrouridin po kome krak nosi ime. Dužine trk variraju od 75 do 95 nukleotida, a varijacije potiču od razlika u dužini D petlje i tzv. promenljive petlje koja se nalazi izmeñu TψC i antikodonskog kraka. Kod većine trk ove petlje sadrže samo 3 5 nukleotida, a ponekad i 20-ak. Tercijarna struktura trk Za ispitivanje tercijarne strukture trk bilo je neophodno dobiti čistu trk u kristalnom stanju i ispitati je rendgenskom kristalografijom. Prva ispitana trk bila je trk za fenilalanin (trk Phe2 ) iz kvasca. Spiralizovani delovi sekundarne strukture održavaju se i u tercijarnoj strukturi, a rasporeñeni su tako da formiraju dve zavojnice koje stoje pod pravim uglom: akceptorski i TψC kraci formiraju jednu, a antikodonski i D krak drugu. Tako, molekul trk ima prostorni oblik koji podseća na latinično slovo L, u kome pregib čine petlje TψC i D krakova (slika 3). Deo akceptorskog kraka za koji se vezuje aminokiselina i antikodon nalaze se na suprotnim krajevima molekula. Različite trk razlikuju se po veličini ugla izmeñu dva kraka slova L i po još nekim detaljima tercijarne strukture. Tercijarnu strukturu održavaju H-veze izmeñu baza koje nisu sparene u sekundarnoj strukturi i koje često formiraju nestandardne bazne parove. H-veze koje održavaju sekundarnu strukturu označene su kao sekundarne, a one koje održavaju tercijarnu strukturu, kao tercijarne H-veze. Tercijarne H-veze uglavnom se formiraju izmeñu nepromenljivih ili polupromenljivih baza, što znači da je oblik molekula zajednički za sve trk. ajveći broj tercijarnih H-veza formira se u predelu TψC i D petlji. Pretpostavlja se da je tercijarna struktura u rastvoru i u prisustvu proteina podložna promenama, i da fleksibilnost molekula trk u velikoj meri utiče na njegovu funkciju. Slika 3. Tercijarna struktura trk 2 Po konvenciji, trk specifične za pojedine aminokiseline označavaju se tako što se data aminokiselina piše u indeksu. pr. trk Phe označava trk koja specifično vezuje fenilalanin. 5

6 Aktivacija aminokiselina Transportne RK su ključni molekuli u procesu translacije. Dve važne uloge ovih molekula u translaciji su: da omoguće aktivaciju aminokiselina i da obezbede njihovo ugrañivanje u polipeptidni lanac redosledom koji je odreñen redosledom kodona u irk (slika 4). Aminokiseline se pre polimerizacije u polipeptidni lanac vezuju svojim COOH krajem za 3 -kraj trk i time se aktiviraju, tj. zadobijaju energiju koja će potom biti upotrebljena za formiranje peptidne veze. Ustvari, svaka aminokiselina donosi sa sobom aktivacionu energiju koja će se upotrebiti za vezivanje sledeće u polipeptidni lanac. Proces aktivacije je neophodan preduslov za sintezu proteina, jer se neaktivirane aminokiseline ne mogu ugraditi u polipeptidni lanac, s obzirom da je formiranje peptidne veze praćeno utroškom energije. Kao što je već rečeno, enzimi koji katalizuju aktivaciju aminokiselina su aminoacil-trk sintetaze. Svaka aminoacil-trk sintetaza prepoznaje samo jednu aminokiselinu i sve trk koje toj aminokiselini odgovaraju (izoakceptorske trk). Reakcija vezivanja aminokiseline za trk odvija se u aktivnom centru enzima, u dve faze (slika 4-1). U prvoj fazi ovog procesa enzim katalizuje vezivanje COOH grupe aminokiseline za AMP nastao pirofosfatnom hidrolizom ATP-a. U drugoj fazi, AMP se oslobaña, a COOH grupa aminokiseline se prenosi na OH grupu riboze adeninskog nukleotida na 3 -kraju trk, tako da nastaje kompleks aminoacil-trk u kome je aminokiselina vezana za 3 -kraj trk aktiviranom estarskom vezom. Slika 4. Aktivacija aminokiselina Biohemijskim i genetičkim eksperimentima nesumnjivo je dokazano da upravo trk odreñuju mesto svake pojedinačne aminokiseline u polipeptidnom lancu (slika 4-2) i da ribozomi u tom procesu slepo prihvataju svaki kompleks aminoacil-trk koji se ispravno vezuje za antikodon. U biohemijskim eksperimentima, aminokiseline su posle vezivanja za odgovarajuće trk hemijski modifikovane u druge aminokiseline. a primer, posle vezivanja za svoju trk (trk Cys ) cistein se može konvertovati u alanin. Kada je takav hibridni kompleks, u kome je alanin vezan za trk Cys, upotrebljen u in vitro sistemu za sintezu proteina, na svakom kodonu za cistein, u polipeptidni lanac se ugradio alanin. U genetičkim eksperimentima je pokazano da trk sa mutacijom u antikodonu uvek ugrañuje aminokiselinu na pogrešan kodon. Prema tome, ispravno čitanje genetičke informacije za vreme translacije (tačnost translacije) zavisi u velikoj meri od mehanizama koji obezbeñuju da se svaka aminokiselina veže za sebi odgovarajuću trk. 6

7 aravno, postavlja se pitanje na koji način enzimi prepoznaju i vezuju svaku aminokiselinu za njoj odgovarajuću trk, odnosno kakav je mehanizam ovog diskriminatornog procesa? Ovo pitanje je utoliko interesantnije, ukoliko se ima u vidu da su aminokiseline mali molekuli i da su neke od njih meñusobno veoma slične po strukturi. Pretpostavlja se da se reakcija vezivanja aminokiseline za trk odigrava sve do odreñenog koraka u kome će se ustanoviti da li je odabrana odgovarajuća aminokiselina ili nije. To su potvrdili eksperimenti u kojima je pokazano da slične aminokiseline mogu biti vezane za istu trk, ali da takvi kompleksi nisu stabilni i u narednom koraku mogu biti odbačeni. Aktivacija aminokiseline, po svemu sudeći, obuhvata vezivanje bilo koje aminokiseline za neku trk. Potom, ako je par odgovarajući, ova veza biva stabilizovana konformacionom promenom enzima koja omogućuje da se reakcija aktivacije završi veoma brzo. Ukoliko, meñutim, aminokiselina ne odgovara datoj trk, izostaje konformaciona promena enzima i reakcija se nastavlja toliko sporo, da postoji velika verovatnoća da će aminokiselina disosovati sa trk pre nego što se proces završi. Prema tome, reakcija aktivacije aminokiselina se sastoji od ciklusa vezivanja i hidroliza sve dok se ne pronañe odgovarajući par aminokiselina-trk. Slični diskriminatorni procesi se javljaju i na drugim nivoima ekspresije gena (npr. sparivanje baza u toku replikacije i transkripcije, sparivanje kodon-antikodon itd). Radi se o procesima u kojima svi članovi jedne familije imaju podjednake šanse da ostvare kontakt sa aktivnim centrom enzima, ali samo jedan od njih (npr. jedan nukleotid od četiri, jedna aminokiselina od 20, jedna trk od 40) biva odabran, dok ostali bivaju odbačeni. Postoje i dokazi, bar kada je reč o nekim aminoacil-trk sintetazama, da je u proces aktivacije aminokiselina uključen i korektivni mehanizam (eng. proofreading) sličan onome koji je zastupljen u replikaciji DK. aime, neke aminoacil-trk sintetaze pored katalitičkog centra poseduju i korekcioni centar u vidu udubljenja čije su dimenzije takve da se u njega mogu smestiti svi aminoacil-trk kompleksi manjih dimenzija od onog pravog. Smeštanje aminoacil-trk kompleksa u korekcioni centar dovodi do njegove hidrolize, tako da korekcioni centar deluje kao molekulsko sito koje isključuje ispravan par aminokiselina-trk. Dakle, proces aktivacije aminokiselina kontrolisan je u dva koraka: prvo, prilikom samog vezivanja aminokiseline za trk, a potom i korekcijama koje nastupaju posle vezivanja. U svakom od ova dva koraka tačnost procesa aktivacije aminokiselina se povećava za faktor 100, što čini da ukupna učestalost grešaka bude Pored specifičnog prepoznavanja aminokiseline od strane aminoacil-trk sintetaze, druga specifična interakcija bitna za aktivaciju aminokiselina je specifično prepoznavanje odgovarajućih izoakceptorskih trk od strane ovih enzima. Pošto je svaki od ovih enzima specifičan za jednu aminokiselinu i prepoznaje samo trk koje pripadaju istoj izoakceptorskoj grupi, to znači da se trk jedne izoakceptorske grupe odlikuju nekim specifičnim strukturnim karakteristikama. Prvobitna ideja bila je da postoje kratki nizovi nukleotida karakteristični za pojedine grupe izoakceptorskih trk. Ispitivanja primarne i sekundarne strukture izoakceptorskih trk pokazala su, meñutim, da osnova za njihovo specifično prepoznavanje od strane aminoacil-trk sintetaza ne leži samo u njihovoj primarnoj i sekundarnoj strukturi, već da je specifičnost prema aminoacil-trk sintetazi bar delimično obezbeñena varijacijama tercijarne strukture, koja je do sada ispitana na ograničenom broju trk. U interakciju sa enzimom su uključena dva regiona molekula trk, i to akceptorski krak i antikodonska petlja (slika 5). Reakcija prepoznavanja je veoma precizna i zasniva se na kontaktu malih regiona trk sa enzimom, a specifičnost 7

8 obezbeñuju razlike u nukleotidnoj sekvenci i geometriji molekula trk u tim malim regionima. Slika 5. Interakcija trk Gln sa aminoacil-trk sintetazom Interakcija kodon antikodon Interakcija kodona i antikodona koja omogućuje ugrañivanje odgovarajuće aminokiseline u polipeptidni lanac, zasniva se na sparivanju komplementarnih baza, ali pod manje strogim uslovima nego sparivanje unutar dvolančane DK ili RK koje je ograničeno samo na A=T (odnosno A=U) i G C parove. Genetički kod je degenerisan: većini aminokiselina odgovara više od 2 kodona, pri čemu se kodoni koji odreñuju jednu aminokiselinu najčešće razlikuju samo u jednom nukleotidu i to trećem po redu. Pošto za 20 aminokiselina postoji 61 kodon, moglo bi se očekivati da za svaki kodon postoji trk koja sadrži odgovarajući antikodon. Meñutim, eksperimenti sa in vitro sintezom proteina su pokazali da jedna trk može da prepozna više različitih kodona. a primer trk Phe iz kvasca koja ima antikodon G m AA (G m označava metilovani guanozin) prepoznaje kodone UUC i UUU, a trk Ala, čiji je antikodon IGC (I je inozin, tj. dezaminovani adenin), prepoznaje kodone GCU, GCC i GCA. Ovde treba imati u vidu da se antikodon i kodon sparuju antiparalelno, što znači da se prva baza antikodona (ona na 5 -kraju antikodona) sparuje sa trećom bazom kodona (onom na 3 -kraju kodona). U in vitro sistemu za sintezu proteina pokazano je da u sparivanju prve baze antikodona sa trećom bazom kodona, onom koja je najčešće izroñena, često dolazi do odstupanja od standardnog principa A=U i G C. Zato se za prvu bazu antikodona kaže da je kolebljiva. Kombinujući strukturne analize i logičko zaključivanje Francis Crick je postavio hipotezu o kolebljivosti interakcije kodon antikodon (eng. wobbling hypothesis), po kojoj sparivanje baza na prve dve kodonske pozicije uvek odgovara standardnim pravilima, dok na trećoj poziciji može doći do odstupanja. Polazeći od toga da se konformacije parova baza, zbog strukturnih ograničenja, ne mogu drastično razlikovati od Watson-Crickove geometrije i analizirajući poznate slučajeve nestandardnog sparivanja, Crick je zaključio koji nestandardni parovi se mogu naći na prvoj antikodonskoj poziciji i utvrdio pravila o sparivanju na trećoj poziciji kodona koja dozvoljavaju i sparivanje G=U pored standardnog G C. Tako, 8

9 ako se na prvoj antikodonskoj poziciji nalazi U, moguće je sparivanje sa A ili sa G na trećoj poziciji kodona; ako je prva baza antikodona G, na trećoj poziciji kodona se može naći U ili C, a ako je na prvoj poziciji antikodona I, onda se na trećoj kodonskoj može naći U, C ili A. Meñutim, ako se na prvoj poziciji antikodona nalaze C ili A, moguće je samo standardno sparivanje sa G, odnosno U na trećoj poziciji kodona (Tabela 1). Kolebanje je, po svemu sudeći, moguće zbog specifične konformacije antikodonske petlje trk koja obezbeñuje fleksibilnost u sparivanju, a ona zavisi od prisustva modifikovanih baza u neposrednoj blizini prve antikodonske baze. Tabela 1. Sparivanje nukleotida na trećoj poziciji kodona. Prvi nukleotid antikodona C A U G I Treći nukleotid kodona G U A ili G U ili C U, C ili A Zbog kolebanja prvog antikodonskog nukleotida, postoji više načina da se konstruiše set trk koji pokriva kodone za sve aminokiseline, te broj trk ne mora biti jednak ni broju aminokiselina, ni broju kodona. Kada se uzmu u obzir sve mogućnosti, minimalan set morao bi da se sastoji od 31 trk, odnosno 32 jer je za inicijaciju translacije neophodna još jedna, specifična trk. Mnoge ćelije sadrže, meñutim, mnogo više od 32 trk, meñu kojima neke sadrže iste antikodone. U različitim ćelijama, različite trk (sa različitim antikodonima) čitaju iste kodone, tj. jednom kodonu može odgovarati nekoliko različitih trk. Takoñe, trk sa istim antikodonima mogu se vezivati za različite kodone. Ovakvu fleksibilnost, čiji je biološki smisao efikasna zaštita od mutacija, omogućuju modifikacije baza u trk i konformacija antikodonske petlje, odnosno, ukupna tercijarna struktura trk. Ipak, za svaku grupu izoakceptorskih trk postoji samo po jedna specifična aminoacil trk sintetaza. Ribozomi Komponente ribozoma Ribozomi su supramolekularne strukture veliki ribonukleoproteinski kompleksi koji sadrže molekule ribozomskih RK (rrk) i veliki broj različitih molekula proteina. Ribozomi prokariotskih i eukariotskih ćelija su veoma slični po organizaciji i funkcijama koje vrše. I jedni i drugi se sastoje od dve subjedinice: male i velike. Prokariotski ribozomi su nešto manji po veličini i sadrže nešto manji broj komponenti od eukariotskih. Veoma su slični ribozomima u eukariotskim organelama mitohondrijama i hloroplastima. Glavne komponente ribozoma su rrk kojih ima četiri vrste (dve velike i dve male) i ribozomski proteini. Svi bakterijski ribozomi su meñusobno identični i imaju sedimentacioni koeficijent od 70S (slika 6). Mala subjedinica (30S) sadrži 1 molekul rrk čiji je sedimentacioni koeficijent 16S (1500 nukleotida) i 21 protein (označeni su kao S1 S21). Velika subjedinica prokariotskih ribozoma ima sedimentacioni koeficijent od 50S i sadrži: 1 molekul 23S rrk (2900 nukleotida), 1 molekul 5S RK (120 nukleotida) i 31 molekul proteina (L1 L35). Sa 9

10 izuzetkom jednog proteina koji je prisutan u četiri kopije, svi ostali su zastupljeni sa samo jednim molekulom. U obe subjedinice prokariotskih ribozoma, rrk čine najveći deo mase (60% u maloj, odnosno 70% u velikoj subjedinici). Slika 6. Komponente prokariotskih ribozoma Eukariotski ribozomi su veći (80S), sadrže veće molekule rrk i veći broj različitih proteina (slika 7). Mala subjedinica (40S) sadrži 1 molekul 18S rrk (1900 nukleotida) i 33 proteina. Oko 50% mase ove subjedinice čine proteini i isto toliko rrk. Velika subjedinica (60S) sadrži 1 molekul 28S rrk (4800 nukleotida), dve male rrk (5S i 5,8S) i 50 proteina koji su zastupljeni sa po jednim molekulom. rrk čine oko 65% mase ove subjedinice, a proteini 35%. Eukariotske ćelije sadrže ribozome i u organelama kao što su mitohondrije i hloroplasti. Ovi ribozomi se razlikuju od citoplazmatičnih i po mnogim karakteristikama su slični prokariotskim ribozomima. U eukariotskim ćelijama citoplazmatični ribozomi su često vezani za membrane endoplazmatičnog retikuluma. To su ribozomi koji su angažovani u sintezi sekretornih proteina i posebno su brojni u ćelijama sa izraženom sekretornom funkcijom. Sintezu citosolnih i većine drugih nesekretornih proteina obavljaju slobodni ribozomi (slika 8). Slika Komponente eukariotskih ribozoma Primarna struktura: Osnovu ribozomskih subjedinica čini rrk koja se proteže duž cele strukture i odreñuje položaje pojedinih proteina koji sa njom intereaguju. Po baznom sastavu rrk se razlikuju od prosečnog baznog sastava DK. Obe velike rrk imaju relativno visok sadržaj parova G C i izraženu sekundarnu strukturu. Sadržaj parova G C varira od vrste do vrste i raste sa položajem vrste na evolutivnoj lestvici, što ukazuje da je evolucija išla ka stabilizaciji sekundarne strukture. aime, dvolančani delovi RK su zaštićeni od delovanja ribonukleaza tako da RK sa izraženijom sekundarnom strukturom imaju duži metabolički vek. Slika 7. Komponente eukariotskih ribozoma Ribozomske RK Posebna karakteristika primarne strukture rrk je prisustvo modifikovanih baza. ajzastupljenije modifikovane baze su pseudouracil, 2-metilguanozin, 3-metilcitozin i 3-metiluracil. Metilacija se često vrši i na 2 -OH grupi riboze. Kod eukariotskih rrk 10

11 metilacija baza je više izražena nego kod prokariotskih. 16S rrk sadrži oko 10 metil grupa uglavnom u 3 delu molekula, a 23S rrk sadrži oko 20 metilovanih baza. Eukariotske 18S i 28S rrk sadrže čak 43, odnosno 74 metil grupe (oko 2% baza je metilovano). Metilovanjem baza se stabilizuje konformacija jednolančanih petlji. eravnomeran raspored metilovanih baza ukazuje da su pojedini delovi molekula stabilniji od drugih. añeno je, takoñe, da su metilovane baze više zastupljene u onim delovima molekula rrk koji su bolje očuvani u toku evolucije. Slika 8. Slobodni i ribozomi vezani za membrane endoplazmatičnog retikuluma Iako je primarna struktura svih rrk poznata, teško je predvideti njihovu sekundarnu strukturu zato što su molekuli rrk relativno veliki, pa postoji mnogo različitih mogućnosti za spiralizaciju unutar molekula. a osnovu proračuna stabilnosti pojedinih regiona predloženo je više modela sekundarne strukture pojedinih rrk. Meñutim, najbolji pristup za predviñanje sekundarne strukture je uporeñivanje redosleda nukleotida u rrk različitih organizama, jer oni regioni koji su bitni za sekundarnu strukturu obično su evolutivno očuvani. Iz takvih ispitivanja proizašli su najprihvatljiviji modeli sekundarne strukture 16S i 23S rrk. Molekul 16S rrk sadrži četiri glavna domena u kojima je blizu polovine nukleotida spareno. Pojedinačni dvolančani delovi su kratki (do 8 bp), a dvolančane spirale često nisu savršene, već na mnogim mestima sadrže petlje od po nekoliko nesparenih nukleotida (slika 9). Slika 9. Model sekundarne strukture 16S rrk 11

12 Ovaj model sekundarne strukture odnosi se na strukturu slobodne 16S rrk u rastvoru, ne uzimajući u obzir interakcije sa ribozomskim proteinima koje mogu da utiču na sparivanje baza u pojedinim regionima. Ispitivanja sekundarne strukture 16S rrk unutar subjedinice ribozoma su pokazala da se ovaj model može primeniti i na strukturu 16S rrk u sastavu male ribozomske subjedinice, s tim što u okviru ribozoma molekul ima nešto manje spiralizovanih regiona. Drugo važno pitanje bilo je da li je struktura 16S rrk promenljiva? Ispitivanja reaktivnosti 16S rrk u okviru slobodne subjedinice i kompletnog ribozoma, u slobodnim ribozomima i onima koji učestvuju u sintezi proteina pokazala su da se struktura rrk, a prema tome i samog ribozoma, menja prilikom vezivanja irk za malu subjedinicu, u toku asocijacije subjedinica, kao i prilikom vezivanja trk za ribozom. Još uvek se ne zna da li zapažene promene nastaju zbog direktne interakcije rrk sa irk ili trk, ili do tih interakcija dolazi indirektno, ali u svakom slučaju struktura ribozoma je fleksibilna. a slici 10 prikazan je model sekundarne strukture 23S rrk u kome se razlikuje šest strukturnih domena. Slika 10. Model sekundarne strukture 23S rrk. Polinukleotidni lanac je na nekim mestima prekinut kako bi struktura bila prikazana na pregledniji način. Velika ribozomska subjedinica i kod prokariota i kod eukariota sadrži pored velike (23S odnosno 28S) i tzv. malu, 5S rrk. Ribozomi u mitohondrijama sisara, meñutim, ne sadrže ovu RK. I prokariotska i eukariotska 5S rrk sadrže evolutivno očuvane regione, ali nemaju meñusobno homolognu primarnu strukturu. 5S rrk ima važnu strukturnu ulogu u rekonstrukciji biološki aktivne 50S subjedinice prokariotskih ribozoma. Takoñe, ona pomaže vezivanje kompleksa aminoacil-trk za ribozom i učestvuje u vezivanju trk za kodon, pri čemu se interakcija kodon antikodon stabilizuje sparivanjem nekih baza iz trk sa bazama iz 5S rrk. U velikoj subjedinici eukariotskih ribozoma prisutna je još jedna mala rrk - 5,8S rrk, koja je H-vezama vezana za 3 -kraj 28S rrk. Slična mala rrk (4,5S) nalazi se i u ribozomima hloroplasta viših biljaka. Po nekim osobinama 5,8S rrk je slična bakterijskoj 5S rrk. Uloga joj još uvek nije rasvetljena, ali izgleda da su eukariotske 5S i 5,8S rrk podelile uloge bakterijske 5S RK: eukariotska 5S rrk učestvuje u vezivanju inicijatorske trk za ribozom, dok 5,8S rrk učestvuje u vezivanju ostalih trk. Ribozomski proteini Ribozomske RK na odreñenim mestima vezuju ribozomske proteine (r-proteine). Za izolovane rrk, meñutim, čvrsto se vezuju samo neki r-proteini. Prilikom in vitro 12

13 rekonstrukcije ribozoma od njihovih komponenti, ovi proteini se prvi vezuju za rrk i zajedno sa njom grade jezgro ribozomske subjedinice, pa su označeni kao proteini jezgra ribozoma. Oni se mogu ukloniti iz ribozoma samo drastičnim tretmanom sa jonskim deterdžentima. Mesta na rrk za koja se ovi proteini vezuju mogu se odrediti tako što se odrede regioni rrk zaštićeni od digestije nukleazama. Takvi eksperimenti dali su linearne mape zaštićenih mesta na rrk na kojima se može videti da do interakcija proteina sa rrk dolazi uglavnom u dvolančanim regionima koji sadrže nesparene baze. Drugoj grupi r-proteina pripadaju slabije vezani proteini koji se ne vezuju za izolovane rrk i do njihovog vezivanja može doći samo ukoliko su proteini jezgra prethodno već vezani za rrk. To znači da je konformacija rrk, koju ona zadobija posle interakcije sa proteinima jezgra, od presudnog značaja za formiranje vezivnih mesta za slabo vezane proteine. Oni se mogu ukloniti sa ribozoma povišenom koncentracijom soli. Trećoj grupi r-proteina pripadaju tzv. uslovno ribozomski proteini. Oni su vezani za ribozome samo u odreñenim fazama biosinteze proteina, i u ovu kategoriju spadaju proteinski faktori inicijacije, elongacije i terminacije translacije. Raspored r-proteina u subjedinicama ribozoma izučavan je primenom različitih eksperimentalnih pristupa. U principu, r-proteini se nalaze na površini ribozoma i ispunjavaju udubljenja koje formiraju rrk u unutrašnjosti ribozoma. Položaj svih proteina male i većine proteina velike subjedinice ribozoma bakterije E.coli odreñen je elektronskom mikroskopijom uz primenu specifičnih antitela na pojedine proteine. Analiziranjem parova r-proteina koji nastaju kada se nativna subjedinica ribozoma tretira specifičnim, bifunkcionalnim reagensima za unakrsno vezivanje proteina dobijeni su takoñe značajni podaci o rasporedu proteina u ribozomima, jer pod odreñenim uslovima do unakrsnog vezivanja dolazi samo izmeñu onih proteina koji se nalaze u neposrednoj blizini. Primenjene su i biofizičke metode kao što je rasejanje neutrona na subjedinicama u koje su ugrañeni r-proteini obeleženi deuterijumom. Posebno korisni podaci o funkciji pojedinih r-proteina dobijeni su ispitivanjem bakterijskih i eukariotskih ćelija koje nose mutacije u genima koji ih kodiraju. Spektar različitih mutacija je veoma širok. eke su letalne, dok neke dovode do minornih defekata u translaciji. Mutacija u nekom r-proteinu mogla je biti povezana sa defektom koji se uočava, pa je, izmeñu ostalog i na taj način, do sada utvrñena funkcija svih r-proteina. Posebno značajne informacije o strukturi ribozoma dobijene su razgradnjom i rekonstrukcijom ribozoma in vitro. Kada se subjedinice bakterijskih ribozoma centrifugiraju u gradijentu gustine CsCl, jedna grupa proteina napušta subjedinice od kojih ostaju jezgra (23S od male i 42S od velike subjedinice). Pošto nastale čestice uvek imaju istu veličinu, tj. sedimentacioni koeficijent, moglo se zaključiti da se proteini odvajaju od ribozoma u grupama (paketima). Bilo je, dakle, očigledno da se radi o kooperativnom uklanjanju grupa proteina, i to onih koji su slabo vezani. Disocijacija proteina je reverzibilna, tako da se uklanjanjem CsCl i dodavanjem jona Mg 2+ mogla postići rekonstitucija subjedinica koje su bile aktivne u sintezi proteina. Eksperimenti in vitro razgradnje ribozoma pomogli su da se razvije sistem za in vitro rekonstrukciju funkcionalnih ribozoma počevši od njihovih komponenti. Rekonstrukcija ribozoma in vitro je bila je još jedan način da se ispitaju funkcije pojedinih r-proteina. Izostavljanjem pojedinih proteina iz smeše za rekonstrukciju i korišćenjem takvih ribozomskih subjedinica u in vitro sistemu za sintezu proteina, moglo se ustanoviti kakvu ulogu imaju pojedini r-proteini u procesu translacije. Tako je konstatovano da najčešće nekoliko proteina zajedno ostvaruju jednu ulogu i da je svaki pojedinačni protein obično uključen u nekoliko funkcija ribozoma. pr. jedna grupa proteina je odgovorna za 13

14 metilaciju baza u 16S rrk, druga grupa inhibira metilaciju, treća je odgovorna za tačnost prevoñenja genetičke šifre, četvrta za vezivanje trk za ribozom itd. Pri tome se neki proteini pojavljuju kao važni faktori u nekoliko grupa. Funkcionalni centri ribozoma Detaljno upoznavanje strukture ribozoma, posebno prostornog rasporeda njihovih komponenti, bilo je neophodan preduslov za utvrñivanje lokalizacije funkcionalnih centara ribozoma kao što su mesta vezivanja irk, trk, proteinskih faktora translacije, peptidil transferaze itd. Slika 11. Model strukture prokariotskog ribozoma Podaci o obliku i veličini ribozoma i pojedinačnih subjedinica dobijeni su elektronskom mikroskopijom, kao i difrakcijom X-zraka i sporih neutrona. Oblik prokariotskih i eukariotskih ribozoma je sličan. Mala subjedinica je spljoštena, izdužena i asimetrična sa izraženim udubljenjem u centralnom delu (slika 11). Velika subjedinica se sastoji od kompaktnog tela sfernog oblika sa tri jasno izražena ispupčenja. Dve subjedinice su povezane ostvarivanjem kontakta izmeñu udubljenja na maloj i centralnog produžetka na velikoj subjedinici. Eukariotske male subjedinice su veoma slične prokariotskim, dok se velike unekoliko razlikuju. Tri značajna mesta na ribozomu su ona za koja se vezuju molekuli trk. Označena su kao P mesto (od peptidil-trk mesto), A mesto (od aminoacil-trk mesto) i E mesto (od exit mesto). Sva tri mesta se nalaze na granici izmeñu dve ribozomske subjedinice i zahvataju i malu i veliku. P mesto sadrži region 16S RK odmah iza njenog 3 terminusa, kao i nekoliko proteina velike subjedinice. U njegovoj neposrednoj blizini nalazi se A mesto koje sadrži 16S RK i neke proteine velike subjedinice. Za E-mesto se vezuje deacilovana trk neposredno pre napuštanja ribozoma. U svakom trenutku u toku translacije za ribozom 14

15 su vezane najmanje dve trk, jedna za P-mesto i jedna za A-mesto. Kada je i E-mesto zauzeto, onda su za ribozom vezane čak tri trk. S obzirom da su molekuli trk relativno veliki u odnosu na ribozom, oni se smeštaju u udubljenje na površini ribozoma koje se nalazi na granici izmeñu dve subjedinice (slika 12). Veličina molekula trk je tačno tolika da može da premosti rastojanje izmeñu dva najvažnija aktivna centra ribozoma: peptidil transferaznog centra koji se nalazi na velikoj subjedinici i odgovoran je za formiranje peptidne veze i dekodirajućeg centra na maloj subjedinici u okviru koga aminoacil-trk čita genetičku informaciju tj. dešifruje kodone u irk. Slika 12. Vezivanje trk za ribozom U maloj subjedinici ribozoma postoje kanali kroz koje irk ulazi u dekodirajući centar i izlazi iz njega (slika 13). Kroz ulazni kanal, koji je veoma uzan, može da proñe samo izdužena jednolančana RK svako sparivanje baza je isključeno, što olakšava očitavanje kodona. U regionu izmeñu ova dva kanala susreću se antikodonske petlje trk koje su vezane za A i P mesto sa susednim kodonima u irk. U tom regionu irk gradi pregib na mestu tačno izmeñu dva kodona. Zbog postojanja ovog pregiba pozicija upražnjenog A mesta tj. narednog kodona se razlikuje od ostatka irk, pa se na taj način održava ispravan okvir čitanja genetičke poruke tj. smanjuje verovatnoća da se nova aminoacil-trk veže za pogrešan triplet nukleotida. U velikoj subjedinici ribozoma nalazi se kanal kroz koji prolazi rastući polipeptidni lanac (slika 13). Zbog relativno male širine ovog kanala savijanje rastućeg polipeptidnog lanca je ograničeno. Unutar kanala on može da formira samo α spiralu, dok su drugi oblici sekundarne strukture kao i bilo kakve tercijarne interakcije onemogućeni. Zbog toga, novosintetisani polipeptidni lanac može da zauzme konačnu 3D strukturu tek pošto se njegova sinteza završi i on napusti ribozom. Peptidil transferazni centar se nalazi na velikoj subjedinici ribozoma i sastoji se isključivo od velike rrk. Delovi nekih r-proteina koji se nalaze u blizini ovog centra imaju ulogu u održavanju konformacije rrk. Ribozomske RK, dakle, ne predstavljaju samo strukturne komponente ribozoma, već obavljaju i veoma važnu funkciju kao što je katalitička funkcija formiranja peptidne veze 3. Pored toga, u toku translacije 16S rrk ostvaruje i značajne interakcije sa antikodonskim petljama aminoacil-trk, kao i sa kodonima u irk, o čemu će kasnije biti više reči. 3 Molekuli RK koji poseduju katalitičku aktivnost nazivaju se ribozimi, po analogiji sa proteinskim katalizatorima koji se nazivaju enzimi. 15

16 Slika 13. Model strukture 70S ribozoma bakterije E. coli. Biogeneza ribozoma Ribozomi čine čak 40 50% ćelijske mase bakterijske ćelije. U jednoj bakterijskoj ćeliji nalazi se oko , a u eukariotskoj oko deset miliona ribozoma. jihova biosinteza mora biti strogo kontrolisana, jer je to proces koji podrazumeva koordinisanu sintezu velikog broja komponenti (r-proteina i rrk), kao i organizovanje tih komponenti u funkcionalno aktivne ribozome. Takoñe, ćelija može obezbediti adekvatne količine rrk, koje su finalni produkti gena koji ih kodiraju, zahvaljujući tome što su ovi geni prisutni i u prokariotskim i u eukariotskim ćelijama u većem broju kopija. Slika 14. Raspored gena za rrk u prokariotskom genomu U genomu bakterije E. coli nalazi se sedam zasebnih transkripcionih jedinica od kojih svaka obuhvata po jedan gen za 16S, 23S i 5S RK. Primarni transkript, prema tome, sadrži sve tri rrk, ali i oko 20% nukleotida više nego što je zbir nukleotida u njima. Povezivanjem sva tri gena za rrk u jednu transkripcionu jedinicu, obezbeñena je koordinacija sinteze različitih rrk, pa je u ćeliji uvek prisutan jednak broj molekula svake od njih za formiranje ribozoma. Sve transkripcione jedinice koje kodiraju rrk smeštene su u regionu oko mesta inicijacije replikacije, a unutar svake od njih geni su rasporeñeni na sledeći način (slika 14): posle gena koji kodira 16S rrk, nalazi se unutrašnja margina u okviru koje su smešteni geni za neke trk, zatim deo koji kodira 23S rrk i najzad deo koji kodira 5S rrk. 16

17 Primarni transkript (oko 30S) podleže obradi još u toku transkripcije. Obrada transkripta se sastoji od isecanja delova koji kodiraju tri rrk ribonukleazom III. Potom se za pojedine rrk vezuju r-proteini, a na kraju se, modifikacijom pojedinih baza, završava sazrevanje rrk. R-proteini se vezuju u paketima, slično kao pri in vitro rekonstrukciji ribozoma. Oni se sintetišu na policistronskim irk. Proteini sintetisani na istoj irk formiraju komplekse (pakete) koji se vezuju za rrk, što ubrzava formiranje ribozoma i povećava kooperativnost procesa. Količina r-proteina u ćeliji reguliše se mehanizmom povratne sprege na nivou translacije koji obezbeñuje da u ćeliji sinteza r-proteina i rrk bude koordinisana. Vezivanjem r-proteina za rrk u toku formiranja male subjedinice (30S) nastaje prekurzor sedimentacionog koeficijenta 22S, a u toku formiranja velike (50S) subjedinice nastaju prekurzori čiji sedimentacioni koeficijenti iznose 26S, 30S i 40S. Ovaj poslednji obuhvata i 5S RK. Slika 15. Raspored gena za rrk u eukariotskom genomu Kod eukariota biosinteza ribozoma se odvija u nukleolusu. Geni za rrk zastupljeni su u genomu različitih eukariota sa kopija i organizovani su na sličan način kao kod bakterija, osim što su geni za 5S rrk fizički odvojeni (ne nalaze se u nukleolusu). Ispred gena koji kodira 18S rrk nalazi se niz nukleotida koji se ne transkribuje (spoljašnja margina) i niz koji se transkribuje (unutrašnja margina), a iza njega je gen za 5,8S rrk ograničen unutrašnjim marginama sa obe strane i najzad gen koji kodira 28S rrk iza koga se nalazi još jedna unutrašnja margina (slika 15). Kao proizvod transkripcije nastaje prekurzor rrk koji sadrži oko nukleotida i ima sedimantacioni koeficijent 45S (slika 16). Pre hidrolize ovog prekurzora na pojedinačne rrk (18S, 5,8S i 28S rrk), on podleže intenzivnoj hemijskoj modifikaciji koja uključuje metilaciju 2 -OH grupa na oko 100 mesta i izomerizaciju oko 100 uridina u pseudouridin. Modifikacije, kao i hidroliza 45S prekurzora, odvijaju se na specifičnim pozicijama u polinukleotidnom lancu koje odreñuje nekoliko stotina malih nukleolarnih RK (snork od eng. small nucleolar RA,). Ove RK, koje su, inače, poznate pod imenom vodiči (eng. guide RA), hibridizuju sa ciljnim nukleotidnim sekvencama 45S prekurzora i na ta mesta dovode enzime koji modifikuju ili presecaju polinukleotidni lanac. 17

18 Slika 16. Obrada 45S prekurzora rrk u eukariotskoj ćeliji Elektronske mikrografije aktivnih nukleolusnih gena pokazuju veoma intenzivnu sintezu rrk, tj. transkripcione jedinice u obliku božićne jelke. Vrh svakog nascentnog lanca transkripta obogaćen je proteinima, što znači da pridruživanje r-proteina počinje još u toku transkripcije. Za primarni transkript, 45S prekurzor, još pre nego što napusti nukleolus, vezuju se r-proteini sintetisani u citoplazmi gradeći veliku ribonukleoproteinsku (RP) česticu sedimentacionog koeficijenta 80S. Od ovog prekurzora degradacijom endonukleazama nastaju 65S i 55S RP čestice koje, kao prekurzori ribozomskih subjedinica, sadrže 41S i 32S prekurzore rrk. Ostatak primarnog transkripta (oko 6000 nukleotida) degradira se do sitnih fragmenata. Slika 17. Biogeneza ribozoma u eukariotskoj ćeliji. 18

19 ukleolus napuštaju prekurzori rrk sedimentacionih koeficijenata od 20S i 32S. Od prekurzora 20S nastaće 18S rrk, a od prekurzora 32S nastaće 28S i 5,8S rrk (slika 17). Iskrajanje pojedinih rrk iz ovih prekurzora katalizuje endonukleaza slična bakterijskoj ribonukleazi III, koja deluje samo na prekurzore, ali ne i na zrele rrk. U jedru se završava sazrevanje rrk i pridružuje se 5S RK sintetisana izvan nukleolusa. Formiranje male subjedinice prethodi formiranju velike. Mala subjedinica koja nosi 18S rrk napušta jedro i pojavljuje se u citoplazmi oko 30 min posle početka transkripcije. Poslednji koraci u sazrevanju ribozoma obavljaju se u citoplazmi. To je mehanizam kojim se eukariotska ćelija štiti od eventualnog započinjanja translacije u jedru, gde bi zreli ribozomi mogli doći u kontakt sa još neobrañenim transkriptima. Mehanizam translacije Opšti pregled translacije U prokariotskim ćelijama translacija započinje na 5 -kraju još nezavršenog transkripta. Drugim rečima, ona se odvija istovremeno sa transkripcijom. Kod eukariota, meñutim, ovi procesi su i vremenski i prostorno odvojeni. Jedarni ovoj ima i tu ulogu da onemogući vezivanje ribozoma za transkript pre nego što se završi njegova obrada do zrele irk. Osnovna hemijska reakcija na kojoj se zasniva sinteza polipeptidnog lanca je formiranje peptidne veze izmeñu COOH grupe na kraju rastućeg polipeptidnog lanca i H 2 grupe aktivirane aminokiseline. Polipeptidni lanac se, prema tome, sintetiše u smeru od H 2 - ka COOH-kraju. Formiranje peptidne veze je energetski favorizovano, jer je tokom sinteze polipeptidnog lanca COOH-kraj rastućeg lanca aktiviran kovalentnim vezivanjem za trk, gradeći peptidil-trk molekul. U svakom ciklusu ova kovalentna veza se raskida i odmah zamenjuje istom takvom vezom koja se gradi izmeñu COOH-kraja rastućeg lanca i H 2 grupe nove aminokiseline. Tako, svaka aminokiselina donosi sa sobom aktivacionu energiju koja će se upotrebiti za vezivanje sledeće (slika 18). Slika 18. Hemizam translacije U toku translacije, redosled nukleotida u irk čita se u setovima od po tri u smeru 5 3. Mesto svake aminokiseline u polipeptidnom lancu koji se sintetiše odreñuje se na osnovu komplementarnosti kodona i antikodona uz kolebanje na trećoj kodonskoj poziciji. Translaciona mašinerija, meñutim, prevodi samo deo irk, i to deo koji počinje START 19

20 kodonom i završava se STOP kodonom. Taj kontinuirani niz nukelotida izmeñu START i STOP kodona koji predstavlja genetičku informaciju za sintezu jednog polipeptidnog lanca naziva se otvoreni okvir čitanja (eng. ORF od open reading frame). Ključne uloge u procesu translacije pripadaju molekulima RK (slika 19): irk nose genetičku informaciju o strukturi proteina koji se sintetiše, trk prevode genetičku informaciju sa jezika nukleotida na jezik aminokiselina, a rrk katalizuje formiranje peptidne veze. Slika 19. Tri uloge RK u translaciji Proces sinteze proteina odvija se u ribozomima. Ribozomi su veliki ribonukleoproteinski kompleksi u kojima kompaktni paket proteina i rrk formira nekoliko aktivnih centara sposobnih da katalizuju različite reakcije u toku sinteze polipeptidnog lanca. Ribozomi koji su u datom trenutku angažovani u sintezi proteina vezani su u nizu za irk i grade polizome (ili poliribozome). Prosečan razmak izmeñu pojedinačnih ribozoma u polizomu je 80 nukleotida ( Å). Poliribozomi se mogu lako odvojiti od ribozoma ako se ćelijski ekstrakt centrifugira kroz gradijent gustine saharoze, a izolacija neke irk iz polizoma predstavlja dokaz da se u ćeliji iz koje su polizomi izolovani ta irk prevodi u protein. Proces sinteze polipeptidnog lanca može se podeliti u tri faze. To su inicijacija, elongacija i terminacija translacije. Inicijacija translacije kod prokariota Inicijacija translacije je proces u kome se ribozomske subjedinice i trk udružuju sa irk gradeći kompleks koji može da otpočne elongaciju polipeptidnog lanca i to sa tačno odreñenog mesta na irk. U principu, jedan isti niz nukleotida u RK se može prevesti na tri različita načina od kojih će svaki dati potpuno različit polipeptidni lanac. To zavisi od toga da li prevoñenje počinje od prvog, drugog ili trećeg nukleotida u nizu. Odabiranjem tačnog mesta u polinukleotidnom lancu od koga treba da započne prevoñenje genetičke šifre odreñuje se okvir čitanja (eng. reading frame). U ćeliji, on je odreñen stvaranjem inicijacionog kompleksa za translaciju na onom mestu na irk od koga treba da započne očitavanje kodona. 20

21 Proces inicijacije translacije je veoma složen i u njemu, pored ribozoma, irk i trk, učestvuju i proteini koji su označeni kao faktori inicijacije translacije. Mehanizam ovog procesa u prokariotskim i eukariotskim ćelijama se bitno razlikuje. Slika 20. Formilacija metionina Kod bakterija postoje dve trk koje specifično vezuju metionin. Jedna od njih, inicijatorska trk, koristi se samo u inicijaciji, a druga tokom elongacije translacije. Kada se metionin veže za inicijatorsku trk, ubrzo se na njegovoj slobodnoj H 2 grupi odigra Met reakcija formilacije, tako da nastaje -formilmetionil-trk, ili skraćeno fmet-trk f (slika 20). Reakciju formilacije katalizuje enzim koji specifično prepoznaje samo inicijatorsku trk, a donor formil grupe je 10 -formil-tetrahidrofolat. Inicijatorska trk (trk Met f ) služi samo za inicijaciju, a ne i za elongaciju translacije i prepoznaje start kodone, a to su AUG i ponekad GUG. Druga trk koja vezuje metionin (trk Met m ) prepoznaje samo unutrašnje AUG kodone koji šifruju metionin, a metionin koji je za nju vezan ne može biti formilovan. Prema tome, ove dve aminoacil-trk se razlikuju i po trk i po statusu H 2 grupe metionina koji nose. Posle završetka translacije ili u toku elongacije, kada nascentni lanac dostigne dužinu od aminokiselina, na H 2 -kraju novosintetisanog polipeptidnog lanca počinje reakcija uklanjanja formil grupe metionina specifičnom deformilazom, koju u nekim slučajevima prati i reakcija uklanjanja samog metionina aminopeptidazom. Zato većina bakterijskih proteina ne sadrži formilmetionin, odnosno metionin kao prvu aminokiselinu, iako sinteza svih proteina počinje sa formilovanim metioninom. U procesu inicijacije kod bakterija učestvuju tri inicijaciona faktora. Kao i ostali proteinski faktori translacije oni spadaju u kategoriju uslovno ribozomskih proteina, jer su vezani za ribozome samo u toku odreñenih faza translacije. Ta tri faktora su IF1, IF2 i IF3 (oznaka IF je akronim od inicijacioni faktor) i svaki od njih ima ključnu ulogu u inicijaciji translacije: IF1 se vezuje za malu subjedinicu ribozoma u regionu koji će postati deo A mesta. a taj način ovaj inicijacioni faktor onemogućuje vezivanje aminoacil-trk za buduće A mesto. Pored toga ovaj faktor pomaže vezivanje IF2, tako što ga vezuje za sebe. IF2 učestvuje u vezivanju inicijatorske trk za nekompletno P mesto na 30S subjedinici. IF2 formira kompleks isključivo sa fmet-trk Met f, a ne i sa ostalim aminoacil-trk i na taj način obezbeñuje da samo inicijatorska trk može da učestvuje u inicijaciji. Pored toga, IF2 vezuje GTP i poseduje GTP-aznu aktivnost. IF3 se vezuje za malu subjedinicu ribozoma i to u regionu koji će postati deo E mesta. Dakle, u prisustvu sva tri inicijaciona faktora, samo je nekompletno P mesto slobodno da 21

22 primi fmet-trk Met f, dok su A i E mesto blokirani vezivanjem IF1, odnosno IF3. Glavna uloga IF3 je da učestvuje u disocijaciji ribozoma na subjedinice. aime, ribozomi se u toku translacije nalaze vezani za irk u 70S obliku i kao takvi se i oslobañaju sa irk prilikom terminacije translacije. U citoplazmi, kompletni ribozomi se nalaze u dinamičkoj ravnoteži sa slobodnim subjedinicama (slika 21a). IF3 se vezuje za 30S subjedinice i stabilizuje ih u slobodnom stanju, tj. sprečava njihovu reasocijaciju sa 50S subjedinicama (slika 21b). Broj slobodnih 30S subjedinica koje su neophodne za inicijaciju translacije zavisi od koncentracije IF2 u ćeliji. Prema tome, IF3 utiče na učestalost translacionih ciklusa u ćeliji. Kada se sva tri inicijaciona faktora vežu za malu subjedinicu ribozoma (slika 21c), tada postoje uslovi za formiranje 30S inicijacionog kompleksa (slika 21d), čije komponente su: Met mala (30S) subjedinica ribozoma, GTP, inicijacioni faktor 2 (IF2), fmet-trk f i irk. Inicijatorska trk i irk se pridružuju ovom kompleksu nezavisno i ne uvek istim redosledom. U svakom slučaju, 30S inicijacioni kompleks se formira na vodećem nizu irk (eng. leader sequence), gde desetak nukleotida uzvodno od start kodona sve irk prokariota sadrže tzv. Šajn-Dalgarnov niz koji je komplementaran 3 -kraju 16S rrk. a 3 - kraju 16S rrk nalazi se jedan evolutivno konzervisan invertovani ponovak koji može da nagradi intramolekulsku zavojnicu (ukosnicu). S obzirom da je Šajn-Dalgarnov niz komplementaran sa delom ove ukosnice, u toku vezivanja male subjedinice za irk dolazi do sparivanja baza izmeñu irk i 16S rrk. Pošto 3 -kraj 16S rrk ne može istovremeno da gradi ukosnicu i da vezuje irk, verovatno je da u toku inicijacije dolazi do narušavanja ukosnice i stvaranja hibrida irk-rrk koji se posle inicijacije razgrañuje rekonstituisanjem ukosnice. Kada se mala subjedinica veže za Šajn-Dalgarnov niz, najbliži AUG (ili GUG) kodon se nañe u regionu P mesta na maloj subjedinici. To je, u tom trenutku, nekompletno P mesto, a kompletno će se formirati tek po vezivanju velike subjedinice. Prema tome, kod prokariota inicijacija se odigrava na onom AUG (ili GUG) kodonu koji se nalazi pored signala za vezivanje male subjedinice. Šajn-Dalgarnovi nizovi se mogu naći na više mesta duž lanca irk, jer su bakterijske irk u većini slučajeva policistronske. Tako, iako bakterijski ribozomi prepoznaju stop kodon kao signal za završavanje polipeptidnog lanca, oni se mogu ponovo vezati za sledeći Šajn-Dalgarnov niz na istoj irk i započeti translaciju na sledećem start kodonu koji se nalazi u njegovoj neposrednoj blizini. 22

23 Slika 21. Inicijacija translacije kod prokariota. Met Vezivanje fmet-trk f za START kodon prouzrokuje konformacionu promenu male subjedinice ribozoma, usled koje dolazi do disocijacije IF3. Sada je moguće da se u sledećem koraku 30S inicijacionom kompleksu pridruži i velika (50S) subjedinica ribozoma (slika 21e), što je praćeno hidrolizom GTP-a i oslobañanjem inicijacionih faktora IF1 i IF2. Inicijacioni faktori, dakle, napuštaju ribozom na kraju faze inicijacije i neće imati nikakvog uticaja na proces elongacije polipeptidnog lanca. astali 70S inicijacioni kompleks (slika 21f) zadobija odgovarajuću konformaciju na račun slobodne energije hidrolize GTP-a, tako da može da započne sintezu polipeptidnog lanca. Vezivanjem velike subjedinice ribozoma formira se kompletno P mesto u kome je vezana fmet-trk Met f, a A mesto je slobodno i spremno da primi aminoacil-trk čiji je 23

24 antikodon komplementaran kodonu u A mestu (prvi posle start kodona). Prva peptidna veza formira se izmeñu formilmetionina na inicijatorskoj trk i aminokiseline u A mestu. Pri tome Met se fmet-trk f ponaša kao analog peptidil-trk u smislu da nudi jednu aminokiselinu umesto restućeg polipeptidnog lanca. Svaki AUG (odnosno GUG) kodon dalje u nizu poslužiće sada, kada je kompletan ribozom prisutan na irk, kao šifra za metionin (odnosno valin), jer u odsustvu inicijacionih faktora, samo elongaciona trk može da se veže za ribozom. Inicijacija translacije kod eukariota Slika 22. Inicijacija translacije kod eukariota U inicijaciji translacije u eukariotskim ćelijama učestvuje više od 30 proteinskih faktora i proces inicijacije se u nekim aspektima bitno razlikuje u odnosu na prokariote (slika 22). Pre svega, kao start signal služi samo kodon AUG. Zatim, iako postoje dve vrste kompleksa Met metionil-trk (za inicijaciju: Met-tRK i i za elongaciju: Met-tRK Met ), ti kompleksi se razlikuju samo po trk komponenti, jer metionin nikada nije formilovan. Za malu subjedinicu ribozoma uvek se prvo vezuje Met-tRK Met i, da bi se tek potom mala subjedinica vezala za irk. Posebno značajne razlike u odnosu na prokariote sastoje se u načinu vezivanja male subjedinice ribozoma za irk i u načinu pronalaženja START kodona. 24

25 Eukariotski inicijacioni faktori eif1a i eif3 (prefiks e označava da se radi o eukariotskom faktoru) vezuju se za male subjedinice ribozoma na sličan način i imaju slične uloge kao i njihovi prokariotski analozi, IF1 i IF3 (slika 22a). U prvim fazama nastajanja inicijacionog kompleksa, dva inicijaciona faktora sa GTP-aznom aktivnošću, eif2 i eif5b, imaju ulogu da regrutuju Met-tRK Met i. Pri tome, uloga faktora eif2 je da prvo veže GTP, a potom i Met-tRK Met Met i. Tako nastaje ternarni kompleks eif2*gtp*met-trk i koji će se uz pomoć faktora eif5b vezati za malu subjedinicu ribozoma. Uloga eif5b je analogna ulozi prokariotskog faktora IF2. Faktor eif5b se vezuje za malu subjedinicu posredstvom eif1a koji je vezan u oblasti nekompletnog A mesta na sličan način kao što se njegov prokariotski analog, IF1, vezuje za malu subjedinicu. Vezan za malu subjedinicu, a u kompelksu sa Met GTP-om, eif5b omogućuje vezivanje ternarnog kompleksa eif2*gtp*met-trk i za 40S Met subjedinicu i to na takav način da se Met-tRK i pozicionira u oblast budućeg P mesta. Kao rezultat ovih dogañaja nastaje 43S preinicijacioni kompleks za translaciju. Tek pošto je inicijatorska trk vezana za malu ribozomsku subjedinicu, može doći do vezivanja male subjedinice za irk. Za razliku od prokariota kod kojih, usled komplementarnog vezivanja 3 -kraja 16S RK i Šajn-Dalgarnovog niza u vodećem nizu irk, mala subjedinica biva postavljena na početni AUG kodon, kod eukariota se mala subjedinica uz pomoć proteina eif4f vezuje za sam početak irk, tj. za 5 -kapu. Faktor eif4f se sastoji od tri subjedinice (eif4e, eif4g i eif4a), od koji se jedna vezuje za 5 -kapu, a druge dve za irk (slika 22b). Ovom faktoru pridružuje se faktor eif4b koji aktivira helikaznu aktivnost jedne od subjedinica eif4f. Uloga ove helikaze je da naruši ( ispegla ) sekundarnu strukturu irk, što je neophodan preduslov za vezivanje 43S preinicijacionog kompleksa za irk, koje se odvija posredstvom interakcije izmeñu inicijacionih faktora eif4f i eif3. Mala subjedinica, zajedno sa vezanim inicijacionim faktorima i inicijatorskom trk, sada se kreće duž vodećeg niza irk sve dok ne naiñe na prvi AUG kodon (slika 23). Ovo kretanje omogućava faktor eif4f tj. njegova subjedinica sa helikaznom aktivnošću, a energija je obezbeñena hidrolizom ATP-a. Prepoznavanje startnog kodona omogućeno je njegovim komplementarnim sparivanjem sa antikodonom na Met-tRK Met i. Sparivanje kodon-antikodon prouzrokuje da inicijacioni faktori eif2 i eif3 budu osloboñeni, čime se stiču uslovi za pridruživanje velike ribozomske subjedinice. Kada se velika subjedinica veže, oslobañaju se i preostali inicijacioni faktori, a nastali 80S inicijacioni komplaks je spreman da prihvati novu aminoacil-trk na prazno A mesto, pošto se u njegovom P mestu nalazi Met-tRK Met i. Startni AUG kodon je najčešće prvi AUG kodon koji se nalazi nizvodno od 5 -kape. Jedna irk obično sadrži više AUG kodona, ali će samo onaj koji se nalazi prvi u nizu posle 5 -kape poslužiti kao početni, a svi ostali kao šifra za metionin. Takoñe, kod eukariota prvi STOP kodon označava kraj genetičke poruke i na tom kodonu translacija se završava. Zato su eukariotske irk uvek monocistronske 4. 4 I pored ovog ograničenja, funkcionalno povezani enzimi kod eukariota mogu se sintetisati sa jedne irk. U tom slučaju irk se prevodi u jedan veliki polipeptid, koji posle translacije može biti isečen specifičnim proteazama, tako da dâ nekoliko aktivnih enzima. Takav polipeptid se naziva poliprotein. Ponekad, meñutim, ovaj veliki polipeptid ostaje celovit, tako da posle savijanja u nativnu konformaciju od njega nastaje protein koji sadrži nekoliko različitih domena i obavlja nekoliko različitih funkcija. U tom slučaju govorimo o multifunkcionalnom proteinu. Kod bakterija, multifunkcionalni proteini obično se sastoje od nekoliko polipeptidnih lanaca koji su sintetisani svaki zasebno sa iste irk. 25

26 Slika 23. Pronalaženje START kodona U nekim slučajevima, ipak, eukariotska ćelija ne koristi prvi AUG kodon nizvodno od 5 kape kao startni signal za translaciju. a primer, kada se AUG kodon koji je najbliži 5 -kapi ne nalazi u odgovarajućem kontekstu 5, translaciona mašinerija može da ga preskoči. Takoñe, kod eukariota se sreću i slučajevi da se uzvodno od glavnog otvorenog okvira čitanja (ORF-a) nalazi vrlo kratak tzv. uzvodni ORF (uorf od eng. upstream open reading frame) koji kodira oligopeptid od 10-ak aminokiselina. Često se iza uorf-a nalaze nukleotidne sekvence koje omogućuju jednom delu malih subjedinica ribozoma da nastave da skeniraju irk u potrazi za startnim AUG kodonom i posle prevoñenja uorf-a. ajzad, neke eukariotske irk i mnoge virusne irk sadrže nizvodno od prvog AUG kodona tzv. IRES sekvence (od eng. internal ribosome entry sites), koje mogu da regrutuju 43 S preinicijacione komplekse i omoguće im da započnu translaciju sa nekog od unutrašnjih AUG kodona. Eukariotske irk često imaju kružni oblik (slika 24). jihova cirkularizacija je rezultat interakcije izmeñu proteina vezanog za 5 -kapu, a to je trimerni faktor eif4f, i proteina vezanih za poli A rep. Kao rezultat te interakcije, kada ribozom završi translaciju stigavši do 5 Termin kontekst koristi se da označi nukleotidnu sekvencu koja okružuje nukleotid, sekvencu, kodon ili regulatorni element o kome se govori, u ovom slučaju AUG kodon. 26

27 STOP kodona i disosuje sa irk, on se nañe u neposrednoj blizini 5 -kape, te može brzo da započne novi ciklus translacije. Slika 24. Cirkularizacija eukariotskih irk Elongacija translacije U trenutku kada je ribozom formiran na inicijacionom kodonu, A mesto je kompletno i može da primi bilo koju aminoacil-trk izuzev inicijatorske, a na P mestu se nalazi inicijatorska trk koja nosi metionin, odnosno formilmetionin. Tada počinje druga faza translacije elongacija polipeptidnog lanca. U ovoj fazi, proces translacije u prokariotskim i eukariotskim ćelijama razlikuje se samo po izvesnim detaljima i mnogo manje nego u fazi inicijacije Slika 25. Elongacija translacije Elongacija polipeptidnog lanca na ribozomu odvija se u tri koraka (slika 25): 1. Vezivanje aminoacil-trk za A mesto: Vezivanje aminoacil-trk se odvija uz pomoć elongacionog faktora EF-T kod bakterija, odnosno eef1 kod eukariota. Bakterijski 27

28 EF-T se sastoji od dve komponente, od koji je jedna termostabilna (EF-Ts), a druga termolabilna (EF-Tu). EF-Tu vezuje GTP i aminoacil-trk gradeći ternarni kompleks: aminoacil-trk*ef-tu*gtp. U ovom kompleksu EF-Tu se vezuje za 3 -kraj trk maskirajući aminokiselinu, tako da ona ne može da učestvuje u formiranju peptidne veze sve dok EF-Tu ne disosuje (slika 26). EF-Tu nikada ne vezuje inicijatorsku trk, već samo one trk koje učestvuju u elongaciji, što je važno za raspoznavanje početnog AUG kodona od onih koji šifruju metionin. Pošto se aminoacil-trk postavi u A mesto, GTP hidrolizuje i binarni kompleks EF-Tu*GDP se oslobaña, zato što je afinitet EF-Tu prema aminoacil-trk znatno manji kada je za njega vezan GDP nego kada je za njega vezan GTP. Iz istog razloga kompleks EF-Tu*GDP ne može da veže novu aminoacil-trk. GTP-azna aktivnost faktora EF-Tu je slaba i potrebno je da bude stimulisana da bi uopšte došlo do hidrolize GTP-a. Do stimulacije dolazi kada se ostvari interakcija izmeñu EF-Tu i odgovarajućeg domena velike ribozomske subjedinice, centra za vezivanje faktora, a ta interakcija je moguća samo pod uslovom da se za A mesto vezala aminoacil-trk i to ona koja ostvaruje ispravnu interakciju sa antikodonom. Ukoliko se za A mesto veže neodgovarajuća aminoacil-trk, EF-Tu ne ostvaruje vezu sa centrom za vezivanje faktora, izostaje hidroliza GTP-a i umesto da se oslobodi EF-Tu*GDP, dolazi do oslobañanja celog ternarnog kompleksa aminoacil-trk*ef-tu*gtp, a A mesto ostaje upražnjeno. Očigledno je da je GTP-azna aktivnost elongacionog faktora EF-Tu u velikoj meri odgovorna za tačnost translacije. Slika 26. Vezivanje aminoacil-trk za A mesto Kao što je rečeno kompleks EF-Tu*GDP ne može da veže novu aminoacil-trk. Da bi učestvovao u novom ciklusu elongacije potrebna je njegova regeneracija, a ona se vrši uz pomoć EF-Ts, koji istiskuje GDP formirajući originalni, kombinovani faktor EF-Ts*EF-Tu. Zatim dolazi do zamene EF-Ts GTP-om i nastaje novi aktivan kompleks EF-Tu*GTP koji 28

29 može da vezuje aminoacil-trk. Eukariotski faktor elongacije, eef1, sastoji se od dve subjedinice od kojih jedna ima ulogu kao EF-Tu, a druga kao EF-Ts. Kada se za A mesto veže ispravna aminoacil-trk i EF-Tu disosuje, tada trk rotira tako da se njen 3 -kraj sa vezanom aminokiselinom, koji je prvobitno bio udaljen od peptidil transferaznog centra, smešta u ovaj centar. Ovaj proces, tzv. akomodacija, omogućuje da se dve aminokiseline nañu u takvom meñusobnom položaju u okviru peptidil transferaznog centra da se izmeñu njih može formirati peptidna veza (slika 27). U slučaju nepotpunog sparivanja kodon-antikodon, u toku akomodacije dolazi do disocijacije aminoacil-trk iz A mesta, tako da je i ovaj proces značajan za tačnost translacije. Slika 27. Akomodacija 2. Transpeptidacija: Veza izmeñu COOH-kraja rastućeg polipeptidnog lanca i trk u P mestu se raskida, a umesto nje formira se peptidna veza sa H 2 grupom aminokiseline koja je vezana za trk u A mestu. Ovu reakciju katalizuje peptidil transferaza koja je ribozim. aime, peptidil transferazna aktivnost se pripisuje velikoj ribozomskoj RK, 23S RK. Konačan dokaz da je peptidil transferaza ribozim dobijen je kada je detaljno ispitana 3D struktura ribozoma. Tada je ustanovljeno da rastojanje izmeñu katalitičkog centra u 23S RK i njemu najbliže aminokiseline iznosi 18 Å, što isključuje mogućnost da aminokiseline učestvuju u katalitičkom procesu. U trenutku kada se završi formiranje peptidne veze, u P mestu se nalazi deacilovana trk, a u A mestu rastući polipeptid, tj. peptidil-trk (slika 25). 3. Translokacija: ova peptidil-trk se translocira iz A u P mesto, dok se ribozom pomera za tačno tri nukleotida duž irk. Ovaj korak zahteva energiju i praćen je serijom konformacionih promena ribozoma koje su omogućene hidrolizom GTP-a. U toku ovog koraka, slobodna (deacilovana) trk koja je u toku transpeptidacije nastala na P mestu vezuje se za E mesto, pri čemu prethodno deacilovana trk biva osloboñena sa ovog mesta i vraćena u citoplazmu. Kada se translokacija završi, A mesto pokriva novi triplet nukleotida i slobodno je da primi novi kompleks aminoacil-trk, čime ciklus može da otpočne ponovo (slika 25). Proces translokacije je složen i odvija se u dve faze (slika 28). U prvoj fazi, formiranje peptidne veze uzrokuje da se akceptorski krak nove peptidil-trk prebacuje iz A u P mesto na velikoj subjedinici, dok njen antikodon ostaje vezan za A mesto na maloj subjedinici (slika 28-2). Tako nastaje hibridno A/P vezivno mesto. Akceptorski kraj deacilovane trk se istovremeno premešta iz P mesta u E mesto na velikoj subjedinici, a njen antikodon ostaje vezan za P mesto na maloj subjedinici, čime se formira još jedno hibridno vezivno mesto, 29

30 P/E mesto. U drugoj fazi, vezivanje kompleksa elongacionog faktora EF-G sa GTP-om i hidroliza GTP-a, stimulisana kontaktom faktora EF-G sa centrom za vezivanje faktora, dovode do toga da se antikodonski krajevi ovih trk zajedno sa irk pomere u odnosu na malu subjedinicu tako da se peptidil-trk nañe u P mestu na obe subjednice ribozoma (P/P vezivno mesto), a deacilovana trk u E mestu na velikoj subjedinici (slika 28-3). Kada se hidroliza GTP-a završi, kompleks EF-G*GDP ima izmenjenu konformaciju i disosuje sa ribozoma. Ciklus elongacije se sada može završiti oslobañanjem trk iz E mesta i vezivanjem nove aminoacil-trk za osloboñeno A mesto (slika 28-4). Slika 28. Translokacija Kod bakterija, u translokaciju je, dakle, uključen elongacioni faktor EF-G. Ovaj faktor se vezuje za ribozom samo u prisustvu GTP-a, čija hidroliza obezbeñuje energiju za translokaciju. Interesantno je da ribozom ne može da veže istovremeno i EF-T i EF-G, zato što se oba faktora vezuju za isto mesto - centar za vezivanje faktora. Zato se elongacija odvija uz alternativno vezivanje i oslobañanje ovih faktora. EF-Tu*GDP mora biti uklonjen pre nego što se veže kompleks EF-G*GTP, a EF-G*GDP mora disosovati pre nego što se veže sledeći kompleks aminoacil-trk*ef-tu*gtp. Kod eukariota postoji faktor eef2 koji je analogan bakterijskom EF-G i funkcioniše na sličan način. Za sintezu proteina se u većini ćelija utroši više energije nego za bilo koji drugi proces. Kod bakterija u fazi brzog rasta na sintezu proteina se potroši oko 80% od ukupnog utroška energije. Sve u svemu, za formiranje jedne peptidne veze raskinu se tri energijom bogate fosfoestarske veze nukleozid trifosfata (ATP-a odn. GTP-a). Jedan molekul ATP-a utroši se za formiranje aminoacil-trk kompleksa tj. za aktivaciju aminokiseline. Ova energija će se 30

31 iskoristiti za formiranje peptidne veze u koraku transpeptidacije. Prilikom vezivanja aminoacil-trk za A mesto utroši se jedan molekul GTP-a. ajzad, treći nukleozid trifosfat, i to ponovo GTP, utroši se za translokaciju ribozoma. Terminacija translacije Kada se jedan od stop kodona (UAA, UAG ili UGA) nañe u A mestu, za njega se vezuje terminacioni faktor. Kod E. coli postoje tri terminaciona faktora: RF1, RF2 i RF3 (RF je akronim od eng. release factor). RF1 prepoznaje stop kodone UAA i UAG, RF2 prepoznaje UAA i UGA, a RF3 vezuje GTP i stimuliše disocijaciju prva dva faktora sa ribozoma posle oslobañanja polipeptidnog lanca. Kada se terminacioni faktor RF1 ili RF2 veže za A mesto, stimulisana je hidroliza veze izmeñu trk i nascentnog polipeptida. Kao rezultat toga COOH-kraj rastućeg polipeptidnog lanca oslobaña se od trk. Pošto je ovo jedina veza kojom je rastući polipeptidni lanac vezan za ribozom, on se oslobaña u citoplazmu (slika 29a). Kod eukariota postoji jedan faktor terminacije, označen kao erf1, koji je analogan prokariotskim faktorima RF1 i RF2, i jedan, označen kao erf3, koji je analog bakterijskog RF3. a b Slika 29. Terminacija translacije. Pošto se veže za ribozom i prouzrokuje oslobañanje nascentnog polipeptida, terminacioni faktor RF1 (ili RF2) treba da bude uklonjen sa ribozoma. Tu ulogu obavlja RF3. 31

32 Za razliku od većine proteina koji vezuju GTP, RF3 pokazuje veći afinitet prema GDP-u nego prema GTP-u. Zato se u slobodnom stanju u ćeliji nalazi u kompleksu sa GDP-om. Kompleks RF3-GDP vezuje se za ribozom samo ako je RF1 (ili RF2) već vezan (slika 29a). Oslobañanje polipeptida dovodi do konformacione promene RF1 (ili RF2) i ribozoma, što za posledicu ima zamenu GDP-a GTP-om. U kompleksu sa GTP-om RF3 zadobija visok afinitet prema ribozomu tj. prema centru za vezivanje faktora i potiskuje RF1 (ili RF2). Kao i u slučaju vezivanja drugih faktora, interakcija sa ovim centrom stimuliše hidrolizu GTP-a. Kada se završi hidroliza GTP-a, kompleks RF3-GDP disosuje, jer u odsustvu RF1 (ilirf-2) ima nizak afinitet prema ribozomu. Posle oslobañanja polipeptida i terminacionih faktora, ribozom je još uvek vezan za irk, a za njega su u P i E mestu vezane dve deacilovane trk. U bakterijskim ćelijama, za slobodno A mesto vezuje se faktor RRF (od eng. ribosome recycling factor), koji regrutuje EF-G (slika 29b). EF-G stimuliše oslobañanje deacilovanih trk iz P i E mesta uz hidrolizu GTP-a, a zatim i sam disosuje sa ribozoma u kompleksu sa GDP-om. U oslobañanje irk uključuje se IF-3 koji ostaje vezan za malu subjedinicu ribozoma održavajući je u slobodnom stanju. Tek sada ribozom je spreman da učestvuje u narednom ciklusu translacije i zato se proces prikazan na slici 29b naziva recikliranje ribozoma. Savijanje proteina u nativnu konformaciju Kada se završi sinteza polipeptidnog lanca, to još uvek nije kraj složenog procesa ekspresije gena. U toku, i posle translacije sledi obrada polipeptidnog lanca koja ima za cilj njegovo prevoñenje u biološki aktivan oblik. Da bi mogao da obavi svoju biološku ulogu, polipeptidni lanac nakon sinteze mora da zauzme nativnu konformaciju. Pored toga, u nekim slučajevima neophodno je da bude kovalentno modifikovan, lokalizovan u odreñeni deo ćelije do koga, naravno, mora biti transportovan, a često mora biti i udružen u kompleks sa istim ili drugačijim polipeptidima. Još u toku translacije, rastući polipeptidni lanac može da ostvari prerane interakcije sa delovima istog ili drugih polipeptida. Takvi prerani kontakti izmeñu proteina moraju u ćeliji biti sprečeni, da ne bi doveli do agregacije i pogrešnog savijanja novosintetisanog polipeptida. Iako nema nikakve sumnje da primarna struktura proteina u potpunosti odreñuje njegov finalni trodimenzionalni oblik (konformaciju), eksperimentalno je dokazano da se savijanje proteina u nativan oblik može postići, a agregacija sprečiti samo u uslovima niske temperature i koncentracije proteina. Meñutim, uslovi u ćeliji su suprotni: citosol se odlikuje visokom koncentracijom proteina, a fiziološke temperature se kreću od 25 do 37 C. Uz to, ako se novosintetisani polipeptid mora transportovati kroz ćelijske membrane kako bi dospeo do svog definitivnog odredišta u ćeliji, on mora biti odvijen, jer samo u takvom obliku može nesmetano proći kroz membranu. I u toku transporta kroz membrane postoji opasnost od neželjenih kontakata sa drugim proteinima. To znači da u ćeliji postoji potreba za mehanizmima koji bi sprečavali agregaciju i omogućavali savijanje proteina u nativnu konformaciju (eng. folding), kao i bezbedan transport proteina kroz membrane. osioci ovih mehanizama su proteini pratioci ili molekularni šaperoni (od eng. chaperones) u koje, izmeñu ostalih, spadaju i proteini toplotnog stresa (HSPs od eng. heat shock proteins). Uloge molekularnih šaperona su: (1) da omoguće savijanje nascentnih polipeptida u nativnu konformaciju, (2) da omoguće transport proteina kroz biološke membrane u odvijenom 32

33 obliku, a bez neželjenih interakcija sa drugim proteinima, (3) da omoguće udruživanje polipeptida u funkcionalno aktivne oligomerne komplekse, (4) da spreče agregaciju i pogrešno savijanje novosintetisanih polipeptida, (5) da dovedu do dezagregacije, odvijanja i ponovnog savijanja u biološki aktivan oblik onih proteina koji su već parcijalno denaturisani i/ili agregirani. Slika 30. Uloga molekularnih šaperona Teoretski polipeptidni lanac se u ćeliji može naći u tri različita stanja (slika 30): odvijenom ( O ), ispravno savijenom ( S ) i agregiranom i/ili denaturisanom ( A/D ). U ravnoteži favorizovani su oblici S i A/D zbog toga što su kompaktni. Stanje O je samo prolazno stanje u kome se polipeptid nalazi neposredno nakon sinteze ili posle aktivnog odvijanja (uz utrošak energije). Pod odreñenim uslovima, in vitro, polipeptidni lanci se spontano savijaju i prelaze iz stanja O u S. U ćeliji, meñutim, favorizovan je prelaz iz O u A/D zbog visoke temperature i koncentracije proteina. Ovakav prelaz je naročito favorizovan u uslovima stresa, pa se tada u ćeliji akumulira velika koncentracija nefunkcionalnih proteina. Uloga šaperona bila bi da omoguće savladavanje energetske barijere pri prelazu iz stanja A/D u O. Ovi proteini mogu da obave takvu ulogu zahvaljujući činjenici da poseduju enzimsku aktivnost, i to ATP-aznu i odvijajuću aktivnost (eng. unfoldase activity). Oni, prema tome, omogućuju prelaz iz stanja A/D u O na račun slobodne energije hidrolize ATP-a, a prelaz iz stanja O u S se i inače odvija spontano. Smatra se da se na taj način, aktivnim odvijanjem pogrešno savijenih polipeptida uz pomoć šaperona i njihovim ponovnim spontanim savijanjem u nativnu konformaciju, održava u ćeliji maksimalan mogući broj polipeptida u S stanju. Posttranslacione modifikacije proteina Posle translacije mnogi polipeptidi podležu i kovalentnim modifikacijama od kojih često zavisi njihova biološka aktivnost. Većina polipeptida biva podvrgnuta obradi koja podrazumeva nekoliko tipova kovalentnih modifikacija. ajzastupljeniji tip kovalentne modifikacije polipeptida u ćelijama je proteolitičko uklanjanje vodećeg metionina (odnosno formilmetionina) sa H 2 -kraja polipeptida. Česta modifikacija je i ograničena proteoliza tokom koje se inaktivni proteinski prekurzori (proproteini), uklanjanjem odreñenih oligopeptida ili polipeptida (propeptida) 33

34 prevode u aktivne proteine. Ovakvoj obradi posle translacije podležu npr. neaktivni prekurzori proteolitičkih enzima himotripsina i tripsina, himotripsinogen i tripsinogen. Mnogi transmembranski i proteini namenjeni sekreciji sintetišu se sa tzv. signalnim peptidima na H 2 -kraju (preproteini). Signalni peptidi obično sadrže hidrofobnih aminokiselinskih ostataka i omogućuju prolaz novosintetisanih proteina kroz ćelijske membrane. Posle ugrañivanja u membranu, sekrecije ili zauzimanja definitivne lokalizacije u ćeliji, signalne peptide uklanjaju specifične peptidaze. eki proteini se sintetišu u obliku poliproteina, jednog polipeptidnog lanca koji sadrži nekoliko proteina. Posle translacije, specifične proteaze hidrolizuju odgovarajuće peptidne veze oslobañajući pojedine aktivne proteine. a ovaj način se sintetiše i posttranslaciono obrañuje većina polipeptidnih hormona. Poznato je, takoñe, više od 150 različitih kovalentnih modifikacija aminokiselinskih bočnih grupa kojima podležu sve aminokiseline u sastavu proteina osim alanina, glicina, izoleucina, leucina, metionina i valina. ajčešće modifikacije su: fosforilacija, acetilacija, glikozilacija, hidroksilacija, metilacija, ADP-ribozilacija i sl. Reverzibilne modifikacije kao što je fosforilacija ili ADP-ribozilacija često imaju regulatorni značaj i predstavljaju univerzalan mehanizam putem koga ćelija brzo i efikasno odgovara na signale iz spoljne sredine, modulišući aktivnost mnogih enzima i drugih proteina (receptora, hormona i sl.). Fosforilaciju katalizuju enzimi proteinske kinaze, koje prenose terminalnu fosfatnu grupu ATP-a na serinske, treoninske ili tirozinske ostatke u proteinu i time menjaju njegovu biološku aktivnost. U nekim slučajevima fosforilacijom se stimuliše, a u nekim smanjuje katalitička aktivnost enzima, odnosno biološka aktivnost drugih proteina. Posttranslacione kovalentne modifikacije proteina uključuju i vezivanje koenzima (npr. biotina, piridoksal fosfata) za proteinske komponente enzima. Ove modifikacije su ireverzibilne. Regulacija ekspresije gena na nivou translacije Regulacija brzine translacije U prokariotskim ćelijama irk su kratkoživeće. Degradiraju se već nekoliko minuta nakon sinteze. Ekspresija gena je skoro u potpunosti regulisana na nivou transkripcije, a potrebe za regulacijom na nivou translacije su minimalne. U nekim slučajevima, meñutim, izražena je i kontrola na nivou translacije. a primer, samo postojanje Šajn-Dalgarnovog niza u okviru vodećeg niza neke bakterijske irk nije garancija da će translacija na toj irk zaista i započeti. Ovaj niz može biti sakriven i nedostupan za interakciju sa 16S rrk, a pored toga i njegova efikasnost može biti modulisana vezivanjem nekih proteina. Menjanjem dostupnosti i/ili efikasnosti ovog niza može se, prema tome, regulisati sinteza proteina, tj. ekspresija pojedinih gena i na nivou translacije. Jedan od primera kontrole ekspresije gena na nivou translacije u bakterijskim ćelijama je regulacija sinteze ribozomskih proteina (r-proteina). Geni za r-proteine rasporeñeni su u genomu bakterije u setovima koji obuhvataju više gena, a svaki set predstavlja zaseban operon, koji kodira policistronsku irk. Meñu proteinskim produktima svakog operona nalazi se po jedan protein koji je označen kao ključni r-protein. To su r-proteini koji se mogu vezati za sopstvene policistronske irk u oblasti Šajn-Dalgarnovog niza, blokirajući njihovu 34

35 translaciju i stimulišući njihovu degradaciju. Kada brzina sinteze r-proteina u bakterijskoj ćeliji prevaziñe brzinu sinteze rrk, slobodni r-proteini se akumuliraju, a oni koji su ključni vezuju se za Šajn-Dalgarnove nizove na sopstvenim irk, tako da svaki od njih inhibira sintezu svih onih r-proteina koji pripadaju njegovom operonu. Ključni r-proteini se takoñe, vezuju i za rrk i to za nizove slične onima u irk, tako da se translaciona kontrola, u stvari, zasniva na kompeticiji izmeñu rrk i irk za vezivanje ključnih r-proteina. Drugim rečima, kada u ćeliji ima dovoljno slobodnih rrk, tada je favorizovano vezivanje ključnih r-proteina za njih i formiranje ribozoma, a kada je koncentracija rrk niska, tada se ključni r-proteini vezuju za irk i zaustavljaju dalju produkciju r-proteina. a taj način, r-proteini se nikada ne sintetišu brže nego što ih ćelija može upotrebiti za biosintezu ribozoma, jer je njihova sinteza usaglašena sa sintezom rrk. Kada translacija započne, njena brzina zavisi od dostupnosti različitih aminoacil-trk komplementarnih kodonima u irk. Različite trk su, u normalnim uslovima, prisutne u bakterijskoj ćeliji u različitim koncentracijama, a koncentracija pojedinih trk obično je proporcionalna zastupljenosti odgovarajućeg kodona u irk. U eukariotskim ćelijama, kontrola brzine translacije je veoma izražena, a poluživot irk se meri satima ili danima. Ispitivanja načina regulacije brzine sinteze proteina u eukariotskim ćelijama vršena su na ćelijama gajenim u kulturi, kao i u in vitro sistemu za sintezu proteina baziranom na lizatu retikulocita, ćelija čiji je aparat za translaciju gotovo u potpunosti posvećen sintezi globina (proteinske komponente hemoglobina). Ova ispitivanja su dovela do zaključka da je eif2 ključni faktor regulacije brzine sinteze proteina u eukariotskim ćelijama. Eukariotski IF2 je oligomerni protein sastavljen od tri subjedinice (α, β i γ), koji vezuje GTP, a zatim i Met-tRK i Met, omogućujući njeno vezivanje za A mesto na ribozomu. Funkcija ovog proteina regulisana je fosforilacijom njegove najmanje (α) subjedinice. U retikulocitnom lizatu, fosforilacija α subjedinice eif2 je stimulisana odsustvom hema, a u drugim eukariotskim ćelijama ona može biti stimulisana energetskim ograničenjima (npr. nedostatkom glukoze, aminokiselina i sl.), virusnom infekcijom, delovanjem teških metala i mnogih agenasa koji inhibiraju rast i proliferaciju ćelija. asuprot tome, agensi koji stimulišu rast i proliferaciju ćelija uzrokuju smanjenje fosforilacije ove subjedinice. Mehanizam regulacije brzine translacije koji je zasnovan na fosforilaciji/defosforilaciji α subjedinice eif2 i verovatno univerzalan za sve eukariotske ćelije, sastoji se u sledećem: Posle inicijacije translacije koja je praćena hidrolizom GTP-a vezanog za eif2, neophodno je da se binarni kompleks eif2-gtp regeneriše za novi ciklus zamenom GDP-a sa GTP-om. Ovu zamenu obavlja inicijacioni faktor eif2b koji je u ćeliji prisutan u znatno nižoj koncentraciji nego eif2. Kada je α subjedinica eif2 fosforilisana, tada ovaj faktor čvršće vezuje eif2b, što ubrzo dovodi do nedostatka slobodnog eif2b, i nemogućnosti regeneracije binarnog kompleksa eif2-gtp neophodnog za inicijaciju, a time i do usporavanja translacije. Fosforilaciju α subjedinice eif2 katalizuje specifična kinaza, a delovanje mnogih faktora koji utiču na rast i proliferaciju ćelija može se objasniti upravo stimulacijom ili inhibicijom ovog enzima. aime, agensi koji stimulišu rast i ćelijsku deobu uzrokuju smanjenje aktivnosti i/ili koncentracije ove kinaze, a time dovode i do ubrzanja sinteze proteina koji su ćeliji neophodni za rast i deobu. Suprotno tome, agensi koji na rast i proliferaciju ćelija deluju inhibitorno ostvaruju ove efekte povećanjem aktivnosti i/ili koncentracije ovog enzima. a sličan način, moduliranjem aktivnosti kinaze odgovorne za fosforilaciju α subjedinice eif2, usaglašava se brzina translacije i sa energetskim stanjem u ćeliji. Regulacija inicijacije translacije posredstvom 35

36 eif2 nije jedini, ali je u većini eukariotskih ćelija verovatno najznačajniji mehanizam kojim se reguliše brzina sinteze proteina. Kontrola degradacije irk Brzine degradacije različitih irk u eukariotskim ćelijama se veoma mnogo razlikuju. eke od njih opstaju satima ili danima, dok se druge degradiraju već pola sata pošto su dospele u citoplazmu. U principu, zapaženo je da na stabilnost irk utiče poli(a) rep na 3 -kraju, koji sadrže skoro sve eukariotske irk. Histonske irk koje ga ne sadrže imaju kraći životni vek od većine drugih irk. Pored ove, postoji još jedna strukturna karakteristika irk koja utiče na njihovu stabilnost, a to je karakterističan niz nukleotida u 3 nekodirajućem delu irk u kome se često nalazi dublet AU. Sve irk koje sadrže ovakav niz, podležu ubrzanoj degradaciji. Pretpostavlja se da ovakve strukturne odlike mogu predstavljati signale za selekciju irk za degradaciju. Meñutim, s obzirom da još uvek nisu identifikovane nukleaze koje katalizuju degradaciju različitih irk, mehanizmi koji su odgovorni za ovu selekciju nisu razjašnjeni. U nekim slučajevima, degradacija irk je kontrolisana hormonima, tako da u zavisnoti od hormonskog statusa životinje, jedna ista irk može imati različit poluživot. pr. poluživot irk za vitelogenin u oviduktu pileta se menja pod delovanjem estrogena: u prisustvu ovog hormona on iznosi 480, a u odsustvu samo 16 sati. Inhibitori sinteze proteina Mnogi antibiotici, toksini i druge supstance deluju inhibitorno na sintezu proteina. Različiti antibiotici se vezuju za različite proteine ribozoma, pa shodno tome inhibiraju različite faze sinteze proteina. eki od njih pokazuju selektivnost u odnosu na strukturne i funkcionalne razlike prokariotskih i eukariotskih ribozoma, pa se zahvaljujući tome mogu primenjivati u medicini u relativno visokim koncentracijama, bez opasnosti od toksičnih efekata. Meñu antibiotike koji deluju samo na prokariotske ribozome spadaju: tetraciklin koji blokira vezivanje aminoacil-trk za A mesto na ribozomu, streptomicin koji u visokim koncentracijama sprečava prelaz iz inicijacionog kompeleksa u kompletan ribozom, a u niskim povećava učestalost grešenja u prevoñenju genetičke šifre, hloramfenikol koji reverzibilno inhibira peptidil transferazu i eritromicin koji blokira translokaciju. eki antibiotici, npr. puromicin, deluju inhibitorno na sintezu proteina i kod prokariota i kod eukariota. Puromicin je analogon 3 -kraja trk tako da ga ribozom ne razlikuje od trk i ugrañuje ga u A mesto, što uzrokuje prerano oslobañanje nascentnog polipeptidnog lanca (peptidilpuromicina). eke supstance, kao npr. cikloheksimid koji reverzibilno inhibira peptidil transferazu, deluju samo na eukariotske, a ne i na prokariotske ribozome. Ribozomi mitohondrija i hloroplasta su u pogledu osetljivosti na inhibitore sinteze proteina veoma slični prokariotskim ribozomima. Tako u eukariotskim ćelijama hloramfenikol blokira sintezu proteina samo u mitohondrijama ili hloroplastima, dok cikloheksimid inhibira samo citoplazmatičnu sintezu proteina. a osnovu efekata ova dva jedinjenja može se, prema tome, zaključiti da li se odreñeni protein sintetiše u citoplazmi ili u organelama. Primena različitih inhibitora sinteze proteina u istraživanjima je u velikoj meri doprinela upoznavanju mehanizama translacije i u prokariotskim i u eukariotskim ćelijama. 36

37 Tačnost translacije Translacija se odvija veoma precizno. Prosečna učestalost grešaka iznosi do 10-4 po kodonu, što znači da se pogrešno ugrañuje samo jedna od aminokiselina. Dva glavna izvora grešaka u translaciji su aktivacija aminokiselina i interakcija kodon antikodon. Pored toga na tačnost prevoñenja genetičke šifre utiču i drugi faktori kao što su struktura ribozoma, tj. pojedinih ribozomskih komponenti, faktori koji menjaju afinitet trk prema ribozomu, brzina elongacije itd. Kao što je već rečeno (odeljak Aktivacija aminokiselina), proces aktivacije aminokiselina kontrolisan je u dva koraka: prvo, prilikom samog vezivanja aminokiseline za trk, a potom i korekcijama koje nastupaju posle vezivanja. Aktivacija po svemu sudeći obuhvata vezivanje bilo koje aminokiseline za bilo koju trk, a potom, ako je trk odgovarajuća, veza se stabilizuje konformacionom promenom enzima koja omogućuje da se reakcija završi veoma brzo. Ukoliko, meñutim, aminokiselina ne odgovara datoj trk, izostaje konformaciona promena enzima i aktivacija se nastavlja tako sporo da postoji velika verovatnoća da će aminokiselina disosovati sa enzima pre nego što se proces završi. Uz to, neke aminoacil-trk sintetaze pored katalitičkog centra poseduju i korekcioni centar koji funkcioniše kao molekulsko sito koje isključuje ispravan par aminokiselina-trk. Greške koje nastaju zbog nepravilnog sparivanja kodona i antikodona javljaju se takoñe retko (jednom u 10 4 slučajeva). Ovaj podatak je, meñutim, iznenañujući, jer specifičnost interakcije kodon antikodon je, zbog kolebanja na trećoj kodonskoj poziciji, suviše mala da bi obezbedila tako nisku učestalost grešaka. Kada se trk i irk nalaze u rastvoru, antikodoni se vezuju za kodone sa relativno niskim afinitetom, a veza izmeñu tripleta koji su potpuno komplementarni je samo deset puta stabilnija od veze izmeñu tripleta kod kojih su komplementarne samo dve baze. Ovakvi nalazi su sugerisali da je u ćeliji za proveravanje sparivanja kodon antikodon odgovoran ribozom koji na neki način može da napravi razliku izmeñu ispravnog i neispravnog para kodon antikodon. I zaista, ribozom koristi više različitih mehanizama kojima se selektiraju one aminoacil-trk koje se svojim antikodonima ispravno sparuju sa sva tri kodononska nukleotida, a odbacuju one druge. Jedan od mehanizama koji doprinosi tačnosti prepoznavanja kodona zasniva se na postojanju dva susedna adeninska ostatka u 16S rrk. Ovi nukleotidi uspostavljaju interakciju sa baznim parovima koje formiraju prve dve kodonske baze sa odgovarajućim bazama antikodona i to u malom žljebu. S obzirom da su u malom žljebu razlike izmeñu baznih parova G C i A=U relativno male, adeninski ostaci ih prepoznaju kao ispravne tj. uspostavljaju sa njima interakcije (slika 31). asuprot tome, nestandardni bazni parovi u interakciji kodon-antikodon se ne prepoznaju kao ispravni, interakcije adeninskih ostataka sa njima izostaju, i kao rezultat toga, veza trk sa ribozomom ostaje slaba, a verovatnoća da trk disosuje se značajno povećava. Drugi mehanizam kojim se proverava interakcija kodon-antikodon zasniva se na GTP-aznoj aktivnosti elongacionog faktora EF-Tu. Dovoljno je da samo jedan nukleotid kodona ne bude ispravno sparen sa antikodonom, pa da to dovede do drastične redukcije GTP-azne aktivnosti ovog faktora. Suprotno tome, ispravno sparivanje kodon-antikodon na sve tri pozicije snažno stimuliše hidrolizu GTP-a, što ima za posledicu značajno povećanje verovatnoće formiranja peptidne veze (videti odeljak Elongacija translacije). 37

38 Treći mehanizam koji obezbeñuje tačno sparivanje kodon-antikodon povezan je sa procesom akomodacije. Smatra se da rotacija trk u A mestu povećava napetost u interakciji kodon-antikodon, tako da samo tripleti ispravno spareni na sve tri pozicije uspevaju da je prežive. Pogrešne aminoaci-trk, stoga, napuštaju A mesto još tokom akomodacije, odnosno pre nego što doñe do formiranja peptidne veze. Slika 31. Mehanizam za proveru ispravnocti interakcije kodon-antikodon Još jedan mehanizam koji učestvuje u kontroli vernosti translacije zasniva se na delovanju kodona kao alosteričnog efektora. Prilikom ostvarivanja interakcije kodona i odgovarajućeg antikodona dolazi do promene konformacije u antikodonskoj petlji koja se zatim prenosi i na druge delove molekula trk. Zbog alosteričnih promena u drugim delovima trk, neka mesta na trk bivaju demaskirana, tako da mogu da ostvare interakcije sa homolognim nizovima nukleotida u rrk (npr. TψC triplet se komplementarno vezuje za CGA sekvencu u 5S rrk). Moguće interakcije drugih delova trk sa komponentama ribozoma, pored interakcije kodon antikodon, mogu višestruko uvećati specifičnost selekcije odgovarajuće aminoacil-trk i stabilnost njene veze sa ribozomom. 38