EDITOVANJE RNK DEZAMINACIJOM ADENOZINA U INOZIN

Transcript

1 EDITOVANJE RNK DEZAMINACIJOM ADENOZINA U INOZIN 1. UKRATKO O RAZLIČITIM TIPOVIMA EDITOVANJA RNK Editovanje RNK je ko-transkripcioni proces kojim se genomski kodirana infromaciju menja na nivou RNK. Značajno doprinosi plastičnošću genoma kroz stvaranje većeg broja izoformi RNK i proteina od jednog gena. Editovanje prekursora irnk, rrnk, trnk i malih regulatornih RNK opisano je kod velikog broja organizama, počev od bakterija do čoveka. Prvi primer editovanja RNK opisan je godine, kada je otkriveno da kod irnk preipisane sa mitohondrijskog gena coxii tripanozome dolazi do post-transkripcione insercije uridina (U) voďene vodičem RNK (eng. guide RNA, grna). Nakon toga, otkriveni su drugi tipovi editovanja RNK, i postalo je jasno da je reč o fenomenu koji je široko rasprostranjen u sva tri domena živih origanizama. U transkriptima mitohondrijskih i hloroplastnih gena kod biljaka, široko je zastupljena konverzija citidina (C) u U (editovanje C-u-U), a manje je česta konverzija U u C (editovanje U-u-C). Editovanje C-u-U dešava se i u rrnk male subjedinice mitohondrijskih ribozoma Dictyostelium discoideum. Kod ameboidne praživotinje Physarum polycephalum opisani su različiti tipovi editovanja mitohondrijskih irnk i rrnk: insercija većeg broja C, insercija dinukleotida CU, GU, UA, AA, UU i GC, kao i delecija AAA. Insercija većeg broja guanozina (G) opisana je u irnk prepisanoj sa negativnog lanca RNK virusa. Transportne RNK podležu različitim tipovima editovanja. Kod ameboidne praživotinje Acanthamoeba castellanii opisano je editovanje 5'-kraja mitohondrijskih trnk. Editovanje adenozina (A) u inozin (I) (editovanje A-u-I) u trnk, katalizovano familijom adenozin dezaminazama koje deluju na trnk (eng. adenosine deaminases acting on trna, ADATs), opisano je kod eukariota, ali i kod bakterije Escherichia coli. ADAT1 edituje A 37 (u blizini antikodona) u trnk Ala, dok heterodimeri ADAT2-ADAT3 edituju A 34 na kolebljivoj (eng. wobble) poziciji antikodona u odreďenoj grupi molekula trnk. Kod sisara su opisane dve vrste editovanja RNK dezaminacijom nukleotida. Prvi opisani tip bila je dezaminacija C u U, katalizovana APOBEC1 citidin dezaminazom, na primeru irnk prepisane sa gena za apolipoprotein E (APOE). Editovanje C-u-U u APOE irnk je tkivno specifično i dovodi do promene kodona za glutamin u stop kodon, omogućavajući sintezu izoformi apolipoproteina B sa različitim funkcijama u metabolizmu lipida. U ćelijama creva, nakon editovanja, sintetiše se kraća izoforma (APOB48), koja učestvuje u transportu lipida unetih hranom do različitih tkiva. U ćelijama jetre ne dolazi do editovanja i sintetiše se izoforma pune dužine (APOB100), koja učestvuje u transportu endogeno sintetisanih triglicerida i holesterola. Drugi tip editovanja RNK u ćelijama sisara je editovanje A-u-I u dvolančanim strukturama RNK, katalizovano familijom adenozin dezaminaza koje deluju na RNK (eng. adenosine deaminases acting on RNA, ADARs) (slike 1 i 2). Iako se originalno verovalo da je editovanje A-u-I redak dogaďaj, 1

2 analize na nivou celog transkriptoma pokazale su da je ovaj proces široko rasprostranjen i veoma korišćen kod sisara. Prisustvo I umesto A u kodirajućim ili nekodirajućim regionima pre-irnk/irnk utiče na njihovu strukturu, stabilnost, lokalizaciju, translaciju i splajsovanje, čime značajno doprinosi diverzifikaciji transkriptoma i proteoma. Editovanju A-u-I podležu i prekursori malih regulatornih RNK, čime se može promeniti njihova obrada ili interakcija zrelih malih regulatornih RNK sa ciljnim molekulima (na primer, interakcija mirnk sa ciljnom irnk). 1. EDITOVANJA ADENOZINA U INOZIN 1.1. Adenozin dezaminaze koje deluju na RNK (proteini ADAR) Editovanje A-u-I podrazumeva hidrolitičku dezaminaciju A u I u dvolančanim strukturama RNK, katalizovanu enzimima familije ADAR (slika 1). Inozin se u pogledu saprivanja baza ponaša kao G (slika 1). Enzimi ADAR su originalno identifikovani u jajnim ćelijama i embrionima Xenopus laevis, kada su opisani kao proteini koji odmotavaju dvolančane RNK. Prvi otkriveni gen sisara je bio ADAR (ranije označavan kao ADAR1) u genomu čoveka, u kome su zatim identifikovana jod dva gena, ADARB1 i ADARB2 (ranije označavana kao ADAR2 i ADAR3, redom). Ortolozi ADAR gena su evoluciono očuvani kod kičmenjaka, a samo nekoliko je identifikovano kod beskičmenjaka. Drosophila melanogaster ima jedan gen označen kao dadar, koji je sličan sa ADARB1, dok Cenorabditis elegans ima dva gena, c.e.adar-1 i c.e.adar-2. U genomima biljaka i gljiva nisu identifikovani ADAR geni. Smatra se da su ADAR geni tokom evolucije nastali od ADAT gena. Slika 1. Dezaminacija adenozina u inozin. a) Adenozin se hidrolitičkom dezaminacijom prevodi u inozin. b) Adenozin se bazno sparuje sa uridinom; c) Inozin se bazno sparuje sa citidinom. Enzimi familije ADAR odlikuju se zajedničkim funkcionalnim domenima (slika 2). Poseduju dva do tri vezivna domena za dvolančanu RNK (eng. dsrna-binding domain, dsrbd), dužine oko 65 aminokiselina, pomoću kojih ostvaruju direktne kontakte i vezuju se za dvolančanu RNK. Na C-kraju sadrže katalitički dezaminazni domen. Pretpostavlja se da se ciljni A iz unutrašnjosti dvolančane RNK 2

3 okreće (eng. base flipping) i smešta aktivni centar enzima. Protein ADAR na N-kraju sadrži dva Z-DNK-vezivna domena, označena kao Zα and Zβ, od kojih samo Zα ima vezivni kapacitet. Njihove funkcije nisu sasvim jasne. S obzirom da se struktura Z-DNK stabilizuje prolaznom negativnom superspiralizacijom uzvodno od aktivne RNK polimeraze, smatra se da bi Zα domen mogao da vezuje ADAR na mesto gde se odigrava transkripcija, što bi proteinu ADAR omogućilo da obavi editovanje pre splajsovanja. Zα domen se vezuje i za dvolančane RNK koje imaju Z strukturu i podležu editovanju A-u-I. Takve su virusne RNK tokom tranksripcije, što bi proteinu ADAR moglo omogućiti da ih efikasno modifikuje. TakoĎe, smatra se da Zα domen specifično povećava afinitet ADAR za kratke dvolančane RNK, kao što su male interferirajuće RNK (sirnk). ADARB2 na N-kraju poseduje domen bogat argininom (R), koji vezuje jednolančanu RNK, ali njegova funkcija u ovom proteinu još nije poznata. Manje zastupljena izoforma ADARB1, takoďe, sadrži R domen. Slika 2. Familija proteina ADAR. a) Članovi familije proteina ADAR kod čoveka (ADAR, ADARB1 i ADARB2, sa označenom dužinom proteina i pozicijom njihovih gena na hromozomima), Drosophile melanogaster (dadar) i Cenorabditis elegans (c.e.ada1 i c.e.ada2). Svi proteini ADAR poseduju RNK-vezivne domene za dvolančanu RNK (dsrbd) i katalitički dezaminazni domen. Protein ADAR čoveka poseduje Z-DNK vezivne domene (Zα i Zβ), dok ADARB2 sardži vezivni domen za jednolančanu RNK bogat argininom (R). b) Alternativna obrada i izoforme ADAR: ADARp150 se eksprimira sa interferon/dvolančana RNK inducibilnog promotora, a egzon E1A, koji sadrži start kodon, splajsuje se sa egzonom E2. ADARp110 se eksprimira sa jednog od dva konstitutivna promotora, a egzon E1B ili E1C slajsuju se sa egzonom E2 koji sadrži start kodon. c) Proteini ADAR pomoću dsrbd prepoznaju svoje supstrate, dvolančane regione RNK, u okviru kojih katalitičkim domenom vrše dezaminaciju jednog ili većeg broja A. Geni ADAR i ADARB1 se eksprimiraju u mnogim tkivima, najviše u nervnom, dok se ADARB2 eksprimira samo u mozgu. Kao rezultat alternativnog korišćenja promotora i egzona gen ADAR kodira dve proteinske izoforme: izoformu pune dužine (ADARp150 ili ADARL) i kraću izoformu okrnjenu na N-kraju (ADARp110 ili ADARS) (slika 2). ADARp150 se transkribuje sa promotora inudukovanog interferonom ili dvolančanom RNK, i pojačano se eksprimira nakon ćelijskog stresa ili virusne infekcije. 3

4 Druge dve ADAR irnk prepisuju se sa dva konstitutivna promotora i alternativno se splajsuju preskakanjem egzona sa start kodonom. Njihova translacija se inicira sa nizvodnog kodona za Met, usled čega se sintetiše kraća izoforma ADARp110. ADARp150 kruži izmeďu nukleusa i citoplazme i uglavnom lokalizuje u citoplazmi, što je verovatno uslovljeno lokalizacijom njegovih ciljnih molekula (na primer, virusnih RNK ili prekursora sirnk). ADARp110 i ADARB1 lokalizuju u nukleusu. Akumuliraju u neukleolusu, verovatno, kroz interakciju dsrbd sa dvolančanim regionima rrnk ili snornk. Imajući u vidu da nukleolus obavlja funkciju mesta za čuvanje nekih proteina u cilju inhibicije njihove aktivnosti, pretpostavlja se da bi ADARp110 i ADARB1 mogli da se čuvaju u nukleolusu, odakle bi se "pomerali" u nukleoplazmu kada se pojave dvolančani RNK supstrati. ADAR i ADARB1 su funkcionalno aktivni kao homodimeri, koji se formiraju nezavisno od prisustva dvolančane RNK. Prilikom prepoznavanja supstrata, dsrbd u homodimerima funkcionišu kooperativno. ADARB2 ne formira homodimere. Skoro sve reakcije editovanja A-u-I pripisuju se aktivnostima enzima ADAR i ADARB1. Iako su funkcionalne osobine dezaminaznog domena očuvane kod ADARB2, smatra se da je odsustvo njegove katalitičke aktivnosti upravo vezano za nemogućnost homodimerizacije. Funkcija ADARB2 je još nepoznata. Smatra se da bi mogao delovati kao repesor aktivnosti ADAR i ADARB1 vezujući se za njihove potencijalne supstrate bez mogućnosti da ih edituje, ili da bi mogao formirati nefunkcionalne heterodimere sa ADAR i ADARB1. Fenotipske promene opisane kod različitih model organizama sa mutacijama u genima za ADARs, ukazuju da njihova inaktivacija ima značajne fiziološke posledice. D. melanogaster sa homozigotnom delecijom dadar ispoljava promene vezane za centralni nervni sistem, kao što su gubitak koordinacije kretanja i neurodegeneracija zavisna od starosti. Sojevi C. elegans sa homozigotnom delecijom oba gena za ADARs, c.e.adar-1 i c.e.adar-2, imaju poremećaj hemotaksije. Knockout miš za Adar2 umire nekoliko nedelja nakon roďenja. Karakterišu ga epileptički napadi, vezani za povećan influks jona Ca 2+ uzrokovanog needitovanim mestom Q/R u irnk za GluR-B, usled čega dolazi do umiranja neurona. Inaktivacija Adar1 kod miša je letalna tokom embrionalnog razvića, usled poremećene eritropoeze i sveprisutne apoptoze Specifičnost enzima ADAR za supstrat Supstrati proteina ADAR su dvolančane strukture RNK sa kojima stupaju u interkaciju pomoću dsrbd. U strukturni dvolančane RNK funkcionalne grupe koje nose informaciju o specifičnosti sekvence smeštene se duboko u unutrašnjosti molekula, tako da proteini ADAR ne prepoznaju specifičnu sekvencu dsrnk, već specifičnu strukturu dvolančane RNK. Supstrati za proteine ADAR su intramolekulske i, reďe, intermolekulske dvolanačne RNK duže od 20 bp, što odgovra dvolančanoj zavojnici RNK sa dva okreta (slika 2). Efikasnost i determinante specifičnosti proteina ADAR razlikuju se u zavisnosti od dužine i sekundarne strukture RNK. Visoka efikasnost (i neselektivno) editovanje velikog broja A dešava se u perfektno ili skoro perfektno komplementarnim dvolančanim RNK dužim od 100 bp, a njihova sekundarna struktura i stabilnost diktiraju selekciju mesta editovanja (slike 3b i 7). Sam proces editovanja dovodi do destabilizacije (odmotavanja) RNK supstrata, usled nemogućnosti sparivanja I sa U, i verovatno se odvija do trenutka kada enzim više ne prepoznaje supstrat kao dvolančanu RNK. Suprotno, u kraćim dvolančanim 4

5 strukturama RNK dužine 30 do 70 bp ili u dužim, parcijalno komplementarnim dvolančanim RNK sa pogrešno sparenim bazama, jednolančanim izbočinama i petljama specifično se edituje samo jedan ili nekoliko A. Dezaminacija jednog ili nekoliko A u takvim supstratima menja njegovu strukturu i smanjuje stabilnost ispod praga koji prepoznaju proteini ADAR. Editovanje specifičnog A u dvolančanim strukturama RNK odreďeno je strukturom, ali i sekvnecom RNK koja okružuje mesto editovanja i koje prepoznaju dsrbd. TakoĎe, sam dezaminazni domen pokazuje preferenciju za editovanje u odreďenom kontekstu sekvence. Neka mesta editovanja u dvolančanim strukturama RNK mogu biti supstrat za ADAR ili ADARB1, dok su neka preferencijalni supstrat za ADAR ili ADARB1. Ovo ukazuje da se specifičnost za supstrat može razlikovati izmeďu funkcionalnih formi ADAR, verovatno usled različitog broja i meďusobne udaljenosti dsrbd, koji omogućavaju razlikovanje RNK različite strukture i stabilnosti. Efekati dezaminacije A-u-I na nivou molekula RNK su: 1) promena informacionog potencijala RNK, vezana za činjenicu da se I preferencijalno sparuje sa C, tako da ga mašinerije za translaciju i splajsovanje interpretitraju kao G; 2) promena trodimenzionalne strukture i stabilnosti RNK stvaranjem ili uklanjanjem jednolančanih izbočina, što se odražava na njenu interakciju sa raznim RNK-vezivnim proteinima uključenim u svim koracima metabolizma irnk. Editovanje A iz baznog para A-U dovodi do formiranja pogrešnog baznog para I-U i destabilizacije strukture dvolančane RNK, dok reďe editovanje A iz pogrešnog baznog para A-C formira bazni par I-C i stabilniju dvolančanu RNK. 2. TIPOVI I EFIKASNOST EDITOVANJA A-U-I Dezaminacija jednog ili nekoliko tačno odreďenih A označena je kao editovanje specifično za mesto. Suspstrati za ovaj tip editovanja su pre-irnk koje formiraju kratke dvolančane regione (30-70 bp) nastale sparivanjem dela egzona i introna (eng. editing-site-complementary sequence, ECS), u okviru kojih editovanju podležu uglavnom kodirajući delovi (slika 3a). Ovaj proces doprinosi diverzifikaciji proteoma. Inicjalno se smatralo da su supstrati za ADAR samo kodirajući regioni irnk. Danas je poznato da se svega oko pedesetak pre-irnk edituje u kodirajućim regionima, dok se ogroman broj mesta editovanja (oko 1,6 miliona!) nalazi u nekodirajućim regionima pre-irnk. Naime, godine je otkrivano da su najčešća mesta editovanja A-u-I duge (>100 bp), visoko-komplementarne dsrnk nastale sparivanjem invertovanih ponovaka Alu ili LINE, smeštenih u intronima i netranslatirajućim regionima pre-irnk. U ovim dvolančanim strukturama RNK visoko-efikasno i neslektivno edituje se i do 50% A, čime se značjano menja lokalna struktura i stabilnost irnk. Ovaj tip editovanja poznat je pod nazivom globalno hipereditovanje ili promiskuitetno editovanje. Proces značajno doprinosi diverzifikaciji transkriptoma. Od godine poznato je da postoje interakcije procesa editovanja A-u-I i RNK interferencije (RNKi) zasnovane na editovanju prekursora malih regulatornih RNK i na nekim funkcijama proteina ADAR nezavisnim od dezaminazne aktivnosti. Editovanju podležu specifični A u prekursorima mikrornk (mirnk), dok hipereditovanju podleže veliki broj A u prekursorima malih interferirajućih RNK (sirnk). Proces je važan mehanizam regulacije malih nekodirajućih RNK. 5

6 Efikasnost editovanja transkripta odreďene vrste kreće se u rasponu od 0 do 100% i zavisi od vrste supstrata, faze razvića i sredinskih faktora. Ova osobina editovanja A-u-I dozvoljava istovremenu ekspresiju editovanih i needitovanih produkata jednog gena u različitim odnosima. Kroz regulisanje stepena editovanja odreďene vrste transkripata, postiže se graduisano regulisanje funkcije njihovih proteina, što značajno povećava plastičnost u funkcionisanju ćelije. Slika 2. Tipovi editovanja A-u-I katalizovanih proteinima ADAR. a) Editovanje specifčno za mesto. b) Hipereditovanje (promiskuitetno editovanje). c) Editovanje prekursora malih regulatornih RNK Mesto-specifično editovanje i diverzifikacija proteoma Mesto-specifično editovanje A-u-I u kodirajućim regionima menja informacioni potencijal pre-irnk, jer se I sparuje sa C, a ribozom i splajsozom ga interpretiraju kao G (slika 1). Posledice su promena značenja kodona (rekodiranje) (slika 3a) ili mesta splajsovanja (slika 3b). Usled suspstitucije aminokiseline ili novog dogaďaja alternativnog splajsovanja stvaraju se proteinske izoforme, koje uglavnom obavljaju iste funkcije, ali se meďusobno razlikuju u stepenu funkcionalnosti. 6

7 Rekodiranje Rekodiranju podleže oko pedesetak pre-irnk kod sisara. One ukupno sadrže oko 300 visoko-konzervisanih A koji su supstrati za reletivno visok stepen precizno regulisanog editovanja sa posledicama na funkcionalnost proteina. Većina takvih irnk eksprimira se u centralnom nervnom sistemu (CNS), a njihovi proteini, uglavnom, učestvuju u hemijskoj i električnoj neurotransmisiji ili drugim sinaptičkim funkcijama. Slika 3. Efekti editovanja A-u-I u trsanskriptima koji kodiraju proteine.: a) Promene kodona koje mogu nastati usled editovanja A-u-I, zasnovane na interpretaciji I kao G od strane translacione mašinerije. Aminokiseline su grupisane prema naelektrisanju i hidrofobnosti. b) Nastanak alternativno splajsovanih izoformi pomoću editovanja RNK. Visokokonzervisana sekvenca GU u 5'-mestu splajsovanja može biti kreirana editovanjem (AU IU=GU), kao i visokokonzervisana sekvenca AG u 3'-mestu splajsovanja (AA AI=AG). Slično, editovanje AG u 3'-mestu splajsovanja (AG IG = GG) može eliminsati ovo mesto.savijena linija označava granice introna koji se iskraja u odsustvu editovanja RNK. Isprekidane linije označavaju alternativno splajsovane forme nastale usled editovanja RNK. Primeri editovanih transkripata za receptore za neurotransmitere ili jonske kanale kod sisara su receptori AMPA i GABA A, serotoninski receptor 2C (HTR2C), kanal za kalijum Kv1.1 i kanal za kalcijum Ca v 1.3, na primer. Kod D. melanogaster je opisano editovanje transkripta za Na-kanale, a kod lignje kanala za kalijum Kv1.1A. Poslednjih godina opisano je editovanje još nekih proteina koji se specifično eksprimiraju u neuronima. MeĎu njima su triptofan hidroksilaza 2, odgovorna za sintezu serotonima u mozgu, i RNK-vezivni proteini važni za post-transkripcionu regulaciju irnk u neuronima (HuB, HuD i NOVA1). Supstrati za editovanju A-u-I su i transkripti za proteine uključene u različite korake reorganizacije aktina (CyFip2, filamin A i filamin B), koji su esencijalni za pokretljivost i migraciju ćelija, a u neuronima i za formiranje dendritskih trnova i sinapsi. TakoĎe, transkripti nekih proteina uključenih u proliferaciju ćelije podležu editovanju A-u-I. Pored ćelijskih transkripata supstrati za editovanje A-u-I su i neki virusni transkripti (na primer, transkript gena za antigen hepatitis delta virusa). Rekodiranjem se stvaraju proteinske izoforme koje, za razliku od proteinskih izoformi nastalih alternativnim splajsovanjem, skoro uvek obavljaju istu funkciju ali se meďusobno fino razlikuju po osobinama koje utiču na efikasnost obavljanja njihove funkcije. Tako, rekodiranje utiče na kintetiku enzima (na primer, TPH2) ili jonskog kanala i receptora, asembliranje subjedinica i ekspresiju jonskog kanala i receptora na površinu ćelije, afinitet vezivanja za RNK supstrat (na primer, Hu proteini), stabilnost proteina (na primer, NOVA1) ili na interakciju sa partner proteinima (na primer, CyFip2, 7

8 filamin A i filamin B). Ako se ima u vidu precizna vremenska i prostorna regulacija editovanja i efikasnost editovanja od 0 do 100%, onda postaje jasno da u odreďenom trenutku u odreďenoj ćeliji istovremno funkcioniše veći broj proteinskih izoformi koje sa graduisanom efikasnošću obavljaju svoje funkcije. Upravo ove osobine proces editovanja RNK čine možda i najmoćnijim procesom u pogledu obzbeďivanja izuzetne plastičnosti odgovora ćelije na stimuluse koje prima. Značaj rekodiranja za funkcionalnost nekog proteina može se ilustrovati primerom editovanja pre-irnk za serotonincki receptor 2C (5-HT 2C R). 5-HT 2C R je protein sa sedam tansmembranskih domena koji kupluje sa proteinom G. Njegovom aktivacijom inhibira se dopaminska i norepinefrinska signalizacija u odreďenim regionima mozga. Učestvuje u regulaciji raspoloženja, anksioznosti, ishrane i reproduktivnog ponašanja. 5-HT 2C R pre-irnk edituje se na pet specifičnih mesta u egzonu 5, označenih kao mesta A, B, E, C i D (slika 4b), što menja genomski kodirane aminokiseline Ile, Asn i Ile na pozicijama 156, 158 i 160, redom (slika 4b). Kratka dvolančana RNK sa izbočinama i petljama, koja je supstrat za proteine ADAR, formira se parcijalnim sparivanjem sekvence egzona 5 i nizvodne sekvence introna. Različite kombinacije editovanja ovih pet mesta dovode do promene tri kodona (AUA za Ile, AAU za Asn i AUU za Ile) u mogućih šest novih (slika 4b) i potencijalne ekspesije čak 24 izoforme receptora. Mesta A i B specifično edituje ADAR, mesto D ADARB1, dok mesta C i E ne pokazuju specifičnost prema jednom ili drugom enzimu. Egzon 5 gena 5-HT 2C R kodira drugu unutarćelijsku petlju koja je vžna za post-sinaptičku signalizaciju jer predstavlja domen za kuplovanje sa G proteinom (slika 4b). Funkcionalnost izoformi se graduisano razlikuje u pogledu kuplovanja sa G proteinom, afiniteta za serotonin i agoniste, konstitutivne aktivnosti i ekspresije na površinu ćelije. Potpuno editovana izoforma 5-HT 2C R (VGV) ima 20 puta manju potencijaciju sa serotoninom, 5 puta smanjeno kuplovanje sa G proteinom i 6 puta manje efikasno vezuje agoniste u poreďenju sa needitovanom izoformom (INI). Dalje, potpuno editovana izoforma VGV ima najmanju konstitutivnu aktivnost i potpuno se eksprimira na površini ćelije, needitovana izorma ima najveću konstitutivnu ativnost, konstitutivno internalizuje i akumulira se u endozomima, dok se parcijalno editovana VSV izoroma delimično eksprimira na površini ćelije, a delimično se akumulira u endozomima. Obrazac editovanja 5-HT 2C R pre-irnk moduliše njeno alternativno splajsovanje, čime se kontroliše količina sinteze funkcionalnog 5-HT 2C R. Intron 5 iskraja se korišćenjem jednog od tri alternativna 5 -mesta splajsovanja (GU1, GU2 i GU3). Mesto GU1 se nalazi u egzonu 5, GU2 na granici egzon 5-intron 5 i GU3 u intronu 5. Samo korišćenje mesta GU2 daje zrelu irnk koja kodira funkcionalni protein pune dužine. Većina editovanih pre-irnk splajsuje se korišćenjem ovog mesta splajsovanja. Needitovana pre-irnk, uglavnom, se splajsuje korišćejem mesta GU1, što rezultuje izostankom sinteze proteina. Ukoliko je editovanje neefikasno, povećan nivo splajsovanja u mestu GU1 deluje kao kontrolni mehanizam za smanjenje nivoa sinteze needitovane izoforme INI, kako bi se ograničio odgovor ćelije na serotonin. Editovanjem 5-HT 2C R irnk moduliše se (generalno smanjuje) odgovor ćelije na nivo serotonina, ali i sam nivo serotonina povratnom spregom utiče na nivo i obrazac editovanja 5-HT 2C R irnk, što omogućava modulaciju serotoninske signalizacije i optimalan odgovor ćelije na signale koje prima. 8

9 AMPA receptor (L-α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolproprionat receptor) za glutamat, koji je ujedno i jonski kanal za kalcijum, posreduje u brzoj ekscitatornoj transmisiji u neuronima CNS-a, Sastoji se od četiri subjedinice, označene kao GluR-A, -B, -C i -D. Pre-iRNK za tri subjedinice sadrže po osam A koji se edituju različitom efikasnošću, što predstavlja efikasan način finog regulisanja glutamatergičnih sinapsi u odgovoru na sredinske stimuluse. Editovanje kodona za glutamin (Q) u kodon za arginin (R) u egzonu 11 pre-irnk za subjedinicu GluR-B je jedino za sada poznato mesto koje se edituje sa efikasnošću od 100% i esencijalno je za preživljavanje. Katalizuje ga ADARB1. Kodon CAG za Q menja se u kodon CIG, koji se intrpretira kao kodon za arginin (R), a mesto editovanja se označava kao Q/R mesto (slika 4a). Aminokiseline Q ili R smeštene su u domenu petlje GluR-B koja je okrenuta ka samom jonskom kanalu tako da se editovanjem bitno menja propustljivost receptora AMPA za jone Ca 2+ : prisustvo R čini kanal nepropustljivim za Ca 2+, dok prisustvo genomski kodiranog Q dozvoljava influks Ca 2+ u ćelije. Q/R mesto editovanja, takoďe, utiče na unutarćelijski transport subjedinica i njihovo asembliranje. Slika 4. Supstitucije aminokiselina u proteinima usled editovanja A-u-I i modulacija korišćenja mesta splajsovanja. a) AMPA receptor za glutamat, subjedinica GluR-B; b) receptor za sertonin 2C); c) modulacija odabira alternativnog mesta splajsovanja editovanjem pre-irnk za serotoninski receptor 2C. 9

10 Promena obrasca splajsovanja Editovanje A-u-I može promeniti obrazac splajsovanja ciljnih molekula RNK jer ima potencijal da kreira 5 -mesto splajsovanja, kreira ili eliminiše 3 -mesto splajsovanja ili eliminiše mesto grananja (slika 3b). TakoĎe, može uticati i na odabir jednog od alternativnih mesta splajsovanja. Kod sisara ADARB1 edituje sopstveni transkript (auto-editovanje) kreirajući alternativno 3 -mesto splajsovanja (AA AI=AG) (slika 5). Auto-editovanje rezultuje u uključivanju 47 nukleotida iz intronske sekvence usled čega dolazi do promene faze okvira čitanja i posledično do smanjenjanja nivoa ADARB1. Auto-regulacija splasovanja ADARB1 predstavlja mehanizam negativne povratne sprege kojim se moduliše nivo proteina ADARB1. Slika 5. Editovanje A-u-I menja obrazac splajsovanja ABARB1 pre-irnk. ADARB1 kod sisara edituje sopstvaenu pre-irnk, kreirajući novo 3 -mesto splajsovanja (crvena slova), što rezultuje uključivanjem 47 nukleotida introna, koje dovodi do promene faze okvira čitanja i smanjenja nivoa ADARB1. Editovanje A-u-I može uticati na odabir mesta splajsovanja, kao što je pretodno opisano kod alternativnog splajsovanja 5HT 2C R pre-irnk. Pretpostavlja se da se formiranjem strukture dvolančane RNK u pre-irnk mesto splajsovanja može učiniti nevidljivim za splajsozom. Ukoliko se u toj strukturi nalazi ciljni A, sam proces editovanja destabilizuje dvolančanu RNK, što splajsozomu omogućava pristup mestu splajsovanja Globalno hipereditovanje i diverzifikacija transkriptoma U poli-a frakciji RNK izolovanoj iz mozga pacova zapažen je veliki procenat zastupljenosti I, što se nije moglo objasniti editovanjem A-u-I u kodirajućim regionima transkripata prepisanih sa nekoliko destina gena za proteine. Ova nepodudarnost inicirala je bioinformatičko pretraživanje potencijalnih mesta editovanja u kodirajućim i nekodirajućim regionima sekvenci EST (eng. expressed sequence tag). Ovakvim pristupom identifikovan je mnogo veći broj mesta editovanja A-u-I od očekivanog, a najveće iznenaďenje je bilo da su skoro sva nova mesta editovanja u transkriptomu čoveka (oko mesta u oko gena) identifikovana u nekodirajućim regionima pre-irnk koji se sastoje od invertovanih elemenata Alu (u 90% slučajeva) i LINE (slika 6a). Predikcija izvedena na osnovu bioinformatičkog pretraživanja je ukazala da bi više od 85% pre-irnk moglo da se edituje, i to u 90% slučajeva u intronima, a ostatak u netranslatirajućim regionima. Sličnom strategijom pretraživanja koja je bila ograničena na kodirajuće regione pre-irnk, identifikovano je svega nekoliko potencijalnih mesta editovanja. Savremenim analizama transkriptoma dubokim RNK sekvenciranjem identifikovno je čak 1,6 miliona mesta editovanja u nekodirajućim regionima pre-irnk. Dakle, analizama na nivou celog transkriptoma postalo je jasno da su najčešći supstrati za ADAR nekodirajuće sekvence transkriptoma, i to dvolančane RNK formirane intramolekulaskim sparivanjem invertovanih elementa Alu, a da je rekodiranje kao rezultat editovanja A-u-I mnogo reďe. 10

11 Iako su elemenati Alu karakteristika genoma primata, utvrďeno je da je hipereditovanje A-u-I nekodirajućih ponovljenih elemenata u molekulima RNK široko rasprostranjen fenomen sa različitom zastupljenošću kod različitih organizama. U genomima drugih organizama postoje drugi tipovi elemenata SINE, za koje se smatra da imaju zajedničko poreklo sa elementima Alu. Editovanje elemenata SINE u transkriptomu miša je reďe u odnosu editovanje elemenata Alu barem za jedan red veličine i može se objasniti njihovom manjom dužinom (150 bp, u odnosu na 300 bp za Alu), kao i manjim stepenom meďusobne homologije u odnosu na elemenate Alu. Skrining editovanja A-u-I u transkriptomu pacova, kokoške i vinske mušice, potvrdilo je da su nekodirajuće ponovljene sekvence glavni supstrati za ADAR, ali da je učestalost editovanja mnogo češća kod čoveka, pri čemu je 90% ovog povećanja vezano je za editovanje elemnata Alu u Pol II transkriptima. Dosadašnja istraživanja ukazuju da je globalno hipereditovanje važno za finu post-transkripcionoj regulaciji ekspresije gena i da značajno doprinosi diverzifikaciji transkriptoma. Hipereditovanje invertovanih elemenata Alu može promeniti mesta splajsovanja, a nekoliko ćelijskih procesa, vezanih za specifično prepoznavanje i funkcionisanje molekula RNK obogaćenih inozinom, povezuje se sa izmenjenim transportom, strukturom i stabilnošću irnk. Hipereditovanje privlači veliku pažnju kao mehanizam koji je bio važan za evoluciju kognitivnih sposobnosti čoveka. Naime, iako je rekodiranje proteina slično kod čoveka i miša, ukupno editovanje je 35 puta zastupljenije kod čoveka usled hipereditovanja u ponovljenim sekvancama Alu. MeĎu samim primatima, zastupljenost hipereditovanja Alu sekvenci se, takoďe, povećavala tokom evolucije, tako da je ovaj proces najzastupljeniji u mozgu ćoveka. Smatra se da je ekspanzija hiperdetivanja kod čoveka mogla generisati molekulsku kompleksnost koja je predstavlja osnovu za razvoj kognitivnih sposobnosti čoveka Egzonizacija elemenata Alu Izvestan broj gena čoveka sadrži alternativne egzone čije sekvence odgovaraju elementima Alu. Oni se nazivaju Alu egzonima. Njihova mesta splajsovanja bi mogla nastajati editovanjem A-u-I dvolančane RNK formirane sparivanjem inverotvanih elemenata Alu (slika 6b). Na primer, editovanje jedne takve dvolančane strukture u genu NARF (nuclear prelamin A recognition factor), dovodi do stvaranja 3'-mesta splajsovanja uzvodno od elementa Alu, i posledično do njegovog uključivanja u zrelu irnk. Smatra se da bi modulisanje alternativnog splajsovanja editovanjem A-u-I u dvolančanim RNK formiranim sparivanjem inverotvanih elemenata Alu mogao biti široko rasprostranjen fenomen. Postoje mišljenja da je egzonizacija elemanata Alu kontolisana editovanjem mogla biti glavna pokretačka snaga evolucije CNS-a čoveka koja je omogućila oprobavanje različitih formi proteina sa novim funkcijama (bez narušavanja funkcija postojećih proteina), od kojih su opstale one koje su davale selektivnu prednost Nukleusna retencija hipereditovanih transkripta Afinitetnom hromatografijom u kojoj je korišćena sintetička RNK bogata inozinima izolovan je protein p54 nrb. Ovaj protein lokalizuje u nukleusu, gde obavlja veći broj funkcija: stupa u interakciju sa jednim faktorom splajsovanja (PSF) i jednim proteinom nukleusnog matriksa (matrinom 3), jedan je od proteina koji lokalizuje u nukleusnim parapegama i predstavlja protein koji "hvata" hipereditovane RNK polioma virusa. Pretpostavljeno je da bi editovanje A-u-I moglo biti zadržati i ćelijske transkripte u nukleusu, i da protein p54 nrb i nukleusne parapege verovatno imaju ključnu ulogu u tom procesu. Dobro je proučen 11

12 primer nukleusne retencije hipereditovane irnk za katjonski transporter aminokiselina 2 (mcat2), koji ćeliju snabdeva prekursorima azotmonoksida (NO) (slika 6c). Slika 6. Editovanje invertovanih ponovljenih elemenata Alu i LINE u nekodirajućim regionima transkripata i potencijalni efekti na njihovu regulaciju ekspresije. a) Editovanje intramolekularnih dvolančanih RNK nastalih sparivanjem invertovanih elemenata Alu i LINE; b) Modulisanje splajsovanja egzonizacija Alu; c) Nuklearna retencija Ctn RNK; d) Degradacija transkripta sa Tudor-SN. Objašnjenje u tekstu. Gen mcat2 se skprimira se sa dva promotra dajući dve RNK koje nose identične okvire čitanja za mcat2. Jedna od njih, mcat2 RNK, se nakon transkripcije eksportuje se u citoplazmu i translatira u protein. Duži transkript, Ctn RNK, sadrži produženi 3 -UTR sa invertovanim ponovcima Alu koji su supstrat za proteine ADAR. Hipereditovanu Ctn RNK vezuje protein p54 nrb i ona biva zadržana u nukleusnim parapegama. U uslovima stresa, signali koji se primaju odreďenim receptorima na površini 12

13 ćelije, pokreću sečenje zarobljenih Ctn RNK i de novo poliadenilaciju na alternativnom mestu. OsloboĎeni transkripti se eksportuju u citplazmu i translatiraju u katjonski transporter koji ćeliju snabdeva prekursorima za NO. Opisana regulacija katjonskog transportera za rezultat ima povećanu proizvodnju NO kao odgovor na stres. Iako se smatra se da bi nukleusna retencija mogla da reguliše ekspresiju brojnih drugih gena čiji se transkripti hiperedituju, opšta uloga hipereditovanja invertovanih ponovaka u nukleusnoj retenciji transkripata je donekle dovedena u pitanje. Naime, pokazano je da se neke irnk sa formiranim dvolančanim strukturama RNK eksportuju u citoplazmu, asembliraju u polizome i efikasno translatiraju nezavisno od statusa editovanja Degradacija hipereditovanih transkripta U ćelijama sisara identifikovana je ribonukleaza koja specifično prepoznaje RNK koje sadrže inozine i preferencijalno seče oba lanca dvolančane RNK sa većim brojem baznih parova I-U. Kao potencijalni protein sa ovom funkcijom identifikovana je Tudor stafilokokusna nukleaza (Tudor-SN), koja obavlja različite uloge u metabolizmu irnk u ćelijama sisara, uključujući transkripciju, splajsovanje i degradaciju. Smatra se da bi hipereditovanje invertovanih elemenata Alu i LINE moglo dovesti do degradacije pre-irnk katalizovane sa Tudor-SN, čime bi se kontrolisao nivo ekspresije gena koje nose ponovljene sekvence Alu i LINE (slika 6d) Interakcije puteva editovanja RNK i RNK interferencije Skoro paralelno sa otkrićem hipereditovanja ponovljenih elemenata Alu i LINE, otkriveno je postojanje interakcije izmeďu procesa editovanja A-u-I i puteva RNK interferancije (crosstalk between editor and silencer). Editovanje A-u-I i RNK interferencija (RNKi) su procesi koji funkcionišu na ćelijskim ili virusnim dvolančanim RNK, a njihovi ključni proteini (proteini ADAR, Drosha, DGCR8, Dicer i TRBP) sadrže dsrbd. Ovi domeni ne prepoznaju specifične sekvence, već dvolančanu strukturu RNK, tako da osnovu interakcije procesa editovanja A-u-I i RNKi predstavlja kompeticija za dvolančani RNK supstrat. Modulaciju obrade i ekspresije malih regulatornih RNK proteini ADAR ostvaruju editovanjem prekursora malih regulatornih RNK, dok se protein ADAR ostvaruje i dodatne funkacije u regulaciji RNKi koje su nezavisne od njegove dezaminazne aktivnosti. Znajući da mali regulatorni molekuli RNK regulišu veliki broj ciljnih irnk, editovanje njihovih dvolančanih prekursora ukazuje na novi mehanizam kojim proteini ADAR utiču na globalnu ekspresiju gena Efekat editovanja A-u-I na put sirnk RNKi može biti indukovana dugim dvolančanim molekulima RNK koji su supstrat za Dicer (slika 7). Nastaju male interferirajuće (sirnk), koje pokreću endonukleolitičku degradaciju ciljnih RNK ili epigenetičko utišavanje ciljnih sekvenci u genomau. Interakcije editovanja A-u-I i RNKi posredovane sa sirnk ostvaruju se na dva načina. (1) Dvolančani prekursor sirnk može biti suspstrat za protein ADAR i nakon editovanja postati otporniji na delovanje Dicera, čime se smanjuje količina stvorenih zrelih sirnk. (2) Supresija sirnk sa ADARp150 ostvaruje se čvrstim vezivanjem ADARp150 za sirnk, što smanjuje efektivnu koncentraciju sirnk. Ekekti oba mehanizma su smanjenje efikasnosti RNKi posredovane sa sirnk. 13

14 Duge dvolančane RNK koje su supstart za Dicer predstavljaju i idealne supstrate za proteine ADAR. U takvim molekulima RNK ADAR može nespecifično editovati više od 50% A (slika 7a). UvoĎenje velikog broja pogrešnih baznih parova I-U menja strukturu dvolančane RNK, čineći je "otpornijom" na delovanje Dicera. Rezultat je stvaranje nefunkcionalnih ili manjeg broja sirnk, i posledično suprimiranje RNKi. Pored navedenog, editovana dvolančana RNK može postati supstrat za TudorSN, usled čega se opet smanjuje produkcija sirnk Slika 7. Efekti editovanja A-u-I na RNK interferenciju posredovanu sa sirnk. a) Duga dvolančana RNK, kao što je na primer virusna RNK, efikasno se i nespecifično edituje sa ADAR, što vodi do inhibicije RNK interferencije i degradacije editovane dvolančane RNK sa Tudor-SN. b) ADARp150 se čvrsto vezuje za male interferirajuće RNK (sirnk), a da ih pri tome ne edituje. Na taj način smanjuje se efektivna koncentracija sirnk i efikasnost RNK interferencije. Potvrda ovog modela interakcije editovanja A-u-I i RNKi dobijena je reverzijom fenotipa izmenjene hemotaksije (sposobnosti traženja ili izbegavanja odreďene supstance) kod C. elegans. Soj C. elegans sa homozigotnim delecijama gena adar-1 i adar-2 ispoljava defekte u hemotaksiji, a reverzija se postiže kod onih jedinki koji imaju defektnu RNKi mašineriju. Ovi podaci ukazuju da je fenotip izmenjene hemotaksije kod C. elegans rezultat hiperaktivnosti puta RNKi, koji je u normalnim uslovima suprimiran aktivnošću enzma ADAR. Kod divljih sojeva C. elegans, ekspresija gena koji kontrolišu hemotaksiju je pod kontrolom ravnoteže izmeďu editovanja A-u-I i RNKi, procesa koji deluju na dvolančane RNK formirane u transkriptima ovih gena. Još jedan primer antagonističkih efekata 14

15 editovanja RNK i RNKi kod C. elegans je sprečavanje utišavanja transgena sa invetovanim ponovljenim sekvencama putem RNKi. Utišavanje ovakvih transgena sprečeno je editovanjem dvolančanih RNK nastalih sparivanjem invetovanih ponovljenih sekvenci. Pored toga što su enzimi ADAR u kompeticiji sa Dicerom za dvolančane RNK supstrate, izoforma ADARp150 se čvrsto vezuje za obraďene dvolančane sirnk, smanjujući njihovu efektivnu koncentraciju u citoplazmi, a time i efikasnost RNKi (slika 7b). U ovom slučaju ADARp150 ne edituje sirnk, tako da je ova njegova funkcija nezavisna od dezaminazne aktivnosti. Ovaj model interakcije ADAR i RNKi potvrďuju rezultati eksperimenta u kome su mišu injecirane nespecifične sirnk u velikoj dozi. Nakon toga uočena je indukacija ekspresije ADAR, što ukazuje da je ADAR sastavni deo ćelijskog mehanizma koji se javlja kao odgovor na sirnk. Endogeni molekuli sirnk koji bi mogli biti regulisani sa ADARp150 još uvek nisu identifikovani, a sličan efekat proteini ADAR bi mogli imati na pirnk. ADAR je ćelijski faktor koji ograničava potencijal sirnk u ćelijama sisara, smanjenjem efektivne koncentracije sirnk i sprečavanjem njene inkorporacije u kompleks RISC. U prilog ovome govori podatak da je utišavanje invazivnih nukleinskih kiselina (transpozona, virusne RNK i transgena) sa sirnk značajno efikasnije kod organizama koji nemaju ADAR sistem, kao što su biljke i gljive. Kod ovih organizama RNKi predstavlja jedini odbrambeni mehanizam protiv invazije transpozona i virusa. Smatra se da je ADAR sistem mogao evoluirati kao protivtežnja RNKi kod organizama koji su razvili savršeniji imunski sistem i drugačije mehanizme za odabranu od transpozona Efekat editovanja A-u-I na put mirnk MikroRNK (mirnk) su male regulatorne RNK kodirane eukariotskim genomom, koje post-transkripciono regulišu ekspresiju gena putem RNKi. S obzirom da ne moraju biti perfektno komplementarne ciljnim molekulima RNK, jedna mirnk može regulisati veliki broj irnk, a jedna irnk može biti regulisana sa većim brojem mirnk. Geni za mirnk se prepisuju u primarnu mirnk (pri-mirnk), koja formira strukturu drška-petlja (slike 7a). Kompleks Drosha-DGCR8 endonukleolitički seče pri-mirnk, čime nastaje prekursor mirnk (pre-mirnk) koji se transportuje u citoplazmu. Pre-miRNK je u citoplazmi supstrat za kompleks Dicer-TRBP, koji endonukleolitičkim sečenjem stvara dvolančanu mirnk dugačku oko 22 bp. Dvolančana mirnk stupa u interkciju sa nekim od proteina Argonaut, formirajući utišavajući kompleks RISC, u okviru koga se dešava selekcija aktivnog lanca mirnk (lanca "vodiča"), dok drugi lanac (lanac putnik ) biva degradovan. MikroRNK usmerava kompleks RISC ka ciljnom mestu, obično 3'-UTR-u odreďene irnk, dovodeći do translacione represije i destabilizacije irnk, ili endonukleolitičke degradacije. Transkripcija gena za mirnk je obično kontrolisana promotorima drugih gena, tako da se modulacija obrade mirnk smatra jednim od glavnih načina za regulaciju nivoa mirnk u ćeliji. Editovanje A-u-I je, upravo, jedan od procesa koji bi moduliše biogenezu mirnk. Uočeno je kod mnogih primarnih RNK (pri-mirnk), a postoje i in vitro dokazi za editovanje prekursora mirnk (pre-mirnk). Sistematična pretraživanja editovanja pokazuju da se oko 6% pri-mirnk kod čoveka edituje, dok in vitro ispitivanja editovanja nasumično odabranih pri-mirnk ukazuje da bi čak 50% pri-mirnk moglo biti specifično editovano sa ADAR. 15

16 Slika 8. Efekti editovanja A-u-I u nekodirajućim transkriptima. a) Biogenza mirnk; b) Editovanje primarne mirna (pri-mirnk) može suprimirati ili pojačati njenu obradu sa Drosha. Pri-miRNK čija je obrada sa Drosha suprimirana, može dalje podleći degradaciji sa endonukleazom Tudor-SN; c) Ako editovanje pri-mirnk na utiče na obradu sa Drosha, ili ako je editovana buduća mirnk, takva pre-mirnk odlazi u citoplazmu, gde njena obrada sa Dicerom može biti promenjena. d) Ukoliko editovanje nije uticalo na obradu pre-mirnk nastaće zrela editovana mirnk koja može imati promenjen afinitet za ciljne irnk ili može delovati na novu grupu ciljnih RNK. Editovanje mirnk može dovesti i do promene izbora lanca putnika, i time opet do promene ciljnih molekula RNK. Editovanje pri-mirnk može imati značajne posledice na biogenezu i ekspresiju mirnk, s obzirom da kratki i neperfektni dvolančani regioni pri- i pre-mirnk dozvoljavaju enzimima ADAR da se uključe u put biogeneze mirnk. Editovanje sa ADAR može uticati na obradu mirnk inhibicijom endonukleolitičkog sečenja sa Drosha ili Dicerom (slika 8, b i c), što dovodi do smanjenja nivoa zrelih mirnk. Hipereditovana pri-mirnk se dalje degraduje sa Tudor-SN (slika 8b). Ukoliko obrada mirnk nije narušena editovanjem A-u-I, eksprimira se zrela mirnk koja ima A-u-I supstitucije, odnosno editovana zrela mirnk (slika 8d). Editovana mirnk može imati promenjen afinitet za ciljne irnk ili može utišati set gena koji je različit u odnosu na set koji se utišava needitovanim parnjakom. Setovi ciljnih irnk molekula se naročito razlikuju ukoliko je editovanje izvršeno u regionu "semena" mirnk, koji je ključan za prepoznavanje ciljne irnk. Selekcija aktivnog lanca mirnk bazirana je na termodinamičkoj stabilnosti 5'-kraja dvolančane mirnk, čija lokalna stabilnost može biti izmanjena 16

17 editovanjem. Takve izmene mogu uticati da za aktivni lanac bude izabran lanac putnik, koji deluje na različitu grupu ciljnih irnk. Iako još uvek nisu opisani takvi primeri, editovanje A-u-I bi moglo uticati i na supresiju transporta pre-mirnk iz nukleusa u citoplazmu. 3'-UTR-ovi irnk često podležu editovanju. Pokazano je da promena genomskog A u G u 3'-UTR-u dovodi do stvaranja novog ciljnog mesta za mirnk, tako da je moguće da editovanje 3'-UTR-ova može pojačati ili reprimirati utišavanje specifične irnk. Slično, editovanje može destabilizovati sekundarnu strukturu u 3'-UTR-u, dozvoljavajući kompleksu RISC da stupi u interakciju sa prethodno nedostupnim ciljnim mestom. Kroz sve ove mehanizme, A-u-I editovanje ima potencijal da brzo promeni nivo ekspresije gena kao odgovor na neki stimulus. Nedavno je opisana uloga ADAR1 u obradi mirnk koja je nezavisna od njegove uloge u editovanju RNK. Naime, pokazano je da ADAR1 formira kompleks sa Dicerom kroz direktne proteinprotein interakcije. ADAR1 povećava maksimalnu brzinu sečenja pre-mirnk sa Dicerom i olakšava interakciju mirnk sa kompleksom RISC. ADAR1 "razlikuje" svoje funkcije u editovanju RNK i RNKi formiranjem ADAR1/ADAR1 homodimera ili ADAR1/Dicer heterodimera, redom. Kod embriona Adar1 knockout miševa, koji imaju letalan fenotip, ekspresija mirnk je globalno inhibirana, što dovodi do poremećene ekspresije velikog broja ciljnih gena i verovatno doprinosi letalnom fenotipu. 3. REGULACIJA EDITOVANJA A-U-I Specifični molekularni mehanizmi koji regulišu prostorni i vremenski nivo editovanja A-u-I su uglavnom nepoznati. Prisustvo irnk za ADAR proteine obično nije u korelaciji sa aktinošću proteina ADAR u ćelijama, zbog čega se smata do postoji složena regulacija ovog procesa na posttranskripcionom i post-translacionom nivou. Ona uključuje alternativno splajsovanje (izoforme ADAR i ADARB1 se razlikuju lokalizaciji, enzimskoj aktivnosti i/ili prepoznavanju ciljnih irnk), formiranje heterodimera sa ADARB2 i sa drugim partner proteinima (FMR1), regulaciju na nivou individualnih ciljnih irnk (kompeticija i koregulacija sa splajsovanem), post-translacione modifikacije (SUMOilacija ADAR smanjuje editaznu aktivost) i regulaciju kroz lokalizaciju ADAR proteina u nukleusu. 4. EDITOVANJE A-U-I I BOLESTI ČOVEKA Heterozigotne mutacije u genu ADAR1, koje se nasleďuju autozomno dominantno, dovode do poremećaja pigmentacije kože (dyschromatosis symmetrica hereditaria). Poremećaji u editovanju RNK vezuju se i za bolesti centralnog nervnog sistema i maligne bolesti. Smatra se da smanjenje efikasnosti editovanja mesta Q/R u irnk za GluR-B dovodi do smrti motoneurona kod bolesnika sa sporadičnom amiotrofičnom lateralnom sklerozom, do apoptotoze neurona prilikom ishemije uzrokovane srčanim udarom ili poremećajem cirkulacije u mozgu, a moglo bi biti povezano i sa epilepsijom. Postoje indikacije da je imbalans u editovanju RNK vezan za razne neuropsihijatrijske bolesti. Pokazano je da je obrazac editovanja 5-HT2CR irnk značajno izmenjen u prefrontalnom korteksu samoubica, pacijenata sa depresijom i šizofrenijom. 17

18 Značajno smanjenje nivoa editovanja Alu sekvenci opisano je kod različitih vrsta malignih bolesti, i ono je delemično posledica smanjene aktivnosti svih enzima ADARs. MeĎutim, uzročna veza hipoeditovanja i maligne transformacije nije poznata. 18