ISPITIVANJE OSETLJIVOSTI BAKTERIJA NA ANTIBIOTIKE I HEMIOTERAPEUTIKE
Šta je antibiogram? Postupak za ispitivanje osetljivosti bakterija na antibiotike i hemioterapeutike
Metode antibiograma Fenotipske Difuzioni metod Dilucioni metod Genotipske detekcija gena rezistencije na antibiotike Kombinovani metod (E test) Automatizovani sistemi za identifikaciju bakterija i ispitivanje osetljivosti na antibiotike
MIK: minimalna inhibitorna koncentracija najmanja koncentracija antibiotika koja sprečava rast i razmnožavanje bakterija MBK: minimalna baktericidna koncentracija najmanja koncentracija antibiotika koja izaziva smrt bakterija
Disk difuzioni metod antibiograma Zasniva se na principu difuzije antibiotika kroz čvrstu hranljivu podlogu (agar) prethodno zasejanu ispitivanom bakterijskom kulturom. Iz čiste bakterijske kulture uzeti 4-5 kolonija ezom Poređenje bakterijske suspenzije sa standardom određene gustine Pravljenje suspenzije određene gustine od ispitivane bakterijske kulture
Disk difuzioni metod antibiograma Ravnomerno nanošenje bakterijske suspenzije brisem na celu površinu agara (najčešće Mueller-Hinton) da bi se dobio konfluentan porast Bris natopiti suspenzijom bakterija i ocediti višak tečnosti lakim pritiskom o zidove epruvete Pravilno Nepravilno
Disk difuzioni metod antibiograma Stavljanje diskova sa određenim (standardnim) koncentracijama antibiotika pincetom Raspored diskova sa antibioticima Inkubacija u termostatu na 37 C od 16-24 h
Šta se dešava tokom inkubacije? 1. bakterije se umnožavaju 2. antibiotik difunduje kroz podlogu Koncentracija antibiotika postepeno i radijalno opada sa udaljavanjem od diska sve do tačke gde više nije inhibitorna i gde se pojavljuje porast bakterija. Nastaje zona inhibicije rasta. 37 C 24 h Čvrsta hranljiva podloga zasejana čistom bakterijskom kulturom Antibiogram diskovi Čitanje rezultata
Očitavanje rezultata disk difuzionog metoda antibiograma Zona inhibicije rasta: okrugla zona oko diska sa antibiotikom u kojoj nema vidljivog porasta bakterija Merenje prečnika zone inhibicije
Tumačenje rezultata disk difuzionog metoda 3 kategorije osetljivosti: S osetljiv verovatnoća uspeha terapije je visoka nakon primene uobičajenih doza antibiotika, datih na uobičajeni način I intermedijarno (umereno) osetljiv mogući uspeh terapije ako se antibiotik da u maksimalnim koncentracijama i pareneteralnim putem R rezistentan - nikada se ne primenjuje u terapiji; bez obzira na dozu, terapija je vrlo verovatno neuspešna
Tumačenje rezultata disk difuzionog metoda Primer preporučenih zona Uporediti izmerene prečnike zona inhibicije ispitivane bakterije sa standardnim preporučenim zonama za određenu bakteriju i određeni antibiotik Dijametar zone inhibicije rasta Staphylococcus aureus S I R Ampicilin 29 28 Imipenem 16 14-15 13 Meticilin 14 10-13 9 Hloramfenikol 18 13-17 12 Gentamicin 15 13-14 12 Ciprofloksacin 21 16-20 15 Trimetoprim+ 16 11-15 10 sulfametoksazol Vankomicin 15 / / Escherichia coli S I R Ampicilin 17 14-16 13 Imipenem 16 14-15 13 Meticilin / / / Hloramfenikol 18 13-17 12 Gentamicin 15 13-14 12 Ciprofloksacin 21 16-20 15 Trimetoprim+ sulfametoksazol 16 11-15 10 Vankomicin / / /
Rezultati disk difuzionog metoda antibiograma
Disk difuzioni metod Prednosti: istovremeno se ispituje osetljivost na veći broj antibiotika Jednostavan i jeftin relativno brz (24 h) Ograničenja: ne može se odrediti MIK Kvalitativan metod u rutinskoj upotrebi
Ograničenje kvaliltativnog metoda antibiograma Kvalitativna metoda - disk difuzioni metod antibiograma (rezultati S, I, R) postoji opasnost od prevelike ili marginalno efektivne doze Problematično! Posebno kod teških pacijenata sa invazivnim bakterijskim infekcijama i sa primarnim osnovnim oboljenjem (insuficijencija jetre, bubrega...) kod kojih je važno precizno dozirati lek
Značaj određivanja minimalne inhibitorne koncentracije (MIK) antibiotika Poznavanje MIK određenog antibiotika za dati bakterijski soj koji je izolovan od pacijenta omogućava individualno doziranje antibiotika MIK se smatra referentnim kriterijumom za definisanje osetljivosti mikroorganizama
MIKROBIOLOG Određivanje MIK antibiotika za određeni soj bakterija izolovan od pacijenta FARMAKOLOG Poznavanje farmakoloških parametara za taj antibiotik (zadržavanje u organizmu, vreme eliminacije, penetracija u tkiva...) IZBOR NAJBOLJEG ANTIBOTIKA U ODGOVARAJUĆOJ DOZI ZA DATOG PACIJENTA KLINIČAR Postavljanje ispravne dijagnoze i sagledavanje svih faktora rizika kod pacijenta
Mogućnosti određivanja MIK antibiotika Dilucioni metod antibiograma E test Agar dilucioni metod Bujon dilucioni metod
Dilucioni metod antibiograma dilucioni: niz dvostrukih razblaženja antibiotika u odgovarajućoj podlozi Prema podlozi u kojoj se prave razblaženja antibiotika: 1. bujon dilucioni metod 2. agar dilucioni metod
Bujon dilucioni metod antibiograma Bakterijska suspenzija 100 µl MIK: najmanja koncentracija antibiotika koja inhibira porast bakterija (bujon ostaje bistar) 0,5 0,25 0,125 0,06 37 C 24 h MIK 0,03 Bujon + Antibiotik (µg/ml) MIK = 0,25 µg/ml Mikro bujon diluciona tehnika u pločama za mikrotitraciju
Bujon dilucioni metod antibiograma Prednosti: mogućnost određivanja MIK Ograničenja: ispituje se osetljivost jedne bakterijske vrste na jedan antibiotik složena tehnika izvođenja trajanje > 24 h
Kombinovani metod antibiograma: E test Zasniva se na principu difuzije antibiotika kroz čvrstu hranljivu podlogu (agar) prethodno zasejanu ispitivanom bakterijskom kulturom. Opadajući gradijent koncentracije antibiotika na E test traci. Ε 12 8 4 3 2 1.5 1.75.50.35.25.10.05.02.01 37 C 24 h Ε 12 8 4 3 2 1.5 1.75.50.35.25.10.05.02.01 Plastična traka impregnirana antibiotikom u gradijentu koncentracije Zona inhibicije: elipsa
E test i disk difuzioni metod: razlike u zoni inhibicije
Čitanje rezultata E testa vrednost MIK: očitava se na skali koncentracija na E test traci na mestu gde linija zone inhibicije rasta preseca ivicu E test trake MIK
Interpretacijatacija S.pneumoniae/PenG S: 0.064 I: 0.125-1 R: 2 µg/ml. I R S
Rezultati E testa
E test Prednosti: direktno očitavanje vrednosti MIK istovremeno se ispituje osetljivost na veći broj antibiotika jednostavan relativno brz (24 h) Ograničenja: visoka cena
Automatizovani sistemi za istovremenu brzu identifikaciju bakterija i ispitivanje osetljivosti na antibiotike 1. Priprema suspenzije bakterija 3. Unos panela u aparat 2. Unos bakterijske suspenzije u panele sa biohemijskim supstratima i antibioticima 4. Inkubacija u aparatu; rezultati se očitavaju posle 12/24 sata i tumače u skladu sa preporukama 5
Molekularne metode za detekciju gena rezistencije na antibiotike Metode molekularne biologije - DNK probe, PCR Ćelije/tkivo uzorci ili Izolovana DNK Prirema PCR reakcije Amplifikacija - PCR Umnožavanje gena rezistencije na antibiotik elektroforeza Slika u gelu Analiza dobijenog PCR produkta biblioteka
Disk difuzionim metodom antibiograma DA? Kojim metodama je moguće utvrditi vrednost MIK? Bujon dilucionom metodom antibiograma DA? Agar dilucionom metodom antibiograma: DA? E testom: DA? Molekularnim metodama DA?
Netačno!!!! Disk difuzioni metod antibiograma omogućava kvalitativno ispitivanje osetljivosti bakterija na antibiotike i vrednosti se izražavaju kroz kategorije S, I, R
Tačno!!! Bujon dilucionim metodom antibiograma je moguće kvalitativno ispitati osetljivosti bakterija na antibiotike i vrednosti se izražavaju preko koncetracije izražene u µg/ml Problematično, jer zahteva dosta vremena i komplikovan je za izvođenje Nije rutinska metoda
Tačno!!! Agar dilucionim metodom antibiograma je moguće kvalitativno ispitati osetljivosti bakterija na antibiotike i vrednosti se izražavaju preko koncetracije izražene u µg/ml Problematično što zahteva dosta vremena i komplikovan je za izvođenje Nije rutinska metoda
Tačno!!! E test omogućava jednostavno isitivanje osetljivosti bakterija na antibiotike izvodi se kao i disk dufuzioni metod, a rezultati se izražavaju preko µg/ml Problem je što su E test trake skupe Koristi se za indikovane situacije (teški pacijenti, izolati bakterija iz primarno sterilnih regija)
Netačno!!!! Molekularnim metodama je moguće utvrditi prisustvo gena rezistencije na neki antibiotik, ali ne i vrednost MIK
A Conet Cef3 Met Chl G Cip B V SKRAĆENICE ANTIBIOTIKA Ampicilin Imipenem Ceftriakson (Longaceph) Meticilin Hloramfenikol Gentamicin Ciprofloksacin Trimetoprim+sulfametoksazol (Bactrim) Vankomicin Razblaženje antibiotika: 64 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,125 0,06 0,03